Centro Universitário Hermínio Ometto de Araras
UNIARARAS
MARIANA IOST ANTUNES
ESTUDO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
ANTIBIÓTICOS E FITOTERÁPICOS COMO ANTI-SÉPTICOS
DENTINÁRIOS
“IN VITRO” STUDY OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF
ANTIBIOTCS AND PHITOTHERAPICS DENTIN
DESINFECTANTS
ARARAS/SP
Março/ 2007
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UNIARARAS
Centro Universitário Hermínio Ometto de Araras
Centro Universitário Hermínio Ometto de Araras
UNIARARAS
MARIANA IOST ANTUNES
ESTUDO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE
ANTIBIÓTICOS E FITOTERÁPICOS COMO ANTI-SÉPTICOS
DENTINÁRIOS
Dissertação apresentada ao Centro
Universitário Hermínio Ometto, para obtenção
do título de Mestre em Odontopediatria.
ORIENTADORA: Profa Dra Renata Cristiane da Silva
CO-ORIENTADORA: Profa Dra Ana Laura Remédio Zeni
Beretta
ARARAS/SP
Março/ 2007
CENTRO UNIVERSITÁRIO HERMÍNIO OMETTO - UNIARARAS
Autor: Mariana Iost Antunes
ESTUDO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE AN TIBIÓTICOS E
FITOTERÁPICOS COMO ANTI-SÉPTICOS DENTINÁRIOS”
Dissertação apresentada em 30 de Março de 2007
Banca examinadora:
_________________________________________________ NOTA: ________
Orientador(a): Profa Dra Renata Cristiane da Silva
__________________________________________________ NOTA: ________
Co-orientadora: Profa Dra Ana Laura Remédio Zeni Beretta
__________________________________________________ NOTA: ________
Prof Dr Sérgio Luiz Pinheiro
MÉDIA FINAL: _______________
_________________________ Mariana Iost Antunes
Dedico este trabalho,
Em primeiro lugar aos meus pais, José Arthur e Cristina, pelo apoio e incentivo a
realização de todos os meus sonhos. Obrigada pelo amor e pelo exemplo sempre
presentes em minha vida. Amo muito vocês.
Ao meu amado irmão, pela amizade, carinho, orgulho e respeito que sempre tivemos
um pelo outro.
Aos meus avós Wilma e Arthur, pelo exemplo de vida, luta e vitória.
Aos meus avós Edgard e Abigail, que não estão mais aqui neste plano, mas que me
fazem senti-los presente a cada vez que chamo por eles. Muita saudade.
Ao meu grande amor Igor, pela paciência infindável, por me fazer acreditar que sou
capaz, celebrar comigo a cada momento como se fosse único e me fazer uma
mulher realizada, completa e muito amada. Obrigada meu amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof Dr Sergio Luiz Pinheiro, por aceitar me orientar, pela paciência e
ensinamentos que levarei para minha vida profissional e pessoal.
A Profa Dra Ana Laura Remédio Zeni Beretta, pelo apoio e confiança para que fosse
possível a realização deste trabalho.
Ao Prof Dr José Carlos Pettorossi Imparato, pela oportunidade de fazer parte desta
equipe, pelo incentivo e entusiasmo com cada vitória alcançada durante esta
trajetória. Minha enorme admiração e gratidão.
Aos Profs Drs Fausto Medeiros Mendes, Thiago Machado Ardenghi, Luciana Butini
Oliveira, Monique Bendetto, Daniela Prócida Raggio e Renata Cristiane da Silva
pelos ensinamentos, demonstração de confiança, incentivo e enorme amizade, fruto
de uma convivência extremamente agradável e divertida. Muito obrigada a todos
vocês.
Ao Prof Dr Ricardo Bozzo, coordenador do curso de Odontologia desta faculdade,
pela contribuição que vem dando a minha formação acadêmica desde a graduação
e pela amizade sincera.
A Raquel, responsável técnica do laboratório de microbiologia pelo apoio, ajuda em
todos os momentos e pelos conhecimentos a mim transmitidos. Sem você este
trabalho não teria sido realizado. Muito obrigada de coração.
A todos os funcionários desta casa que de maneira direta ou indireta tornaram
possível que este trabalho fosse realizado. Muito obrigada.
Ao Centro Universitário Hermínio Ometto, por orientar meus passos e me possibilitar
estar onde estou hoje.
As minhas companheiras de turma Paulinha, Baby, Mari, e Déia, que iniciaram
comigo esta caminhada e que de colegas tornaram-se amigas, confidentes,
companheiras que aprendi a amar e a respeitar. Espero tê-las sempre presente em
minha vida.
Aos mais recentes companheiros Fru, Karin e Paulo pela amizade verdadeira, apoio,
por acreditarem que conseguiria finalizar meu projeto e por todos os momentos de
alegria e tristeza, superações e frustrações que temos compartilhado. Adoro vocês.
A amiga Mariana Minatel Braga, pela amizade, apoio e principalmente confiança que
tem depositado em mim me colocando sempre para cima, me fazendo acreditar que
sou capaz.
A minha amiga Luciane, irmã de alma, que mesmo distante se manteve presente em
cada momento da minha vida, me apoiando, acreditando em mim, colocando meus
pés de volta no caminho quando já achava estar perdida. Obrigada por fazer parte
da minha vida. Amo você.
A minha grande amiga Silvia, juntas desde o início de nossas vidas acadêmicas,
obrigada por acreditar em mim, por não me deixar desanimar e estar sempre pronta
quando precisei de um ombro amigo.
As minhas queridas amigas Isadora e Flávia, por me acompanharem durante todo
meu amadurecimento pessoal e profissional e me apoiarem sempre com muito amor
e carinho. Amo vocês.
A Vera Lucy não só pela ajuda fundamental para a conclusão desse trabalho, mas
por considerá-la minha segunda mãe. Obrigada pelo carinho e conselhos sempre
tão sábios.
Ao meu sogro Antonio e minha sogra Neide, minha cunhada Valéria e meus
sobrinhos João Antonio e Maria Julia, pelo apoio, respeito e carinho que sempre
demonstraram durante esta minha jornada.
Não faças do amanhã o sinônimo de nunca,
nem o ontem te seja o mesmo que nunca
mais. Teus passos ficaram.
Olhes para trás... mas vá em frente, pois há
muitos que precisam que chegues para
poderem seguir-te.
Charles Chaplin
8
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 8
2. PROPOSIÇÃO .......................................................................................... 11
3. APRESENTAÇÃO DO ARTIGO................................................................ 12
3.1. RESUMO.......................................................................................13 3.2. ABSTRACT....................................................................................14 3.3. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA.............................15 3.4. CASUÍSTICA E MÉTODOS...........................................................17 3.5. RESULTADOS.............................................................................. 19 3.6. DISCUSSÃO..................................................................................20 3.7. CONCLUSÃO................................................................................24 3.8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................25 ANEXO I........................................................................................................ 31
ANEXO II....................................................................................................... 32
9
1. INTRODUÇÃO
Atualmente a doença cárie dentária está inserida em um contexto de
multicausalidade, envolvendo fatores além dos meramente biológicos. Porém,
considerando a importância do fator bacteriano para o desenvolvimento desta
doença, buscam-se tratamentos pautados na redução da extensão da atividade
bacteriana e/ou no aumento da resistência do dente às conseqüências desta
atividade. Tais tratamentos, porém, devem estar aliados também ao controle de
outros fatores causais, desfazendo dessa maneira o papel paliativo de uma
intervenção que considere apenas um aspecto do desenvolvimento da doença cárie
(ELDERTON, 2001).
Dentre os microrganismos associados à doença cárie, o S. mutans é o
principal microrganismo cariogênico devido às suas propriedades acidogênicas e
acidúricas, além de sua capacidade de produzir polissacarídeos extracelulares (pec)
e polissacarídeos intracelulares (pic) (GEBARA, 1996). Além dos S. mutans, os S.
sobrinus também estão associados ao início do processo de cárie e os Lactobacillus
à progressão da lesão quando a mesma já foi estabelecida (LOESCH, 1986).
HOSHINO, em 1985, estudou a microbiota de lesões de cárie dentinárias e observou
uma predominância de bactérias anaeróbias facultativas ou obrigatórias como
Actinomyces, Eubacterium, Lactobacillus, entre outras.
A eliminação das bactérias do preparo cavitário é um dos mais importantes
procedimentos durante o processo restaurador; entretanto, manobras convencionais
utilizadas no tratamento da doença cárie nem sempre eliminam todos os
microrganismos do tecido residual (KIDD et al., 1993, BOSTON & GRAVER, 1994).
SHOVELTON, em 1968, observou que mesmo após a remoção total do tecido
cariado, túbulos dentinários infectados continuavam presentes, e em uma revisão
sistemática, RICKETTS et al. em 2006, observaram que existe maior probabilidade
de dano pulpar se houver remoção total da dentina afetada.
A paralisação do progresso da lesão pode ser alcançada pela restauração
eficiente das superfícies dentárias, remoção física do tecido altamente infectado,
restrição de nutrientes para as bactérias remanescentes na dentina e uso de
10
substâncias bacteriostáticas com o intuito de reduzir o número de bactérias
remanescentes.
Atualmente, a literatura científica relata o uso de diversos biomateriais
odontológicos e alternativas antimicrobianas que teriam potencial de induzir a
reparação do tecido dentário doente. Diferentes estudos têm sido descritos sobre a
associação de clorexidina aos cimentos ionoméricos (RIBEIRO & ERICSON, 1991;
TAKAHASHIA et al., 2006) ou da incorporação de antibióticos aos cimentos
dentários (SATO et al., 1993; HORI et al., 1997; PINHEIRO et al., 2003; PINHEIRO
et al., 2005).
Na tentativa de reduzir o potencial de lesões residuais e a sensibilidade pós-
operatória, a clorexidina vem sendo muito utilizada como agente de limpeza cavitária
devido as suas propriedades como: substantividade, estabilidade, eficiência e
segurança (ROSING & TOLEDO, 1993). É um potente agente antibacteriano sendo
absorvida pela parede celular o que provoca a ruptura da mesma e escape do
conteúdo intracelular. É mais ativa contra as bactérias Gram-positivas que contra as
Gram-negativas, mas não tem atividade esporicida.
A associação de antibióticos como metronidazol, ciprofloxacina e cefaclor tem
apresentado resultados significativos na redução microbiana, sendo o metronidazol
efetivo contra cocos e bacilos anaeróbios obrigatórios, o cefaclor contra bactérias
aeróbias Gram-positivas e Gram-negativas, e a ciprofloxacina contra Gram-
negativos e micobactérias, porém a ciprofloxacina apresenta pequena ação contra
Streptococcus e anaeróbios (YAGIELA et al., 2000; TAVARES, 2002).
Outras alternativas podem ser encontradas no controle do crescimento
bacteriano. Atualmente, a ciência está estudando o princípio ativo das plantas,
testando sua eficácia no tratamento de doenças e determinando a forma correta de
aplicação. Produtos naturais têm sido utilizados há milhares de anos no campo da
medicina para vários propósitos. Na Odontologia, produtos contendo substâncias
naturais apresentam boas perspectivas no mercado devido à aceitação popular da
fitoterapia.
As plantas medicinais podem ser consideradas como fontes de substâncias
que apresentam atividades biológicas diferentes, pois elas sintetizam várias
moléculas orgânicas e podem ultrapassar a ação da medicina convencional. Podem
ter efeitos analgésico, antiinflamatório, tranqüilizante como também propriedades
11
antimicrobianas que habilitam o seu uso em várias doenças que acometem a
cavidade oral (CUNICO et al., 2003).
O extrato de própolis é um complexo resinoso que as abelhas produzem a
partir de materiais, tais como exsudatos de várias plantas, cera e secreções das
abelhas. É muito utilizada na medicina popular devido as suas propriedades
biológicas, tais como antihepatotoxicidade, antitumural, antioxidativa, antimicrobiana
e antiinflamatória (BANSKOTA et al., 2001). Inúmeros são os relatos sobre a ação
antimicrobiana da própolis “in vitro”, tais como: ação sobre S. pyogene, S. mutans
(KOO et al., 2000) e bactérias anaeróbias da cavidade bucal humana (SANTOS et
al., 2002).
O óleo de copaíba vem sendo utilizado a mais de quatro séculos para
diversos fins farmacológicos. Constituído por 45% de óleos essenciais e 55% de
resina, o óleo-resina de copaíba advém de árvores do gênero Copaífera, sendo Pará
e Amazonas os principais produtores brasileiros, e a espécie Copaífera reticulata a
mais importante. Possue efeito analgésico, antiinflamatório, anti-séptico e
cicatrizante, quando aplicados via oral ou tópica (CAVALCANTI et al., 2005).
Enfim, estudos que visem esclarecer mecanismos de redução microbiana são
importantes para o aprimoramento da Dentística de Mínima Intervenção, além de
permitir a abordagem de conceitos atuais referentes ao contexto saúde/doença,
justificando por meio de tais fatores apresentados a realização do presente estudo.
12
2. PROPOSIÇÃO
Apresentação de um artigo intitulado “Estudo “in vitro” da atividade
antimicrobiana de antibióticos e fitoterápicos como anti-sépticos dentinários”.
13
3. APRESENTAÇÃO DO ARTIGO
Estudo “in vitro” da atividade antimicrobiana de an tibióticos e fitoterápicos
como anti-sépticos dentinários.
Mariana Iost Antunes 1, Ana Laura Remédio Zeni Beretta 2, José Carlos
Petorossi Imparato 1,3, Sergio Luiz Pinheiro 4
1 Disciplina de Clínica Integrada Infantil da Faculdade de Odontologia da Fundação Hermínio
Ometto - UNIARARAS, 2 Departamento de Microbiologia da Fundação Hermínio Ometto –
UNIARARAS, 3 Departamento de Ortodontia e Odontopediatria da Faculdade de Odontologia
da Faculdade de São Paulo, 4 Mestre em Odontopediatria e Doutor em Dentistica pela FOUSP
3.1.RESUMO
14
O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana “in vitro” da
clorexidina a 2%, antibióticos (ceflacor 1%, ciprofloxacina 1% e metronidazol 1%) e
fitoterápicos (óleo de copaíba e extrato de própolis 30%), antibióticos associados ao
óleo de copaíba e antibióticos associados ao extrato de própolis sobre as bactérias
residuais presentes na dentina cariada. Placas contendo ágar sangue foram
semeadas e discos de filtro estéreis previamente embebidos nas substâncias
experimentais foram inseridos de maneira eqüidistante no meio agar sangue. As
amostras foram armazenadas em estufa a 37o C durante 5 dias em atmosfera de
85% de N2 10% de CO2 e 5% de H2, que foi obtida com a utilização de envelopes
geradores de anaerobiose e indicadores de anaerobiose. Após análise estatística de
Kruskal-Wallis, as médias aritméticas e os desvios padrão dos grupos amostrais
foram: soro 0,0 mm (0,0); hipoclorito 2,0 mm (1,0); clorexidina 7,67 mm (0,57);
antibióticos 7,0 mm (2,64); óleo de copaíba 1,0 mm (1,0), própolis 0,0 mm (0,0);
antibióticos associados ao óleo de copaíba 12,33 mm (2,08); antibióticos associados
ao extrato de própolis 15,0 mm (1,0). A associação dos antibióticos ao extrato de
própolis apresentou os maiores halos de inibição com diferenças estatisticamente
significantes, em relação aos grupos do controle negativo (soro), positivo (hipoclorito
de sódio 1%) antibióticos e própolis (p<0,05).
Palavras-chaves: agentes antimicrobianos, anti-sépticos cavitários, fitoterápicos,
cárie dentária.
3.2.ABSTRACT
15
The aim of this “in vitro” study was to evaluate the antimicrobial activity of
chlorhexidine 2%, antibiotics (metronidazole 1%, ciprofloxacin 1% and cefaclor 1%)
and phitotherapics (copaiba oil and propolis 30%), antibiotics associated with
copaiba oils and antibiotics associated with propolis and the behavior of the
permanent teeth affected dentin. Blood agar plates were sowed and sterilized disks
placed in a standard distance. The plates incubated an anaerobic glove box
containing 85% N2, 10% CO2, and 5% H2 at 37o C for 5 days. After Kruskal-Wallis
analyses, mean and standard desviation: soro 0,0 mm (0,0); hipoclorito 2,0 mm(1,0);
clorexidina 7,67 mm (0,57); antibióticos 7,0 mm (2,64); óleo de copaíba 1,0 mm (1,0),
própolis 0,0 mm (0,0); antibióticos associados ao óleo de copaíba 12,33 mm (2,08);
antibióticos associados ao extrato de própolis 15,0 mm (1,0). The antibiotics
associated with propolis presented the higher inhibition zones (medium 15.0 mm),
which were statistically different (p<0,05) in comparison with control groups positive
(sodium hypochlorite 1%) and negative , antibiotics and propolis.
Key-words: antimicrobial agents, disinfection cavity, phitotherapics, dental caries
3.3. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA
16
Atualmente, a Odontologia visa o máximo de preservação da estrutura
dentária, com a manutenção e tratamento das lesões de cárie sem a necessidade da
remoção total do tecido envolvido. Dessa forma, o tratamento odontológico torna-se
menos traumático, mais rápido e possibilita a preservação dos tecidos de suporte.
A cárie dentária é uma doença bacteriana, e qualquer “tratamento” deve visar
reduzir a extensão da atividade bacteriana e/ou aumentar a resistência do dente às
conseqüências dessa atividade (ELDERTON, 2001). A microbiota das lesões de
cárie dentinárias tem sido avaliada por diversos pesquisadores que encontraram
predomínio de bactérias anaeróbias facultativas ou obrigatórias (HOSHINO, 1985;
MASSEY et al., 1993). A diferenciação morfológica e ambiental entre dentes
decíduos e permanentes deve ser levada em consideração, acarretando microbiota
distinta e que de maneira geral são tratados com as mesmas propostas terapêuticas.
Vários conceitos têm sido usados para reduzir ou eliminar microrganismos
abaixo das restaurações. Diferentes maneiras tem sido descritas, dentre elas a
adição de clorexidina aos cimentos ionoméricos ou da incorporação de antibióticos
aos cimentos dentários (SATO et al., 1993; HORI et al., 1997; PINHEIRO et al.,
2005), e também a aplicação de anti-sépticos contendo clorexidina após o preparo
cavitário (RIBEIRO & ERICSON, 1991; MEIERS & KRESIN, 1996; BOTELHO, 2003;
GUIRADO et al., 2006).
Além dos materiais restauradores, soluções utilizadas como anti-sépticos
cavitários também são uma alternativa para remoção de microrganismos
remanescentes do processo da doença cárie. Segundo MEIERS & KRESIN (1996)
e SETTEMBRINI (1997), os anti-sépticos cavitários foram recomendados como pré-
tratamento dos preparos cavitários antes da restauração para remover ou alterar as
bactérias residuais e prevenir os efeitos prejudiciais da atividade bacteriana.
TURKUN et al. (2005) relataram que além da atividade antibacteriana dos agentes
de limpeza cavitária, torna-se fundamental a substantividade dessas soluções e
mostraram que tanto a clorexidina quanto o cloreto de benzalcônio demonstraram
real atividade antimicrobiana sobre S. mutans, L. acidophilus e C. albicans.
Embora anti-sépticos cavitários e condicionadores possam inibir o
crescimento bacteriano, partículas abrasivas residuais (sílica, vidro) ou moléculas
contidas nessas soluções poderiam possivelmente interferir no processo de adesão,
produzindo uma fenda marginal e assim aumentar a contaminação por
microinfiltração segundo TULUNOGLU (1998).
17
A Odontologia como outras áreas da saúde, tem buscado alternativas no
controle do crescimento bacteriano. Atualmente, o estudo de princípios ativos das
plantas para o tratamento de doenças tem sido relatado na literatura. Óleos
essenciais podem ter seu papel no desenvolvimento de novos tratamentos contra a
doença cárie (FILOCHE et al., 2005). O potencial de extratos de plantas e
fitofármacos em modelos de linhagens de microrganismos multirresistentes a
fármacos foi avaliado, como também o efeito sinérgico da associação dos extratos
com atividade antimicrobiana com antibióticos (NASCIMENO et al., 2000). Outros
estudos têm avaliado a possibilidade da associação entre fitoterápicos (MARQUES
et al., 2006) ou de fitoterápicos a biomateriais (PINHEIRO et al., 2003;
NASCIMENTO et al., 2005) frente a diversas microbiotas.
GERBARA et al., 1996; KOO et al., 2000; CUNICO et al., 2003; SOUSA et al.,
2005 avaliaram a atividade antimicrobiana de substâncias naturais sobre microbiota
oral. GEBARA et al. (1996) mostraram a capacidade das tinturas de malva, salva,
camomila, tomilho, cacau e própolis contra S. mutans e S. sobrinus. KOO et al.
(2000) testaram a atividade antimicrobiana do extrato de arnica e de própolis sobre
C. albicans, S. aureus, E. faecalis, S. sobrinus, S. sanguis, S. cricetus, S. mutans, A.
naeslundii, A. viscosus, P. gingivalis, P. endodontalis e P. denticola e observaram
poder de inibição significante do extrato de própolis sobre todos os microrganismos
testados. SOUSA et al. (2005) avaliaram a ação antimicrobiana da malva, óleo de
copaíba e própolis sobre S. mutans e concluíram que o óleo de copaíba associado
ou não a malva e própolis apresentou o maior efeito inibitório.
Além da atividade antimicrobiana, outros fatores foram estudados como a
ação antiinflamatória das substâncias naturais e a própolis foi descrita como a
substância que apresentou menor potencial citotóxico (SILVA et al., 2004).
O propósito deste estudo foi avaliar a ação antimicrobiana da clorexidina a
2%, antibióticos (ceflacor 1%, ciprofloxacina 1% e metronidazol 1%) e os
fitoterápicos (óleo de copaíba e extrato de própolis 30%), antibióticos associados ao
óleo de copaíba e antibióticos associados ao extrato de própolis sobre as bactérias
residuais colhidas da dentina afetada de dente permanente.
3.4. CASUÍSTICA E MÉTODOS
18
As substâncias avaliadas neste estudo foram clorexidina 2% (Farmácia de
manipulação Naturista, Araras, São Paulo, Brasil), antibióticos (metronidazol 1%,
ciprofloxacina 1% e cefaclor 1%) (Farmácia de manipulação Fórmula & Ação, São
Paulo, São Paulo, Brasil), óleo de copaíba e extrato de própolis a 30% (Farmácia
Apis Flora, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil), associação dos antibióticos a própolis
e associação dos antibióticos ao óleo de copaíba. Para o controle positivo foi
utilizado o hipoclorito de sódio 1% (Farmácia de manipulação Naturista, Araras, São
Paulo, Brasil) e como negativo o soro fisiológico (Sanobiol, Pouso Alegre, Minas
Gerais, Brasil) (Quadro 1).
Após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIARARAS (Anexo
I) foi selecionado um molar permanente em paciente da Disciplina de Clínica
Integrada Infantil que atendeu aos critérios de inclusão não apresentando
comprometimento sistêmico e não fazendo uso de medicamentos via oral. O dente
apresentava lesão de cárie dentinária ativa, sem envolvimento pulpar confirmado por
exames clínico e radiográfico. Após a assinatura do Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido (Anexo II), o paciente foi submetido à anestesia local com Lidocaína
2% 1:100.000 com adrenalina (DFL, Rio de Janeiro, Brasil) pertinente a região de
trabalho, isolamento absoluto do campo operatório com lençol de borracha Damtex
(DFL, Rio de Janeiro, Brasil). Para a coleta da dentina afetadafoi primeiramente
removida a biomassa central de dentina cariada e necrótica que se apresentava
desorganizada e amolecida só utilizando uma cureta estéril (BJØRNDAL & LARSEN
2000) e a escavação foi cessada quando a dentina remanescente mostrou
resistência aumentada a instrumentação manual, em lascas ou fatias. A cavidade foi
lavada com jato de água e seca com breve jato de ar e com o auxílio de uma cureta
estéril foram removidas amostras de dentina da parede pulpar e inseridas no meio
BHI (Brain Heart Infusion) (Biobras, Montes Claros, Brasil) (MASSARA et al., 2002).
Procedimentos microbiológicos
O material dentinário foi inserido no meio de transporte BHI e incubado em
jarras a 37o C durante 5 dias em atmosfera de 85% de N2 10% de CO2 e 5% de H2,
que foi obtida com a utilização de envelopes geradores de anaerobiose e
indicadores de anaerobiose. Após o crescimento, o inóculo foi padronizado na
escala meio (0,5) de MacFarland (Figura 1) apresentando aproximadamente 6X108
19
bactérias/ml, segundo padrões estabelecidos pelo National Comite Control
Laboratory Standart (NCCLS). Com o auxílio de swab estéril, foram realizadas
semeaduras em placas contendo meio de cultura agar sangue (Figura 2). Discos de
filtro previamente esterilizados foram imersos por 30 segundos nos agentes
descritos anteriormente e dispostos de maneira eqüidistante nas placas (Figura 3).
Imediatamente após a inserção dos discos as placas foram levadas a estufa e
incubadas em jarras a 37o C durante 5 dias em atmosfera de 85% de N2 10% de
CO2 e 5% de H2, que foi obtida com a utilização de envelopes geradores de
anaerobiose e indicadores de anaerobiose. Os experimentos foram realizados em
triplicata.
Após o período de incubação, foram realizadas coletas do crescimento das
placas e realizada a coloração de Gram. Os halos de inibição foram medidos (em
milímetros) com auxílio de um paquímetro por um único avaliador e os resultados
submetidos ao teste estatístico de Kruskal-Wallis.
3.5.RESULTADOS
20
Os valores mínimos, máximos, as médias e desvios padrão dos grupos
amostrais podem ser vistos na tabela 1 e gráfico 1.
O maior halo de inibição foi observado na associação dos antibióticos ao
extrato de própolis (A+P) (média de 15,0 mm), com diferença estatisticamente
significante em relação aos grupos do controle positivo e negativo, aos antibióticos e
a própolis (p<0,05) (Tabela 2). A associação antibióticos e óleo de copaíba (A+OC)
apresentou atividade antibacteriana estatisticamente significante (p<0,05) quando
comparado ao controle negativo, aos antibióticos e a própolis.
O grupo dos antibióticos não associado à fitoterápicos não apresentou
diferença estatisticamente significante quando comparado aos controle positivo e
negativo, a clorexidina, ao óleo de copaíba, ao extrato de própolis, aos antibióticos
associados ao óleo de copaíba e os antibióticos associados ao extrato de própolis e
o extrato de própolis 30% isolado não apresentou atividade antibacteriana.
Através da coloração de Gram pode-se observar uma predominância de
bactérias Gram-positivas nesta amostra estudada(Figura 6).
3.6.DISCUSSÃO
21
A associação de antibióticos, mais especificamente a associação de
metronidazol, ciprofloxacina e cefaclor tem apresentado resultados significativos na
redução microbiana de bactérias de lesões de cárie dentinárias de acordo com
SATO et al. (1993), HORI et al. (1997), PINHEIRO et al. (2005). O cefaclor é o
responsável por agir sobre as bactérias Gram-positivas inibindo a síntese da parede
celular. O metronidazol gera compostos citotóxicos que interferem no metabolismo e
degradam o DNA agindo sobre as bactérias anaeróbias, auxiliado pela ciprofloxacina
que interfere na síntese do DNA bacteriano, inibindo a DNA-girase, enzima
bacteriana essencial a sua replicação, sobre os cocos Gram-negativos (TAVARES,
2002 e YAGIELA et al., 2000).
Microrganismos são conhecidos por sua habilidade genética de adquirir
resistência aos fármacos através de mutações, principalmente bactérias Gram-
negativas que possuem uma efetiva barreira de permeabilidade, composta de outra
membrana, que restringe a penetração de compostos anfipáticos (TEGOS et al.,
2002). Nos resultados apresentados, pôde-se observar que dentre as substâncias
avaliadas, o grupo dos antibióticos associados ao extrato de própolis apresentaram
os maiores halos de inibição. Segundo NASCIMENTO et al. (2000), o possível efeito
sinérgico da associação entre antibióticos e extratos vegetais frente a
microrganismos sensíveis e resistentes, é relevante, levando a novas possibilidades
para o tratamento de doenças infecciosas quando os antibióticos por si só não
apresentaram efetividade durante tratamento terapêutico.
Entretanto, a própolis isolada não apresentou nenhuma atividade
antimicrobiana discordando dos relatos de WOISKY et al. (1994) e FERREIRA et al.
(1996), que observaram atuação antimicrobiana expressiva do extrato de própolis
contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. GEBARA et al. (1996) e
ALMEIDA et al. (2006) observervaram atividade contra S. mutans e S. sobrinus.
STEINBERG et al. (1996) e PARK et al. (1998) afirmaram que a própolis tem
atividade antimicrobiana contra S. mutans e KOO et al. (2000) mostraram efeito
inibitório para todos os grupos de microrganismos testados (C. albicans, S. aureus,
E. faecalis, S. sobrinus, S. sanguis, S. cricetus, S. mutans, A. naeslundii, A.
viscosus, P. gengivalis, P. endodontalis). PINHEIRO et al. (2003) e NASCIMENTO et
al. (2005) trabalharam com a associação de própolis a cimento ionomérico e adesivo
dentinário respectivamente, quanto a sua capacidade antimicrobiana sobre S.
mutans, sendo que apenas a associação de 5% própolis ao cimento ionomérico
22
apresentou resultados satisfatórios. Segundo MANARA et al. (1999) e FERNANDES
JÚNIOR et al. (2003), alguns aspectos podem influenciar a ação antimicrobiana da
própolis, tais como: forma de preparo (alcoólico ou não alcoólico), época e local de
coleta, espécie de abelha produtora e ainda problemas com o controle de qualidade,
podendo a mesma estar contaminada por fungos.
A própolis tem sido extensivamente estudada por suas propriedades
biológicas, principalmente atividade antimicrobiana e seu mecanismo de ação
parece ser complexo e ainda não totalmente entendido. De acordo com AMOROS et
al. (1994) e BONHEVI et al. (1994), a atividade contra os microrganismos está mais
relacionada ao efeito sinérgico dos flavonoídes (e outros fenóis), que a ação de cada
um deles separados, corroborando o estudo de TAKAISIKIKUNI & SCHILDER
(1994) que observaram que a ação antimicrobiana utiliza vários mecanismos como:
desorganização citoplasmática, da membrana plasmática e da parede celular,
bacteriólise parcial e inibição das sínteses protéicas, além da inibição da divisão
celular.
A associação do antibiótico ao óleo de copaíba apresentou atividade
antimicrobiana significante não havendo relatos prévios na literatura sobre esta
associação. Neste trabalho, o óleo de copaíba isolado não apresentou atividade
antimicrobiana significante, discordando dos achados de SOUZA et al. (2005) e
VEIGA & PINTO (2002), que mostraram atividade antibacteriana do óleo de copaíba
frente ao S. mutans e DRUMOND et al. (2004) que observaram atividade
antimicrobiana do óleo de copaíba sobre L. casei, S. mutans e S. sanguis.
Segundo a literatura, a microbiota dentinária é predominantemente
composta de bactérias anaeróbias facultativas ou obrigatórias (HOSHINO, 1985 e
MASSEY et al., 1993). No presente trabalho, o crescimento parece ser
predominantemente composto por bactérias Gram-positivas, o que pode ser
observado por meio da coloração de Gram, corroborando os estudos de CRONE
(1968) e HOSHINO (1985), que relataram predomínio de bactérias bastonetes e
cocos Gram-positivos em lesões de cárie dentinárias e discordando de MASSEY et
al. (1993) que observaram maior quantidade de bactérias Gram-negativas como
Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium e presentes em pequenas quantidades
Lactobacillus.
Dentre as substâncias avaliadas neste estudo, o digluconato de clorexidina é
um dos agentes antibacterianos mais estudados e que no presente trabalho
23
apresentou atividade antibacteriana significante como os achados de GULTZ et al.
(1999) que apresentaram resultados positivos quando avaliaram diferentes agentes
de limpeza cavitária sobre cepas de S. mutans, S. salivarius e A. viscosus e todos os
materiais que continham clorexidina em sua composição apresentaram atividade
antibacteriana. A clorexidina tem substantividade, ou seja, habilidade de manter um
agente em contato com um organismo tempo suficiente para eliminar ou incapacitar
o mesmo (GULTZ et al., 1999; e WICHT et al., 2004). TURKUN et al. (2005)
avaliaram o Cervitec ® (clorexidina 1%, thymol 1%) sobre a microbiota de lesões
dentinárias “in vivo” e observaram atividade antimicrobiana somente sobre
Lactobacillus.
A clorexidina tem seu mecanismo de ação baseado na adsorção à superfície
da célula bacteriana, o que provoca uma alteração na permeabilidade celular e
conseqüente perda de seus constituintes e em altas concentrações provoca
também, rapidamente, a precipitação de constituintes citoplasmáticos das bactérias.
Desde a comprovação da atividade antibacteriana do hipoclorito de sódio a
5,25% (NaOCl) o mesmo tem sido adotado como controle positivo em estudos
envolvendo crescimento bacteriano ou atividade antibacteriana (TURKUN et al.,
1999). Neste estudo, o NaOCl foi utilizado na concentração de 1%, como controle
positivo mas, não apresentou resultados satisfatórios, apresentando halos de
inibição com média de 2 mm corroborando o estudo de TURKUN et al. (2005). Para
ERGÜCÜ et al. (2005), o NaOCl a 1% exerce uma forte atividade antibacteriana
contra S. mutans, S. sobrinus e L. acidophilus. Entretanto, o uso do NaOCl como um
anti-séptico dentinário tem sido controverso porque o mesmo remove a camada de
colágeno e impede a futura hibridização, caso a restauração da cavidade for feita
com resina composta (PIOCH et al., 1999; PERDIGÃO et al., 2000).
A aplicação de anti-sépticos após o preparo cavitário e antes da restauração
ganhou ampla aceitação como um método de eliminar o risco potencial de lesões de
cárie residuais (MEIERS & KRESIN, 1996 e GULTZ et al., 1999) e também reduzir a
sensibilidade pós-operatória causada por bactérias (MEIERS & KRESIN, 1996;
OWENS et al., 2003).
Entretanto, uma questão ainda discutida na literatura é o fato de que os
componentes das soluções utilizadas para pré-tratamento dentinário após preparo
cavitário, além de eliminarem bactérias, também podem induzir infiltração por
interferir na adesão mecânica da interface dente/material. MEIERS & KRESIN,
24
(1996), RABELLO & COELHO (1998), BOCANGEL et a. (2000), RUANO &
CIAMPONI (2002) e SILVESTRE et al. (2005) mostraram que agentes
antibacterianos não causaram efeito adverso no processo de adesão dentinária, ao
contrário de TULUNOGLU et al. (1998) e OKIDA et al. (2001) que revelaram um
aumento na microinfiltração das restaurações quando utilizadas soluções de
clorexidina. OWENS et al. (2003) observaram que apenas nas cavidades que foram
tratadas com Consepsis Scrub (clorexidina 2% contendo partículas abrasivas
residuais de sílica e vidro) houve maior microinfiltração.
No presente trabalho, utilizou-se o método de difusão em agar, por ser
geralmente aceito como um meio de testar a atividade antimicrobiana dos
biomateriais. Apesar de o método ser simples, barato, e fácil de repetir, a atividade
antimicrobiana dos materiais testados colocados nas placas de agar podem ser
afetados pelo pH do substrato, período de incubação e densidade do inoculo, como
também a capacidade de difundir-se no meio de cultura (VIRTUOSO et al., 2005).
Outro aspecto que deve ser levado em consideração é o tamanho da amostra que
no presente trabalho é pequena. Também deve se pensar na possibilidade de
trabalhar com bactérias isoladas e não com cultura mista e assim poder afirmar a
atividade de cada substância a bactérias específicas. A relevância da presente
cultura, é reproduzir no laboratório, um ambiente propício para todas as bactérias
colhidas da lesão de cárie, situação esta, mais próxima da realidade clínica.
3.7.CONCLUSÕES
25
Diante da metodologia e resultados apresentados pode-se concluir que a
associação dos antibióticos (metronidazol 1%, cefaclor 1% e ciprofloxacina 1%) com
o extrato de própolis a 30% apresentou os maiores halos de inibição em bactérias
presentes na dentina afetada colhida de molar permanente.
3.8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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31
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detistas. 4a ed. Trad. De Patrícia Josophine Voeux. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2002.
32
ANEXO I
33
ANEXO II
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1. Consentimento
Eu _________________________________, RG __________________,
responsável pelo menor ______________________________________certifico que
tendo lido as informações prévias e tendo sido esclarecido sobre todos os itens,
estou plenamente de acordo com a realização do experimento.
2. Título da pesquisa
“Avaliação do efeito antimicrobiano de agentes de limpeza cavitária
compostos de antibióticos e/ou fitoterápicos”
3. Objetivo principal e justificativa
Avaliar a ação de algumas substâncias que matam bactérias sobre a dentina
(“parte de dentro do dente antes de chegar no nervo”). O comprometimento da
dentina se não tratada, muitas vezes, leva a um tratamento de canal (“nervo”) e às
vezes até mesmo à remoção (“arrancar”) do dente. Em crianças com quando isto
ocorre nos dentes de leite, pode prejudicar o dente permanente que ainda vai
erupcionar (“nascer”). Por isso, o estudo de substâncias que matem essas bactérias
poderá prolongar o tempo de permanência deste dente e acabar com o foco de
infecção causado por bactérias.
4. Procedimento
A realização desta pesquisa necessitará de 1 (uma) consulta. Nesta consulta
será feita uma radiografia e o tratamento do dente comprometido com a obturação
do dente com massinha branca (cimento de ionômero de vidro).
5. Benefício
Para o voluntário, vários benefícios ocorrem: aprendizado dos fatores
responsáveis pela doença cárie em dentes-de-leite e permanetes, condições de
saúde analisadas por pessoal treinado e capacitado para essa finalidade,
“obturação” dos dentes com possível diminuição de bactérias e contribuição para o
estudo de medicamentos que tenham capacidade de eliminar as bactérias presentes
em dentes cariados (doentes).
6. Risco
34
Em caso de sensibilidade a qualquer produto utilizado nesta pesquisa os pais
deverão comunicar a pesquisadora responsável Mariana Iost Antunes, através do
telefone (xx16) 9796.5830 ou (xx16) 3335.8317.
Este tratamento não oferece desconfortos adicionais àqueles que a criança
esta sujeita na clínica odontopediatrica. A sensibilidade dolorosa durante este
procedimento não é esperada, porém, caso aconteça, o voluntário, os pais e/ou
responsáveis devem entrar em contato direto com a pesquisadora responsável.
7. Informações adicionais
O voluntário ou seu responsável tem a garantia de que receberá a resposta a
qualquer pergunta, e esclarecimento de dúvidas sobre os procedimentos e
benefícios relacionados à pesquisa. A criança só será envolvida na pesquisa caso
haja o consentimento do seu responsável, através da assinatura desse termo, e
também após consentimento verbal da própria criança. Ou seja, caso a criança não
queira participar, nenhuma forma de condicionamento ou contenção física será
realizada para que ela participe do estudo.
8. É importante que o voluntário contribua com a se riedade da pesquisa
♦ Cooperação e fidelidade no fornecimento dos dados;
♦ A solicitações e pontualidade devem ser seguidas;
♦ Qualquer tratamento médico-hospitalar iniciado deverá ser informado à
pesquisadora;
♦ Os resultados do estudo não são apenas de responsabilidade dos
pesquisadores, mas da consciência individual e conjunta de todo o grupo
envolvido no trabalho;
9. Retirada do consentimento
O voluntário ou seu responsável tem a liberdade de retirar seu consentimento
a qualquer momento, deixando de participar do estudo, sem prejuízo ao tratamento
que ele receberá ou já está recebendo na Clínica Odontológica Integrada Infantil da
Faculdade de Odontologia do Centro Universitário Hermínio Ometto - UNIARARAS.
Além disso, a não aceitação de participar na pesquisa não implica problemas com o
tratamento, ou seja, o tratamento odontológico continuará normalmente.
Os resultados obtidos serão sigilosos, não sendo divulgada a sua identidade.
Os dados serão obtidos através de um questionário, de avaliações intra-orais em
35
questionários identificados apenas com as iniciais dos nomes e um número de
controle. O nome dos voluntários não será divulgado .
10. Declaração de quem dará esclarecimentos ao part icipante da pesquisa
A pesquisa será realizada pela mestranda em Odontopediatria do Curso de
Odontologia do Centro Universitário Hermínio Ometto, Mariana Iost Antunes,
orientada pela Profº. Dr. Sérgio Luiz Pinheiro e co-orientadora Profª Drª Ana Laura
Remédio Zeni Beretta e durante e após a pesquisa, os pesquisadores estarão
disponíveis para responder todas as dúvidas.
Se necessários maiores esclarecimentos, os telefones de contato dos
pesquisadores responsáveis são (16) 9796.5830 e (11) 9245 0090, os quais estarão
disponíveis a qualquer esclarecimento.
Araras, _____ de_____________ de 2006.
_________________________________________
Nome legível
_________________________________________
RG
_________________________________________
Assinatura
_________________________________________
Assinatura do responsável
36
Figura 1: Inóculo de cultura e escala 0,5 de MacFarlad
Figura 2: Semeaduras das placas
Figura 3: Placas contendo os discos com as substâncias
37
Figura 4: Halos de inibição dos controle positivo (CP), controle negativo (CN),
clorexidina (CLX) e antibióticos (A).
Figura 5: Halos de inibição dos antibióticos associados ao óleo de copaíba
(A+OC), dos antibióticos associados ao extrato de própolis (A+P), do óleo de
copaíba (OC) e da própolis (P).
A
CLX
CP
CN
A+OC
A+P
P
OC
Figura 6: Coloração de Gram indicando a presença de cocos e bacilos Gram-
positivos.
39
Quadro 1: Distribuição dos materiais
ABREVIATURAS
MATERIAIS
CP Hipoclorito de Sódio a 1%
CN Soro
A Antibióticos
P Própolis
OC Óleo de Copaíba
A+P Antibióticos + Própolis
A+OC Antibióticos + Óleo de Copaíba
CLX Clorexidina a 2%
40
Tabela 1 – Estatística descritiva simplificada CP CN CLX A OC P A+OC A+P
N= 3 3 3 3 3 3 3 3
Mínimo 1,0 0,0 7,0 5,0 0,0 0,0 10,0 14,0
Máximo 3,0 0,0 8,0 10,0 2,0 0,0 14,0 16,0
Média Aritmética
2,0 0,0 7,67 7,0 1,0 0,0 12,33 15,0
Desvio- padrão
1,0 0,0 0,57 2,64 1,0 0,0 2,08 1,0
CN: controle negativo (soro) CP: controle positivo (NaOCl 1%) CLX: clorexidina 2% A: associação dos antibióticos OC: óleo de copaíba P: extrato de própolis 30% A+OC: antibióticos associados ao óleo de copaíba A+P: antibióticos associados ao extrato de própolis 30%
41
Tabela 2 - Teste estatístico de Kruskal-Wallis
CP CN CLX A OC P A+OC
CP --- 0,2727 --- --- --- --- ---
CLX 0,3263 0,0377* --- --- --- --- ---
A 0,4025 0,0531 0,8852 --- --- --- ---
OC 0,6442 0,5254 0,1489 0,1939 --- --- ---
P 0,2727 1,0000 0,0377* 0,0531 0,5254 --- ---
A+OC 0,0941 0,0056* 0,4884 0,4025 0,0327* 0,0056* ---
A+P 0,0304* 0,0011* 0,2366 0,1842 0,0086* 0,0011* 0,6236
* Diferença estatisticamente significante (p<0,05)
CN: controle negativo (soro) CP: controle positivo (NaOCl 1%) CLX: clorexidina 2% A: associação dos antibióticos OC: óleo de copaíba P: extrato de própolis 30% A+OC: antibióticos associados ao óleo de copaíba A+P: antibióticos associados ao extrato de própolis 30%
42
Gráfico 1 – Médias aritméticas dos grupos
0
2
4
6
8
10
12
14
16
CP CN CLX A OC P OC+A P+A
CN: controle negativo (soro) CP: controle positivo (NaOCl 1%) CLX: clorexidina 2% A: associação dos antibióticos OC: óleo de copaíba P: extrato de própolis 30% A+OC: antibióticos associados ao óleo de copaíba A+P: antibióticos associados ao extrato de própolis 30%
Milímetros
Grupos amostrais
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