1

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 högskolepoäng C-nivå Vt. 2009

Cloning of the functional domains of TSP-1 for protein expression Shadi Zangi

Handledare: Magnus Rosenquist Institution för onkologi, radiologi och klinisk immunologi Uppsala universitet, Sweden

2

ABSTRACT

Thrombospondin-1 (TSP-1) is a multifunctional extracellular matrix glycoprotein that is

released from platelets α-granule to regulate angiogenesis process. TSP-1 is well-known as an

inhibitory factor of angiogenesis that binds to angiogenesis stimulating factors, for example

fibroblast growth factor 2 (FGF-2), vascular endothelial growth factor (VEGF) and

hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), to inhibit angiogenesis. We have cloned

TSP-1 domains separately to allow studying of their function and effect on proliferation of

human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We used an Escherichia coli

expressionsvektor including poly histidin-tags and lac-promoter for induction of the seven

successfully cloned domains by IPTG and arabinose. Our result shows that we have very low

expression and induction of our protein in the E.coli by IPTG and arabinose, which is most

likely due to complications associated with expressing a human protein in a prokaryotic

system.

KEYWORDS: Thrombospondin-1; Angiogenesis; cloning; protein expression

3

INTRODUKTION

Brist på syresättning och näringstillförsel är problem vid transplantation av till exempel

langerhanska öar. En snabb och korrekt revaskularisering är avgörande för funktion och

överlevnad hos transplanterade langerhanska öar. Det har rapporterats visst blodflöde i

langerhanska öar men kapillärerna utvecklas dåligt efter transplantation [1], vilket resulterar i

låg överlevnad av öarna. Stort fokus inom transplantationsforskning ligger därför på

angiogenes.

Angiogenes är blodkärlnybildning i kroppens vävnader. Denna procces regleras av

proangiogenetiska och antiangiogenetiska faktorer, en dynamisk interaktion mellan en

variation av celler, tillväxtfaktorer och extracellulärmatrix (ECM) [2]. Vid ökade behov av

syre och näring startar angiogenesen som stimuleras av tillväxtfaktorer. Endotelcellerna

migrerar till närliggande vävnad och ECM bryts ner med matrixmetalloproteinasenzymet

(MMP) för att nya blodkärl ska få plats att växa (Figur 1).

Fig. 1. Trombospondin-1 i angiogenesprocessen. Tillväxtfaktorer binder till receptorer på endotelcellernas (EC) ytor och aktiverar dem. EC börjar sin prolifiering och migrering för att bilda nya blodkärl. TSP-1 binder direkt till tillväxtfaktorer eller deras receptor och inhiberar angiogenesen. (Modifierad från www.angio.org/understanding/understanding_archive.html)

Trombospondin-1 (TSP-1) är ett protein som normalt finns i öarna och binder till

angiogenesstimulerande faktorer som till exempel fibroblast growth faktor 2 (FGF-2).

Forskning har visat att FGF-2- produktion minskar efter ö-cells transplantation [1]. TSP-1 är

en stor komponent i trombocyters α-granula och frisätts vid aktivering av trombocyter

tillsammans med kalciumjoner. Det är ett multidomänt och multifuntionellt, kalciumbindande

4

ECM glykoprotein som binder till matrix proteiner, receptorer på cellytorna, heparin,

tillväxtfaktorer, proteaser och kalcium. [3]

TSP-1 är inblandad i trombocytaggregation, sårläkning, inflammatorisk svar, tillväxt av

tumörer och reglering av angiogenes. Det binder med hög affinitet till flera andra

heparinbindande angiogenes-faktorer som till exempel fibroblast growth factor 2 (FGF-2),

vascular endotelial growth factor (VEGF) och hepatocyte growth factor/scatter factor

(HGF/SF) [2].

Strukturen hos TSP-1 med 7 domäner visas i Figur 2:

Fig.2. Olika domäner hos TSP-1 med deras bp-storlek, namngivna efter domänens första bokstav. H = Aminoterminal domän (N-terminal): som har en heparinbindning funktion, aggregation, kemotaxi, celladhesion (heparin). O = Oligomeriserande domän: Trimerer av Tsp-1. Pc = Prokollagen domän (Pc): antiangiogenetisk. P = Properdin-liknande domän/typ I: celladhesion, kemotaxi och antiangiogenetisk. E = Epidermal growthfaktor liknande domän/typ II: inhiberar FGF-2, antiangiogenetisk. Ca = Kalciumbindande domän/typ III: adhesion, FGF-2 bindning. G = Karboxyterminal (C-terminal) lektin-liknande globulär domän: adhesion och kemotaxi [4,5].

TSP-1 har både proangiogenetiska och antiangiogenetiska domäner och reglerar

endotelcellernas tillväxt, adhesion och motilitet. Prokollagen, properdin-liknande och

kalciumbindande domänerna inhiberar neovaskularisering och endotelcellers migration [2].

TSP-1 är den första identifierade inhibitorn av angiogenes. Det binder till ECM och har effekt

genom att förutom att den inhiberar migrering av endotelceller, även inducera apoptos i aktiva

endotelceller, inhibera MMP och inhibera tillväxtfaktormedierad proangiogenesaktivitet.

VEGF stimulerar angiogenes genom att inducera proliferation, migration, invasion och

tubformation av vaskulära endotelceller, FGF-2 likaså [6].

Inhibering av TSP-1 kan leda till en ökning av revaskularisering vid transplantation av

organ eller vävnader som i normal fall har låg syretillförsel och ökar därmed deras överlevnad

och funktion. Detta förutsätter en processning av TSP-1 där angiogenetiska domäner frisätts.

Antiangiogenes aktiviteten har främst lokaliserats till typ I och III repeats. Denna

antiangiogenetiska aktivitet där TSP-1 binder till FGF-2 (angiogenetisk faktor) och förhindrar

FGF-2 bindning till endotelceller är lokaliserad till den C-terminala domänen [2].

5

Det finns publikationer som föreslår att TSP-1 kan vara proangiogenetiskt och i

kombination med andra faktorer stimulera angiogenesen. Närvaro av fibrin, kollagen och

fibroblast growth factor samtidigt som TSP-1 ökar blodkärlnybildningen [3].

För att undersöka olika domäner som finns i ett protein så klonar man dem separat för att

vidare undersöka deras funktion. I detta projekt klonades och uttrycktes 7 funktionella

domäner hos TSP-1 proteinet. Funktionen hos de olika domänerna i TSP-1 är ännu inte

klarlagda. Deras funktion och förmåga ska provas på endotelceller vilka är viktiga i många

fysiologiska processer så som angiogenes, cancerutveckling och blodkoagulation. Humana

umbilical ven endotelceller (HUVEC) används vanligen för dessa undersökningar och endast

i forskningssyfte.

För att uttrycka proteiner måste först ett så kallat expressionssystem väljas. Faktorer som

påverkar valet av expressionssystem är t.ex. ursprung, storlek på proteinet, om det är

membranbunden eller inte. Vi valde att först försöka uttrycka proteinerna i Escherichia coli

med gateway-systemet (Figur 3). I studien använde vi en expressionsvektor med poly

histidin-tag för proteinrening och lac-promotor för isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside

(IPTG) och arabinos-induktion. Detta projekt är en del i att hitta en strategi för stimulering av

angiogenes vid transplantation av en syntetisk pankreas till diabetiker.

Fig. 3. Gateway-kloningssytemet, modifierat från Invitrogens produktblad. Vår önskade gen i form av cDNA eller PCR-produkt kan klonas i en entry clone som sedan kan rekombineras och uttryckas i andra sorters vektorer, anpassade efter arten på värdcellen.

6

MATERIAL OCH METOD Arbetsflödet för de metoder som använts i arbetet är illustrerat i Figur 4.

Fig. 4. Översikt över de metoder som har används under projektet för kloning och uttryck av TSP-1 domäner.

Metod

PCR-analys

Först gjordes en sökning efter celler med tsp-1 genuttryck i databas som ledde till valet av

humana navelsträng ven endotelceller (HUVEC). Från endotelcellerna renades totalt RNA

fram (Qia Quick-RNA kit, Qiagen Inc.) och sedan syntetiserades cDNA som var mall DNA

till hela tsp-1 genen i följande PCRer. Med hjälp av specifika primerpar riktade mot de 7

domäner i tsp-1 och designade enligt NM003246 kördes en PCR för amplifikation av

domänerna (Finnzymes Phusion, www.finnzymes.com).

Den totala volymen av PCR-mixen var 50 µl som innehöll 36 µl d H2O, 1µl 10mM dNTP, 10

µl 5X Exp HiFi buffert som ökar enzymstabiliteten under lång inkubering, 1 µl av varje

specifik primer, 0,5 µl av templatet som spädes 20 gånger för att få bort templatplasmider från

PCR-produkten och 0,5 µl Exp HiFi Polymeras (som är långsammare, korrigerar sekvenserna

och undviker mutation). PCR maskinen (MJ RESEARCH, PTC 200) programmerades enligt

följande:

Först 2 min denaturering vid 95°C följdes av 33 cykler (30 s denaturering vid 95°C, 30 s

anealing vid 54C°, 1 min elongering vid 72°C) och 72°C i 10 min slutligen 4°C i evighet (∞).

Agarosgelelektrofores på PCR-produkterna

PCR-produkterna analyserades på 1 % agarosgel för att se produkternas storlek. Till gelen

användes 0,7g agaros (Lonza), 1% TAE (Tris-acetate-EDTA) upp till 70 ml och

7

etidiumbromid 5µl/100ml (0.5ug/ml) för att synliggöra banden. Sedan laddades 10µl av varje

prov på gel som var lättmixad med 2 µl LB färg (loading buffert). Storleksmarkörer var ”2-

Log Ladder” (New England BioLabs, www.neb.com). Efter 30 min gelelektrofores vid 110 V

avlästes resultatet under UV-ljus i ”BIO RAD GelDoc 2000” (www.biorad.com).

 

TOPO-TA-kloning i pCR8

Invitrogen Topo-TA-kloning-tekniken möjliggör en snabb och effektiv kloningsreaktion i fem

min med pCR8/GW/TOPO cloning kit (Invitrogen). Kittet innehåller en vektor som har

arrangerats till en lineär plasmid med 3" deoxitymidin (T) överhäng som aktiveras genom en

kovalent bindning till topoisomeras I. PCR-produkten med A överhäng i 3" ändarna som är

tillförd av Exp HiFi DNA-polymeras kompletterar 3" T överhäng av vektorn och möjliggör

snabb ligering med redan topoisomerase I utan att restriktionsenzymer behövs. Plasmiden kan

sedan transformeras till bakteriecell. Amplifierad PCR-produkt med Exp HiFi polymeras

klonades i pCR8-vektor som innehåller genen för spectinomycin resistans. Detta gjordes

genom att blanda 0,5 µl PCR produkt med 3,5 µl vatten, 1µl saltlösning och 1µl TOPO vektor

(pCR8) från Invitrogen, pCR8/GW/TOPO-kloning kit. Allt blandades genom att pipettera upp

och ner och blandningen inkuberades fem min i rumstemperatur sedan stoppades reaktionen

genom infrysning i -20°C.

Transformering in One Shot Mach-1

De TA-klonade plasmiderna transformerades till förvaringsvektor One Shot Mach-1-t1

(Chemically Competent E.coli, Invitrogen) som är en "high copy number" förvaringsbakterie

som kan innehålla många plasmider. Först tinades sju mach-1 rör, sedan tillsattes 1 µl plasmid

till varsitt mach-1-rör och inkuberades 30 min på is. Rören inkuberades i 42°C vattenbadet i

30 s och flyttades till is igen. 250 µl S. O. C– medium tillsattes till alla rör, som skakades 60

min i skakinkubator vid 37°C, 250 rmp. Proverna odlades på LB-agarplattor

(diskavdelningen, UAS) med spectinomycin (100µg/ml). Glaskulor hälldes i alla plattor, som

skakades för att kulorna skulle spridas på plattan, som inkuberades över natt i 37°C

värmeskåp.

Koloni-PCR

Dagen efter gjordes en koloni-PCR på kolonier som växt på plattorna för att se riktningen på

våra gener. Totalvolymen av PCR-mixen var 25 µl och den innehöll 20,75 µl dH2O, 0,5 µl

8

dNTP, 2,5 µl 10X thermopol buffert, 0,25 µl av varje primer (Tspfw och T7 rv) och 1/2

kolonier. PCR-maskinen programmerades enligt följande:

Först 2 min denaturering vid 95°C som följdes av 33 cykler (30 s. denaturering vid 95°C, 30 s

anealing vid 54°C, 1 min elongering vid 72°C) och 72°C i 10 min slutligen 4°C i evighet (∞).

PCR-produkterna analyserades sedan elektroforetiskt på agarosgel för att se om bandens

basparsstorlek stämde med de önskade. Positiva kolonier odlades i 3ml LB-medium med 3µl

spectinomycin över natt.

Plasmid-preparation på odlingar

För att fälla ut och rena våra plasmider från bakterier måste först bakterierna lyseras. Därför

gjordes en plasmidpreparation på övernatts odlingar med QIAprep Spin Miniprep Kit

(QIAGEN) enligt tillverkarens instruktion. Först centrifugerades övernattskulturen 15 min.

vid 11180g. Bakteriepelleten sparades och supernatanten hälldes av. Sedan följdes "QIAprep

Spin Miniprep Kit Using a Microcentifuge"-protokollet. Koncentrationsbestämning på

plasmidpreparationen gjordes med en NANODROP 1000 spectrofotometer (Thermo

Scientific, SAVEEN WERNER) vid 260 nm. Renheten bestämdes genom att titta på 260/280

kvoten.

 

Rekombinering i pHGWA

Destinationsvektor pHGWA har hög kapacitet för kloning och för att uttrycka rekombinerade

proteiner i E. coli. Det är en pET22b modifierad för rekombineringskloning och med histidin-

tag. Denna vektor har lacoperator och är lämplig för att uttrycka proteiner som är under

kontroll av T7 promotor (Figur5). [Den var en gåva av en samarbetspartner]

Fig. 5. pHGWA-vektorn

9

Vid rekombinering i pHGWA, som är en vektor med gener för ampicillin/kloramfenikol-

resistans, får vi extra aminosyror före och efter vår klonade gen. Dessa krävs för att få

histidintagarna (6xHis) som binder till Ni2+ upp vid isolering av proteiner i följande IMAC-

rening. Histidin kan byta laddning och bli negativtladdad för att binda med hög affinitet till

Ni2+ i kolonnen, därefter kan bli positivtladdad för att släppa målproteiner vid sköljning av

kolonnen.

Extra-sekvens framför proteinerna var: MGSSHHHHHHGTGSYITSLYKKAGSEFAL och

extra-sekvens efter proteinerna var: KGEFDPAFLYKVVMYLEHHHHHH

För rekombinering tillsattes 2µl av varje prov till varsitt PCR-rör, 2µl pHGWA

(destinationsvektor), 4µl TE-buffert och 2µl LR-klonas som var vortexat. Rören inkuberades i

1 tim, vid 25°C. Sedan tillsattes 1µl proteinas-K (tuggar LR-klonas) och rören inkuberades

ytterligare 10 min vid 37°C.

Transformering in One Shot Mach-1

De rekombinerade plasmiderna i pHGWA transformerades till Mach -1för förvaring.

Dagen efter odlades kolonier från plattorna i 3 ml LB-medium och 3µl

ampicillin/kloramfenikol över dag. Rören inkuberades i skakinkubator upp till 5 tim i 37°C

250 rpm. Glycerolstockar gjordes på odlingarna med 225µl glycerol och 1,5 ml prov som

frystes snabbt i flytande kväve och förvarades i -70°C frysen.

Senare gjordes en plasmid preparation på odlingarna enligt QIAprep Spin Miniprep Kit

(QIAGEN)-protokollet för att rena våra pHGWA plasmider.

För att kontrollera produktsekvenserna i de rekombinanta till pHGWA skickades de

gensekvenseringscenter.

Sekvensanalys

För sekvensering av våra PCR-produkter och His-tagarna i expressionsvektorn, skickades

20µl av varje plasmidpreparation med FedEx till Macrogen i Korea. Där utfördes

sekvenseringsreaktionerna och en första kvalitetskontroll. Därefter laddade vi

nerkromatogram från deras server. Sekvensernas kvalitet kontrollerades av oss och dåliga

kromatogram sekvenserades om av Macrogen.

I kromatogrammen sökte vi startpunkten för produkterna, som ligger i kloningskassett, med

hjälp av sekvensen i invitrogenmanualen. Sekvenserna jämfördes med referenssekvensen

(NM_003246) för tsp-1 genom ClustalW i programmet MacVector 9.0.

10

Site Directed Mutagenesis

Det gjordes en ’site directed mutagenesis’ på de kloner som hade punktmutation. Detta är en

PCR som skiljer sig från vanlig PCR och används för att korrigera sekvenserna direkt i

vektorn. Primrar med korrigerad sekvens komplementära till varandra används, där

korrigerande basen placeras i mitten. Efter PCR transformerades produkten direkt in i Mach-1

för amplifiering.

Transformering in i BL21 (DE3) plysS

För att uttrycka målproteiner transformerades pHGWA-plasmider in i expressionbakterie

BL21 Star (DE3) pLysS (Chemically Competent Cells, Invitrogen).

BL21 (DE3) plysS är en komponent E. Coli-stam som möjliggör högt proteinuttryck för gener

som är under kontroll av en T7-promotor och har en ribosombindningställe. BL21 (DE3)

plysS är en T7-promotor driven expressionvektor innehållande DE3 som reglerar

expressionen vid tillsättning av IPTG. IPTG inducerar uttrycket av T7-RNA-polymeras i

bakterie som binder senare till T7-lacpromotor på vektorn och transkription av proteingener

startas. pLysS-delen är en plasmid med gen för kloramfenikolresistent och kodar för T7

lysozym. T7 lysozym inhiberar T7-RNA-polymeraset och minskar målproteinets uttryck.

Detta används när man vill att protein uttrycket ska induceras bara av IPTG och ge hög halt

T7-RNA-polymeras, som kan aktivera T7-lacpromotorn och börja transkriptionen av

målproteinet.

Inducering av proteinuttryck med IPTG och arabinos

Proverna odlades i 3 ml LB medium med 3µl karbenicillin (50µg/ml) över natt vid 37°C i

skakinkubator. Dagen efter mättes turbiditeten på de med spektrofotometer och initialkulturen

odlades igen 1/20 i LB-medium i nya odligsrör vid OD600≈1. När OD (optical density) hade

nått 0,4-0,6 på de nya odlingarna efter 2-3 tim delades provet till två i nya odlingsrör. Det ena

användes som kontroll och det andra inducerades med 1mM IPTG och 0,2 % arabinose. Det

togs 500µl av varje prov i eppendorfrör vid 0, 1, 2 och 3 tim efter inducering. Dessa

centrifugerades och pelletten frystes in.

SDS-PAGE

Pelleten från induceringen löstes i 500µl PBS och 60µl av proverna pipeterades till nya

eppendorfrör och sonikerades med sonikator (Bandelin Electronic) för att få ut proteinerna

från vesiklarna. Sedan tillsattes 15µl merkaptoetanol till dem. Proverna kokades i värmeblock

11

i 10 min vid 95°C och separerades på gel med SDS-PAGE. Gelerna var färdiggjutna (10 %

Tris-HCl från BIO-RAD) och som kontroll användes BIO-RAD precision plus

proteinstandard.

För att proteiner skulle synas färgades gelen med Coomasiefärg under 60 min. Gelen

avfärgades med bara avfärgningslösning som innehöll 500 ml H2O, 100 ml ättiksyra och 400

ml metanol i en liter.

ÄKTA- immobilized metal affinitychromatography (IMAC)-rening

Preparering av provet: framgångsrikt inducerade prov enligt SDS-PAGE odlades igen från

glycerolstockar i större volymer och inducerades efter 3 tim med 0,2 % arabinose och 1mM

IPTG. Proverna centrifugerades 10 min vid 3382g och 4°C. Pelleten löstes i 5 ml iskall

buffert A (20mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 20-40 mM imidazol, pH 7,4 (pH ställs med HCl),

sedan fylls till 1 liter med MQ vatten, filtreras med vacumfilter-Corning) och hälldes över till

ett plaströr placerat i bägare med is. Därefter sonikerades provet på is för lysering (0,5+0,5 s

cykler, 28 W(40%) i 4 min).

Provet hälldes över i centrifugrör och centrifugerades vid 28145g i 20 min i 4°C för att få bort

cellmembran och debris. Supernatanten hälldes över i ett plaströr, som sattes på is.

Programmet för pumparna kontrollerades (UNICORN, ny metod, explorer wizard, ok, 280

nm) på ÄKTA. Programmet bestod av 15 kolonnvolymer (CV) tvätt med 0% Buffert B

( 20mM Tris-HCl, 0,5M NaCl, 500mM imidazol, pH 7,4) följt av en 10 CV tvätt med 6% B.

Därefter en gradient från 6% till 20% B över 10 CV, följt av en gradient från 20% till 100%

över 20 CV. Först tvättades och urluftades slangarna, och fylldes med respektive buffert (A

och B som var iskalla). Kolonnen (HisTrap affinity columns, GE Healthcare) tvättades

manuellt med 20ml H2O, och därefter laddades den med 5 ml nickellösning (1 sked Ni till 40

ml H2O). Överflödet fördes bort med 20 ml buffert A, och slutligen tillsattes provet till

kolonnen och den kopplades in i maskinen för att börja programmet. När programmet var slut

tvättades kolonnen med 20 ml HCl och fylldes sedan med 20% etanol för förvaring.

RESULTAT & DISKUSSION

Resultaten av PCR med specifika primerpar mot TSP-1 sju domäner som kördes på gel visas i

Figur 6. Antal baspar stämde med de förväntade varför rätta produkter hade erhållits.

12

Ca G PC P 1500bp 1000bp 500bp Fig. 6. Exempel på gel med konfirmerade PCR-produktstorlekar, där T7-primrar utanför kloningskasetterna användes, vilket gav produkter 300baspar (bp) större än de klonade fragmenten.

Produkterna klonades i pCR8-plasmiden och förvarades sedan i Mach-1 bakterien. För att

rekombinera våra produkter i pHGWA-plasmiden krävdes att de satt i rätt riktning och därför

kördes koloni-PCR. Produkterna sitter i plasmid (p) kallas för pH, pO, pPC, pP, pE, pCa och

pG. Resultatet från gelen på pH visade att 3 av 10 kolonier var positiva, vilket var förväntat,

eftersom slumpmässig koloni-upplockning användes (Figur 7). ). I annat fall förväntas 5 av 10

kolonier vara positiva.

1500bp 1000bp 500bp Fig. 7. Koloni-PCR på 10 pH-kolonier klonade i pCR8

Plasmidpreparationer från odlingarna på positiva kolonier hade höga koncentrationer eftersom

de var transformerade i Mach-1 vilket är en "high copy nummer" bakterie, med många kopior

av plasmiden. Positiva kolonier rekombinerades i pHGWA och transformerades sedan i

Mach-1 och skickades för sekvensering.

Resultaten visade att sekvenserna hos pO, pG, pCa och pPC var rätt men pH, pE och pP

hade fel i sekvensen. Det var fel läsram på pH på grund av ett fel i den beställda primern. En

korrigerad primer beställdes och en PCR för korrigering av läsramen kördes. Resultatet ses på

gelen i Figur 8 och hela processen kördes om.

Ca < 762bp +300 G < 675bp+300 PC< 189bp+300 P < 522bp+300

pH < 807bp

13

1500bp 1000bp 500bp

Fig.8. PCR-produkt på pH efter läsram-korrigering med nya primerpar.

Det var en punktmutation på pE som korrigerades med ’site directed mutagenesis’ (Figur

9). På grund av punktmutationen uttrycks fel aminosyra (serin istället för asparagin i position

41). En punktmutation kan förändra funktionen eller orsaka lokal instabilitet hos ett protein.

Sekvensen från pP var mycket svag och det visade att den inte var ren, hade för lite DNA eller

inte hade någon sekvens alltså pP-transformanter odlades upp igen för ny plasmidpreparation.

1500bp 1000bp 500bp Fig. 9. pE-rekombinanter i Mach-1 efter ’site directed mutagenesis’

I Figur 10 ses sekvensresultaten från kromatogrammen erhållna från pH med en dålig

sekvens och fel läsram (Figur 10A), pE med punktmutation (Figur 10B) och pP som var

mycket svag (Figur 10C). Sekvenserna på våra produkter jämfördes med dem rapporterade

sekvenserna från genbank för både pH och pE. De första 23 baserna motsvarar korrekt

sekvens för kloningskasetten i pHGWA för pH (Fig.11) och en punktmutation i 123 bp för pE

(Figur 12A). När sekvenserna för pE översattes till aminosyror fick vi annan aminosyra i

position 41 (Figur 12B).

A

pH< 807bp

14

B

C

Fig. 10. Kromatogram för pH med kontaminerad och oren sekvens (A), pE med perfekt sekvens i start punkten (B) och pP med svag signal (C).

Fig. 11. Sekvensjämförelse mellan pHGWA med heparinbindande domänen (pH) klonad i fel läsram (överst) och korrigerad läsram (underst). De första 23 baserna motsvarar korrekt sekvens för kloningskasetten i pHGWA. A.

B.

Fig. 12. Sekvensjämförelse mellan DNA-sekvensen från EGF-liknande domänen från NM_003246 och (pE) epidermal growthfactor liknande domän i pHGWA (A). Motsvarande sekvenser översatta till aminosyror (B).

De tre konstruktionerna (pH, pE och pP) skickades till sekvensering igen. Efter

sekvensering transformerades de i BL21 och inducerades med IPTG men resultaten var inte

bra då ingen expression erhölls. Sedan användes arabinos för inducering men resultaten var

inte helt perfekt varför inducering med både IPTG och arabinos valdes, som hade används i

andra publikationer. Arabinos är mer effektiv för induktion i E.coli med T7-Lac-promotor än

IPTG som kan vara tillväxthämmande för våra proteiner [7]. Resultaten av inducering med

enbart arabinose visas i Figur 13 (pCa och pH i pHGWA).

Storleken på proteinerna uträknades med en formel: Medelaminosyrans vikt 0,12 kDa x (PCR-produktenslängd+ histidintagstorleken 88)/3= storleken i kDa

15

pCa pH 0h 1h 2h 3h 3hctrl std 0h 1h 2h 3h 3hctrl

Fig.13. Inducering av pCa och pH med arabinos. Proverna är tagna vid 1, 2, 3 tim efter tillsättning av arabinos och för icke-inducerade (utan arabinos) vid 0 och 3 tim (3hctrl). Storleksmarkörens (Std) band 37, 25 och 20kDa är angivna.

Eftersom proverna i Figur 13 var inducerade efter 3 tim från tillsättning av arabinos då

bestämdes att bara samla prov efter 3 tim följande odlingar. I Figur 14 visas resultaten av

inducering för pG, pO, pP, pPC och pE (i pHGWA) med både IPTG och arabinos. Proverna

är tagna efter 3 tim (I) från tillsättning av IPTG och arabinos , jämfört med icke-inducerade

transformanter (C). pG pO pP pPC pE I C I C I C Std I C I C

Fig.14. Inducerade prov (I) med IPTG och arabinos och icke-inducerade som kontroll (C) efter 3 tim. Storleksmarkörens (Std) band 37, 25 och 20kDa är angivna.

Resultatet från induceringen på pG, pP och pE syntes på gelen men de överuttryckta pO-

och pPC- proteinerna hade för liten storlek och ett kortare gel borde ha körts för att de små

proteinerna ska synas på gelen. Gelen visade att vi har fått ett dålig induktion med lite protein

uttryck i E.coli. E.coli är en billig prokaryot värdcell som har höga expressionsnivåer av den

orsaken att den växer snabbt och används därför som första hands alternativ för

proteinexpression [8].

Inducerade prov separerades med IMAC på ÄKTA för proteinrening. Sammanfattningsvis

är ÄKTA en gradientpump som blandar 2 buffertar till lämplig koncentration för eluering av

våra proteiner baserat på proteinernas affinitet till i detta fall en nickelkolonn. Histidin-

37

25 20

37

20 25

16

taggade proteiner eluerades från den nickeljonladdade HisTrap kolonen med imidazole 20-

250 mM från [9]. Defekta ventiler i ÄKTAn ledde till luftläckage till kolonnen och inga

proteiner kunde renas fram. För en bättre induktion borde våra humana proteiner uttryckas i

en annan sorts bakterie. Om den inte ger bättre resultat borde de uttryckas i en eukaryot cell

med en mammalies- expressionvektor som har komponenter (organeller och enzymer) som är

mer kompatibla med uttryck av humana gensekvenser. Nackdelen med mammalieceller är att

de växer långsamt och därmed ökar risken för kontamination. Vid lågt uttryck kan också

kraftigare proteinextraktion än sonikering användas, men då kan proteinerna förstöras [10].

Vi lyckades att framgångsrikt klona samtliga sju Tsp1-domäner och rekombinera in dem i

expressionsvektorer, vilka konfirmerades genom sekvensering. Transformanter innehållande

samtliga konstruktioner genererades och induktion av produkter optimerades (genom

kombination av IPTG och arabinos). Denna induktion ska utföras med ytterligare

expressionsbakterier för att försöka uppnå ännu högre uttryck i fortsättningen av projektet.

Proteiner ska extraheras med kraftigare sonikering och de renade proteinernas funktion ska

provas på endotelceller (HUVEC).

ACKNOWLEDGEMENT

Först och främst vill jag framföra ett stort tack till min handledare Magnus Rosenkuist för

ett mycket lärorikt examensarbete och för all hjälp jag fick med den laborativa och skriftliga

arbetet. Jag vill även tacka Lillemor Funke Biomedicinsk analytiker som med sin stora

erfarenhet hjälpte mig med laborerandet. Till sist vill jag tacka all personal på klinisk

immunologi/C5/Rudbeck som gjort min vistelse mycket trivsam.  

REFERENSER

[1] S. Kellouche et al.: Platelets, thrombospondin-1 and human dermal fibroblasts cooperate for

stimulation of endothelial cell tubulogenesis through VEGF and PAI-1 regulation. Experimental cell

research. 2007;313(3):486-99

[2] B. Margosio et al.: Thrombospondin 1 as a scavenger for matrix-associated fibroblast growth

factor 2. Blod. 2003;102(13):4399-406

[3] N. Esemuede et al.: The role of Thrombospondin-1 in human disease. Journal of Surgical Research.

2004;122(1):135-42

[4] D. F. Mosher: Physiology of Thrombospondin. Medicinal research reviews.1990; 41: 85-97

17

[5] D.S. Annis, et al.: Funktion-blocking antithrombospondin-1 monoclonal antibodies. Journal of

Thrombosis and Haemostasis. 2006;4(2):459-68

[6] L. Tillmar and N. Welsh. In vitro cultured rat islets express genes that both prevent and promote

angiogenesis. Journal of the Pancreas. 2004; 5(2): 81-91 [7] N. Narayan et al.: Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase

production in Escherichia coli. Biotechnology progress. 2006; 22(3): 617-25

[8] D. Busso et al: Construction of a set Gateway-based destination vectors for high-throughput

cloning and expression screening in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 2005;343(2):313-21

[9] K.Terpe: Overview of tag protein fusions; from molecular and biochemical fundamentals

to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 2003; 60:523-533

[10] A. Ward et al.: E. coli expression and purification of human and cynomolgus IL-15.

Protein expression and purification. 2009, E-pub ahead of print