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Clase 6 congelacion

Date post: 20-Nov-2014
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Congelaciòn de embriones
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CONGELACION DE CONGELACION DE EMBRIONES EMBRIONES
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Page 1: Clase 6 congelacion

CONGELACION DE CONGELACION DE EMBRIONESEMBRIONES

Page 2: Clase 6 congelacion

Ventajas de la Congelacion de Embriones

• No es necesario transferir los embriones inmediatamente después de colectados.

• No es necesario tener muchas receptoras sincronizadas.

• Permite el transporte de genética a bajo costo.

• Facilita la introducción de una nueva raza y la adaptación de los futuros terneros al nuevo medio ambiente.

Page 3: Clase 6 congelacion

•Disminuye el riesgo de introducir enfermedades exóticas.

•Los embriones pueden ser almacenados mientras se testean los padres por enfermedades o por producción.

•Almacenamiento de genética de razas o especies raras o en extinción.

•Permite mantener la diversidad genética a través de un banco de embriones.

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Page 5: Clase 6 congelacion

- 5 to - 7 °C - 30 to - 35 °C

Page 6: Clase 6 congelacion

Constitution of Freezing MediumConstitution of Freezing Medium

1. PBS + antibiotic-antimycotic1. PBS + antibiotic-antimycotic2. Biological proteins – 0.4-20%2. Biological proteins – 0.4-20%3. Cryoprotectants - ~10%3. Cryoprotectants - ~10%

*Glycerol*Glycerol*Ethylene Glycol*Ethylene Glycol

Page 7: Clase 6 congelacion

CryoprotectantsCryoprotectants

Permeating e.g. Glycerol or Permeating e.g. Glycerol or ethylene glycolethylene glycol

Nonpermeating e.g. SucroseNonpermeating e.g. Sucrose

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Page 9: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

Page 10: Clase 6 congelacion

ColectarColectar

Lavar (10 veces)Lavar (10 veces)

Clasificar los embriones.Clasificar los embriones.

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

Page 11: Clase 6 congelacion

Lavado de embriones• 5 lavados con PBS (1/100 volumen de los

embriones y no mas de 10 embriones)

• 2 lavados con tripsina al 0,2% por 30-60 segundos

• 5 lavados con PBS

• Los Embriones deben Tener la ZP intacta, sin material adherido y ser observados a 50X de magnificación

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Page 13: Clase 6 congelacion

Lavado de embriones

Page 14: Clase 6 congelacion

Enfermedades que no se Transmiten a través de la Transferencia de Embriones

Categoría 1• Leucosis Enzootica Bovina• Fiebre Aftosa (Bovino)• Lengua Azul (Bovino)• Brucela Abortus (Bovino)• Encefalitis Espongiforme Bovina (BSE)• Scrapie (Ovino)• IBR (Bovino) (con tripsina)• Pseudorrabia (Porcino) (con tripsina)

IETS, 2004

Page 15: Clase 6 congelacion

Categoría 2• Peste Porcina Clasica• Lengua Azul (ovino)

Categoria 3• DVB• Peste Bovina• Haemophilus Sommus• Virus de la Inmunodeficiencia

Bovina• Campilobacter Fetus (ovino)• Fiebre Aftosa (porcino, ovino y

caprino)• Enfermedad Vesicular Porcina• Adenomatosis Pulmonar (ovinos)

Categoría 4• Micobacterium Bovis• Micobacterium Paratuberculosis• Neospora Caninum• Anaplasmosis Bovina• Herpesvirus Bovino-4• Ureaplasma Micoplasma• Clamidia Psitaci• Virus Parainfluenza 3• Estomatitis vesicular (bovino)• Enfermedad de Akabane (bovino)• E. Coli 09:k99 (bovino)• Lepto Borgpeterseni s, hardjobovis• Enterovirus (bovino)• Maedi-visna (ovino)• Scrapie (Caprino)• Lengua Azul (caprino)• Artritis-encefalitis Caprina• Parvovirus porcino• Leptospirosis (porcino)• Brucela Ovis • Peste Porcina Africana• Circovirus Porcino• Sindrome Reproductivo y Respiratorio porcino

Page 16: Clase 6 congelacion

Cycle day: 6 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5 Cycle day: 6.5Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 3 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 1

Page 17: Clase 6 congelacion

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 2

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:2 Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:3

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5Quality Code:3 Quality Code:3 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5 Stage Code: 5Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:2 Quality Code:3

Page 18: Clase 6 congelacion

BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITYPage 3

Cycle day: 7 Cycle day: 7 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5Stage Code: 5 Stage Code: 6 Stage Code: 6 Stage Code: 6 Stage Code: 6Quality Code:3 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2

Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5 Cycle day: 7.5Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7 Stage Code: 7Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2

Cycle day: 8.0 Cycle day: 8.0 Cycle day: 7.0 Cycle day: 7.0 Cycle day: 7.0Stage Code: 8 Stage Code: 8 Stage Code: 4 Stage Code: 4 Stage Code: 4Quality Code:1 Quality Code:1 Quality Code:2 Quality Code:1 Quality Code:1

Page 19: Clase 6 congelacion

Calidad y Estadío de los Embriones Respuesta Posible a la Congelación

Calidad y Estadío de los Embriones Respuesta Posible a la Congelación

Estadío Descripción Grado Respuesta posible3 Mórula temprana 1

2 y 3variablemala

4 Mórula compacta 123

muy buenabuena - regularvariable - mala

5 Blastocisto temprano 123

muy buenabuena - regularvariable - mala

6 Blastocisto 123

muy buenabuena - regularmala

7 BlastocistoExpandido

12

muy buena pero variablebuena pero variable

Stroud y Leibo, 1995

Page 20: Clase 6 congelacion

Estado embrión P/total Valor P %Mórula 259/468ab

0,004

55,40

Blastocisto temprano

275/463a 59,39

Blastocisto 179/344bc 52,03

Blastocisto expandido

23/58c 39,66

Total 1333

Page 21: Clase 6 congelacion

Calidad Embrión

P/total Valor P %

1 693/1235a

0,01

56,11

2 32/65ab 49,23

3 11/33b 33,33

Total 1333

Page 22: Clase 6 congelacion
Page 23: Clase 6 congelacion

Cryoprotector

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

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Cryoprotector

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Page 31: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

1. Clasificar los embriones (Grado 1).1. Clasificar los embriones (Grado 1).

2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y 2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. cargar la pajuela.

Tiempo Total: 10 minutos.Tiempo Total: 10 minutos.

3. Colocar las pajuelas en la congeladora 3. Colocar las pajuelas en la congeladora

(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.

4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos

Page 32: Clase 6 congelacion

SeedingSeeding

Induction of ice crystals in the sample (break Induction of ice crystals in the sample (break the metastable state of solution)*the metastable state of solution)*

Begins cell dehydration processBegins cell dehydration process

*Critical step*Critical step

Crioprotector

Embryo

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Page 33: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

1. Clasificar los embriones (Grado 1).1. Clasificar los embriones (Grado 1).

2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la 2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. pajuela.

Tiempo Total: 10 minutos.Tiempo Total: 10 minutos.

3. Colocar las pajuelas en la congeladora 3. Colocar las pajuelas en la congeladora

(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos.

4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos

5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC.5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

6. Sumergirlas en N6. Sumergirlas en N22..

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Page 35: Clase 6 congelacion

DESCONGELACIONDESCONGELACION

10 segundos en arie10 segundos en arie30 segundos en agua a 25-30 30 segundos en agua a 25-30 ooCC

Vaciar la Pajuela en una placa de PetriVaciar la Pajuela en una placa de Petri

Remover el GlicerolRemover el Glicerol

Page 36: Clase 6 congelacion

Embryo Thawing & Broken Zonae

• Mouse Bovine• n % n %

• 22oC Water 223 (10.3%) 207 (21.7%)

• 22oC Air 220 (0.01%) 202 (0.02%)

• Palasz et al. (1989)

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Transferencia Directa Transferencia Directa de Embriones de Embriones

BovinosBovinos

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Cell Volume Changes with Addition and Cell Volume Changes with Addition and Removal of Removal of GlycerolGlycerol vs vs Ethylene GlycolEthylene Glycol

Diluent Diluent AddedAdded

InfluxInfluxEffluxEfflux

11

Rel

ativ

e C

ell

Rel

ativ

e C

ell

Vo

lum

eV

olu

me

Time in Permeating AdditiveTime in Permeating Additive

00

Page 44: Clase 6 congelacion
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Page 46: Clase 6 congelacion

1997 Census of Cattle Embryos Frozen and Transferred in Canada and the

USA

Glycerol Ethylene Glycol

Country

No. Frozen

% Pregnant

No. Frozen

% Pregnant % of Total

Canada 1,609 58.0 11,376 59.2 87.6

USA 12,411 56.9 15,433 58.5 55.4

(Leibo and Mapletoft, 1998)

Page 47: Clase 6 congelacion

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Seeding Temperatures of Direct Seeding Temperatures of Direct Transfer EmbryosTransfer Embryos

Seeding Temperature (oC)

-5-4 -6 -7 -8

Page 48: Clase 6 congelacion

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Cooling Rate of Direct Transfer Cooling Rate of Direct Transfer EmbryosEmbryos

Cooling Rate (oC/min) from -7oC to -33oC

0.4 0.5 0.6

Page 49: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

Page 50: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

• 1. Clasificar los embriones (Grado 1).• 2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. • Tiempo Total: 5 minutos.• 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y

dejar 1 a 2 minutos.• 4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos• 5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

• 6. Sumergirlas en N2.

Page 51: Clase 6 congelacion

Direct Transfer StrawDirect Transfer Straw

Ethylene glycol

EmbryoCotton plug Plug/label

E511 SM010769 SRN 5G DT 1

Page 52: Clase 6 congelacion

Pajuela de Transferencia Directa

Pajuela de Transferencia Directa

Etilenglicol 1,5 MEtilenglicol 1,5 M

Page 53: Clase 6 congelacion

Protocolo de CongelaciónProtocolo de Congelación

• 1. Clasificar los embriones (Grado 1).• 2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. • Tiempo Total: 5 minutos.• 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y

dejar 1 a 2 minutos.• 4. Realizar el “seeding”.• 5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC.

• 6. Sumergirlas en N2.

Page 54: Clase 6 congelacion

Effect of Time Between Flushing and Freezing on Pregnancy Rate (Embryos frozen at Em Tran & thawed at Holland

Genetics)Time (min) No. Transfers % Pregnant

0 - 30 85 54.1

31 - 60 418 56.0

61 - 90 722 56.0

91 -120 507 56.2

121 - 150 264 53.0

151 - 180 106 55.7

(Hasler, 2001)

Page 55: Clase 6 congelacion
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Page 57: Clase 6 congelacion
Page 58: Clase 6 congelacion
Page 59: Clase 6 congelacion

Protocolo de DescongelaciónProtocolo de Descongelación

• 1. Sacar la pajuela.

• 2. Colocarla en Baño María a 30 ºC por 30

segundos.

• 3. Transferir dentro de los 15 minutos de

descongelado.

Page 60: Clase 6 congelacion

100

90

80

70

60

50

40

Pre

gnancy

(%

)

Warming in Air of Direct Transfer EmbryosWarming in Air of Direct Transfer Embryos

Warming Time (sec) in Air

42 6 8 10

Page 61: Clase 6 congelacion
Page 62: Clase 6 congelacion

Rutina de Transferencia Directa de Embriones

Rutina de Transferencia Directa de Embriones

• Trabajar al lado de la manga• 1. Anotar número de receptora y embrión.• 2. Examinar ovarios (palpación o US) y

vaciar el recto. • 3. Anestesia epidural, limpiar zona perineal.• 4. Descongelar el embrión y cargarlo en la

vaina de transferencia.• 5. Transferir en el cuerno ipsilateral al CL lo

más rápido posible.• 6. Chequear planilla y largar.

Page 63: Clase 6 congelacion

Tiempo TETF P/total Valor P %≤180 segundos 251/385

0,42

55,84

>180≤360 segundos

372/655 56,79

>360 segundos 42/82 51,22

Total 1122

Peres Coelho et al., 2007

Page 64: Clase 6 congelacion

Embriones Brahman vs Bos Taurus (Looney et al., 2004)

Biotipo Glicerol Etilenglicol Total

N Pre. % N Pre. % %

Británicas 80 49 61 375 240 64 63.5

Continentales

105 61 58 131 80 61 59.7

Sintéticas con Brahman

103 67 65 231 124 54 57.2

Brahman 67 20 30 203 98 48 43.7

Totales 355 197 55.5 940 542 57.7

Page 65: Clase 6 congelacion

Porcentajes de preñez con embriones congelados o refrigerados por 24-30 h y transferidos en receptoras

cruzas Bos Indicus.

  Grado 1 Grado 2 Total

Congelados

27/49 (55,1) 7/20 (35,0)a 34/69 (49,3)

Refrigerados 21/36 (58,3) 7/13 (53,8)b 28/49 (57,1)

Tribulo et al., 2001

Page 66: Clase 6 congelacion

54.2057.50

52.70 52.40

0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00

100.00

Preñadas

Por

cent

aje

30 days60 days

Refrigerated

n=131

%

Frozen-Thawed DT

n=252

Page 67: Clase 6 congelacion

VitrificationVitrificationVitrumVitrum = Latin for glass= Latin for glassFormation of glassy solid without Formation of glassy solid without

ice crystalsice crystalsVery rapid freezingVery rapid freezingHigh molar level (5 to 7M) of High molar level (5 to 7M) of cryoprotectantscryoprotectantsRequires no freezer (Dewar of Requires no freezer (Dewar of

nitrogen)nitrogen)Can be used with in-straw dilutionCan be used with in-straw dilution

Page 68: Clase 6 congelacion

Advantages of Advantages of Vitrification to the Vitrification to the

PractitionerPractitionerNo freezer requiredNo freezer required

Faster with small no. of embryosFaster with small no. of embryos - -

Shortens day with small no. of embryos or at the Shortens day with small no. of embryos or at the

end of the day with “left over” embryosend of the day with “left over” embryos

Higher survival of IVF-derived embryos Higher survival of IVF-derived embryos

Increased survival of lower quality Increased survival of lower quality

embryosembryos

Page 69: Clase 6 congelacion

Procedures Basal embryo holding

medium

Sucrose or galactose

Need four media• Embryo holding medium• “Low” concentration EG• High concentration EG• Dilution medium

Page 70: Clase 6 congelacion

Addition of Addition of CryoprotectantCryoprotectant

3 minutes in 1st EG solution3 minutes in 1st EG solution

45 seconds in 245 seconds in 2ndnd EG solution EG solution• Draw embryo into straw, seal and Draw embryo into straw, seal and

freezefreeze

• Embryos can be loaded and frozen Embryos can be loaded and frozen approximately 1 per minuteapproximately 1 per minute

Page 71: Clase 6 congelacion

Straw ConfigurationStraw Configuration

DHCDM V2HCDM

Cotton plugPlunged end

Page 72: Clase 6 congelacion

ThawingThawing

In air 10 s

Water bath 37°C 20 s

Shake the straw

Back in bath

Dry

Embryo transfer

Page 73: Clase 6 congelacion

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