Catalisi Enzimatica/Biotrasformazioni in Chimica Verde Prof. Attilio Citterio Dipartimento CMIC “Giulio Natta” http://iscamap.chem.polimi.it/citterio/education/course-topics/
Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione Corso 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
Attilio Citterio
Definizioni
• Biochimica Lo studio della chimica dei sistemi viventi lo studio delle molecole biologiche
1. Come funzionano 2. Le loro strutture 3D 3. Come le loro funzioni si combinano per produrre un sistema vivente
• Bioingegneria Un ampio ambito che può includere le ingegnerie elettrica,
meccanica, industriale, ambientale e chimica operano su sistemi bio/medici e agricoli (ingegneria biologica ha lo stesso significato).
• Ingegneria Biomedica Come l’ingegneria biochimica normalmente si applica al
settore medico.
Attilio Citterio
Definizioni
• Ingegneria Biochimica L’uso per scopi pratici di organismi viventi o di prodotti di sistemi
biologici
Ingegneria di processi che usano dei biocatalizzatori, materie prime bio-organiche e/o bioassorbenti usando i principi dell’Ingegneria Chimica
• Biotecnologia Ogni tecnica che usa organismi viventi o sostanze da essi
prodotte per fare o modificare un prodotto, per migliorare piante o animali, o per sviluppare micro-organismi per specifici usi
Comunemente implica l’uso o lo sviluppo di metodi di manipolazione genetica per obiettivi di interesse (ingegneria genetica o tecnologia del DNA ricombinante).
L’uso di cellule o di componenti di animali, piante e microbi, per produrre sostanze o processi utili.
Attilio Citterio
Definizioni: Enzimi
• Enzimi, Prodotti dagli organismi viventi, sono composti di natura proteica con
proprietà catalitiche. Questi catalizzatori sono sia efficienti che altamente specifici per una particolare reazione chimica che implica la sintesi, la degradazione o l’alterazione di un composto. In queste reazioni in cui le molecole sono ridotte, ossidate, trasposte, o assemblate sono spesso coinvolti dei cofattori. Alcuni enzimi sono modificati covalentemente per fosforilazione, glicosilazione ed altri processi.
CPO subtilisin phytase Promuove la proteolisi di legami peptidici.
La cloroperossidasi catalizza molte ossidazioni di substrati organici
Catalizza l'idrolisi dell'acido Fitico (mio-inositolo esafosfato)
Attilio Citterio
Definizione: Cofattori Enzimatici
• Co-fattori composti non-proteici che si legano a una proteina e sono richiesti per
l’attività biologica della proteina. I cofattori si possono considerare "molecole di supporto" che assistono nelle trasformazioni biochimiche.
I cofattori sono sia organici che inorganici. Si classificano in dipendenza della forza di legame con l’enzima, con quelli debolmente legati detti coenzimi e quelli saldamente legati detti gruppi prostetici. Un enzima inattivo, senza cofattore è detto un apoenzima, mentre l’enzima completo con il cofattore è detto oloenzima.
I coenzimi servono come trasportatori transienti di specifici gruppi funzionali
Derivano spesso da vitamine (nutrienti organici essenziali in piccole quantità nella dieta).
Substrato
Coenzima
Cofattore (composto non proteico)
attivatore
Apoenzima (porzione proteica)
inattivo
Oloenzima (enzima completo)
attivo
Attilio Citterio
Cofattori e Coenzimi
• Alcuni enzimi richiedono cofattori. Molto spesso ioni metallici.
• Coenzimi Molecole organiche Solubili Gruppi prostetici
• Apoenzimi vs. Oloenzimi
O- P
OH
O
O P
OH
O
O P
OH
O
OH OH
O
N
N
NH2
N
NO
Cys
Cys
Cys
Cys
S S
S S Fe Fe
S
S
[ 2Fe-2S ]
S S
S S
Cys
Cys
Cys
Cys
[ 4Fe-4S ]
S S
S S
Fe
Fe
Fe
Fe
Attilio Citterio
Alcuni Cofattori
Acido Lipoico
N
N
NH2
N+
S O P O P OH
OH
O
OH
O
Tiamina Difosfato
NH
O
NH
S
H HH(CH2)4-COOH
Biotina
N
OH
H O
OP
OOH
OH
Piridossal Fosfato
OPO
PO-O
O
OPOH
OHO
OH
N
NNH2
NNO
O-
ONH NH
SHOO
OH
Coenzima A (CoA)
Na+
Na+
NN
OH
OOPO-
OOPO-
OON
NH
ONH
O
NHOH
OH
OH
OH
N
N NH2
FAD
OPO-
O O-NNH
NH
NH
O
O
OH
OH
OH
FMN
N
N+ Fe N+
N
OHO
OH O
Eme
SS OH
OH
NH2NH
O
NHO
OHSH
OO
OH
Glutatione
NH
N
NN
NHO
NH2
NH
OOH
OOH
O
Acido Folico
N
NH2
O
O
OH OH
OPO
OH
OPO
OH
O
OR
O N
N
N
N
NH2
OH
R = H NADHR = -PO3H2 NADPH
Attilio Citterio
Alcuni Esempi di Coenzimi
Coenzima Esempi di gruppi chimici trasferiti
Precursori nella dieta in mammiferi
Biocitina CO2 Biotina Coenzima A Gruppi acili Acido pantotenico e altri
composti Coenzima B12 atomi H e gruppi alchilici Vitamina B12 Flavin adenina di- nucleotide
Elettroni Riboflavina (Vitamina B2)
Lipoato Elettroni e gruppi acili Non richiesto nella dieta NAD Ione idruro (H-) Acido nicotinico (niacina) Piridossal fosfato Gruppi amminici Piridossina (vitamina B6) Tetraidrofolato Gruppi a 1-carbonio Folato Tiamina pirofofato Aldeidi Tiamina (vitamina B1)
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Biotecnologia
• La manipolazione di geni è detta ingegneria genetica o tecnologia a DNA ricombinante.
• L’ingegneria genetica implica il prelievo di uno o più geni dalla porzione di DNA di un organismo e alternativamente: Trasferirli in un altro organismo Rimetterli nello stesso organismo originale in combinazioni
differenti
• Settori coinvolti biologia cellulare/molecolare microbiologia genetica anatomia e fisiologia biochimica ingegneria “computer science”
• Tipi di Biotecnologie • Ricombinante, proteine R , DNA R • Organismi Geneticamente Modificati
(GMO) • Anticorpi (anticorpi monoclonali) • Transgenica • Terapia genica, Immunoterapia
• Rischi e vantaggi del biotech
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Applicazioni delle Biotecnologie
• Piante alimentari e organismi resistenti ai virus • Diagnostici per rivelare malattie genetiche e malattie acquisite • Terapie che usano i geni per curare le malattie • Vaccini ricombinanti per prevenire le malattie
• Composti chimici semplici o complessi (per esempio proteine) via over-espressione genica.
• Ausilio nel risolvere
problemi ambientali.
evoluzione del mais
Attilio Citterio
Obiettivi della Biotecnologia
• Comprendere meglio i processi dell’eredità e dell’espressione genica • Fornire una migliore comprensione e trattamento di varie malattie,
particolarmente quelle dovute a disordini genetici • Generare ritorni economici, inclusi il miglioramento genetico di piante
e animali per l’agricoltura e la produzione efficiente di molecole biologiche utili Esempi: Riso ingegnerizzato per rafforzamento con Vitamina A Mais ingegnerizzato per resistere all’attacco di funghi Piante ingegnerizzate per resistere alla siccità
Attilio Citterio
Sviluppo della Biotecnologia
• Biotecnologia Antica - storia connessa a cibo-casa; Include l’addomesticazione Le popolazioni paleolitiche iniziano a stanziarsi e sviluppare società
agricole circa 10,000 anni fa (siti con colture in Asia, Europa e America) I primi coltivatori in medio oriente coltivavano grano, orzo e anche segale 7,000 anni fa, dei pastori si spostavano nel Sahara con pecore, capre,
bestiame e cercavano e usavano pietre nella preparazione del cibo I primi agricoltori arrivarono in Egitto 6,000 anni fa con bestiame, pecore,
capre e sementi quali orzo, farro e ceci Cibi fermentati - 1500 BC (lieviti – succhi di frutta, vino, birra, pane, alcool;
gli egizi usavano il lievito 1500 BC. Il lievito da birra ind. risale al 1915-20)
• Biotecnologia Classica - costruita sull’antica biotecnologia; produzione di cibi e medicina promossa da Fermentazioni
• Biotecnologia Moderna - manipola le informazioni genetiche in organismi; Ingegneria Genetica
Attilio Citterio
Fermentazione
• Processo microbico in cui avvengono trasformazioni di composti organici controllate enzimaticamente
• La fermentazione è stata praticata per anni e ha prodotto cibi quali il pane, il vino e la birra
• 4000 - 9000 B.C. – La fermentazione del latte produce lo Yogurt • 5000-9000 B.C. – Elaborazione del latte in Cina a produrre formaggio • La pasta fermentata fu scoperta per caso quando dell’impasto non fu
cotto immediatamente
• La moderna fabbricazione dei formaggi implica: inoculazione del latte con batteri produttori di acido lattico aggiunta di enzimi quali il caglio per precipitare la caseina riscaldamento separazione del siero dalla cagliata essicazione della cagliata salatura pressatura della cagliata maturazione
Attilio Citterio
Bevande Fermentate
• La produzione della birra inizia già prima del 6000-5000 B.C.
• Gli egizi ~5000 B.C facevano il vino dall’uva
• Malto d’orzo – Lievito di birra trovato in antiche urne di terracotta
• Monasteri - maggiori produttori di birra
• 1680 - Leeuwenhoek osserva il lievito al microscopio
• Tra il 1866 e il 1876 - Pasteur stabilisce che I lieviti e altri microbi sono responsabili della fermentazione
Attilio Citterio
Biotech Classica
• Descrive lo sviluppo che la fermentazione ha assunto dai tempi antiche ai giorni nostri
• Alta Fermentazione – sviluppata per prima, il lievito sta sopra • 1833 - Fermentazione sommersa (o bassa) – il lievito sta sul fondo • 1886 – Apparecchiature per fermentazioni realizzate da E.C. Hansen
e ancora oggi usate • I Guerra Mondiale – Fermentazione di solventi organici per esplosivi
(glicerina) • II Guerra Mondiale – bioreattori o fermentatori:
Antibiotici Colesterolo – Steroidi Amminoacidi Grandi quantità di aceto si producono con l’Acetobacter su substrati di trucioli di legno
Succo di frutta fermentato
grata di legno
ingresso aria per ossidazione serpentine di raffreddamento
uscita del prodotto
camera di raccolta per l'aceto finito
trucioli di legno (coperti con uno strato di Acetbacter)
scarico
Attilio Citterio
Biotech Classica
• Negli anni 1950, il colesterolo fu convertito in cortisone e ormoni sessuali per idrossilazione microbica (inserimento di un gruppo -OH )
• Dalla metà degli anni 1950, si producono amminoacidi e altri metaboliti primari (necessari alla crescita cellulare), ma anche enzimi e vitamine
• Dagli anni 1960, si cominciò a usare i microbi come fonti di proteine e altre molecole dette metaboliti secondari (non necessari alla crescita cellulare)
Oggi per questa via si producono molti prodotti: Composti farmaceutici quali gli antibiotici Amminoacidi Molti composti chimici, ormoni e pigmenti Enzimi con un’ampia varietà di usi Biomassa per consumo commerciale e animale (quali proteine)
Attilio Citterio
La Vecchia Biotech Incontra la Nuova
• La fermentazione e l’ingegneria genetica sono state usate nella produzione di cibi fin dalli anni 1980
• Organismi geneticamente ingegnerizzati sono coltivati in fermentatori e sono modificati per produrre grandi quantità di enzimi utili, che vengono estratti e purificati
• Si usano enzimi nella produzione del latte, formaggio, birra, vino, dolciumi, vitamine e supplementi minerali
• L’ingegneria genetica è stata usata per aumentare la quantità e purezza di enzimi, per migliorare la funzione di un enzima e per fornire un metodo più conveniente per produrre enzimi. Chimosina, usata per produrre formaggio, è una delle prime prodotte
1590 - Zacharias Janssen - Prime due lenti per microscopio (30x) 1665 - Robert Hooke - “Cellulae” (Piccole Camere) del sughero 1676 - Anthony van Leeuwenhoek – (200x) «animalculi» (in stagni) 1684 – protozoi e funghi
Attilio Citterio
Basi della Moderna Biotecnologia
• 1838, Matthias Schleiden, stabilisce che tutte i tessuti delle piante sono composti da cellule e che ogni pianta deriva da una singola cellula
• 1839, Theodor Schwann, arrivò a una conclusione simile per gli animali
• 1858, Rudolf Virchow, concluse che tutte le cellule derivano da cellule e la cellula è l’unità base della vita
• Prima della teoria cellulare si credeva nel vitalismo: l’organismo intero, non sue singole parti, possedevano la vita
• Dall’inizio degli anni 1880, i microscopi, le tecnologie di conservazione dei tessuti e le colorazioni permisero agli scienziati di capire meglio la struttura e le funzioni delle cellule
• 1928 - Fred Griffith effettuò esperimenti usando lo Streptococcus pneumonia Due ceppi: Liscio (S) - Virulento (gelatinoso) Ruvido (R) - Meno Virulento Iniettando l’R e l’S (pastorizzato) – il gatto moriva e conteneva batteri S Non sicuro di cosa cambiava R in S, egli indicò ciò col termine “Principio di
Trasformazione”
Attilio Citterio
Principio di Trasformazione
estratti Batterio Liscio capsulato infettivo
Cellule infettate uccise dal calore; fatto un estratto
Gli estratti trattati con batteri Infettivi, rugosi non capsulato
Trattato con desossiribonucleasi (spezza il DNA)
Trattato con ribonucleasi (spezza l’RNA)
Trattato con proteinasi (spezza le proteine)
Nessuna cellula trasformata nella forma capsulata, infettiva
Alcune cellule trasformate nella forma capsulata, infettiva
Alcune cellule trasformate nella forma capsulata, infettiva
Attilio Citterio
1952 – Alfred Hershey e Martha Chase
• Usano il batteriofago T2, un virus che infetta i batteri • Radio marcano il batteriofago con S35 (Proteina) e P32 (DNA) • Infettano le cellule batteriche e centrifugano per rimuovere le
particelle del fago • L’analisi mostrò del DNA marcato all’interno dei batteri e che questo
era materiale genetico
infezione cellula batterica
marcatura interna alla cellula
la marcatura rimane se il virus
viene rimosso
particelle di virus con proteina marcata
particelle di virus con DNA marcato
cellula batterica infezione marcatura fuori
dalla cellula la marcatura è
rimossa se il virus viene rimosso
Attilio Citterio
1953 Watson e Crick
• Determinazione della struttura del DNA
• Rosalind Franklin e Maurice Wilkins forniscono i dati di diffrazione ai raggi X
• Erwin Chargaff determina i rapporti delle basi azotate nel DNA
• 1953 - modello della replicazione del DNA
• Le basi del DNA sono fatte di purina e pirimidina
• A accoppia con T e G accoppia con C
• 1962 - Premio Nobel
Attilio Citterio
I Primi Esperimenti di DNA Ricombinante e la Tecnica Elettroforetica
• Nel 1971 degli scienziati manipolano il DNA e lo inseriscono in batteri
• Nel 1972 degli scienziati legano due molecole di DNA da diverse fonti usando l’endonucleasi EcoRI (per tagliare) e la DNA ligasi (per legare)
• H. Boyer successivamente nei Laboratori di Cold Spring Harbor scoprì una nuova tecnica detta gel elettroforesi per separare i frammenti di DNA Si applica una corrente e le
molecole cariche negative del DNA migrano verso il polo positivo e si separano in funzione della loro dimensione
Soluzione tampone Gel
Attilio Citterio
La Rivoluzione Biotech: Individuazione del Codice
• Nel 1961, Nirenberg e Mattei fecero il primo tentativo di individuare il codice genetico, usando l’RNA messaggero (m-RNA) sintetico.
• Nirenberg e Leder, usando le sequenze di RNA di codoni specifici, svilupparono un saggio di legame che consentì loro di determinare quale tripletta di codoni esprime un amminoacido.
Prima Base
Seconda Base Terza Base
U C A G
U
fenilalanina serina tirosina cisteina U
fenilalanina serina tirosina cisteina C
leucina serina stop stop A
leucina serina stop triptofano G
C
leucina prolina istidina arginina U
leucina prolina istidina arginina C
leucina prolina istidina arginina A
leucina prolina istidina arginina G
A
isoleucina treonina asparagine serina U
isoleucina treonina asparagina serina C
isoleucina treonina asparagina arginina A
(inizio) metionina treonina asparagina arginina G
G
valina alanina aspartato glicina U
valina alanina aspartato glicina C
valina alanina aspartato glicina A
valina alanina aspartato glicina G
Attilio Citterio
Il Codice Genetico Standard
translation start codon
translation stop codon
hydrophobic amino acids
hydrophilic non charged amino acids
negatively charged amino acids
positively charged amino acids
cysteine
C G
G
C
UUU UUC UUA UUG
Phe Phe Leu Leu
F F
L L
CUU CUC CUA CUG
Leu Leu Leu Leu
L L
L L
CCU CCC CCA CCG
Pro Pro Pro Pro
P P
P P
UCU UCC UCA UCG
Ser Ser Ser Ser
S S
S S
UAU UAC UAA UAG
Tyr Tyr Stop Stop
Y Y
CAU CAC CAA CAG
His His Gln Gln
H H
Q Q
ACU ACC ACA ACG
Thr Thr Thr Thr
H H
Q Q
AUU AUC AUA
Ile Ile Ile
I I
I AUG Met M
GUU GUC GUA GUG
Val Val Val Val
V V
V V
GCU GCC GCA GCG
Ala Ala Ala Ala
A A
A A
GAU GAC GAA GAG
Asp Asp Glu Glu
D D
E E
GGU GGC GGA GGG
Gly Gly Gly Gly
G G
G G
AAU AAC AAA AAG
Asn Asn Lys Lys
N N
K K
AGU AGC AGA AGG
Ser Ser Arg Arg
S S
R R
G A C U G A C U G A C U
G A C U
CGU CGC CGA CGG
Arg Arg Arg Arg
R R
R R
UGU UGC
UAG
Cys Cys
Stop
C C
UGG Trp W UGA Stop U
U A
A
Attilio Citterio
Il primo Clonaggio del DNA e ……
• Boyer, Helling Cohen, e Chang legarono dei frammenti di DNA in un vettore, e trasformarono una cellula dell’E. coli
• Cohen e Chang trovarono che era possibile mettere del DNA batterico in una specie batterica non correlata
• Nel 1980 Boyer e Cohen ottennero un brevetto sui metodi fondamentali di clonaggio e trasformazione del DNA. La tecnologia del DNA ricombinante aprì
dibattiti tra gli scienziati, teologi, media, avvocati e altri
Negli anni 1980 si concluse che la tecnologia non ha causato alcun disastro e non porta minacce alla salute umana e all’ambiente.
Nel 1997 si clona la pecora – “Dolly” a Edimburgo
Taglio con EcoRI
GAATTC CTTAAG
GAATTC CTTAAG
Taglio con EcoRI
AATTC G
G CTTAA
Congiunzione terminali del vettore e DNA estraneo
Chiusura della lacuna nel plasmide chimerico con DNA Ligasi
C G
DNA ligasi C G
Attilio Citterio
Sviluppo Industriale del Biotech
Si costituiscono le prime compagnie biotech :
1976 - Genentech 1978 - Biogen 1980 - Amgen 1981 - Immunex 1981 - Chiron 1981 – Genzyme
I 160 farmaci e vaccini biotech approvati hanno aiutato più di 325 milioni di persone in tutto il mondo
Attualmente sono in studi clinici più di 350 farmaci e vaccini biotech per combattere oltre 200 malattie
La Biotecnologia è responsabile di centinaia di test diagnostici, inclusi i test su HIV e i test di gravidanza, mappatura del DNA …
Attilio Citterio
I Progressi Continuano
• Però, si sono addensate preoccupazioni sia sulle applicazioni che sulle implicazioni etiche : Esperimenti di terapia genica hanno sollevato la questione dell’eugenetica
(selezione umana artificiale) come pure dell’analisi di malattie attualmente senza una cura Sono stati sviluppati cloni animali, e ciò ha accresciuto la paura che si
possa passare alla clonazione umana In agricoltura, sussistono preoccupazioni sul contenimento genico e la
creazione di “super infestanti” (piante resistenti a erbicidi e/o pesticidi) Oggi, le paure sono focalizzate sui cibi geneticamente ingegnerizzati in
commercio e ha portato alla rapida crescita dell’industria dei cibi organici.
• Molte malattie geneticamente modificate, insetti, e piante resistenti agli erbicidi sono in attesa di approvazione alla commercializzazione
• Si sono identificati i geni coinvolti in alcune malattie • Si sono sviluppati nuovi trattamenti medici • Si è anche sviluppata la “fitomedicina” molecolare, in cui si usano piante per
produrre farmaci (biofarmaci).
Attilio Citterio
Dimensioni in Biotecnologia
Nanometri Micrometri Millimetri Metri
Piccole molecole
Atomi
Aggregazioni Macro
molecole Cellule Organismi pluricellulari
Legame C-C
Glucosio
Emoglobina
Ribosoma
Mitocondri
Batteri Globuli rossi
C. elegans Uomo moderno
Bumblebee
10-10 m 10-9 m 10-8 m 10-7 m 10-6 m 10-5 m 10-4 m 10-3 m 10-2 m 10-1 m 100 m 1 nm 10 nm 100 nm 1 μm 10 μm 100 μm 1 mm 10 mm 100 mm 1 m
Attilio Citterio
Virus
• proteine implicate nella sintesi del DNA, RNA e di proteine
• regolazione genetica • cancro e controllo della
proliferazione cellulare • trasporto di proteine e organelli
all’interno delle cellule • infezione e immunità • possibili approcci alla terapia
genica
Attilio Citterio
Batteri
• proteine implicate nella sintesi di DNA, RNA e di proteine, metabolismo
• regolazione genetica • bersagli per nuovi antibiotici • ciclo cellulare • comunicazione cellulare
Attilio Citterio
Lieviti
Saccharomyces cerevisiae
• Controllo del ciclo cellulare e della divisione cellulare
• secrezione di proteine e biogenesi di membrane
• funzione del citoscheletro • differenziazione cellulare • invecchiamento • regolazione genica e struttura
dei cromosomi
Attilio Citterio
Vermi
Caenorhabditis elegans • sviluppo del piano corpale • linee cellulari • formazione e funzione del
sistema nervoso • controllo della morte cellulare
programmata • proliferazione cellulare e geni
del cancro • invecchiamento • comportamento • regolazione genica e struttura
dei cromosomi
Attilio Citterio
Moscerino della Frutta
Drosophila melanogaster • Sviluppo del corpo • generazione di linee cellulari
differenziate • formazione del sistema nervoso,
cuore e muscolatura • morte cellulare programmata • controllo genetico del
comportamento • geni del cancro e controllo della
proliferazione cellulare • controllo della polarizzazione
cellulare • effetti di farmaci, alcool e
pesticidi
Attilio Citterio
Zebrafish
• sviluppo del tessuto corporeo vertebrato
• formazione e funzione del cervello e del sistema nervoso
• difetti di nascita • cancro
Attilio Citterio
Topo
• sviluppo dei tessuti corporei • funzione del sistema
immunitario nei mammiferi • formazione e funzione del
cervello e del sistema nervoso • modelli del cancro ed altre
malattie dell’uomo • regolazione genica e
ereditarietà • malattie infettive
Attilio Citterio
Geni Omeotici
• L’ordine dei geni omeotici è lo stesso
• L’ordine dei geni corrisponde ad analoghe regioni
del corpo
Attilio Citterio
Piante
• Sviluppo e differenziazione dei tessuti
• genetica della biologia cellulare
• applicazioni in agricoltura • fisiologia • regolazione genica • immunità • malattie contagiose
Attilio Citterio
Specifiche del Genoma
Hepatite B virus 1 4 3215
E. coli batterio 1 4,394 4,639,221
S. cerevisiae lievito 16 6,183 12,000,000
D. melanogaster moscerino 4 14,000 140,000,000
C. elegans nematodo 6 19,000 90,000,000
A. thaliana pianta 5 25,000 125,000,000
M. musculus topo 20 35,000 3,000,000,000
H. sapiens uomo 23 35,000 3,000,000,000
Organismo Tipo # Cromo- # Geni Dimensione Genoma somi (bp)
Attilio Citterio
Specifiche del Genoma
Organismo Uomo Arabidopsis (pianta) C. elegans (verme) Geni ~32,000 25,706 18,266
Organismo Drosophila (moscerino) Saccaromices (lievito) Geni 13,338 ~6000
Metabolismo
Replicazione/modifica DNA
Trascrizione/traslazione
Comunicazione intracellulare
Comunicazione intercellulare
Organiz./degradazione proteine
Trasporto
Proteine multifunzione
Citoscheletro/struttura
Difesa e immunità
Funzioni miste
Sconosciuto
Attilio Citterio
Una Tipica Modifica Genetica
Batterio
Cromosoma batterico
Plasmide
DNA ricombinante (plasmide)
Batterio modificato
Il gene è inserito nel plasmide.
Il plasmide è acquisito da una cellula come un batterio.
Le cellule con il gene d'interesse sono clonate.
O L'obiettivo è di fare copie del gene.
L'obiettivo è di fare prodotti proteici del gene.
Gene di interesse
Si isola un vettore, quale un plasmide.
Si rompe in frammenti il DNA con un enzima.
DNA contenente il gene di interesse.
Attilio Citterio
Tipi di Sistemi d’Espressione
Batteri Insetti Lieviti Linee di cellule di mammiferi
Transgenica Animale Pianta
Attilio Citterio
Batteri
Vantaggi 1. Genetica semplice e ben
caratterizzata
2. Rapida crescita cellulare (raddoppia in 20-30 minuti)
3. Facili da crescere in mezzi di cultura non costosi
4. Fermentazione facile nell'ampliamento di scala
5. Alti livelli di espressione
Svantaggi 1. Mancanza di glicosilazione e
altre modifiche post-traslazionali
2. La rottura delle cellule provoca problemi più complessi di purificazione
3. Formazione di corpi di inclusione; è necessario solubilizzare e ricostruire
4. Presenza di endotossine e proteine delle cellule ospiti
Attilio Citterio
Lieviti (e.g. S. cerevisiae, P. pastoris)
Vantaggi
Genetica ben conosciuta
Rapida crescita cellulare (raddoppia in 90 min)
Mezzi culturali poco costosi
Fornisce e facilita la formazione di legami disolfuro
Relativamente pochi problemi di purificazione
Svantaggi
Le proteine possono essere glicosilate e organizzate in modo non corretto
La over-glicosilazione è un rischio
Altre modifiche post-traslazionali sono limitate
Generalmente livelli di espressione inferiori a quelli dei sistemi batterici
Attilio Citterio
Cellule di Insetti (Baculovirus vector)
Vantaggi Disponibili sistemi di
secrezione
Attivate le modifiche post- traslazionali richieste per le proteine eucariotiche superiori
Alta espressione
I vettori Baculovirus non sono patogeni per l’uomo
Svantaggi Lenta crescita cellulare
Mezzi di cultura costosi
Possibilità di modifiche post-traslazionali non identiche a quelle dei sistemi superiori
Sensibile a forze di taglio
Attilio Citterio
Cellule di Mammiferi
Vantaggi
Glicosilazione di tipo complesso
Altre modifiche post-traslazionali
Disponibili sistemi secretori
Svantaggi
Lenta crescita cellulare (raddoppia in 18-24 ore)
Bassa densità cellulare finale
Mezzi di cultura costosi
Sensibile a forze di taglio
Produzione di vaccini, enzimi, ormoni, MAbs, proteine native o modificate, proteine di fusione
CHO
NSO
Cellule umane – preoccupazione: potenziali trasportatori di malattie
Attilio Citterio
Differenti Tipi di Cellule
Procariote Nessun vero nucleo Nessun organello legato
alla membrana Piccole dimensioni Cromosoma circolare Cellule singole
Eucariote Nucleo con membrana Organelli intracellulari Può contenere
cromosomi multipli lineari
Generalmente cellule più grosse
Si possono organizzare in organismi multicellulari
Attilio Citterio
Cellule Procariote
E. Coli Ribosoma
Proteine
mRNA tRNA DNA
Lipopolisaccaride
Fosfolipide Lipoproteina Peptidoglicano
Attilio Citterio
Cellule Eucariote
Membrana nucleare
Nucleo
Nucleolo
Cromatina
Centrioli
Apparato di Golgi
Vacuolo
Ribosomi liberi
endoplasmatico Reticolo
Membrana cellulare
Mitocondrio
Lisosoma
endoplasmatico Reticolo ruvido
Reticolo liscio endoplasmatico
Attilio Citterio
Metabolismo Cellulare
Attilio Citterio
Metabolismo Cellulare (Ciclo Acido Citrico, CTA)
È utile pensare all’ossidazione metabolica dei substrati come a un processo a 3 stadi:
il carbonio è incorporato nell’acetil-CoA
il carbonio viene quindi ossidato a CO2, agenti ridotti di trasferimento elettronico e una piccola quantità di ATP
gli agenti ridotti di trasferimento elettronico sono riossidati fornendo energia per la sintesi di ulteriore ATP (fosforilazione ossidativa)
L’attività del ciclo TCA è favorita da bassi rapporti NADH/NAD+
Attilio Citterio
Promesse del Biotech in Campo Medico
DNA proteine
Alcuni farmaci sono così complessi che si possono sintetizzare solo in sistemi viventi.
Attilio Citterio
Promesse del Biotech in Campo Vegetale
• Riso “giallo”
• Rilevazione di Mine
Riso giallo con il riso bianco standard.
A livello mondiale, 7% dei bambini presentano deficienza da vitamina A; molti vivono in regioni in cui il riso è un alimento della dieta.
Mina
• Proteina transgenica brevettata, inserita in piante
• In presenza di metalli provenienti dalla mina:
• La pianta vira dal verde al rosso
• Tecnologia sviluppata da Aresa Biodetection
Attilio Citterio
Prodotti della Microbiologia
Cellule
Cellule lievito
Bio-conversione
Prodotto (per esempio, Bioconversione steroidi)
Cellule
Substrato
Composti chimici (per es. acido citrico)
Prodotti da cellule
Enzimi (per esempio, glucosio isomerasi)
Antibiotici (per esempio, penicillina)
Alcol (etanolo)
Additivi per cibi (per esempio, amminoacidi)
Attilio Citterio
Prodotti Industriali e i Microorganismi che li Producono
• Le proprietà d un utile microbo industriale includono: – Produce spore o si può facilmente inoculare – Cresce rapidamente su ampia scala in mezzi a basso costo – Produce rapidamente il prodotto desiderato – Non deve essere patogeno – Soggetto a manipolazione genetica
• I prodotti microbici di interesse industriale includono: – Cellule microbiche – Enzimi – Antibiotici, steroidi, alcaloidi – Additivi per cibi – Composti chimici di base
• Composti a basso costo prodotti in bulk • Includono etanolo, acido citrico, acid lattico e vari altri
Attilio Citterio
Produzione e Scala
• Il Fermentatore è dove avviene il processo microbiologico
• Qualsiasi reazione su larga scala si indica come fermentazione
– Per lo più sono processi aerobici • Dimensioni dei fermentatori: 5 -
500,000 litri • Fermentatori aerobici / anaerobici • I fermentatori su grande scala sono
quasi sempre in acciaio - Giranti e spruzzatori
alimentano l'O2
Attilio Citterio
Produzione dell'Aceto
1/2 O2 H2O
Citocromo o
Protone forza motrice
ATP 2 H 2 H
UQ UQH2 UQH2 UQ
CH3CH2OH Etanolo
CH3CHO Acetaldeide
CH3COOH Acido acetico Alcol
deidrogenasi Aldeide
deidrogenasi
Attilio Citterio
Produzione dell'Aceto
Sfiato
Tubi di ricircolo
Pompa
Grata di legno
Camera di raccolta
Materiale di partenza
Ingresso aria ossidazione
Serpentine di Raffreddamento
Prelievo prodotto
Trucioli di legno
Attilio Citterio
Innovazione nei Sistemi di Produzione di Enzimi
Piattaforme
SVILUPPO DI PROCESSO
Prodotto Valutazione su 10 L
Ampliamento di scala
> 100.000L
Molecola di interesse
Aspergillus
Trichoderma
B. substilis
Streptomyces
B. licheniformis
test iniziali: Definite piattaforme per una rapida scelta di sistemi ospiti ottimali
Mezzi per analisi dei ceppi:
DNA arrays Sequenza Genoma Secrezione Stabilità prodotto
Miglioramento Ceppi:
siRNA HTS FACS Modifiche genetiche
Attilio Citterio
Antibiotici
Richiedono un preciso controllo dei nutrienti
Si può modificare il prodotto finale per dare una varietà di derivati (per es. penicilline semisintetiche)
Lattosio Penicillina
Cellule
Ammoniaca
Carica azoto
Carica glucosio
Tempo di fermentazione (h)
Bio
mas
sa (g
/L),
carb
oidr
ato,
Am
mon
iaca
, pen
icill
ina
(g/L
×10)
Attilio Citterio
Via Biosintetica della Penicillina
Acido L-Amminoadipico L-Cisteina L-Valina
Acil-trasferasi Cefalosporine
Penicillina G
IPN sintasi
iso-penicillina N
ACV sintasi
ACV-Tripeptide
NHO
OHO
SHNH
O
OH
O
NH2
N
S
O
OH
H
H
O
NH
O
OH
O
NH2
H 1 23
456
7
N
H
NO
S
H O
OH
HH
O CH3
CH31 2
3456
7
OH
O
NH2
OH
O
SH
NH2
O OH
NH2
O
OH
Attilio Citterio
Produzione Industriale delle Penicilline
Fermentazione della Penicillina Aggiunta
precursore I
Aggiunta precursore III
Trattamento chimico o enzimatico della penicillina G
Aggiunta catene laterali chimicamente
Penicillina III biosintetica
Penicillina II biosintetica
Penicillina I biosintetica
Penicilline naturali (per esempio, penicillina G) Penicilline semisintetiche
(per esempio, ampicillina, amoxicillina, meticillina)
Acido 6-amminopenicillanico
Aggiunta precursore II
1 23
4567
R N
H
NO
S
H O
OH
HH
O CH3
CH3
Attilio Citterio
Meccanismi di Regolazione
Regola l'attività enzimatica
No prodotto
Enzima B
Regola la sintesi dell'enzima
Alla traslazione Alla trascrizione
no mRNA
No enzima
Dogma Centrale
Substrato Prodotto
Enzima A
Traslazione
Trascrizione
Attilio Citterio
Modificazione dell'Espressione Genica
Consente la sovrapproduzione di un prodotto, produzione di più di un prodotto da parte dello stesso organismo, o la sintesi di prodotti modificati
Architettura del percorso analisi, progettazione e modifica del percorso biochimico
per migliorare l'efficienza del processo Ingegnerizzazione del percorso metabolica Alterazione intenzionale del percorso metabolico per
inattivazione di specifici geni Ingegnerizzazione del controllo metabolico alterazione dei meccanismi di controllo di specifici geni.
Attilio Citterio
Sistemi Esperti per le Biotecnologie
Flusso Informazioni
Controlli in linea
Attilio Citterio
Biotecnologia: Struttura di Produzione di un Impianto Pilota
Personale di bioprocesso Personale dei Servizi Centrali Materie prime Intermedi e prodotti in bulk
Controllate, non classificate
Aree classificate (stanze sterili)
Corridoi di uscita (“sporchi”)
Spazi per servizi (“grigi”)
Biotrasformazioni (trasformazione di un composto chimico in un altro mediante l'uso di un biocatalizzatore)
Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione Corso 096125 (095857)
Introduction to Green and Sustainable Chemistry
Attilio Citterio
Biotrasformazioni e Bioprocessi
materie prime
organiche
Bio-trasformazione
Preparazione Biocatalizzatore
Isolamento
Isolamento
prodotto Sottoprodotti scarti
mutagenesi
bioingegneria
“il processo con cui un materiale è convertito in un altro usando agenti biologici (cioè, organismi viventi, microbi o enzimi). Esso combina chimica, ingegneria, microbiologia e biochimica”
Attilio Citterio
Enzimi: Fonti e Usi
A. I microrganismi si usano per produrre i catalizzatori naturali come gli enzimi B. Gli enzimi per uso industriale si purificano dai microorganismi C. L'enzima seleziona uno specifico substrato al suo sito attivo D. L'enzima catalizza la reazione chimica con cui si formano i prodotti E. Quindi si separano i prodotti dalla superficie dell'enzima
Attilio Citterio
Efficacia Catalitica di Alcuni Enzimi
Enzima Velocità di reazione non enzimatica (s-1)
Velocità di reazione enzimatica (s-1)
Aumento di velocità
Anidrasi Carbonica 1.3 × 10-1 1 × 106 7.7 × 106
Chorismato mutasi 2.6 × 10-5 50 1.9 × 106
Trioso fosfato isomerasi
4.3 × 10-6 4300 1.0 × 109
Carbossipeptidasi 3.0 × 10-9 578 1.9 × 1011
AMP nucleosidasi 1.0 × 10-11 60 6.0 × 1012
Stafilococco nucleasi 1.7 × 10-13 93 5.6 × 1014
Fonte: Radzicka, A.; Wolenden R. Science, 267, 91 (1995).
Attilio Citterio
Purificazione e Funzioni degli Enzimi
Purificazione: • Certamente una buona
opzione per vari enzimi • Processi costosi. • Ancora non pratici se sono
richiesti dei cofattori (p.es. reazioni redox)
Funzione: • Riconoscimento dei substrati • Catalisi (abbassamento di Eatt
o Satt) • Selettività
Specificità di substrato:
• Complementarietà geometrica • Complementarietà elettronica • Adattamento Indotto
Attilio Citterio
Stereo-specificità
N+
H NH2
O
RNAD+
+CH3CD2OH
YADH
N
H NH2
O
R
D+
CH3CD=O
+ H+
NADD
NAD++YADH
N
H NH2
O
R
D
+ CH3CD=O+ H+
NADD
H C D
OH
CH3
NAD++YADH
N
H NH2
O
R
H
+ CH3CD=O+ H+
NADH
D C H
OH
CH3
Attilio Citterio
Da dove Ottenere gli Enzimi: Cosa dire sull’uso di animali superiori?
• La società in generale è meno spaventata dalle forme macroscopiche della vita che dai membri del mondo microscopico
• L’uomo ha usato animali da molto tempo per biotrasformazioni
• Molte problematiche etiche e ambientali associate
• Spesso costoso.
Attilio Citterio
… e sull’uso delle Piante?
• Grande diversità e capacità metabolica. • Minori problemi etici e ambientali associati. • Probabilmente non costosi • Molti vecchi e nuovi lavori si riferiscono a cellule di piante
in sospensione • Del tutto simile all’uso di microorganismi ma in pratica più
complicato Crescita lenta Frequente contaminazione Si richiedono attrezzature speciali Incredibilmente costoso.
Attilio Citterio
Parti di Piante come Reagenti Chimici
I problemi si possono superare se si usa la “pianta stessa” (o una parte di essa) al posto di lavorare con una cultura cellulare:
Le cellule stanno già crescendo Non sono richieste attrezzature speciali Nessuna contaminazione I cofattori sono già presenti Pochi problemi ambientali Costi molto contenuti.
Attilio Citterio
Classificazione degli Enzimi in Base al Tipo di Reazione
CLASSI DI ENZIMI Tipo di REAZIONE CATALIZZATA ____________________________________________________ 1. Ossidoriduttasi Reazioni di ossido-riduzione
2. Transferasi Trasferimento di gruppi funzionali
3. Idrolasi Reazioni idrolitiche (H2O) o solvolitiche
4. Liasi Eliminazione di gruppi (per es. formazione di doppi legami) 5. Isomerasi Reazioni di isomerizzazione
6. Ligasi Formazione di legami accoppiata a idrolisi del trifosfato ATP ____________________________________________________
Attilio Citterio
Enzimi in Biotecnologia
Enzimi nella produzione di alimenti e bevande Industria casearia Industria della birra Industria del vino e dei succhi Industria dell’alcool Industria delle proteine Industria della carne Industria da forno Industria degli oli e grassi
Enzimi come catalizzatori industriali
Industria della lavorazione dell’amido Industria degli antibiotici Industria della Chimica Fine
Attilio Citterio
Enzimi in Biotecnologia
Enzimi come prodotti finali Industria dei detergenti Industria degli agenti di pulizia Industria farmaceutica Industria dell’alimentazione animale Applicazioni analitiche
Enzimi come ausiliari di processo Industria Tessile Industria del cuoio Industria della carta Industria dello zucchero Industria del caffè
Attilio Citterio
Fattori Importanti nell’Uso di Enzimi
• Possibili reazioni non realizzabili mediante la chimica tradizionale
• Specificità di reazione inclusa la specificità di substrato, la specificità di posizionale e la stereo specificità
• Consente condizioni di processo più blande, quali temperatura, pH, sterilità, ecc.
• Riduce il numero di fasi di processo richieste • Elimina la necessità di usare solventi organici nelle lavorazioni • L’immobilizzazione dell’enzima ne permette il riuso o l’uso in
continuo • L’uso di enzimi in combinazione con altri stadi chimici • Ingegneria genetica per migliorare gli enzimi
Attilio Citterio
Metodi di Immobilizzazione di Enzimi
E E E
E
E E
E
E
E
E
E
E E
E
E E E
E E
E
E
E
E E E
E+ E+
- - - -
Metodi Chimici Metodi Fisici
Legami covalenti Reticolazione Intramolecolare (reticolazione intersubunità)
Reticolazione Intramolecolare
Copolimerizzazione di enzimi modificati con monomero insaturo in gel tridimensionali
Intrappolamento in gel polimerici
Adsorbimento Intrappolamento in fibre
Microincapsulazione
Intrappolamento in film polimerici e membrane semipermeabili
Adsorbimento elettrostatico
Intrappolamento in liposomi
Intrappolamento in fibre cave
Attilio Citterio
Mercato Industriale degli Enzimi
Vendite annuali: 1.6 miliardi di dollari
Lavorazione cibi ed amido: 45% Detergenti: 34% Tessili: 11% Cuoio: 3% Carta: 1.2% Prodotti di reazioni enzimatiche
Sciroppi ad alto tenore di fruttosio 1 miliardo di $ Aspartame: 850 milioni di $ Acrilammide 300 milioni di $
Attilio Citterio
Nuovi Enzimi e Reazioni Enzimatiche
CPO subtilisina fitasi
laccasi CaLB HNlasi
Attilio Citterio
Idrolasi: Produzione di Glucosio da Amido
_______________________________________________________________ Liquefazione Saccarificazione DE Glucosio _______________________________________________________________ Acido Acido 92 85 Acido Glucoamilasi 95 91 Acido/α-amilasi Glucoamilasi 96 92 α-Amilasi/cottura ad alta Glucoamilasi 97 93 pressione/ α-amilasi α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi 97 94 α-Amilasi (termostabile) Glucoamilasi 97-98.5 95-97.5 _______________________________________________________________
Attilio Citterio
Produzione di Concentrati di Fruttosio da Amido
Melassa di Glucosio DE 95-96
Impasto di amido (30-35% DS, pH 6.0-6.5, Ca2+ 50 ppm) Liquefazione α-Amilasi termostabile Gelatinizzazione (105°C, 5 min) Destrinizzazione (95°C, 2h)
Amido Liquefatto DE 10-15 Saccarificazione Glucoamilasi (60°C, pH 4.0-4.5, 24-72 h)
Isomerizzazione Glucosio isomerasi (pH 7.5-8.0, 55-60°C, 5 mM Mg2+)
Melassa ad alto contenuto di Fruttosio (42%)
Glucosio isomerasi
OH
OHH
OHH
OH
HOH
HOH
OH
HO
H
OH
H
OH
OH
H
Attilio Citterio
Vantaggi nell’Uso della Pullulanasi nel Processo di Saccarificazione dell’Amido
• Aumento delle rese di glucosio (~ 2%) con glucoamilasi
• Aumento delle rese di maltosio (~ 20-25%) con β-amilasi
• Riduzione del tempo di saccarificazione (a 48 h)
• Aumento della concentrazione del substrato (a 40%, DS)
• Riduzione nell’uso di glucoamilasi (fino al 50%)
Attilio Citterio
Amminolisi di Esteri
Steverink(1995), Hacking (1999), Wegman(2001)
R
O
Nu
Ser
R O
O NuH
Nu = OH, OR, NH2 , RNH, OOH, ecc.
Amminolisi Enzimatica
NH2
O
lipasi, 40oC
NH3/t-BuOH OEt
O
R R
• sintesi verde di ammidi • Enantio-selettiva con esteri di amminoacidi
Processo BASF
NH2 Lipasi NH2
ee > 99% (S)
+
O O
O
NH O
O
ee > 99% (R)
NaOH
glicol-acqua (2:1), 150oC
ee > 99% (S)
NH2
> 3000 t/anno
Attilio Citterio
Risoluzione Facilitata in Ingresso e Uscita
P h
NH2 ArCH2COX
P h
NH2
+ P h
NHCOCH2Ar H2O
P h
NH2
ee > 99%
ee > 99% pen acilasi pH 10-11
pen acilasi pH 7
L.van Langen(2001), R.Madeira Lau(2003), H.Ismail(2007)
Risoluzione Cnetica Dinamica
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
0 20 40 60 80 100 120 time (h)
% y
ield
(am
ide)
Risoluzione cinetica
Risoluzione cinetica dinamica
H. Ismail (2007)
- Resa 88 % (4 giorni) - Prodotto ee 98 % .
NH2 O
O H N
O
NH2
CaLB, 50oC, 96h Nano
Pd
Attilio Citterio
Sintesi Enzimatica delle Penicilline: Acido 6-Amminopenicillanico
Penicillina: Scoperta da Fleming nel 1932 19% del mercato mondiale degli antibiotici. > Azione inibitoria sulla sintesi delle pareti cellulari di batteri Ampio spettro di attività antibatterica Bassa tossicità Straordinaria efficacia verso vari ceppi batterici. L’eccessivo uso ha portato allo sviluppo di patogeni resistenti
6-APA:
materia prima per la produzione di nuove penicilline semisintetiche (amoxycillina e ampicillina)
Minori effetti collaterali e diminuita tossicità Maggiore selettività verso i patogeni Più ampio spettro antimicrobico Migliori proprietà farmacologiche
N
S
O
OH
H
O
NH2
Attilio Citterio
Deacilazione Chimica ed Enzimatica di Penicilline a 6-APA
Penicillina V o G (6-APA)
Penicillina acilasi
Alcalina [Enzimatica]
[Chimica]
[R = Ph o PhO]
Piridina Me3SiCl
PCl5 ROH H2O
N
S
O
OH
H
O
NHO
R
N
S
O
OH
H
O
NH2
N
S
O
OSi(CH3)3
H
O
NHO
R
Attilio Citterio
Acido 6-Amminopenicillanico
Metodo Chimico: Uso di composti pericolosi - piridina, pentacloruro di fosforo,
nitrosil cloruro Metodo Enzimatico:
Regio- e stereo-specifico Condizioni di reazione più blande (pH 7.5, 37 °C) Il processo enzimatico è del 10% meno costoso
Enzimi:
Penicillina G acilasi (PGA) - Escherichia coli, Bacillus megaterium, Streptomyces lavendulae
Penicillina V acilasi (PVA) - Beijerinckia indica var. Penicillium, Fusarium sp., Pseudomonas acidovorans
Enzima immobilizzato: vita, 500-2880 ore
Attilio Citterio
Modifica Enzimatica di Penicilline in 6-APA e Penicilline Semisintetiche
Penicillina V o G (6-APA)
Penicillina acilasi [Acilazione] Acido
Penicilline Semisintetiche
Penicillina acilasi
Alcalino [Deacilazione]
N
S
O
OH
H
O
NHO
RN
S
O
OH
H
O
NH2
Attilio Citterio
Sintesi Enzimatica dell’Acrilammide
Materia prima monomerica per la produzione di polimeri sintetici Ottenuta per idratazione della funzione nitrilica dell’acrilonitrile Mercato mondiale, 200,000 t/anno
Processo Chimico: Reazione dell’acrilonitrile con acqua in presenza di H2SO4 (90 °C) o
catalizzatore metallico (80-140 °C) Formazione di scarti tossici (HCN) La reazione si deve bloccare per prevenire la conversione dell’acrilammide in
acido acrilico
Processo Enzimatico: Resa: 99.9% Kg di prodotto / g cellule Non si produce acido acrilico Numero minore di stadi di processo Molto più ambientalmente compatibile Nitto Chemical Industry: 6,000 t/anno L’enzima attivo è la nitrile idrolasi presente
nelle cellule intere di Rhodococcus rhodochrous, immobilizzate su gel di poli(propenammide)
CH2CH
CN CH2
CH
NH2
O5 °CpH 7.5Resa 99.99%
Attilio Citterio
Confronto tra le Sintesi Chimiche e Biochimiche dell’Acrilammide
Processo microbiologico
Acrilonitrile
Catalizzatore spento
Acqua
Prodotto Acrilammid
e Decolorazione Separazione
catalizzatore Idratazione
Coltivazione e immobilizzazione del microrganismo
Processo catalizzato (Cu)
Acrilonitrile non reagito
Rimozione del Cu2+ Decolorazione
Prodotto Acrilammid
e Concentrazione Rimozione del Cu2+
Decolorazione Separazione catalizzatore Idratazione Rimozione
di O2
Recupero e preparazione
del catalizzatore
Acrilonitrile
Acqua
Reazioni della nitrile idratasi e amidasi
CH2=CH-CONH2
H2O H2O
CH2=CH-CN CH2=CH-COOH Nitrile idratasi Amidasi
Attilio Citterio
Biocatalisi e Acrilammide
Poli(propenammide) acqua con Poliacrilammide colorante verde
Mescolamento Gel risultante
Matrice per separazione di macromolecole biologiche
Attilio Citterio
Sintesi dell'Aspartame (Estere Metilico L-Asp-L-Phe)
L’Aspartame è un dolcificante dipeptidico formato dalla condensa-zione dell’estere metilico della fenilalanina con l’acido aspartico
Molto usato nei cibi e nelle bevande 200 volte più dolce del saccarosio Vendite annuali: 200 milioni di libbre, 850 milioni di $
Metodo Chimico: Bisogna proteggere il gruppo amminico dell’acido aspartico per
prevenirne la reazione con un’altra molecola di acido aspartico e dare sottoprodotti
Si deve usare il singolo enantiomero corretto di ogni reagente per dare la corretta stereochimica dell’aspartame (il beta-aspartame è amaro)
Metodo Enzimatico: La Termolisina promuove la reazione solo alla funzionalità alfa Condizioni blande, pH 6-8, 40 °C Cbz. = benzilossicarbonile
Attilio Citterio
Bioproduzione dell’Aspartame
H2O
termolisina
estere metilico D,L-fenilalanina
Cbz-aspartame
+
Acido N-Cbz-aspartico
Cbz = benzilossicarbonile (PhCH2OCO-)
NH
CO O
Ph
HOOC
COOH
O NH
NH
O
OPh Ph
COOMe
COOH
Attilio Citterio
L-Carnitina
Inibitore della Tiroide agente dimagrante Supplemento dietetico per atleti Si usa solo un enantiomero del composto
Disponibili due strade biocatalitiche: Saccharomyces cerevisiae Rhizobiaceae
L-Carnitina OH
OOH HMe3N
+
Attilio Citterio
Sintesi della Carnitina
(1)
riduttasi
estere ottilico dell’acido γ-cloroacetoacetico
estere ottilico dell’acido (R)-γ-cloro-β-idrossibutanoico
OO
Cl C8H17O
OOHCl C8H17
O
H
L-carnitina
idrossilasi
L-carnitina γ-butirrobetaina
(2) O-
OMe3N
+
O-
OMe3N
OH H+
Attilio Citterio
Sintesi Alternative del Naproxen
Naproxen
MeO MeO
COOH
*biocatalysis
MeO MeO
COOH
MeO
COOH
several steps *resolution(D,L)
O
MeO
C2H5
MeO
COOH
*
1) Tartaric acid2) Br2
3) Hydrolysis
Attilio Citterio
Sintesi del Calcio Antagonista Diltiazem
O
OCH3O
CH3O
esterasi O
O OH
CH3O
S
NH O
O
O
CH3
CH3O
Diltiazem
(R,R)
(S,S)
Racemato
Attilio Citterio
Sintesi Ambientalmente Compatibile del Catecolo dal Glucosio vs. dal Benzene
(a) propilene, catalizzatore solido H3PO4, 200-260°C, 400-600 psi. (b) O2, 80-130°C quindi SO2, 60-100°C. (c) Ti-Silicalite, 70-80°C
Draths and Frost, 1995
(d) E. coli AB2834/pKD136/pKD9.069A, 37°C.
OH
OHOH
a
acetone
bc
hydroquinone
cathecol
cumenebenzene
E. colid
Protocateuchic acid3-Dehydroshikimic acidD-glucose
OHO
O OH
OH
O
OHOH
OHOHOH OH
OH
O OHE. coli
Attilio Citterio
Eliminazione dell’Amaro dagli Idrolizzati Proteici
• Trattamento con carboni attivi
• Estrazione con alcool
• Precipitazione isoelettrica
• Separazione cromatografica
• Mascheramento dell’amaro
• Idrolisi enzimatica dei peptidi amari con amminopeptidasi con proteasi alcalina/neutra con carbossipeptidasi
• Reazioni di condensazione usando proteasi
Attilio Citterio
Mannitolo
• Additivo alimentare (usato nel chewing gum) • Riduce la tendenza alla cristallizzazione dello zucchero e si usa come tale per
aumentare la conservazione delle derrate • Formulazioni farmaceutiche di compresse masticabili e polveri granulari • Previene l’assorbimento dell’umidità dall’aria, mostra eccellenti proprietà alla
compressione meccanica, non interagisce con i componenti attivi, e il suo leggero dolce maschera il sapore sgradevole di molti farmaci
• Il mannitolo esanitrato è un ben noto vasodilatore, usato nel trattamento dell’ipertensione
• Il complesso dell’acido borico con il mannitolo si usa nella produzione dei condensatori elettrolitici a secco
• E’ un poliolo ampiamente usato per la produzione di resine e tensioattivi • Ha una limitata solubilità in acqua (solo 18% w/w a 25 °C) • In soluzioni alcaline, è un potente sequestrante di ioni metallici • E’ dolce circa la metà del saccarosio • Si prepara per idrogenazione catalitica del D-fruttosio
Attilio Citterio
Via di Conversione Etero-fermentativa del Fruttosio a Mannitolo
2 Fruttosio
2 Mannitolo
Fruttosio
NADPH + H+
Lattato
ADP
NADP+
Acetato
CO2
Gliceraldeide - 3-P
Glucosio – 6-P
Piruvato
NAD+
ATP
2 ADP
2 ATP
Acetil - P
NADPH + H+
NADP+ 6 - Fosfogluconato
Ribulosio – 5-P
Xilulosio – 5-P
NAD+
NADH + H+
NADH + H+
Fruttosio – 6-P
ADP
ATP
O H
O H
O O H
O H O H
O H
O H
O H O H
O H O H
D-Fruttosio Mannitolo
Mannitolo 2-deidrogenasi
NAD(P)H NAD(P)
Attilio Citterio
Produzione del Mannitolo dal Fruttosio per Fermentazione batch a pH controllato
Fruttosio (g/L)
150 200 250 300
A 37oC, 130 rpm, pH Iniziale 6.5, pH controllato a 5.0, recipiente da 500 ml con 300 ml di mezzo.
Tempo (h)
Mannitolo (g/g)
Acido lattico (g/g)
Acido Acetico (g/g)
15
40
64
136
0.72±0.00 0.69±0.03 0.70±0.02 0.66±0.03
0.17±0.00 0.17±0.00 0.16±0.00 0.15±0.01
0.12±0.00 0.13±0.00 0.12±0.00 0.11±0.00
Attilio Citterio
Co-Ulilizzazione del Fruttosio e Glucosio e Produzione del Mannitolo
0 0
50
100
24 36 12
Fruttosio
Glucosio
Mannitolo
Acido lattico
Acido acetico
37 C pH 5.0
O
48 Tempo (h)
Subs
trato
o P
rodo
tto (g
/L)
Attilio Citterio
Produzione del Mannitolo per Fermentazione (Alimentata a Batch) a pH Controllato
Fruttosio usato: 300 g/L
(concentrazione finale)
0 0
50
100
150
200
24
Fruttosio
Mannitolo
Acido acetico
Acido lattico
37 C pH 5.0
O
72 96 48 Tempo (h)
Subs
trato
o P
rodo
tto (g
/L)
Attilio Citterio
Confronto tra Fermentazione e Idrogenazione Catalitica
• Tutto il fruttosio convertito in mannitolo
• Co-prodotti: acido lattico e acido acetico pari a metà del mannitolo
• Il glucosio è la fonte di idrogeno nella idrogenazione
• Una fonte di azoto è essenziale per la crescita
• Elettrodialisi per rimuovere gli acidi organici
• Uso di substrati meno puri non pone problemi
• Solo metà del fruttosio è convertito in mannitolo
• Co-prodotto: sorbitolo in grande eccesso (3)
• E’ necessario idrogeno gas molto puro
• Essenziale il catalizzatore di Nichel
• Resine a scambio ionico per togliere gli ioni nichel
• Necessari substrati molto puri per prevenire la disattivazione del catalizzatore
Attilio Citterio
Rigenerazione del Cofattore
• Chimica
• Fotochimica
• Elettrochimica
• Biologica
• Enzimatica
Attilio Citterio
Rigenerazione del Cofattore (per la Conversione di D-Fruttosio in Mannitolo)
Mannitolo Deidrogenasi
Na-Formiato CO2 + H2O Formiato Deidrogenasi
Glucosio + H2O Acido Gluconico Glucosio Deidrogenasi
o
D-Fruttosio Mannitolo
NADH NAD+
Attilio Citterio
Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche
I processi di Ossidazione Biologica non sono molto indagati (≠p.es. idrolasi)
1. mancanza di disponibilità commerciale e 2. considerati complessi (richiedono attrezzature/conoscenze
microbiologiche, adeguamenti, ‘cofattori’ non-enzimatici e proteine essenziali redox)
Lipasi
Esterasi
Proteasi Nitrilasi Altre Idrolasi
Ossido-riduttasi (cellule intere)
(enzimi isolati)
Ossigenasi
Liasi trasferasi Isomerasi
Attilio Citterio
Esempi di Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche Disponibili
Idrossilazioni
Ossidazione di alcoli
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
Flavina Monoossigenasi (FMO)
Citocromi P450
Alcool Deidrogenasi
R R1 R
OH
R1
R R1
OH
R
O
R1
R R1
O
R
O
OR'
Attilio Citterio
Esempi di Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche Disponibili
Ossidazioni di eteroatomi
Varie ossidasi, inc. P450, diossigenasi, FMO
RX
R'R
XO
R'X = S, Se, N
P450, cloroperossidasi
Epossidazioni
Amminoacido ossidasi
Ossidazione di amminoacidi
Attilio Citterio
Esempi di Reazioni di Ossidazione Biocatalitiche Disponibili
Diidrossilazioni
Diossigenasi R
OH
OH
R
Dealchilazioni
R-X-Alk R-X-HX = N, O
Perossidasi R
H H
R'R
R'
OOH
Formazione di perossidi
Attilio Citterio
Idrossilazione
• Catalizzata dai Citocromi P450 (ossidasi contenenti l’EME implicate nei processi di detossicazione cellulare)
• Si usano più frequentemente cellule intere in quanto: I P450 tendono a legarsi alla membrana cellulare (perciò sono
intrattabili) L’attività dipende da ‘cofattori’ non-proteici E normalmente da
proteine ausiliarie di tipo redox
R R1 R
OH
R1
O2
enzima
Attilio Citterio
Idrossilazione
Tipi di citocromi P450 (da Roberts G.A., Grogan, G., Greter, A. Flitsch, S.L. e Turner N.J. J. Bacteriol. (2002) 184, 3898-3908.
FAD FAD
Eme Eme FeS
NAD(P)H NAD(P)+
Classe I Classe II NADPH NADP+
FMN / ENDOPLASMIC
RETICULUM
NADPH NADP+
Classe III Classe IV NADPH NADP+
FAD Eme FMN / HO2C NH2 FMN Eme NH2
FeS CO2H
Attilio Citterio
Idrossilazione
Progesterone 11α-Idrossi-Progesterone
• Idrossilazione di steroidi [e.g. Peterson et al. J. Am. Chem. Soc. 74, 5933-5936 (1952)]
• L’applicazione commerciale della idrossilazione 11α del progesterone ha eliminato metà dei passaggi della sintesi dell’idrocortisone
• Esiste un biocatalizzatore per l’idrossilazione selettiva di CIASCUNA posizione sul nucleo steroideo
• Nessun equivalente abiotico dimostra ugual selettività.
O
O
H H
O
OH
O
H H
1
3
11
9 14 16
15
7
8
Rhizopus arrhizus
Attilio Citterio
Idrossilazione
L’idrossilazione della (S)-nicotina da parte del A. oxydans (Lonza) implicata nella produzione dell’epibatidina.
Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B., Kiener, A., Wubbolts, M e Witholt, B., Nature
(2001) 409, 258-268.
N
N
H
N
NOH
H Acetobacter oxydans NRRL B3603
( S )-nicotina 6-Idrossi-( S )-nicotina
Attilio Citterio
Idrossilazione
O
OOH
OH
O
HAlkyl
OH
O
OH
OBn
O
OH
OHOH
OH
OH
NMeNH2OH
Attilio Citterio
Ossidazioni di Alcoli
TEMPO .
N O
“O” = NaOCl, m-CPBA, oxone (+ Br -)
van Bekkum et al , Synthesis, 1996, 1153
OH H
O
+ 0 . 5 O 2
TEMPO (5m%)
Cu(II) / bipy (5m%) Base / MeCN / H2O
Gamez
Cu(II) / PIPO / O2
• No solvente • No Br-
• NaOCl • Riciclabile • Materia prima economica Chimassorb 944
Dijksman (2001)
PIPO
N N
N N
NH(tert-octyl)
(CH2)6
N O.
N
N O.
5
RCH2OH O2 2
H2O
laccasi
laccasi c ox
. N O
RCHO N
O
+
Laccasi : una ossidasi multirame
Li (2004), Matijosyte de Vries/Hagen
OH
H
R1
R2 R2
R1 O + “O” + H2O
. N O
CH2Cl2 / H2O
Attilio Citterio
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
Flavina Monoossigenasi (FMO)
Inserimento di un atomo di ossigeno adiacente al gruppo carbonilico catalizzato dalle Baeyer-Villiger Monoossigenasi (BVMO).
BVMO necessitano di
• Un cofattore flavinico • Un cofattore nicotinamide nucleotide • O2
R
O
R' R
O
OR'
Attilio Citterio
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
Però, A. calcoaceticus è un patogeno ACDP di Classe II
Levitt, M.S., Newton, R.F., Roberts, S.M. and Willetts, A.J., J. Chem. Soc, Chem. Commun., (1990) 619-620.
FO
Br
FO
Br
OO
F
Br
AcinetobactercalcoaceticusNCIMB 9871
(+/-) (-)- (-)-
+
Attilio Citterio
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
1. Uso dell’enzima isolato
Approccio costoso (NADPH da Catalogo Sigma £ 500/g!)
Seelbach K., Riebel B., Hummel W., Kula M.R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C., Kragl U., Tetrahedron Lett., (1996) 37, 1377-1380.
OR
OR O
R
O BVMO fromA. calcoaceticus
NADPH NADP
sodium formate carbon dioxide Formate dehydrogenase
+
Attilio Citterio
Ossidazioni di Baeyer-Villiger
2. Uso di organismo ingegnerizzato; BVMO espresso nel lievito ‘progettato’ o in Escherichia coli di Classe I
Wang, S., Chen, G. Kayser, M.M., Iwaki, H., Lau, P.C.K. and Hasagawa, Y. Can. J. Chem., (2002) 80, 613-621
OR
OR O
O
R
BVMO from A. calcoaceticus NCIMB 9871 espressed in Baker's Yeast
+
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Racemizzazione di Amminoacidi
Amminoacido ossidasi Catalizza la deamminazione ossidativa di amminoacidi a α-chetoacidi Richiede ossigeno molecolare e una flavina come cofattore Sono commercialmente disponibili con selettività sia ‘D’ che ‘L’ Si possono usare sia come enzimi isolati, che espressi in sistemi
cellulari completi
Amminoacido ossidasi
R NH2
CO2H
R O
CO2H
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Racemizzazione di Amminoacidi
Chemoenzymatic deracemisation of amino acids. After Hafner, E.W. and Wellner, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 1971, 68, 987.
R
NH2
CO2H
R
NH2
CO2H
R
NH
CO2H R
O
CO2H
bioossidazione conD-amimnoacido ossidasi
reduzionecon per es.NaBH4
+ H2O
- H2O
Attilio Citterio
Amminoacido Ossidasi – Deracemizzazione di Amminoacidi
Beard T.M. e Turner N. J., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (2002) 246-247
Deracemizzazione dell’acido DL-piperazin-2-carbossilico (un componente dell’inibitore della protease HIV Crixivan)
NH
NH
CO2H NH
NH
HCO2H
D-Amminoacido Ossidasi NaCNBH3
resa 86% e.e. 99%
Attilio Citterio
Reazioni di Riduzione con “Daucus carota”
• Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900. • Maczka, W. K.; Mironowicz, A. Tetrahedron: Asymmetry 2002, 13, 2299. • Bruni, R.; Fantin, g.; Medici, A.; Pedrini, P.; Sachetti, G. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 3377. • Baldassarre, F.; Bertoni, G.; Chiappe, C.; Marioni, F. J. Mol. Cat. B: Enzymatic 2000, 11, 55. • Chadha, A.; Manohar, M.; Soundararajan, T.; Lokeswari, T. S. Tetrahedron: Asymmetry 1996, 7, 1571.
CS
O
LC
S
OH H
LH2O, 20 ºC1 - 48 ore
Attilio Citterio
Riduzioni con Lievito di Birra
• stereoselettivo • sostenibile • facile da fare • prezzi ragionevoli
• Il “Baker’s Yeast” è il solo microorganismo che si può comprare in una panetteria.
• Non richiede condizioni asettiche e neppure un laboratorio microbiologico.
• Non richiede l’aiuto di un microbiologo. • Di fatto non è necessario conoscere per
nulla la microbiologia.
CS
O
LC
S
OH H
LH2O, 30 ºC0.5 - 24 ore
Saccharomicies cerevisiae
Attilio Citterio
Limiti nell’uso del Lievito (BY)
• Nel sistema ci sono molti enzimi differenti, per cui non si possono escludere reazioni collaterali.
• Il lievito BY commerciale non è puro e frequentemente porta a risultati inattesi.
• L’isolamento del prodotto è talvolta complicato.
• Ci può essere un impatto ambientale implicato nella preparazione del BY.
Attilio Citterio
Procedura Semplice
Attilio Citterio
Effetto dei Sostituenti
0
20
40
60
80
100
H Cl Br F NO2 Me MeO HO
Perc
entu
ale
Resa ee
Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.
O
R
C
OH H
RH2O, 20 ºC1 - 24 hours
Attilio Citterio
Effetto del Nucleo Aromatico
0
20
40
60
80
100
Naph MeO-Naph Furile Benzofuranile
Perc
entu
ale
Resa ee
Yadav, J. S.; Nanda, S.; Thirupathi Reddy, P.; Bhaskar Rao, A. J. Org. Chem. 2002, 67, 3900.
Ar
O
ArC
OH H
Attilio Citterio
Effetto del Nucleo Aromatico
0
20
40
60
80
100
Tetralone 2-tetralone 6-MeO-1-tetralone
Indanone
Perc
entu
ale
Resa ee
Ar
O
ArC
OH H
Attilio Citterio
Altri Composti Carbonilici
0
20
40
60
80
100
Tetralone 2-tetralone 6-MeO-1-tetralone
Perc
entu
ale
Resa ee
Ar
O
ArC
OH H
Attilio Citterio
Fattore E e EMY in Biotrasformazioni
Fattore E = Kg Scarti reali Kg di Prodotto
E = 10 g / 70 x 10-3 g = 143
100 mg 70 mg
Fattore EMY = Kg Scarti NBio* Kg di Prodotto
* NBio = scarti che non si possono smaltire o riciclare in sicurezza
EMY = 70 x 10-3g / 70 x 10-3 (+10)g = da 1 a 0.007
O
R
C
OH H
RH2O, 50 g
10 g
Attilio Citterio
Tempi di Reazione e Rapporti
45
72
89
62 61
0
20
40
60
80
100
acetofenone chetoniciclici
chetonialifatici
chetoesteri azidochetoniTem
po d
i rea
zion
e m
edio
(ore
)
45
24
6 3 0
20
40
60
80
100
100/1 1000/1 5000/1 10000/1
Tem
po d
i rea
zion
e m
edio
(ore
)
Rapporto carota/ substrato
Attilio Citterio
Usi Non-Convenzionali di Enzimi in Mezzi Non acquosi
Liofilizzazione
Sali Acqua
(Solubile)
“Anidro”
Solvente Organico
(Insolubile)
Attilio Citterio
Substrato
Prodotti
• Consentite temperature superiori
• Più alte concentrazione di vapori
• Superiore stabilità/durabilità
• Limitato cineticamente, non limitato dal trasporto interfase
• Verificato in esterificazioni, vari test in corso
Uso non-convenzionale di Enzimi: Stato-Dry
Attilio Citterio
Adattare il Catalizzatore Enzima al Processo Ideale
Processo Nightmare
Cataliz- zatore
Sviluppare il processo per accomodare il catalizzatore
Adattare il catalizzatore al processo ottimale
EVOLVERE
Processo Auspicabile
Catalizzatore Adattato
Evoluzione Diretta
Attilio Citterio
Mescolamento del DNA: Evoluzione nella Linea più Veloce
Nuovi Geni
gene A
gene B
gene C gene D
Ripetere
Selezione HTP
Geni dalla Natura
Librerie di Nuovi Geni
Miscelazione DNA TM
Attilio Citterio
Green Synthesis of Lipitor Intermediate (Codexis)
KRED = cheto reduttasi ; GDH = glucosio deidrogenasi HHDH = aloidrina dealogenasi (nucleofilo non-naturale)
OEt Cl
O O
NADPH NADP+
OEt Cl
OH O
OEt Cl
OH O
HHDH OEt NC
OH O
KRED
glucosio gluconato GDH
aq. NaCN, pH 7
(>99.9% ee)
> 99% ee
Presidential Green Chemistry Challenge Award 2006
Nature Biotechnol. 2007, 25, 338-334
Attilio Citterio
Miglioramento Prestazioni per Evoluzione Orientata: dal lab al processo commerciale per miscelazione geni 1. KRED + GDH
97% ~80% >90% Resa Isolata 0.7 g/L 10 g/L <1 g/L Alimentaz. Enzima
~1 min. >1 h Tempo di separaz. fasi 540 g/L·giorno 80 g/L·giorno >240 g/L·giorno Produttività Volumetrica
8 h 24 h <16 h Tempo di Reazione 180 g/L 80 g/L 160 g/L Alimentaz. Substrato
Prestazione Finale Prestazione Iniziale Prog. Processo Parametro
92% ~60% >90% Resa Isolata 1.2 g/L 130 g/L <1.2 g/L Alimentaz. Enzima
670 g/L·giorno 7 g/L·giorno >180 g/L·giorno Produttività Volumetrica
5 h 72 h <16 h Tempo di Reazione 140 g/L 20 g/L 120 g/L Alimentaz. Substrato
Prestazione Finale Prestazione Iniziale Prog. Processo Parameter 2. HHDH
Attilio Citterio
Svantaggi degli Enzimi (e Soluzione) • Basse stabilità operativa e durata di conservazione
• Macchinoso recupero e ri-uso (operazione batch vs. continua)
• Contaminazione del Prodotto
Soluzione : Immobilizzazione
Attilio Citterio
Aggregati di Enzimi Reticolati (CLEA)
Enzima in soluzione
precipitante
CLEAS aggregato
Connettore X
come connettori X si usa la glutaraldeide o la polialdeide del destrano
• Consente il riciclo per filtrazione • Maggiore produttività • Non richiede enzimi ad alta purezza • Procedura semplice e / ben applicabile • Stabilità rispetto alla denaturazione
CLEAS attivi in: - scCO2 (M. Poliakoff) - Liquidi ionici (Sheldon)
Sorgedrager (2006), Janssen (2006 )
Attilio Citterio
Esempli di CLEAzione Riuscita
Idrolasi
• Pen. acilasi (2)
• Lipasi (7)
• Esterasi (3)
• Proteasi (3)
• Nitrilasi (2)
• Amminoacilasi
• Fitasi
• Galattosidasi
• OPH
Ossidoriduttasi • ADH
• FDH
• Glucosio ossidasi
• Galattosio ossidasi
• Laccasi
• Catalasi
• Cloroperossidasi
Liasi
•R- & S- HnLiasi
• PDC
• DERA
• Nitrile idratasi
Cao, Lopez-Serrano, Mateo, Perez, van Langen, Sorgedrager Janssen, Bode, van Pelt, Chmura, Matijosyte, Aksu-Kanbak,
Attilio Citterio
Processi Catalitici in Cascata
Resa 97% / > ee 99%
H 2 N
O
OH N H O
OCH3 O N H O
OCH3 O
0 , 4 % cat.
5 a t m H2
Resa 99% / ee 95%
amidasi
Catalizzatore: Rh(monophos) su TUD-1
Simons (2007)
H 2 O
H 2 O 2 H O H
lipasi
PS- I(O2CR)2
PS- I
RCOOH
RCO2OH
O
Kotlewska
Attilio Citterio
Cascata Trienzimatica con un Triple-Decker combi CLEA
O
OH
CN
HCN /(S)-HnL OH
COOH
Conv. 96% / ee >99%
OH
CONH2
NLasi Pen G amidasi
Chmura, Stolz
H2O
Attilio Citterio
Conclusioni
• Le Reazioni Biocatalitiche continuano ad essere studiate con grande interesse perché: In molti casi, non esistono reazioni equivalenti ‘abiotiche’ di
selettività confrontabile Le caratteristiche generali delle Reazioni Biocatalizzate le fanno
percepire come vie ‘più sostenibili’ per molti composti.
• Ostacoli Percezione dell’uso di sistemi microbici/ biochimici dalla comunità
organica Percezioni dell’uso di organismi/reagenti GM nella produzione di
materiali per il consumo umano
Attilio Citterio
Aree di Ricerca di Bioprocessi
• Produzione di combustibili e composti chimici • Trattamento biologico di combustibili fossili • Biotrattamento & bioremediation • Biologia applicata • Sintesi Organica
Capacità • Ing. BioChim. - nuovi reattori, separazioni, modellizzazioni e integrazione di sistemi • Biocatalizzatori multi-fase e non acquosi • Sviluppo di ceppi microbici e bioprospezione • Infrastrutture per ricerche di bioprocessi
Aree correlate - Separazioni (indotte da campi elettrici) - Biomimetici (adsorbenti, catalisi, materiali)
Attilio Citterio
Biotrattamenti e Bioremediation di Scarichi
• Biofiltrazione e Biosolubilità di VOC (alcani, NOx, TCE) • Agenti Chim-Bio • Biocatalisi non acquosa (‘anidra’) per vapori pericolosi (CWA, VOC) • Bioadsorbimento di metalli pesanti (U, Cd) con biopolimeri • Rimozione e trattamento del mercurio • Bioremediation usando enzimi termofili non acquosi (solventi clorurati) • Biodegradazione dei PCB • Biodegradazione dei BTEX e combustibili • Over espressione microbica di enzimi degradativi e produzione di
GEM • Biodegradazione dei pesticidi e farmaci
Attilio Citterio
Riferimenti sulla Biotecnologia
• B. R. Glick, C. L. Patten: Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 5th Ed. ASM Press (2017)
• V. S. Bisaria, A. Kondo Ed. Bioprocessing of Renewable Resources to Commodity Bioproducts, 2014 (ISBN: 9781118175835)
• Werpy T, Petersen G. Top Value Added Chemicals From Biomass. Volume I (2004): Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas PNNL Laboratory and National Renewable Energy Laboratory (NREL), Vol.II (2007)
• Ahmann D, Dorgan J. Bioengineering for Pollution Prevention through Development of Biobased Energy and Materials: State of the Science Report U.S. EPA Agency, Jan. 2007. EPA/600/R-01/028.
• Gary Walsh, Biopharmaceuticals : Biochemistry and Biotechnology 2003 (ISBN: 978-0-470-84327-7)
• M. Shuler, F. Kargi: Bioprocess Engineering - Basic concepts, Prentice Hall; 2 Ed. (2001)
