Contardi , Lorena Gabriela

Reverendo, María Amelia

CEMIC 2009

Nuevo Influenza A H1N1

Influenza

Los virus influenza son virus pertenecientes a la familia Orthomyxoviridae

3 tipos de influenza, A, B y C Los virus B y C causan enfermedad solo en

el hombre mientras que influenza A además infecta aves y otros animales

Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Síndrome Gripal Fiebre,escalofríos,malestar general Mialgias Dolor de garganta Tos no productiva, rinitis Cefalea Fatiga extrema Convalecencia: 1-2 semanas Complicaciones: Neumonía, exacerbación de

problemas cardíacos ó pulmonares, encefalopatías, mielitis, síndrome de Reye, miositis, miocarditis y pericarditis

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Transmisión por aerosoles

Periodo Incubación: 1-4 días Adultos eliminan virus: 1 día antes de los

síntomas hasta 5 días Niños: > a 10 días Inmunocomprometidos:

semanas a meses

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Influenza A

Genoma de ARN segmentado y de polaridad negativa. La replicación es nuclear.

Los viriones son envueltos por una cubierta lipídica proveniente de la célula huésped.

En la envoltura poseen distintas proyecciones con forma de espícula.

Reseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

Influenza A

Influenza A

La HA y la NA son los antígenos claves contra los que la respuesta inmune es dirigida.

Utilizados para tipificar los virus de influenza A en 16 HA y 9 NA subtipos.

Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans. J.S.Malik Peiris, Leo L.M.Poon, Yi Guan. Journal of Clinical Virology 45 (2009) 169-173

Hemaglutinina

Adsorción del virus a la célula. HA se une a los residuos de ácido siálico que se encuentran en el receptor de las células

Fusión de la envoltura viral con la membrana del endosoma. Clivaje en dos péptidos HA1 y HA2

Responsable de la hemoaglutinación mediante la HA1

Induce la aparición de Acs. neutralizantes

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Hemaglutinina viral

Hemaglutinina se une alácido siálico

Virus es incorporado dentro de la célula

RNA del virus se replica en el núcleo

Neuraminidasa Integrada por 4 subunidades

Enzima destructora de receptores

Permite transportar al virus a través de las mucinas y destruir los receptores de la HA sobre la célula huésped

Estimula la producción de anticuerpos inhibidores de la NA

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

El rol de la Neuraminidasa viral

La neuraminidasa corta la unión entre la hemaglutinina y el ácido siálico, lo que libera el virus de la célula

Ciclo de vida del virus de la Influenza

Subtipos de Hemaglutinina

Subtype Human Swine Horse Bird

H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15H16

Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Subtipos de Neuraminidasa

Subtype Human Swine Horse Bird

N1

N2

N3

N4

N5

N6

N7

N8

N9

Adapted from Levine AJ. Viruses. 1992;165, with permission

Variación antigénica en Influenza A Drift antigénico o cambios menores:

mutación puntual en el gen de HA y/o NA. No reconocida por su Ac correspondiente.

Shift antigénico o cambios mayores: involucra grandes cambios HA y/o NA por el reemplazo de los genes de estas proteínas.

epidemia

pandemiaReseña sobre vigilancia y prevención de la influenza aviar y rol zoonótico. Linzitto et al. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana v.39 n.4 485-492, Diciembre 2005.

“Shift” antigénico: origen de las cepas pandémicas

Reasociación genética entre cepas animales y cepas humanas en circulación. (1957/1968)

Cepas aviarias o de mamíferos adquieren la capacidad de infectar al hombre. (1918)

Cepas que desaparecieron, se mantuvieron escondidas y reaparecen luego de un período. (1977)

Familia Orthomyxoviridae. Capítulo 8. pág 157-180. Virología médica. Guadalupe Carballal, Jose Oubiña.

Orígenes de las pandemias de influenza

The Origins of Pandemic Influenza – Lessons from the 1918 Virus. Robert B. Belshe, MD. NEJM 353;21 November 24, 2005.

Nuevo Influenza A H1N1

Geographic Dependance, Surveillance and Origins of the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. Vladimir Trifonov, Hossein Khiabanian and Raul Rabadan. NEJM 10.1056, May 27, 2009.

Proteínas de superficie del virus porcino

5 genes de origen porcino

1 gen de origen humano2 genes de origen

aviar

¿Por qué es el cerdo un huésped intermediario apropiado?

Su tracto respiratorio expresa acido siálico (SA) α 2,3 Gal que une la influenza aviar y SA α 2,6 Gal que une la influenza humana, esto permitiría la infección con ambos virus.

Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Inicios de la pandemia

Nuevo Influenza A H1N1, 2009

Abril: Emerge en México o en USA

Se disemina en USA, Canadá y en el mundo

La OMS declara alerta Mundial.

Junio 3: PANDEMIA FASE 5: transmisión

interhumana sostenida

Junio 11: FASE 6: PANDEMIA GLOBAL

Hoy

Virus respiratorios: diagnóstico

MÉTODOS DIRECTOS Cultivo: Gold standard clásico Rápidos: Detección de Antígenos: IF, ELISA, Inmunocro- matografía Detección de Genomas: PCR, RT-PCR, PCR a tiempo real

MÉTODOS INDIRECTOS: Serología Escaso valor diagnóstico de infección reciente

WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Obtención de la muestra

Aspirado nasofaringeo Hisopados nasal/faríngeo

combinadoHisopado nasofaríngeoHisopado nasalAspirado traquealBALBiopsia

¿Cuando? Dentro de los 3 días del inicio del cuadro

WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Transporte y conservación Medios de transporte para virus: Caldo

triptosa/Solución salina Hanks + gelatina ó albúmina al 1% + atb-antimicóticos 1%

Transporte: en frío. A 4 ºC menos de 72 hs. No congelar

Conservación por tiempos mayores a 72 hs –70 °C ó N2 líquido (Para aislamiento)

ASPIRADO NASOFARINGEO

Métodos RápidosMétodos clásicos

Centrifugación

sedimento

tinción IFI

Cultivo

sobrenadante

HEP 2 o MRC 5 ó MDCK ó LLC-MK2

ACP IFI células infectadas

IFI

Virus sincicial respiratorio (Paramixoviridae)

Adenovirus (Adenoviridae)

Influenza A (Orthomixoviridae)

Influenza B (Orthomixoviridae)

Parainfluenza (Paramixoviridae)

IFI panel respiratorio

Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Detección directa de antígeno: IFI en ANF

Ventajas: Rápida

< costo

Desventaja:

Personal entrenado

Adecuado Nº células

Requiere microscopio IF

Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

ASPIRADO NASOFARINGEO

Diagnóstico molecular PCR, RT-PCR PCR en tiempo real.

Permite cuantificar

WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update

Diagnóstico molecular de nuevo H1N1

Diferentes protocolos Genes targets importantes:

Gen de proteína de la matriz de influenza A Gen de hemaglutinina específico de H1N1 Gen de hemaglutinina específico para influenza

estacional

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Diagnóstico

La OMS recomienda que los casos sospechosos de

Influenza A H1N1 sean confirmados por:

Ensayos RT-PCR que diferencien S-OIV de los virus de influenza estacional

Aislamiento e identificación de Influenza H1N1 La detección de un aumento de cuatro veces en los

anticuerpos S-OIV por neutralización o inhibición de la hemoaglutinación (HAI).

WHO information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans - update Ruling out Novel H1N1 Influenza Virus Infection with Direct Fluorescent Antigen Testing. Nira R. Pollock, Scott Duong, Annie Cheng, Linda L. Han, Sandra Smole, and James E. Kirby. Clinical Infectous Diseases 2009; 49: e66-8

Experiencia del CEMIC en el diagnóstico de influenza A H1N1

Objetivos: Determinar la frecuencia de positividad en

nuestro hospital del nuevo influenza A H1N1 por PCR en tiempo real

Evaluar la sensibilidad del panel de virus respiratorio versus la PCR en tiempo real

Evaluar la sensibilidad de un método rápido inmunocromatográfico para screening de nuevo H1N1 versus PCR en tiempo real

Materiales y Métodos

1741 muestras respiratorias

16 muestras respiratoriasRT-PCR en tiempo real

Método Inmunocromatográfico (SD Bioline)

224 muestras respiratoriasIFI panel virus respiratorios (Chemicon)

RT-PCR en tiempo real

Buenos Aires y Jujuy Desde 11/06 al 31/08/09

HNF ANFHNF ANF

Aspirado traqueal Aspirado traqueal

BALBAL

RT-PCR en tiempo real Protocolo CDC (11/06-1/07)

Light Cycler Roche (1/07-31/08)

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido inmunocromatográfico

Método rápido inmunocromatográfico

Resultados

Resultados Figura: Detección de I nfluenza A H1N1

por PCR en Tiempo Real (n=1741) Periodo 10/ 06 al 31/ 08/ 2009

0

100

200

300

400

500

600

700

J unio J ulio Agosto Meses

n

Positivos

Negativos

52%

38%

16%

n: 234n: 972n: 535

Positividad total: 39%

PCR H1N1 (+) PCR H1N1(-) Total

IFI FLUA (+) 45 7 52

IFI FLUA (-) 31 141 172

Total 76 148 224

IFI RSV : 3 (H1N1 +) y 15 ( H1N1-)

Sensibilidad : 59 %

VPP: 86 %

Especificidad : 95 %

VPN:82%

Sensibilidad panel viral vs.

RT-PCR en tiempo real

Resultados

Resultados

PCR H1N1 (+) PCR H1N1(-) Total

Inmunocromatografía (+)

2 0 2

Inmunocromatografía (-)

11 3 14

Total 13 3 16

Sensibilidad Inmuno-cromatografía vs.

RT-PCR en tiempo real

Sensibilidad : 15.4 % Especificidad : 100 %

VPP: 100 % VPN: 21%

Controles Flu A estacional: 2/3 . Controles Flu B estacional: 2/3

Conclusiones: La frecuencia de casos positivos para influenza A H1N1

fue variando a lo largo de los meses siendo mayor al principio de la pandemia (52%).

Comprobamos que los mismos monoclonales que utilizamos para la detección de gripe estacional por IFI también detectan al nuevo influenza, pero con una menor sensibilidad (59%) que la observada para influenza A estacional (70-80%).

Se comprobó que la sensibilidad del método rápido inmunocromatografico estudiado fue baja (15%) y es similar a lo publicado en otros trabajos.

Poor Clinical Sensitivity of Rapid Antigen Test for Influenza A Pandemic (H1N1) 2009 Virus. Jan Felix Drexler, Angelica Helmer, Heike Kirberg et al. Emerging Infectious Diseases. Vol 15. N° 10, October 2009.Field performance of an Inluenza Rapid Diagnostic Test in an ambulatory setting. Isabelle Rouleau, Hugues Charest, Monique Douville- Fradet, JCM..00762-09

Muchas gracias por Muchas gracias por su atención!!su atención!!

Agradecimientos:

Laboratorio de Virología Dra. Cristina Videla Dr. Alfredo Martínez A nuestras compañeras de residencia