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kinetic parameters ofSaccharomyces cerevisiae in batchfermentation
during different growthconditionsDATASET SEPTEMBER
2013DOWNLOADS6,713VIEWS3482 AUTHORS, INCLUDING:Miguel Alejandro
Muoz FloresUniversidad Tecnolgica de Chile2 PUBLICATIONS 0
CITATIONS SEE PROFILEAvailable from: Miguel Alejandro Muoz
FloresRetrieved on: 24 July 2015Publicado online el 28 de
septiembre del 2013
EstimacindeparmetroscinticosdeSaccharomycescerevisiaeensistemade
fermentacin Batch bajo distintas condiciones de crecimiento Miguel
Muoz, Gustavo Catrilaf.
LaboratoriodeIngenieraenfermentaciones,DepartamentodeIngenieraenBiotecnologa,reade
procesosagroindustriales.UniversidadTecnolgicadeChile,Av.VicuaMackenna3864conCamino
Agrcola, Santiago, Chile. Resumen. Durante el proceso de
fermentacin aerobia, se estudiaron los efectos de la temperatura,
pH,medioenriquecido,concentracindeazcares,limitacindeoxgeno,enlosparmetrosde
crecimientodelaSaccharomycescerevisiaeendistintascondicionesdecultivo.Paraevitar
comenzar con fase lag (>1h), se inici la fermentacin con un
cultivo previo al fermentador, por lo
quelaslevadurascomenzaronlafermentacintansolounahoradespusdelainoculacin.La
temperaturafueunadelasvariablesmsimportantes,sinembargo,losefectosdelas
concentracionesdeazcaresyelpHfuerontambinsignificativos.Desdeelcomienzodela
fermentacin, se utiliz 37C como temperatura ptima para estas
levaduras, las cuales despus de 3 horas fueron sometidas a un shock
trmico, aumentando en 15C por sobre la temperatura ptima, llegando
a los 52C. Los principales resultados con respecto al shock trmico
fueron la disminucin progresiva de la biomasa a los 20 minutos bajo
shock trmico, quedando con una concentracin de biomasa de 2,1gL-1
despus de 4,5horas de fermentacin,y adems, la determinacin
deazcares,
confirmunadesaceleracinenelconsumodestosdesdeelcomienzodelshocktrmico,
quedandoconunaconcentracinde0,182gL-1unavezalcanzadaslas3horasy20minutosde
fermentacin. Adicionalmente, con estos datos, se pudo obtener
parmetros cinticos, tales como la velocidad especfica de
crecimiento (0,188h-1) los cuales fueron de gran importancia para
entender el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae en el
proceso de fermentacin aerobia.
Palabrasclave:fermentacinaerobia,shocktrmico,Saccharomycescerevisiae,velocidad
especfica de crecimiento (). Abstract. During the aerobic
fermentation process, the effects of temperature, pH,enriched
media,
sugarconcentrations,oxygenlimitations,inthegrowthparametersofSaccharomycescerevisiae
underdifferentcultureconditionswerestudied.Toavoidstartingwithlagphase(>1h),the
fermentationstartedwithacultureprevioustothefermentator,thustheyeaststartedthe
fermentationjustonehouraftertheinoculation.Thetemperaturewasoneofthemostimportant
variables,however,theeffectsofthesugarconcentrationsandthepHwerealsosignificant.From
the begining of the fermentation, 37C were used as optimal
temperature for the yeast, which after 3
hourswereunderheatshock,increasing15Covertheoptimaltemperature,reaching52C.The
main results with respect to the heat shock were the progressive
decreaseof the biomass at the 20
minutesunderheatshock,withonly2,1gL-1ofbiomassconcentrationleftafter4,5hoursof
fermentation, and also, the sugar determination, confirmed a
deceleration in the sugar consumptions from the begining of the
heat shock, with only 0,182gL-1 of concentration left once the 3
hours and
20minutesoffermentationwerereached.Additionally,withtheobtaineddata,kineticparameters
wereobtained,suchasthespecificgrowthrate(0,188h-1)whichwerehelpfultounderstandthe
Saccharomyces cerevisiae growth in the aerobic fermentation
process. Key words: aerobic fermentation, heating shock,
Saccharomyces cerevisiae, specific growth rate () Publicado online
el 28 de septiembre del 2013 1Introduccin.
Parauncultivodebiomasayasealevadurao bacterias se necesita un
reactor o fermentador lacualserlaherramientaprincipalparala
produccindeesta.steproveetodaslas
condicionesnecesariasparaelcultivo, tales comoagitacin,regulacinde
temperatura,suministrodeoxgeno,entradas para adicin de nutrientes,
control del pH, etc. Estasdiversascondicionesdecrecimiento
fueronrealizadaspordistintosgruposenel
laboratorio,condicioneslascualessepueden
encontrarlosefectosdelatemperatura,sub
ptima(oambiente),temperaturacrtica (shock trmico), concentraciones
de azcares, mediosenriquecidos,limitacindeoxgeno, entre
otros.Porotraparte,cuandosehabladesistemas de
cultivoo,tambin,mtodosdecultivo,se hacereferenciaalmododeoperar el
biorreactor, en este caso de cultivo en lote o
cultivoBatch.ElcultivoBatchesel crecimientodemicroorganismosenun
volumen fijo de nutrientes que continuamente
esalteradohastasuagotamientoporel
crecimiento.Serealizasinintercambiode
materiaconlosalrededores.Estesistema
ofrececomoprincipalcaractersticasu
simpleza,tantodesdeelpuntodevistade
equiponecesariocomodesuoperacin.Al
mismotiempo,estamodalidaddecultivo presenta limitaciones, como la
falta de control sobrediversosparmetrosdelcultivoyel
hechoquelasclulassedesarrollanenun estado fisiolgico poco definido
y cambiante. Elcultivoquesedesearealizaresdela levadura
Saccharomyces cerevisiae, la cual es una de las ms utilizadas en
diversos procesos delaindustriaalimenticia,comoenlas
fermentacionesdelvino,endondetieneun
fuertepapelenelefectodelacalidadyel sabor final del producto
(Arroyo-Lopez et al). Estemicroorganismoesmesofilo,porloque
creceaunatemperaturaentre30y40grados
Celsius,siendolatemperaturaptima37 grados aproximadamente (Paul
Held, et. al). Seobtendrlacurvadecrecimientode
biomasalacualseocupaelmtododepeso
secoyturbidimetraparaverificareste,se medir los azucares reductores
con el mtodo deMilleroDNSyatravsdelasdistintas ecuaciones
utilizadas para este tipo de cultivo,
seconocernlosdistintosparmetros
cinticosdeestalevadura,comovelocidad
especificadecrecimiento,rendimiento,etc.
Ademsdemedirestosparmetroscinticos, sellevaralalevaduraaunaumentode
temperaturaa15Csobrelatemperatura ptima, llegando a los 52C y se
observar el comportamientodeesta,eltiempoestimado en la cual se
realizara en la tercera hora. 2Objetivos Objetivo general
-Conocerelefectodediversas condicionesdecultivo,talescomo
temperatura,laconcentracinde azucares,limitacindeoxgeno,entre
otros,enlacinticadecrecimientode Saccharomyces cerevisiae.
Objetivos especficos -Establecerlascondicionesdecultivo
quealterarnsignificativamenteel crecimiento de la S. cerevisiae.
-Realizarelcultivoenlascondiciones escogidas,verificandoquesoloun
parmetroocondicinseaelque tengaunefectosignificativoenel
crecimiento.-Obtencindelosparmetroscinticos despus de realizar los
cultivos con las condiciones escogidas.Publicado online el 28 de
septiembre del 2013 Materiales y mtodos Figura 1: Diagrama de flujo
de la metodologa experimental y analtica. Figura 1: Se puede
observar que despus del inicio de la fermentacin comienzan las
metodologas analticas de determinacinde la concentracin
debiomasaydeconcentracin
deazcares.Sedecidihacertomademuestracada30minutosydespusdelshock
trmico cada 10 minutos debido a la disponibilidad de laboratorio el
da del prctico. El cultivo finalmente fue realizado en matraz
Erlenmeyer debido a que cuando se debi originalmente iniciar la
fermentacin se tuvieron problemas con el reactor. Publicado online
el 28 de septiembre del 2013 Metodologas Experimental
Medicindeparmetrosenbiorreactor mediante software micro CU System.
pH: ParalamedicindepHprimeroesnecesario calibrar el electrodo
propiamente tal, para ello sedebeiralmendeCalibration,unavez
ahsedebeelegirmodomanual(manually),
sumergirelelectrodoenelbufferdepH7.0,
esperarelavisodequelamedicinseha llevadoacabo,yluegorealizarelmismo
procedimientoconelbufferdepH4.0o9.0
dependiendodelrangodelproceso.Medirla
temperaturadelbufferyhacerclicken
TEMP.Ingresarlatemperaturamedidacomo
valordereferenciaparalacalibraciny confirmar con ok.Temperatura:
Para el control de la temperatura, es necesario
dirigirsealmendecontrolador(Controller)
hacerclickenTEMPydigitarlatemperatura deseada,enestecasoseutilizuna
temperaturade37C,consideradacomo ptima,yluegode52Cparaelshock
trmico.Parahabilitarelaguade enfriamiento,sedebehacerclickenTherm
fill, para que el suministro de agua fra pueda llenar el ciclo del
termostato. Aireacin-Oxgeno: Paracontrolarlaaireaciny/ooxgeno,se
debeiralmendecontrolador(Controller)y
hacerclickenpO2controller.Ajustarel porcentaje de O2 a utilizar,
click en ok. Agitacin: Paracontrolarelagitador,sedebeiralmen
decontrolador(Controller)yhacerclicken
STIRRController,ingresarunvalorderpm,
habilitarlavelocidaddeagitacinenmodo automtico y confirmar con ok.
Shock Trmico: Consideraremoscomoshocktrmicoel aumentar la
temperatura por 15C por sbre la temperaturaptima(37C)paraestimarlos
parmetros cinticos con crecimiento crptico.
Paraelloseelevarlatemperaturaenel momentoenquelafaseexponencialest
llegandoasufin,oalmenosseinterrumpir
esta.Porestimacionesbibliogrficas,se
realizarelshocktrmicocercanoalas3 horas de crecimiento. Analtica
Determinacin de turbidimetraEstemtodosebasaprincipalmenteen
lamedicindelacantidaddeluz dispersadaotransmitidaatravsdeun cultivo
bacteriano Paraladeterminacindebiomasaconel
mtododeturbidimetria,sesacaranmuestra
delreactoscada30min,lacualseharn dilucionesde1:9(1ml
demuestray9mlde aguadestilada),lacualsemediraenel espectrofotmetro
a 640 nm.Serealizaraunblancoenlacualtendrla misma dilucin, con 1 ml
de medio de cultivo y 9 ml de agua. Peso seco Curva de calibracin
Paralaobtencindebiomasa,esnecesario realizar previamente una curva
de calibracin, staserrealizadaporelgrupodelcultivo control.
Lacurvadecalibracinserealizaobteniendo8muestrasdelcultivocadaciertosintervalos
Publicado online el 28 de septiembre del 2013
detiempo,estasmuestrasde12mlcadauna
sedebendepositar12mlenuntuboFalcon,
loscualesdebenserrefrigeradosparasu
posteriorutilizacin.Almomentodeobtener
eltotaldemuestras,estasdebenser descongelasy2mldebensermedidosenel
espectrofotmetropararegistrarsu absorbanciaylos10mlrestantesdecada
muestras deben ser destinados para obtencin de biomasa por
seco.Paraobtencindebiomasaporpessecose deben realizar los
siguientes pasos: 1.Llevarlos8tubosconmuestraala centrifuga por 1
minuto a 5000 rpm 2.Luegoretirarelsobrenadanteysolo dejar el pellet
3.Agregaralostubosaguayre suspender en un
vortex4.Realizaresteprocedimientolasveces
queseanecesario,generalmentese realiza tres veces
5.Hacerrecipientesdepapelaluminio (capachos),masaryrotularcada
recipiente 6.Volverare-suspenderyverterel contenido en un capacho
rotulado 7.Llevar los capachos a una estufa a 180 C por 12 horas.
8.Trascurridoeltiemporetirarlos capachoseintroducirlosenuna
desecadoraparaprevenirquelas muestrasabsorbanlahumedaddel ambiente
9.Retirar un capacho de la desecadoray llevarlo a balanza analtica
10. Registrarmasayrestrselaalamasa del capacho rotulado previamente
para as obtener la masa final. 11. Elresultadodemasafinaldividirlo
por el volumen de la muestra, para as
obtenerlaconcentracindebiomasa final12.
Realizarelmismoprocedimientocon los recipientes restantes. 13.
Construirungrficodeconcentracin versus absorbancia. Determinacin de
Biomasa: Paralaobtencindebiomasaesnecesario realizar el siguiente
procedimiento: 1.tomarmuestrasdelcultivocada
ciertosintervalosdetiempoy rotularlasdelasiguienteforma muestra 1,
muestra 2, etc. 2.cadamuestradebeserllevadaal
espectrofotmetro.3.Elespectrofotmetrodebecontener
dosblancos,loscualessondos cubetascadaunaconaguadestilada ubicadas
una en elextremo superiory laotraenelextremoinferiordel recipiente
de lectura. 4.Tomarunacubetalimpiaysinrayas,
agregaraproximadamente1mldela muestra 1 y registrar su absorbancia.
5.Realizar elmismo procedimiento con todas las muestras.
6.Llevarlosvaloresregistradosal graficoconstruidoconlacurvade
calibracinyobtenerelvalorde biomasa para cada muestra. Publicado
online el 28 de septiembre del 2013 Determinacin de biomasa por
peso seco Material: Muestra microbiolgica. 3 tubos Eppendorf (vol.
15 mL). 3 pipetas (vol. 10 mL). 3 propipetas. Agua destilada.
Estufa. Centrfuga. Balanza analtica. Procedimiento:
Tomar10mLdelamuestrainicial,o problema,yllevarlosauntuboEppendorf
previamente masados. Estos tubos se llevan a
unacentrfugaporunperodode10minutos
conunavelocidaddeagitacinde4000rpm. Una vez finalizado el proceso
de agitacin, se elimina el lquido sobrenadante y se rellena la
muestraconaguadestiladahastaelvolumen
inicial(10mL),steprocesoserealizapor
triplicado.Unavezrealizadalatercera
aforacinsellevaeltuboalaestufaauna temperaturade105Cporunperodode12
horasohastaquelamasaseaconstante.
Luegodeterminarelsecado,sedeterminala masa en una balanza
analtica.Labiomasaseobtendrconlasiguiente ecuacin: (
)
( ) Esterilizacin previa del bioreactor Materiales: Autoclave
Bioreactor Procedimiento: Previamentealautilizacindel
Bioreactorparaelprocesobiolgico, esnecesariaunaesterilizacindel
equipoparaevitarcontaminaciones. Para esto se debe disponer el
reactor a autoclavadoporunperodode15 minutosyaunatemperaturade
120C. Mtodo de DNS Elaboracin del reactivo
DNS:Disolver4gdeNaOHen250mldeagua destilada ayudado por un agitador
magntico y calentamiento. 1.Disolver75grdetartratode
sodioypotasiojuntoconel NaOH. 2.Agregar2,5grcido dinitrosalisilico
poco a poco en bao termo regulado a 50C. 3.Dejar disolver durante
30min o hasta que no existan grumos. 4.Filtraralvacomediante
membrana. Elaboracin de la curva de calibracin:
1.Prepararporduplicado solucionesdeglucosaanhidra conlassiguientes
concentraciones.0,0mg/l (blanco),0,2mg/l,0,4mg/l, 0,6 mg/l, 0,8
mg/l y 1,0 mg/l. 2.Leer la absorbancia en espectro fotmetro
utilizando 540nm de longitud de onda. 3.GraficardatosABSvs
CONCENTRACION. 4.Agregarlneadetendencia lineal y obtener la ecuacin
del grfico, Y=mX+b. Publicado online el 28 de septiembre del 2013
Medicin de un analito: 1.Tomar2mldemuestra
problemautilizandounamicro pipeta. 2.Centrifugarpor3mina 3000rpm.
3.Colocar1mldelamuestraen matraces aforados de 50, 100 y 200 ml y
aforar. 4.Secolocara1mldelas muestrasanterioresen3tubos de ensayo
respectivamente. 5.Adicionar3mldelreactivo DNSacadatubo
(procedimiento por triplicado). 6.Paralelamente se debe preparar
unblancoquellevara1mlde agua destilada y 3ml de
DNS7.Dejarcalentarlostubosde ensayoaanalizara100Cpor 5min y luego
dejar enfriar. 8.Aadir 6ml de agua destilada a cada tubo de ensayo.
9.Llevaraespectrofotmetrode absorcinmolecularymedira
540nm.(ajustarelautocero conelblancopreparado anteriormente).
*Delas3dilucionesanalizadasseoptarpor
laqueesteenelrangodeabsorbancia establecido (0,200 0,800).El
procedimiento antes descrito se realizara slo con la dilucin
determinada (50 o 100 0 200 ml) Materiales: 2 Micropipetas de 1000
l 3 pipetas de 10 ml 3 propipetas 10 gotarios2 Tubos de en ensayo
de 5 ml 12 tubos de ensayo de 10 ml2 Vasos precipitados de 500 ml 1
Matraz aforados de 50, 100 y 200 ml4 Cubetas de vidrio 1 Mecheros1
Trpodes1 Centrifuga 1 Espectrofotmetro UV visible. 1 caja de
guantestalla s Parafilm 2 picetas de agua destilada1 piceta de
alcohol al 70 % 1 termmetro2 gradillasManejo matemtico:
Luegodeobtenerlosresultadosdelespectro
fotmetro,estossedebenreemplazarenla ecuacin arrojada por la curva
de calibracin: Y=mX+b ABS=A[X]+B[X]=(ABS-B)/A Dnde: ABS:
Absorbancia. A y B: constantes. [X]: Concentracin. Diseo del medio
de cultivo Formulacin del medio de cultivo:
Sedebenmasarlosdiferentescomponentes delmediosegnlatablaconsus
componentes. Luego trasladar los nutrientes a
unmatraz,adicionaraguadestiladayaforar hasta1000mL.Elmatrazsellevaa
esterilizacin junto con las pipetas a travs del autoclave a 121C y
1atm por 15 minutos. Inocularcon10mldelcultivode
Saccharomycesutilizandolaspipetas graduadas de 10ml previamente
esterilizadas.Paraclculodevelocidadespecificade
crecimientoX=Xo*
5.8 = 3*
= 0.188 h-1 Publicado online el 28 de septiembre del 2013
TiempoduplicacindelalevaduraS. cerevisiae.Td = ln 2/ Td = 3.68
horasTabla1:Diseodemediodecultivo,medio definido. fuente elemento
gramosCGlucosa 4,0381 Nsulfato de amonio 1,1295 Mgsulfato de
magnesio 0,0944 Kfosfato de potasio 0,2816 Cacloruro de calcio
0,026 Na cloruro de sodio 0,0335 Fesulfato de fierro 0,038
Bibliogrficamentelaconstantedesaturacin
(Ks)paralaS.cerevisiaeesde25mg/l entoncespodemosdecirquelavelocidad
especificamximadecrecimiento(max)es
igualalavelocidaespecificadecrecimiento (),yaquealserpequeoelksde
saccharomycescerevisiaesevuelve prcticamente igual a max.
Discusiones Discusiones de experimentos globales
Lalevadurafueexpuestaadistintastiposde
experienciasenlascualesseanalizaransus
resultadosatravsdegrficosdeproduccin de biomasa y consumo de
sustrato. Temperatura crptica Grfico 1. Curva consumo de sustrato
Grfico 2. Curva concentracin celular
Enlosgrficos1y2,selograapreciarquehayun
crecimientodebiomasaenlacuallalevaduracrecede
maneraexponencialtambin,estacreceatemperaturade35 C, y al aumentar
la temperatura a 50 C (punto 5), hubo una
muertetrmicalacualsevereflejadoenlostrespuntos siguientes. La clula
consumi el sustrato sostenido en el tiempo, y recin en los puntos 6
y 7 se puede observarqueestasemantuvoeneltiempo,
estoprobablementesignificaqueenelmedio ya no queda microorganismo
existente. Limitacin de oxigeno Grfico3.Consumodesustratocon
limitacin de oxgeno. Curva consumo de
sustrato0,3000,3100,3200,3300,3400,3500,3600,3706,8 7 7,2 7,4 7,6
7,8 8 8,2 8,4Concentracin de azcar (g/L)Absorbancia (540 nm)Curva
concentracin Celular0,40,50,60,70,80,94,2416 4,6575 6,2947 6,6929
7,8699 5,9673 4,5159Concentracin celular (g/L)Absorbancia (540
nm)Publicado online el 28 de septiembre del 2013
Enestaexperienciaseeliminlaaireacina las3horasdesdequeseinicila
fermentacin,entoncessemuestraqueenel
punto180quecorrespondealas3horas,el sustrato permanece constante en
el tiempo, lo cualsepuedeconcluirquelaclulayano
consumeelsustratoyaqueestaalnotener oxgeno, tuvo una muerte
celular, por lo tanto sepuedeconfirmarqueestaclulaes netamente
aerbica. Medio enriquecido con extracto de levaduraGrfico 4.
Biomasa y sustrato en el tiempo.
Enestaexperienciaselograapreciarcon exactitud la fase
estacionaria, comparados con otrosresultadosyunconsumodesustratoal
mismo tiempo,yesto puede confirmar que el
medioenriquecidoayudaaqueel microorganismostengauncrecimiento
ptimo.Temperatura sub ptimaGrfico6.Biomasacontemperaturasub-ptima.
Estegraficomuestraquealdisminuirla
temperaturaa21C,sibienlalevadurano
tuvocrecimientoexponencialnotorio,fue aumentando en el tiempo.
Grfico7.Consumodesustratobajo temperatura sub-ptima.
Elgraficodesustratomuestraunaumentoen
losprimerospuntos,yluegounconsumo
constante,estoprobablementeocurripormalamanipulacinoperacional,oquela
levaduraestabacreciendodemanera inadecuada,yaqueenelgrficodebiomasa
muestraunpequeoaumentodebiomasa,lo
quenoquedaclaroconexactitudsifueun crecimiento real. Medio
enriquecido con extracto de levadura Grfico 8. Curva concentracin
celular Lospuntos6y7muestranunafase
estacionariatemprana,comparadosconotros
crecimientos,estoprobablementeocurriya queelmedioqueseocupofueuno
curva de de biomasa00,010,020,030,040,050,060,070,083 4 5 6 7
8concentracion celuar (g/l)Absorbancia (640 nm) Publicado online el
28 de septiembre del 2013 enriquecido,estotambinpudohaber
favorecidoalobtenermayores concentraciones de biomasa. Discusin
Shock Trmico. Una vez comenzado el shock trmico, se pudo
apreciarquelaconcentracindebiomasa seguaaumentandoanporsobrelos37C,
estoesdebidoaquelaSaccharomyces
cerevisiaeposeeunmecanismoderespuesta al shock trmico (heat shock
response, HSR), elcuallepermiteseguircreciendoinclusoal
llegaralos42C(KevinA.Moranoet.al).
Estoesdebidoaqueseliberaunazcarel cualpermitealasprotenasretenersu
conformacinnativaaelevadastemperaturas
ysuprimirlaagregacindeprotenas denaturadas(MikeA.Singer&Susan
Lindquist).Detodasformasdespusdeal menos20minutoscreciendobajoshock
trmico,alascenderlatemperaturaporsobre
los42Cyfinalmentellegaralos52Cse puedeapreciarcmoesquedisminuye
considerablemente la cantidad de biomasa, y a
suvezqueelconsumodeazucaresdejade
variarconeltiempo,confirmandolamuerte de gran parte de las
levaduras. Grfico9.Curvadecrecimientodebiomasa con shock
trmico.
Elgraficomuestrauncrecimiento exponencialhastaelpunto9,lacual
correspondealmomentodelshocktrmico, luegolacurvacomienzadescender
abruptamenteyaquelatemperaturadeese momentoesde15Csuperioraloptimo
(35C), llegando a alcanzar los 50
CGrfico10.Analisisdeazucaresreductores con shock trmico.
ElanlisisrealizadopormediodeDNS,
muestraelconsumocelulardeazcar,este muestrauncomportamientonormalde
consumohastaelpunto5(horas),dondeen
esemomentoserealizaelshocktrmico,y
muestracomodelpunto5haciadelantese
mantieneconstantelacurvaeneltiempo,y
estosedebeaquelacelulayanoconsume este. 02460 5 10 15Curva biomasa
g/L00,20,40,60,810 5 10Concentracin [g/L] Tiempo Consumo de
sustrato Publicado online el 28 de septiembre del 2013 Referencias:
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Saccharomyces cerevisiae. Citado el 8 de septiembre del 2013.
Disponible on-line en:
http://www.biotek.com/assets/tech_resources/SynergyH1_Yeast_Growth_App_Note.pdf
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The Yin and Yang of trehalose. Citado el 12 de septiembre del 2013.
Disponible on-line en:
http://www.cell.com/trends/biotechnology//retrieve/pii/S0167779998012517?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0167779998012517?showall=true
4)Arroyo-Lpez, Effects of temperature, pH and sugar concentration
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kudriavzevii and their interspecific hybrid.Citado el 15 de
septiembre del 2013. Disponible on-line en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19246112 5)Arjun Singh. Genetic
analysis of mutations affecting growth of saccharomyces cerevisiae
at los temperature. Citado el 21 de Septiembre del 2013. Disponible
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1213157/
