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Citogenetica eBiologia molecolare

Convegno regionale SIE – Giornate Ematologiche Pescaresi

Mieloma Multiplo,una nuova era

Pescara, 21 settembre 2009

Risk Factors• Decline in the immune system

– Increases with age, 40% of patients around 60 yrs

• Genetic factors– Ethnic variation (African Americans > caucasians >asians)– Higher incidence in males (1.5:1)– Familial clustering

• Occupational exposures– Agriculture, petrochemical, rubber & paint industries

» Gene Gene Interactions/Gene Environment Interactions

Citogenetica e Biologia molecolare

• Le informazioni che la citogenetica fornisce nelmieloma multiplo (MM) e nella gammopatiamonoclonale di significato indeterminabile(MGUS) sono limitate dalla scarsa proliferazionespontanea delle cellule e dalla difficoltà diseparare quelle neoplastiche preservandone laproliferazione.

• Per tali ragioni le anomalie cromosomiche siosservano solo nel 25-50% dei casi, più spessonelle forme avanzate.


• Il cariotipo presenta frequentementeriarrangiamenti complessi;

• l’iperdiploidia è presente nei 2/3 dei casi,• il cariotipo normale può evolvere in forme con

riarrangiamenti cromosomici durante il decorsodella malattia;

• le anomalie strutturali ricorrenti sono:– duplicazione del cromosoma 1q (30-40%);– riarrangiamenti del cromosoma 14q (40-50%);– anomalie del cromosoma 11q (30%);– le anomalie 6q (15%).


FISH

• Da tempo molte anomalie sono più facilmenteindagate mediante l’analisi in FISH su nucleiinterfasici.

• È stato così possibile rilevare inizialmentel’elevata frequenza di:

• delezioni/monosomie del cromosoma 13 (40%),• duplicazioni 1q (40%)• riarrangiamenti in 14q (60%).


Citogenetica e Biologia molecolareArricchimento del campione in cellule CD138+• chromosomal abnormalities without CD138 enrichment, 61/132

(46%)chromosomal abnormalities with CD138 enrichment 45 /49(92%)

• increase in chromosomal abnormalities with 13q-, 17p-, andder(14)(q32).

• G-banding cytogenetic abnormalities in 19/72 cases (26%).Concordance between G-banding and i-FISH for one or moreaberrations was found in 14 patients.Translocation (11;14) was detected by both methods in four of fivecases.

• either near-tetraploidy/triploidy or hypoploidy in the G-bandedkaryotypes could not be elucidated with certainty with i-FISH.

• 3/10 MGUS patients showed abnormalities.• PC-ID+ is important for the detection of structural

aberrations Christensen et al 2007

• Con la FISH, meglio se associata all’arricchimento del campioneper le cellule MM CD138+, il 67-90% dei casi presenta anomaliecromosomiche

• due entità con differente significato prognostico:1. iperdiploidia a migliore sopravvivenza complessiva, e presenza di trisomie

3, 5, 7, 9, 11, 15, 19, 21 associate infrequentemente a riarrangiamentistrutturali (t IgH comuni: 12%);

2. ipodiploidia (o, meglio, non-iperdiploidia) molto spesso caratterizzata dariarrangiamenti cromosomici strutturali complessi, traslocazionicoinvolgenti 14q32 (t IgH comuni 70%), delezioni o monosomie delcromosoma 13, e progressione rapida.


- La delezione di 17p e il riarrangiamento del gene MYC sono tipicidelle forme avanzate e indicatori di evoluzione maligna.

Cariotipo complesso in MM: dup(1q), del(1p),der(5)t(5;9),t(6;8;10),-13,+18


5050Riarrangiamenti IgH

76,311Non-iperdiploidia +del13q

2511,5Non-iperdiploidia31,938iperdiploidia + del13q45,624,6del13q59,554Iperdiploidia

MMMGUS

Brousseau et al 2007

Anomalie cromosomiche in FISH

Citogenetica e Biologia molecolareTranslocazioni Cromosomiche coinvolgenti IgH (14q23) in MM

Cinque sono i partner più frequenti delle traslocazioni coinvolgenti il locus IGH:

11q13

6p21

4p1616q2320q12

FGFR3/ MMSET (4p16; 9%)CCND3 (6p21)CCND1 (11q13; 20%)MAF (16q23)MAFB (20q11).

Il locus IGH può ancherisultare coinvolto intraslocazioni complessespecialmente nello stadioavanzato di MM.

Incidence of chromosomal abnormalities inmultiple myeloma

Genomic aberration Incidence, % (no. of patients analyzed)

del(13) 48 (936)t(11;14)(q13;q32) 21 (746)t(4;14)(p16;q32) 14 (716)Hyperdiploidy 39 (657)MYC translocations 13 (571)del(17p) 11 (532)

Avet-Loiseau et al 2007


Prognostic value of chromosomal abnormalities (univariate analysis)

* Median EFS for patients presenting the chromosomal abnormality vs that of those without the genomic aberration.§ Median OS for patients presenting the chromosomal abnormality vs that of those without the genomic aberration. Whenthe median was not attained, we did calculate the percentage of patients alive at the time of median follow-up (ie, 41months).

22 months vs 75% (< .001) 15 vs 35 (< .001) del(17p)

72% vs 78% (.50) 35 vs 37 (.94) MYC translocations

82% vs 70% (.006) 37 vs 33 (.02) Hyperdiploidy

41.3 months vs 79% (< .001) 20.6 vs 36.5 (< .001) t(4;14)(p16;q32)

80% vs 74% (.28) 35 vs 34 (.2) t(11;14)(q13;q32)

68% vs 83% (< .001) 29 vs 41 (< .001) del(13)

Impact on OS § (P) Impact on EFS, mo* (P) Genomic aberration




Senza anomaliedel(13)

alta β2-microglobdel(13) / alta β2-microglob

t(4;14) o del(17)t(4;14) o del(17) / alta β2-microglob


• Good/average prognosisHyperdiploidyt(11;14)(q13;q32): cyclin D1 upregulation

• Bad prognosisHypodiploidyt(4;14)(p16.3;q32): FGFR3 and MMSET upregulationt(14;16)(q32;q23): c-MAF upregulation1q+ (overexpression of CKS1B)17p-13q-

Bladè et al 2008


ComparativeGenomic

Hybridization(CGH)

È la tecnica di baseper l’analisigenetica mediantemicroarray

Cromosoma 8 normale Cromosoma 15 in trisomia

• HR array CGH(Largo et al 2007)

• 100% dei casi consbilanciamentigenomici

• Hyp-MMcon/senzaamplificazioni 7q

• DuplicazioniXq21


• HR array CGH + SKY

• Differenze nei risultati tra la citogenetica classica el’arrayCGH


Largo et al 2007

• SNPArray CGH5q+, 12p- indicatori rilevanti per la prognosi




Fig 2. Prognostic impact of (A) hyperdiploidy and (B) amp(5q31.3) within hyperdiploid patients.


• Recentemente sono stati identificati alcunipolimorfismi in geni coinvolti nella riparazionedel DNA come possibili fattori predisponenti allosviluppo della malattia (Hayden et al 2007; Tewariet al 2009).

• Il coinvolgimento di XRCC4, XRCC5 e ligase4,oltre che fornire una base patogenetica per lamalattia e giustificare la forme familiari di MM,potrebbe suggerire nuovi bersagli per una terapia‘molecolare’ specifica per il singolo paziente.


• XRCC4: rs 963248 significant association with risk to myeloma• Strong association from A-T haplotype ( p=0.008)

– Rs 963248 tags for ten other SNPs

• XRCC5(Ku80): rs 1051685 genotype GG observed in ten myelomacases and one control (p=0.015)– Rare homozygous variant– 3′UTR –Functional characterization

• Ligase 4: rs 1805386 significant difference in allelic frequencybetween myeloma cases & controls (p=0.032)– Synonymous SNP


Tewari et al 2009


Our findings and those of Johnson et al (2008) highlight thesignificance of identifying genetic susceptibility loci in myelomapatients who contribute to increased disease risk and permitdelineation of key genetic variants that could help guide clinicalmanagement and therapeutic intervention for high-risk patients.

Blood 2009;22:5691

United States (4.8)

New Zealand (4.7)

Italy (4.5)

Ireland (4.0)

Extensive variation in incidence of Multiple Myeloma

Hanno collaborato:

G. PalkaD. FantasiaP. Guanciali FranchiR. Di GianfilippoD. RomagnoA. Marzuoli

Genetica Medica,Università di Chieti.UOC di Genetica Umana, P.O. ASL Pescara

G. FioritoniR. Di Lorenzo

Dip. di EmatologiaP.O. ASL Pescara


Multiple Myeloma• Haematological malignancy – terminally

differentiated B cells– Malignant plasma cells increasingly infiltrate the bone

marrow

• Incurable: 3-4 year survival with routine therapy– 4-5 year survival with high-dose therapy

• Incidence - Accounts for more than 10% of allhaematological malignancies– Increase in incidence at the rate of 2% per annum for

Europe

Defects in DNA repair during class switch recombination


Translocazioni Cromosomiche coinvolgenti IgH (14q23) in MM

11q13

6p21

4p1616q2320q12

Molecular karyotyping

Deletion

Duplication Array of DNA fragments

Patient DNA Control DNA

46,XX Cy5/ 46,XY Cy3

Direct chromosome preparations (DCP)A median of 58 metaphases (range 9-158) was analysed

per sample.Interphase FISH analyses using probes to detect IGH

rearrangements, -13/13q-, +3, +7, and +11 detectedAbnormal karyotypes in 15 (63%) of 24 MM and in 4(50%) of eight MGUS cases that could be successfullycytogenetically analysed.

Combining the G-banding and FISH results, abnormalitieswere detected in 29 of 31 (94%) MM and in six of eight(75%) MGUS patients. Thus, cytogenetic and FISHanalyses after DCP using 100-200 ng Colcemide/mlidentified aberrations in most MM/MGUS, irrespective ofPC percentages.

Nilsson et al 2004

Date post:	17-Feb-2019
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