Conceptos baacutesicosDr Sinisterra
Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy
Universidad Complutensewwwbiotransformacionescom
Main Enzyme Classes____________________________________________________Enzyme class Catalyzed reaction____________________________________________________Oxidirectadases Oxidation-reduction reaction
Transferases Transfer of functional group
Hydrolases Hydrolytic reactions
Lyases Group elimination (forming double bonds)
Isomerases Isomerizaion reaction
Ligases Bond formation coupled with a triphosphate cleavage
____________________________________________________
bullNo obstante no debe considerarse tanto el precio en siacute cuanto su contribucioacuten al precio final del productobullEjemplos
bull Transaminasa ($20-30kg) para la produccioacuten de p-fluoro-L-fenilamina ($500kg)bull El costo final de la penicilinacilasa en la produccioacuten de Penicilina G es de aproximadamente $1kgbull El costo final de la aspartasa en la produccioacuten de aacutecido L-aspaacutertico es menor de aproximadamente $01kg
bullFinalmente si comparamos con los precios de los catalizadores quiacutemicos veremos que no existe mucha diferenciabullSI SE INMOVILIZAN PUEDEN REUTILIZARSE CON LO QUE EL COSTO GLOBAL VA A VERSE DISMINUIDO
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
bullTambieacuten se pueden usar enzimas de organismos termoacutefilos
bullSe pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION)
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
3-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales
bullAlgunas (las maacutes especializadas) pero otras muchas nobullLas hidrolasas proteasas esterasas y especialmente lipasas son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales
bullProceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3
bullAmidasa de Comomonasacidovorans expresada en E ColibullEl enantiomerohidrolizado de la amida se recicla a amida raceacutemicabullLa Cilastatina es un inhibidor de la β-galactosidasa
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Main Enzyme Classes____________________________________________________Enzyme class Catalyzed reaction____________________________________________________Oxidirectadases Oxidation-reduction reaction
Transferases Transfer of functional group
Hydrolases Hydrolytic reactions
Lyases Group elimination (forming double bonds)
Isomerases Isomerizaion reaction
Ligases Bond formation coupled with a triphosphate cleavage
____________________________________________________
bullNo obstante no debe considerarse tanto el precio en siacute cuanto su contribucioacuten al precio final del productobullEjemplos
bull Transaminasa ($20-30kg) para la produccioacuten de p-fluoro-L-fenilamina ($500kg)bull El costo final de la penicilinacilasa en la produccioacuten de Penicilina G es de aproximadamente $1kgbull El costo final de la aspartasa en la produccioacuten de aacutecido L-aspaacutertico es menor de aproximadamente $01kg
bullFinalmente si comparamos con los precios de los catalizadores quiacutemicos veremos que no existe mucha diferenciabullSI SE INMOVILIZAN PUEDEN REUTILIZARSE CON LO QUE EL COSTO GLOBAL VA A VERSE DISMINUIDO
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
bullTambieacuten se pueden usar enzimas de organismos termoacutefilos
bullSe pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION)
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
3-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales
bullAlgunas (las maacutes especializadas) pero otras muchas nobullLas hidrolasas proteasas esterasas y especialmente lipasas son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales
bullProceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3
bullAmidasa de Comomonasacidovorans expresada en E ColibullEl enantiomerohidrolizado de la amida se recicla a amida raceacutemicabullLa Cilastatina es un inhibidor de la β-galactosidasa
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
bullNo obstante no debe considerarse tanto el precio en siacute cuanto su contribucioacuten al precio final del productobullEjemplos
bull Transaminasa ($20-30kg) para la produccioacuten de p-fluoro-L-fenilamina ($500kg)bull El costo final de la penicilinacilasa en la produccioacuten de Penicilina G es de aproximadamente $1kgbull El costo final de la aspartasa en la produccioacuten de aacutecido L-aspaacutertico es menor de aproximadamente $01kg
bullFinalmente si comparamos con los precios de los catalizadores quiacutemicos veremos que no existe mucha diferenciabullSI SE INMOVILIZAN PUEDEN REUTILIZARSE CON LO QUE EL COSTO GLOBAL VA A VERSE DISMINUIDO
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
bullTambieacuten se pueden usar enzimas de organismos termoacutefilos
bullSe pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION)
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
3-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales
bullAlgunas (las maacutes especializadas) pero otras muchas nobullLas hidrolasas proteasas esterasas y especialmente lipasas son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales
bullProceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3
bullAmidasa de Comomonasacidovorans expresada en E ColibullEl enantiomerohidrolizado de la amida se recicla a amida raceacutemicabullLa Cilastatina es un inhibidor de la β-galactosidasa
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
bullTambieacuten se pueden usar enzimas de organismos termoacutefilos
bullSe pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentar su estabilidad (DIRECTED EVOLUTION)
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
3-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales
bullAlgunas (las maacutes especializadas) pero otras muchas nobullLas hidrolasas proteasas esterasas y especialmente lipasas son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales
bullProceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3
bullAmidasa de Comomonasacidovorans expresada en E ColibullEl enantiomerohidrolizado de la amida se recicla a amida raceacutemicabullLa Cilastatina es un inhibidor de la β-galactosidasa
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratos naturales
bullAlgunas (las maacutes especializadas) pero otras muchas nobullLas hidrolasas proteasas esterasas y especialmente lipasas son capaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyos naturales
bullProceso one pot de LONZA en un biorreactor de 15m3
bullAmidasa de Comomonasacidovorans expresada en E ColibullEl enantiomerohidrolizado de la amida se recicla a amida raceacutemicabullLa Cilastatina es un inhibidor de la β-galactosidasa
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
4-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muy bajas de sustrato por lo que la productividad del proceso biocatalizado es baja
bullProceso de Glaxo WellcomebullLa enzima es una proteasaalacalina alcalasabullEl medio de reaccioacuten es THFaguabullResultados 50 de conversioacuten ee gt 99 bullLa concentracioacuten de sustrato es 100 g l
ABACAVIR anti HIVZiagen TM
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
5-Las enzimas solamente catalizan reacciones poco atractivas
bullRotundamente falsobullEl volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante
21- EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
2- Las enzimas no producen contaminacioacuten medioambiental
bullLas enzimas son proteiacutenas y por tanto biodegradables
bullSi se usan soportes inertes (siacutelice barro de diatomeas) el derivado
inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente
bullAdemaacutes las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo
energeacutetico y por tanto poco costo y emisioacuten de gases poco
contaminantes por lo que no se incrementa el efecto invernadero
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH temperatura y presioacutenbullGeneralmente las enzimas funcionan a T ambiente presioacuten atmosfeacuterica y pH neutro o cercano a la neutralidadbullPor ello se minimiza la generacioacuten de subproductos por reacciones colaterales lo que conlleva un aumento de la conversioacuten y facilita los procesos de recuperacioacuten de productos (down stream)bullUno de los ejemplos mas claros produccioacuten de acrilamida por Nitto Chemical Japoacuten
bullLa escala de produccioacuten es aproximadamente 20000 toneladas meacutetricas al antildeobullEl proceso quiacutemico opera a temperaturas de 80-140ordmC y siempre se produce aacutecido acriacutelico como subproducto Ademaacutes usa un catalizador de Cu que genera subproductos toacutexicos (HCN entre ellos)bullEl proceso enzimaacutetico opera a 10ordmC para generar un 100 de acrilamida
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
22- VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
5- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reaccionesbullHIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES AMIDAS LACTONAS ANHIDRIDOS EPOXIDOS y NITRILOS
bullOXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS ALQUENOS COMPUESTOS AROMAacuteTICOS ALCOHOLES ALDEHIDOS y CETONAS SULFUROS Y SULFOXIDOS
bullADICION-ELIMINACION DE AGUA AMONIACO ACIDO CIANHIDRICO
bullHALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES ALQUILACIONES y DEALQUILACIONES ISOMERIZACIONES CONDENSACIONES ALDOLICAS ACILOINICA ADICIONES DE MICHAEL
bullTRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN
bullCICLOADICIONES DIELS-ALDER
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
1- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un soacutelo enantioacutemero
no existen imaacutegenes especulares de las enzimas formadas por D-aminoaacutecidos se debe hacer un screening si se quiere la otra enantioselectividad
2- Las enzimas requieren paraacutemetros operacionales muy estrechos
3- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgaacutenicos poco solubles en agua
4- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibicioacutenpor sustrato mantener baja la concentracioacuten inicialpor producto final hay que retirar el producto a medida que se forma
23- DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
31 ASPECTOS MECANIacuteSTICOS
PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Δ GDagger= Δ HDaggerndashTΔ SDagger
Por tanto la energiacutea inicial del complejo E-A-B seraacute superior y la E activacioacuten menor
32 ASPECTOS CINETICOS
ΔGDagger
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
MeN
Me Me+
O
O
NO2
HO
NO2
O-
O MeN
MeMeH+ +H2O
ON
MeMe
O
NO2O-NMeMe
O
H
+
HO
NO2+
H2O
Reaccioacuten de segundo orden k = 43 mol-1 l min-1
Reaccioacuten de primer orden k = 21500 mol-1 l min-1
32 ASPECTOS CINETICOS
EJEMPLOS QUIacuteMICOS
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
2- FACTOR CATAacuteLISIS AacuteCIDO-BASE
Existen 2 tipos
Especiacutefica si intervienen contribuciones de H+ y OH- en la reaccioacuten O sea estos iones aceleran la reaccioacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende soacutelo del pH y no de la concentracioacuten del tampoacuten
General cuando el tampoacuten en su conjunto ayuda a estabilizar el estado de transicioacuten viacutea donacioacuten o eliminacioacuten de un protoacuten por lo que la velocidad de reaccioacuten depende de la concentracioacuten del tampoacuten asiacute como del apropiado estado de protonacioacuten ES LA QUE PRODUCEN LAS ENZIMAS
32 ASPECTOS CINETICOS
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
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41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
32 ASPECTOS CINETICOS
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
Las reacciones pueden catalizarse por la formacioacuten y desaparicioacuten raacutepida de intermedios covalentes En estos casos los estados de transicioacuten se estabilizan por la enzima
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Las enzimas favorecen la unioacuten del estado de transicioacuten en lugar de la del sustrato
3- FACTOR CATAacuteLISIS COVALENTE
32 ASPECTOS CINETICOS
Sin cataacutelisis Cataacutelisis enzimaacutetico
S
Mala unioacuten del sustrato
S
Fuerte unioacuten del ET
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
32 ASPECTOS CINETICOS
A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se situacutea entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52) Asp-52 existe en forma ionizada mientras que Glu-35 esta protonado Glu actuacutea como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transicioacuten mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio Entonces Glu actuacutea como una base y desprotona el agua en el estado de
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
32 ASPECTOS CINETICOS
5- FACTOR MICROENTORNO
Las reacciones quiacutemicas se ven afectadas por los disolventesLa existencia de microentornos hace que las micro-constantes dieleacutectricas sean diferentes por lo que los micro-pKa de los aminoaacutecidos cambia Esta es la situacioacuten en la cataacutelisis enzimaacutetica
Grupo cadenalateral
Carga neta a pH 7
pKa
del AA librepKa
in protein
394160
84105105125
Asp carboxilo -1 4-5Glu carboxilo -1 4-5His imidazol Aprox 0 6-7
Cys tiol Aprox 0 8-95Tyr fenol 0 95-10Lys amino +1 ~10Arg guanidinio +1 ~12
Ser hidroxilo 0 ~16
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
32 ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la accioacuten de la papaina
pH lt 42 pHgt82
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacutetica
Dr J V Sinisterra GagoBiotransformations group
Facultad de FarmaciaUniversidad Complutense
wwwbiotransformacionescom
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
DEFINICIONES
1CONVERSIONNuacutemero de moleacuteculas convertidas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
Xs conversioacuten del sustrato S
ns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacuten
ns cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccioacuten
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
2RENDIMIENTONuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas iniciales
ηp conversioacuten del producto Pnp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
3SELECTIVIDADNuacutemero de moleacuteculas de producto sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas convertidas
σp selectividad para el producto pns0 cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccioacutenns cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccioacutennp0 cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccioacutennp cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenνs factor estequiomeacutetrico para el sustrato Sνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
DEFINICIDEFINICIOacuteOacuteNN
bull LAS ENZIMAS son proteiacutenas que se comportan como catalizadores muy potentes y eficaces de las reacciones quiacutemicas de los sistemas bioloacutegicos
bull La CATAacuteLISIS ENZIMAacuteTICA es esencial para los sistemas vivos
bull La mayoriacutea de las RQ ocurririacutean muy lento en condiciones bioloacutegicamente significativas
bull Hace posible que en condiciones fisioloacutegicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requeririacutean condiciones extremas de presioacuten temperatura o pH
bull Las biomoleacuteculas son muy estables a pH neutro temperatura suave y ambiente acuoso
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Estructura-actividad cataliacutetica
bull La actividad cataliacutetica depende del mantenimiento de la conformacioacuten proteica nativa
bull Si se desnaturaliza la proteina o se disocia en subunidades pierde su actividad
bull Estructuras 1deg 2deg 3deg y 4degson esenciales
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cofactor (Coenzima)
Aacutetomo ion o moleacutecula que participa en el procesocataliacutetico sin ser enzima ni substrato
Los cofactores participan de dos maneras distintas
1 A traveacutes de una fijacioacuten muy fuerte a la proteiacutena y no sonmodificados en el ciclo cataliacutetico- cofactor
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
2 Como un segundo substrato se ven modificados en el ciclo cataliacutetico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original- coenzima
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Se pueden extraer sin perder actividad
bioloacutegica
Extractos se usa para Estudios de
Reacciones metaboacutelicas y su regulacioacuten
Estructuras y mecanismos de accioacuten
Catalizadores en siacutentesis industrial
Diagnoacutesticos enfermedades
Distribucioacuten intracelular de las
enzimas
Localizacioacuten por HistoenzimologiacuteaEnsayos Elisa
Biotransformaciones
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Sitio ActivoSitio Activo
1- El enzima y su sustrato
2- Unioacuten al centro activo
3- Formacioacuten de productos
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
iquestCoacutemo actuacutean las enzimas como catalizadores
Hipoacutetesis de la Cerradura y la llave (E Fischer 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospeciacuteficade la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura
Modelo aceptado durante mucho tiempo hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenoacutemenos de la inhibi-cioacuten enzimaacutetica por ejemplo
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
k1
K -1
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Cineacutetica de Michaelis-Menten
ndash 1ordm etapa se forma el complejo enzima-sustrato
ndash 2ordm etapa el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacioacuten del producto liberando la enzima libre
Paso lento
V1 = k1 [E] [S]
V2 = k2 [ES]
V3 = k3 [ES]k1 k3
E + S ES E+ P
k2
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaEn este esquema k1 k-1 y k2 son las constantes cineacuteticas
individuales de cada proceso y tambieacuten reciben el nombre de constantes microscoacutepicas de velocidad Seguacuten esto podemos afirmar que
bull v1 = k1 [E] [S] bull V2 = k2 [ES] bull v3 = k3 [ES]
Podriacutea Expresarse V como funcioacuten de [E]t y [S]
Asumiendo que E y S estaacuten en equilibrio cuando k2ltlt k-1
Ks cte de disociacioacuten
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES) de forma que la concentracioacuten total de enzima [ET] (que es constante a lo largo de la reaccioacuten) es[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES] resulta que v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Como v1=v2+v-1 podemos decir quek1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES] queda que
siendo
donde la expresioacuten (k2+k3)k1 se ha sustituido por KM o constante de Michaelis-Menten Esta relaacioacuten nos explica las razones que hacen de la KM un paraacutemetro cineacutetico importantePor lo tanto en el estado estacionario la velocidad de formacioacuten del producto es
v = v3 = k3 [ES] =
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Pero E S y ES no estaacuten en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs ndash Haldane Estado Estacionario
Entonces
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull KM es caracteriacutestica de cada reaccioacuten
bull Tiene unidades de concentracioacuten
bull Cuando KM gtgt [S] se alcanza Vmax
EcuaciEcuacioacuteoacuten de n de MichaelisMichaelis -- MentenMenten
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat [segundos-1]
ndash Medida directa de la produccioacuten cataliacutetica en
condiciones oacuteptimas (enzima saturada)
ndash Tiempo necesario para cambiar S en P
ndash Nuacutemero de recambio (Ndeg moleacuteculas de S
transformadas por segundo)
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Significado de KM Kcat KcatKM
bull Kcat KM
ndash Cuando [S] ltlt KM Entonces [E]t ltlt [E]
ndash Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
ndash Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
ndash Valor maacuteximo entre 108 y 109 (molL)-1 s-1
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis EnzimaacuteticaAlgunos valores representativos
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten doble inversa o de Lineweaver-Burk
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica de la Cataacutelisis Enzimaacutetica
bull Representacioacuten de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de [E] pH y temperatura constante se observa que la accisa correspondiente a Vmax2 es Km
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten del sustrato
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
En condiciones de concentracioacuten de S crecientes hasta la saturacioacuten pH y temperatura constante se observa que la velocidad inicial crece con [s]
bull Efecto de la variacioacuten de la concentracioacuten de la enzima
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimaacuteticandash En general los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones quiacutemicas por cada 10ordmC de incremento la velocidad de reaccioacuten se duplica Q10
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Factores que afectan la velocidad de reaccioacuten
bull Efecto del pH sobre la actividad enzimaacuteticandash Los enzimas poseen grupos quiacutemicos ionizables
(carboxilos -COOH amino -NH2 tiol -SH imidazol etc) en las cadenas laterales de sus aminoaacutecidos
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
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AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Reacciones en que intervienen dos o
maacutes sustratos Puede haber dos casos extremos
ndash Unioacuten aleatoria de los sustratos
La fosforilacioacuten de la glucosa con ATP catalizada con hexokinasa con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar
bullUnioacuten ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Unioacuten ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima nicotinamida adenindinucleotido (NAD+)
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacutetica
bull Reacciones en que intervienen dos o maacutes sustratosndash Mecanismo ldquoping-pongrdquo
La ruptura de una cadena polipetiacutedica con una serin-proteasa tal como la tripsina o la α-chymotripsina
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacutetica
Anaacutelisis cineacutetico en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismo de Inhibicioacuten Reversible
ndash Inhibicioacuten competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
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4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Cineacutetica Enzimaacuteticabull Mecanismos de Inhibicioacuten Reversibles
ndash Inhibicioacuten no competitiva
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Meacutetodos graacuteficos de determinacioacuten del proceso de inhibicioacuten
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Activador alosteacuterico favorece la unioacuten del sustrato
Inhibidor alosteacuterico impide la unioacuten del sustrato
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
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4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Elementos de la reaccioacuten
El enzima no fosforilado es inactivo
El enzima fosforilado es activo
Activacioacuten enzimaacutetica por fosforilacioacuten de la enzima
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
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A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
HO OHH H
Lipasas Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACEacuteMICAS
Resolucioacuten de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
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4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
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33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
4EXCESO ENANTIOMEacuteRICOEn una mezcla de dos enantioacutemeros es el porcentaje de uno de los enantioacutemeros menos el del otro
eeR exceso enantiomeacuterico del enantioacutemero R
nR cantidad (moles) del enantioacutemero R
nS cantidad (moles) del enantioacutemero R
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
C
D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcatKm)a___Vb (kcat Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]
ΔΔ Gne = -RT ln E
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
41 PARAacuteMETROS BAacuteSICOS
5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
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6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
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D
A BC
D
AB C
CB
A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
R1 R2
OHO
O
R4R1 R2
O R4
O
+ R3
R1 R2
O R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
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5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
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6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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7 ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA Velocidad de reaccioacuten por unidad de peso de catalizador (proteiacutena)
V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
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33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
D
AB
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A BC
D
AB C
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A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
A
E
+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
Condiciones para realizar una resolucioacuten cineacutetica dinaacutemica (DKR)
1- la resolucioacuten cineacutetica debe ser eficiente (E gt20) 2- la racemizacioacuten debe ser raacutepida Al menos 10 veces mas raacutepida que la reaccioacuten de la enzima con el enantioacutemero menos activo
k rac gt 10 kent-s3- La reaccioacuten de racemizacioacuten no debe dar lugar a la formacioacuten de subproductos4-El metal de transicioacuten usado no debe racemizar el producto de reaccioacuten5- la resolucioacuten cineacutetica y l a racemizacioacuten deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reaccioacuten One pot synthesis
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5NUacuteMERO DE RECAMBIO (TURNOVER NUMBER) Nuacutemero de moleacuteculas sintetizadas por nuacutemero de moleacuteculas de catalizador usadas
tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
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6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
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Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
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A BC
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accioacuten enzimaacutetica
CB
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+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
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tn nuacutemero de recambionP cantidad (moles) de producto P al final de la reaccioacutenncat cantidad (moles) de catalizadorνp factor estequiomeacutetrico para el producto P
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6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
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Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
CB
A
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A BC
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AB C
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A
accioacuten enzimaacutetica
CB
A CB
A CB
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+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
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6FRECUENCIA DE RECAMBIO Nuacutemero de moleacuteculas convertidas por unidad de tiempo
tof frecuencia de recambio (s-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles ) de sustrato convertidoncat cantidad (moles μmoles ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s)
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V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
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Proceso irreversible
bullSELECTIVIDAD DE SUSTRATObullIncluso conociendo la estructura 3D de una enzima a veces es difiacutecil entender por queacute una enzima reconoce un tipo de sustratos mientras que otros similares no son transformadosbullPor ejemplo la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad de 2-oxoaacutecidos usando aacutecido L-glutaacutemico o L-Aspaacutertico como donador del grupo amino
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
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A BC
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A
accioacuten enzimaacutetica
CB
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+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
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V maacutexima actividad de la enzima en unas condiciones determinadas (katal bull kg-1 U bull mg-1)δns diferencial de cantidad (moles μmoles) de sustrato convertidomcat peso (kg mg ) de catalizadorδt diferencial de tiempo para la conversioacuten (s min)
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kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
D
AB
C
(S)(R)
D
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A
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accioacuten enzimaacutetica
CB
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+ A [EA]
[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
31 ASPECTOS CINETICOS
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
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8 VELOCIDAD DE DESACTIVACIOacuteN Es la peacuterdida de actividad cataliacutetica por unidad de tiempo
kdeact velocidad de desactivacioacutenV0 actividad de la enzima al comienzo de la medicioacuten (U bull mg-1)V1 actividad de la enzima al final de la medicioacuten (U bull mg-1)t0 tiempo inicial de medicioacuten (min h d)t1 tiempo final de medicioacuten (min h d)
Expresa la estabilidad del catalizador
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Proceso irreversible
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
CB
A
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ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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33 TIPOS DE PRECISIOacuteN ENZIMAacuteTICA
DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
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ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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DISCRIMINACIOacuteN ENANTIOMEacuteRICA
D
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[EB]
E + P
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ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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E
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[EB]
E + P
E + Q+B
ΔΔG = ΔΔH - TΔΔS = -RTln (VAVB)
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ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999
3- CONCEPTOS BAacuteSICOS
ΔΔG(kcalmol) VA VB ee () 0118 12 10 0651 3 50 174 19 90 217 39 95 314 199 99 450 1999 999