Mar
queu
r II
I
Mar
queu
r II
I
Kb
Lad
der
non
coup
é
Eco
RV
Bam
HI +
Eco
RV
Bam
HI
21,2
5,054,25
1,951,61,37
0,830,95
Mar
queu
r II
I
Kb
Lad
der
10865432,521,5
10,8
Kb Kb
Figure 1a : Analyse de restriction du plasmide recombinant.Les fragments de restriction sont séparés par électrophorèsesur gel d’agarose à 1 % et révélés par coloration au BET.
Plas
mid
e no
n co
upé
Eco
RV
Bam
HI +
Eco
RV
Bam
HI
Figure 1b : Autoradiogramme du « Southern blot »hybridé par la sonde « insert » .
TAILLE DES FRAGMENTS :
BamHI : 7 + 4,9EcoRV : 12BamHI + EcoRV : 7 + 3,2 + 1,7
BamHI
4,9 kb
EcoRV
BamHI
1,7 kb
7 kb
3,2 kb
PLASMIDE RECOMBINANT =11,9 Kb
Vecteur : 7 Kb+
Insert : 4,9 Kb
TaqI : 1,9 + 10 2 sites de coupure
TaqI + BamHI : 1 + 1,9 + 2 + 7 pas de site TaqI sur le vecteur
TaqI + BamHI + EcoRV : 0,7 + 1 + 1,2 + 2 + 71 site TaqI de part et d’autre de EcoRV
Taq de 1,9 = 0,7 + 1,2BamHI-EcoRV de 1,7 = 1 + 0,7EcoRV-BamHI de 3,2 = 1,2 + 2
BamHI
BamHI
TaqI
TaqI
EcoRV
1 0,7 1,2 2
COUPURES par TaqI
TaqI
BamHI
1 kb
4,9 kb
0,7 kb
7 kb
10 kb EcoRV
TaqI
1,2 kb
2 kb
BamHI
1,9 kb
PLASMIDERECOMBINANT
de 11,9 Kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 11 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 9 11
Figure 2a : Coloration au BET des fragments de restriction du plasmide recombinant Figure 2b : Autoradiogramme du « Southern-blot » du « Profil 1 » après séparation par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%. gel précédent hybridé par une sonde « vecteur ». Dépôts sur Gel d’agarose Taille des fragments visualisés (en Kb) 1 : Marqueur de taille 2 : Plasmide non coupé 3 : BamHI 6,1 + 3,9 4 : HindIII 3,6 + 2,9 + 0,55 5 : EcoRI ≈ 10 6 : EcoRV ≈ 10 7 : BamHI + EcoRI 6,1 + 3,9 8 : BamHI + EcoRV 6,1 + 3,9 9 : HindIII + BamHI 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55 10 : HindIII + EcoRI 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,55 11 : EcoRI + EcoRV 6,1 + 3,9
Kb
10 8 6 5 4
3 2,5
2
1,5
1 0,8
0,6
0,4
3 - BamHI : 6,1 + 3,9 taille du plasmide recombinant = 10 Kbtaille du vecteur = 3,9 Kb
4 - HindIII : 3,6 + 2,9 + 0,55 = 7,05 !!! il manque ≅ 2,90 Kbsuperposition de 2 fragments d’environ 2,9 Kbdonc 4 sites HindIIIFragment de 3,6 Kb totalement inclus dansl’insert, donc 2 sites HindIII dans l’insert.
H
H
B
B
5 - EcoRI : ≅ 10 Kb 1 seul site EcoRI6 - EcoRV : ≅ 10 Kb 1 seul site EcoRV
H
H
B
BRV
RI
7 - BamHI + EcoRI : 6,1 + 3,9 EcoRI très proche d’1 site BamHI8 - BamHI + EcoRV : 6,1 + 3,9 EcoRV très proche d’1 site BamHI
11 - EcoRI + EcoRV : 6,1 + 3,9 EcoRI très proche d’1 site BamHIet EcoRV très proche du 2eme site BamHI
9 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,553,6 + 1,8 + 0,7 = 6,1 Kb = Insert 2,15 + 1,15 + 0,55 = 3,9 Kb = Vecteur
2 sites HindIII dans le vecteur
H
H
B
BRV
RI
H
H
Fragment HindIII de 0,55 Kb non coupé par BamHI ni par EcoRI.Fragment HindIII de 3,6 Kb non coupé par BamHI ni par EcoRI
H
H
B
BRV
RI
H
H
0,55
3,6
≅ 2,9
≅ 2,9
4 - HindIII : 3,6 + 2,9 (+ 2,95) + 0,559 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55
10 - HindIII + EcoRI : 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,55
Insert = 6,1 Kb= 1,8 + 3,6 + 0,7
Vecteur = 3,9 Kb = 2,15 + 0,55 + 1,15
0,72,15
HBRI2,2 0,65
H HH
1er fragment Coupure N° 9 :HindIII de 2,85 Coupure N° 10 :
4 - HindIII : 3,6 + 2,9 (+ 2,9) + 0,559 - HindIII + BamHI : 3,6 + 2,15 + 1,8 + 1,15 + 0,7 + 0,55
2,15 + 0,7 = 2,851,15 + 1,8 = 2,95
10 - HindIII + EcoRI : 3,6 + 2,95 + 2,2 + 0,65 + 0,552,2 + 0,65 = 2,852,95 non coupé par EcoRI
1,15 1,82eme fragment Coupure N° 9 :HindIII de 2,95 Coupure N° 10 : H
BH HH2,95
BamHI
BamHI
0,70 kb
EcoRV
HindIII
EcoRI
HindIII
HindIII
HindIII
6,1 kb3,9 kb
2,15 kb
0,55 kb
1,15 kb
1,8 kb
3,6 kb
Plasmide recombinantde 10Kb
(profil N°1)
VecteurInsert
Réaliser unedouble coupureHindIII + EcoRVpour positionnerEcoRV / BamHI
Profil 2 - HindIII : 6,5 + 2,9 + 0,55 = 9,95donc 3 sites HindIII au lieu de 4fragment de 0,55 Kb conservé doncle site HindIII en moins est situé dans l’insert
ANALYSE DU PROFIL N°2
Profil 1 - HindIII + BamHI : 0,7 + 3,6 + 1,8 + 1,15 + 0,55 + 2,15Profil 2 - HindIII + BamHI : 4,3 + 1,8 + 1,15 + 0,55 + 2,15
HindIII + EcoRI : 4,25 + 2,95 + 0,55 + 2,20
disparition du site HindIII le plus proche de EcoRI