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P l a n t P h y s io l .( 1 9 9 2 )9 9 ,1 6 9 5 - 1 6 9 80 0 3 2 - 0 8 8 9 / 9 2 / 9 9 / 1 6 9 5 / 0 4 / $ 0 1 . 0 0 / 0

R e c e i v e df o rp u b l i c a t i o nM a r c h2 0 ,1 9 9 2A c c e p t e dA p r i l2 2 ,1 9 9 2

C o m m u n i c a t i o n

I n c r e a s e dE x p r e s s i o no f a m y o - l n o s i t o lM e t h y lT r a n s f e r a s ei n

M e s e m b r y a n t h e m u m c r y s t a l l i n u mI s P a r t o f a S t r e s sR e s p o n s eD i s t i n c tf r o m C r a s s u l a c e a nA c i dM e t a b o l i s mI n d u c t i o n '

D a n i e l M . Ve r n o na n d H a n s J . B o h n e r t *

D e p a r t m e n t so f M o l e c u l a ra n d C e l l u l a rB i o l o g y( D . M . V. ,H . J . B . ) ,a n d B i o c h e m i s t r y( H . J . B . ) ,U n i v e r s i t yo f A r i z on a,T uc s on , A r i z on a8 5 7 2 1

ABSTRACT

T h ef a c u l t a t i v eh a l o p h y t eM e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u mr e -s p o n d st o o s m o t i cs t r e s sb y s w i t c h i n gf r o m C 3 p h o t o s y n t h e s i st oC r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s m( C A M ) .T h i ss h i f tt o C A Mi n v o l v e st h es t r e s s - i n i t i a t e du p - r e g u l a t i o no f m R N A se n c o d i n gC A Me n -z y m e s .T h ec a p a b i l i t yo ft h ep l a n t st o i n d u c ea k e y CAM e n z y m e ,p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ,i s i n f l u e n c e db y p l a n ta g e ,a n di t h a s b e e ns u g g e s t e dt h a ta d a p t a t i o nt o s a l i n i t yi n M . c r y s t a l l i n u mm a y b e m od u l a t e db y a d e v e l o p m e n t a lp r o g r a mt h a tc o n t r o l sm o l e c u l a rr e s p o n s e st o s t r e s s .We h a v e c o m p a r e dt h ee f f e c t so fp l a n ta g e o n t h ee x p r e s s i o no f t w o s a l i n i t y - i n d u c e dg e n e s :G p d l ,w h i c he n c o d e st h ep h o t o s y n t h e s i s - r e l a t e de n z y m eg l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ,a n d I m t I ,w hi c h e nc od e sa m e t h y lt r a n s f e r a s ei n v o l v e di n t h eb i o s y n t h e s i so fa p u t a t i v eo s m o p r o t e c -t a n t ,p i n i t o l .I m t !m R N Aa c c u m u l a t i o na n d t h ea c c o m p a n y i n gi n -c r e a s e i n p i n i t o li n s t r e s s e dM e s e m b r y a n t h e m u me x h i b i ta p a t t e r no f i n d u c t i o nd i s t i n c tf r o m t h a to b s e r v e df o rC A M - r e l a t e dg e n e s .We c o n c l u d et h a tt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m st h a tt r i g g e rI m t !a n dp i n i t o la c c u m u l a t i o ni n r e s p o n s e t o s a l ts t r e s si n M . c r y s t a l l i n u md i f f e ri n s o m er e s p e c t sf r o m t h o s e t h a tl e a dt o C A Mi n d u c t i o n .T h e r em a yb e m u l t i p l es i g n a l so r p a t h w a y st h a tr e g u l a t ei n d u c i b l ec o m p o n e n t so fs a l i n i t yt o l e r a n c ei n t h i sf a c u l t a t i v eh a l o p h y t e .

T h e common i c ep l a n t ( M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m )i s a f a c u l t a t i v eh a l o p h y t et h a t s w i t c h e s f r o m C 3 p ho to s yn -t h e s i st o CAM i n r e s p o n s e t o d r o u g h tor h i g h s a l i n i t y .CAMi s a n a l t e r n a t ep h o t o s y n t h e s i sp a t h w a yt h a t s e r v e s as a w a t e rc o n s e r v a t i o nmec ha n i sm

( 1 ,9 ) .D u r i n gC A M ,s t o m a t a l o p e n -

i n g a n d p r i m a r yc a r b o n f i x a t i o no c c u r a t n i g h t ,a l l o w i n gf o rc l o s u r e o f s t o m a t a d u r i n g t h e d a y a n d , c o n s e q u e n t l y ,d e -c r e a s e d e v a p o r a t i v ew a t e r l o s s .CAM i n d u c t i o n i n t h e i c ep l a n th a s b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e da t t h e b i o c h e m i c a ll e v e l .E x p o s u r et o h i g h s a l i n i t yh a s b e e n shown t o t r i g g e rt h ea c c u m u l a t i o no f a number o f mRNAs e n c o d i n gCAM e n -zymes ( 5 , 6 , 8 ),r e s u l t i n gi n i n c r e a s e de x p r e s s i o nan d a c t i v i t yo f t h e s e p r o t e i n s( 4 ) .

1 S u p p o r t e db y U . S . D e p a r t m e n to f A g r i c u l t u r ean d A r i z o n aA g -r i c u l t u r a lE x p e r i m e n t a lS t a t i o n .

O ne s u c h s t r e s s - i n d u c e de n z y m ei s P E P C a s e 2 ,w h i c hc a t -a l y z e st h ep r i ma ry c a rb onf i x a t i o ns t e pi n C A M . P p c la n dp r o t e i ne x p r e s s i o nh av e b e e nu s e d a s m a r k e r st o s t u d y t h es t r e s sr e s p o n s e i n M . c r y s t a l l i n u ma t t h e m o l e c u l a r l e v e l .A l t h o u g hP E P C a s ee x p r e s s i o ni n t h e i c ep l a n ti s p r i m a r i l ye n v i r o n m e n t a l l yr e g u l a t e d( 1 1 ) ,a n u m b e ro f r e c e n t s t u d i eh a v en o t e dt h a tt h ec a p a c i t yo ft h e p l a n t st o i n d u c eP E P C a s ei n r e s p o n s e t o s t r e s sa n d t h er a t eo fP p c li n d u c t i o ni n c r e a s ew i t hp l a n ta g e ( 1 ,3 , 5 ,1 2 ) .T h r e e - w e e k - o l di c ep l a n ts e e d l i n g se x h i b i tn o s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n P E P C a s ea c t i v i t y( 5 )a n do n l y a m o d e s ti n c r e a s e i n P p c lmRNA l e v e l sd u r i n g a 5 - ds t r e s sw i t h 5 0 0 mm N a C l ,w h e r e a sp l a n t s6 o r 9 w e e k so fa g ei n d u c eP p c lt om a x i m u m l e v e l sd u r i n gs u c ha s t r e s s( 3 ) .A l s o ,g r a d u a l i n c r e a s e si n P p c lt r a n s c r i p t i o na nd P E P C a s ea c t i v i t ya r eo b s e r v e di n u n s t r e s s e dp l a n t so fi n c r e a s i n ga g e ( 2 ,3 , 1 2 ) .S u c h o b s e r v a t i o n sh a v e l e dt o t h ep r o p o s a l t h a tt h es t r e s sr e s p o n s ei nM . c r y s t a l l i n u mi s m o d u l a t e db y a d e v e l o p m e n t a lp r o g r a mt h a ta l l o w sm a x i m u m e x p r e s s i o no fs a l i n i t y - r e s p o ns i v eg e n e s o n l y a f t e ra c e r t a i np l a n ta g e ( a p p r o x i m a t e l y5w e e k su n d e ro u r g r o w t hc o n d i t i o n s )i s r e a c h e d .

T o d e t e r m i n ew h e t h e ro t h e rs a l ts t r e s s - r e s p o n s i v em R N A se x h i b i te x p r e s s i o np a t t e r n ss i m i l a rt o t h a to f P p c l ,w e h a v ee x a m i n e dt h ei n f l ue n c e o fp l a n ta g e o n t h e e x p r e s s i o no ft w oa d d i t i o n a ls a l i n i t y - i n d u c e dg e n e s .O n e , G p d l ,e n c o d e sG A P d H ( 6 ) ,a n e n z y m et h a th a s i m p o r t a n t h o u s e k e e p i n gf u n c t i o n sa n d p h o t o s y n t h e t i cc a r b o n r e d u c t i o n r o l e si n C 3p l a n t s .G A P d H i s t h o u g h t t o b e u p - r e g u l a t e dd u r i n g s a l ts t r e s si n t h ei c e p l a n tt o f u l f i l la n i n c r e a s e d n e e d f o rt h ee n z y m ei n c a r b o n f l u xd u r i n g t h e l a r g ed i u r n a lf l u c t u a t i o n s

i n o r g a n i c a c i d sa n d s t a r c ht h a ta r ec h a r a c t e r i s t i co f C A M .F o r t h i s r e a s o n ,t h e i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f G A P d H i ns t r e s s e dM . c r y s t a l l i n u mi s c o n s i d e r e d' C A M - r e l a t e d . 'T h es e c o n ds a l i n i t y - i n d u c e dg e n e , I m t l ,e n c o d e sa m y o - i n o s i t o l0 -m e t h y lt r a n s f e r a s et h a tc a t a l y z e st h e f i r s ts t e pi n t h e b i o s y n -t h e s i so fp i n i t o l( 1 0 ) ,a m e t h y l a t e dc y c l i cs u g a r a l c o h o lt h a ti s t h o u g h t t o s e r v e a s a n i n t r a c e l l u l a ro s m o l y t ea n d / o r o s -

2 A b b r e v i a t i o n s : P E P C a s e , p h o s p h o e n o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s eG A P d H ,g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ;I m t l ,g e n ee n -c o d i n g m y o - i n o s i t o l0 - m e t h y l t r a n s f e r a s e ;G p d l ,g e n e e n c o d i n gG A P d H ;P p c l ,g e n ee n c o d i n gP E P C a s e .

1 6 9 5

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P l a n tP h y s i o l .Vo l .9 9 , 1 9 9 2

m o p r o t e c t a n td u r i n g o s m o t i ca d j u s t m e n ti n s a l t - s t r e s s e dM .c r y s t a l l i n u m( 7 ) .

I n t h i ss t u d y ,w e s h o wt h a tt h ee x p r e s s i o no fI m t l ,a sw e l la s t h ea c c u m u l a t i o no fp i n i t o l ,e x h i b i ta p a t t e r no fi n d u c t i o nt h a td i f f e r sf r o m t h eC A M - r e l a t e di n c r e a s ei n e x p r e s s i o no ft h eG p d lg e n e .A l t h o u g ht h eb e h a v i o ro fG p d ld u r i n gd e v e l -o p m e n ta n d s t r e s sr e f l e c t st h et r e n dp r e v i o u s l yo b s e r v e df o rP p c l ,I m t la n d p i n i t o ll e v e l s a r er e a d i l yi n d u c e db y s a l ts t r e s si nM . c r y s t a l l i n u m r e g a r d l e s so fp l a n ta g e .F u r t h e r m o r e ,t h e r ei s n o o b v i o u sg r a d u a l a c c u m u l a t i o no f t h e I m t lt r an s c r i p t i nu n s t r e s s e dp l a n t sd u r i n g d e v e l o p m e n t .We c o n c l u d et h a ti nr e g u l a t i o na s w e l l a s f u n c t i o n ,t h i smRNA i s p a r to fa s t r e s sr e s p o n s ed i s t i n c tf r o mt h ei n d u c t i o no fCAM i n t h ei c ep l a n t .

M A T E R I A L SAND M E T H O D S

P l a n tM a t e r i a l s

P l a n t sw e r e g r o w ni n 1 - L p o t si n s o i l( 5 )a n d e i t h e rl e f tu n s t r e s s e d( c o n t r o l s )o r i r r i g at e dd a i l yf o r5 d w i t h 5 0 0 mmN a C li n t h en u t r i e n t s o l u t i o n .S t r e s st r e a t m e n t sw e r es t a r t e d3 , 6 , o r 8 . 5( 8w e e k sp l u s4 d )w e e k sa f t e rs e e d i n g .L e a f a n da x i l l a r yt i s s u eo fs t r e s s e dp l a n t sa n d c o n t r o l sw a s h a r v e s t e do n t h ef i f t hd o fs t r e s s( 1 0 2h ) ,g r o u n db y m o r t a r a n d p e s t l ei nl i q u i d N 2 ,a n d s t o r e da t - 7 0 0 C .M a t e r i a lf r o mt h r e et o f i v ep l a n t sw a s c o m b i n e df o r e a c h s a m p l e .T o a v o i d p o s s i b l ev a r i a t i o no fmRNA l e v e l sd u e t o d i u r n a lr e g u l a t i o n ,a l lh a r -v e s t sw e r ec a r r i e do u t a t t h es a m et i m e o f d a y ,4 h b e f o r et hee n d o ft h el i g h tp e r i o d .

R N AE x t r a c t i o na n d A n a l y s i s

T o t a lR N Aw a s e x t r a c t e df r o m l e a f / a x i l l a r yt i s s u ea s p r e -v i o u s l yd e s c r i b e d( 5 ) ,a n d d i l u t i o ns e r i e sw e r e s l o tb l o t t e da n d p r o b e da c c o r d i n gt oVe r n o ne ta l .( 1 1 ) .B l o t sw e r ep r o b e dw i t h r a n d o m - p r i m e df u l l - l e n g t hI m t lc D N A ( 1 0 )o r a 6 5 0 -b a s e p a i rp a r t i a lG p d lc D N A ( M c U A 1 )( 6 ) .

we e x a m i n e dt h e e x p r e s s i o no f t w o s a l ts t r e s s - i n d u c e dt r a n -s c r i p t s ,G p d la n d I m t l ,i n 3 - ,6 - ,a n d 8 . 5 - w e e ko l dM . c r y s t a ll i n u m ( F i g .1 ) . P l a n t s o fa l l t h r e ea g e s r e s p o n d e dt o a 5 - ds t r e s sw i t h 5 0 0 mm N a C l b y s i g n i f ic a n t l y i n c r e a st h ee x p r e s s i o no fI m t lt o a p p r o x i m a t e l ye q u a l l e v e l s .T h i sr e s u l tc o n t r a s t e dw i t h w h a t w a s o b s e r v e df o rG p d l .G p d lw a s u p -r e g u l a t e dt o a g r e a t e re x t e n ti n o l d e rp l a n t si n r e s p o n s e t os t r e s s .P o s t s t r e s sG p d lt r a n s c r i p tl e v e l sw e r ea p p r o x i m a t e l y3t i m e sh i g h e ri ns t r e s s e d6 -a n d 8 . 5 - w e e k - o l dM . c r y s t a l l i nt h a n i n s t r e s s e d3 - w e e k - o l dp l a n t s .A n a d d i t i o n a ld i f f e r e nb e t w e e nG p d la n d I m t l e x p r e s s i o nw a sa p p a r e n ti nu n s t r e s sc o n t r o l s ,w h e r e t h e r ew a s a g r a d u a l a c c u m u l a t i o no f G p d lmRNA w i t h a g e .G p d ll e v e l sw e r e a t l e a s tt w o f o l dh i g h e r i n8 . 5 - w e e k - o l du n s t r e s s e dp l a n t st h a n i n 3 - w e e k - o l du n -s t r e s s e dp l a n t s .N o r e p r o d u c i b l es i g n i f i c an t i n c r e a s ew a s ob -s e r v e df o rI m t l .

T h ep a t t e r n o fe x p r e s s i o nd e s c r i b e dh e r e f o rG p d lr e s e m b l e st h a td e s c r i b e dp r e v i o u s l yf o rP p c l( 3 ) .T h e e x p r e s s i o nb e f o r ea n d a f t e rs a l ts t r e s so fb o t h C A M - r e l a t e dt r a n s c r i p t ss e e m st o b e i n f l u e n c e ds i m i l a r l yb y p l a n ta g e .I m t l e x h i b i t ed i f f e r e n tp a t t e r no fa c c u m u l a t i o n ;i t w a sd r a m a t i c a l l yi n d u c e dt o m a x i m u m l e v e l si n y o u n ga n d o l dp l a n t sa l i k ew i t h o u ti n c r e a s i n gs i g n i f i c a n t l yw i t h a g e i n u n s t r e s s e d p l a n t s .T h ed i f f e r e n te f f e c t so fs a l ts t r e s sa n d d e v e l o p m e n to n t h e e x p r e ss i o no fI m t la n d t h eC A M - r e l a t e dm R N A sG p d la n d P p c la r e

I m t l Gpd 1

MM

- m m 03 wk

4

C a r b o h y d r a t eE x t r a c t i o na n d A n a l y s i s

C a r b o h y d r a t e sw e r e e x t r a c t e db y g r i n d i n g5 0 m g o f l e a f /a x i l l a r yt i s s u ei n 1 . 0 m L o f m e t h a n o l / c h l o r o f o r m / w a t e r( 1 2 : 5 : 3 )i na g l a s sh o m o g e n i z e r .A f t e rg r i n d i n g ,1 m L o fw a t e rw a s a d d e d a n dp h a s e sw e r es e p a r a t e db y c e n t r i f u g a t i o n .T h ea q u e o u sp h a s e was d e s a l t e do n a c o l u m no f AG50WX4( B i o R a d )a n d A m b e r l i t eI R A - 6 8i n t h eO H- f o r m ( S i g m a ) .S a m p l e sw e r e d r i e d ,d i s s o l v e di n d e i o n i z e dw a t e r ,a n d f i l -t e r e dt h r o u g h a n y l o n A c r o d i s c1 3 ( G e l m a nS c i e n c e s ,A n nA r b o r ,M I ) .E q u a la m o u n t so fe x t r a c t sw e r er e s o l v e db y HPLCo n a 3 0 0 X 7 . 8mm HPX87C c a l c i u m - f o r ml i g a n de x c h a n g ec o l u m n( B i o R a d )a s d e s c r i b e d( 1 0 ) .T h r e e r e p l i c a t er u n s o fe a c h e x t r a c tw e r e c a r r i e do u t .P i n i t o l l e ve l sw e r e q u a n t i f i e db y c o m p a r i n gHPLC p e a k a r e a s o bt ai ne d w i tha S p e c t r o -p h y s i c sS P 4 2 9 0i n t e g r a t o r( S p e c t r o p h y s i c sA n a l y t i c a l ,S a nJ o s e ,C A ) t o p e a k a r e a s o f p i n i t o ls t a n d a r d s o f knownc o n c e n t r a t i o n .

R E S U L T SAND D I S C U S S I O N

B e c a u s ei t h a s b e e n p r o p o s e dt h a tt h e s t r e s sr e s p o n s e i nM . c r y s t a l l i n u mi s c o n t r o l l e db y a d e v e l o p m e n t a lp r o g r a m ,

a m _

6 w k

8 . 5 w k

- mm

- -

- - _

F i g u r e1 . L e v e l so fI m t la n d G p d lm R N Ai ns t r e s s e da n d u n s t r e s sM . c r y s t a l l i n u mo f d i f f e r e n ta g e s . P l a n t sw e r e g r o w n i n s o i la n de i t h e rl e f tu n s t r e s s e d( - ) o r s t r e s s e dw i t h5 0 0 m m N a C I i n t h en u t r i e n ts o l u t i o n( + ) .P l a n ta g e sa t t h eb e g i n n i n go fs t r e s st r e a t m e na r es h o w n .A l lp l a n t sw e r e h a r v e s t e da t t h ee n d o f t h e 5 - ds t r e s sp e r i o d .tRNA w a s i s o l a t e df r o m l e a fa n d a x i l l a r ys h o o t m a t e r i ap o o l e df r o mt h r e ep l a n t sf o re a c h s a m p l e .Tw o f o l ds e r i a ld i l u t i o no f R N A ( 5 - 0 . 6 2 5M g )w e r e h y b r i d i z e dt o 3 2 P - l a b e l e dG p d lo r I m t Ic D N A p r o b e s .A u t o r a d i o g r a m so fb l o t sa r es h o w n .

16 9 6 V E R N O NA N D B O H N E RT

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3/4

D I S T I N C TS T R E S SRESPONSES I N M . CRYSTALLINUM

A Pp c I G p d l B I m t a M -

CL L

3 6 3 6 85 3 6 8 5

P l a n t A ge ( w e e k s ) P l a n t A ge ( w e e k s )

F i g u r e2 . T h e e f f e c t so f p l a n tag e a n d s a l ts t r e s son t h er e l a t i v ee x p r e s s i o no fv a r i o u s s a l i n i t y - r e s p o n s i v emRNAs. T h e b e h a v i o ro ft h e p h o t o s y n t h e s i s - r e l a t e dm R N A sP p c la n d G p d l( A )w i t hr e s p e c tt o d e v e l o p m e n ta n d r e s p o n s e t o s t r e s s i s c o m p a r e dt o t h a to fl m t l ,a n o n - C A M gene ( B ) .T r a n s c r i p tl e v e l s( r e l a t i v et o m a x i m u m expres -s i o nf o re a c h )f r o mu n s t r e s s e dp l a n t sar e E . L e v e l sa f t e ra 5 - ds t r e s sw i t h5 0 0 mm N a C I ar e U. A g e sa t s t a r to f s t r e s sar e n o t e d . P p c le x p r e s s i o ni n f o r m a t i o ni s f r o mC u s h m a ne t a l . ( 3 ) .

s u m m a r i z e di n g r a p h i cf o r m i n F i g u r e 2 . The r e l a t i v e l yh i g hl e v e lo f G p d l i n u n s t r e s s e d c o n t r o l si s n o t u n e x p e c t e d( 6 )s i n c eG A P d Hc a r r i e so u t g l y c o l y t i ch o u s e k e e p i n gf u n c t i o n sa n d p h o t o s y n t h e t i c c a r b o n r e d u c t i o n r o l e si n u n s t r e s s e dt i s s u e .

T h e p r o t e i n e n c o d e db y I m t lc a t a l y z e st h e i n i t i a ls t e p i nt h e s t r e s s - i n d u c e db i o s y n t h e s i so f t h e m e t h y l a t e dc y c l i csugara l c o h o l p i n i t o l( 1 0 ) .T o v e r i f yt h a tt h e i n c r e a s e de x p r e s s i o no f I m t lmRNA r e s u l t si n t h e e x p e c t e dp h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e( t h ea p p e a r a n c e o f p i n i t o l )i n y o u n g as w e l l as o l d s t r e s s e dp l a n t s ,c a r b o h y d r a t e swere e x t r a c t e df r o ml e a f / a x i l l a r yt i s s u eo fp l a n t so f d e s i g n a t e dages a n d s u b j e c t e dt o HPLC a n a l y s i s .Va l u e s f o rp i n i t o ld e t e c t e d i n p l a n te x t r a c t s ar e shown i nTa b l e I . P i n i t o ld i d i n d e e d i n c r e a s e as m u c h i n 3 - w e e k - o l dM . c r y s t a l l i n u mas i t d i d i n o l d e r p l a n t s ,r e f l e c t i n gt h e i n d u c -t i o no f t h e I m t l t r a n s c r i p ts e e n i n F i g u r e 1 . S o m e p i n i t o lwasp r e s e n t i n o ld e r c on t r ol p l a n t s .Lo w l e v e l so f p i n i t o lh a v eb e e n o b s e r v e dp r e v i o u s l yi n u n s t r e s s e dl e a f t i s s u ef r o m ma-t u r e p l a n t s( 7 ) .T h i s a c c u m u l a t i o ni s l i k e l yd u e t o t h e f a c tt h a tp i n i t o l ,b e i n g r e l a t i v e l ym e t a b o l i c a l l yi n e r t ,h a s a s l o wt u r n o v e r t i m e ;t h e p i n i t o lp r o d u c e di n s m a l l amounts b yu n s t r e s s e d p l a n t s , t h e r e f o r e ,may a c c u m u l a t eo v e r t i m e ( 7 ,1 0 ,E . J .D e R o c h e r ,P . A d a m s ,D . M . Ve r n o n , u n p u b l i s h e do b s e r v a t i o n s ) .I n an y c a s e , i t i s c l e a rf r o m b o t ht h e RNA d a t a( F i g .1 ) a n d t h e l a r g ei nc re as e o f p i n i t o li n s t r e s s e d ,y o u n gs e e d l i n g st h a t t h i sa s p e c t o f t h e M . c r y s t a l l i n u ms t r e s s r e -sponse i s n o t d e p e n d e n ton p l a n t ag e as i s t h e e x p r e s s i o no fC A M - r e l a t e dg e n e s .

I t i s n o t k n o w n what c a u s e s t h e o b s e r v e di n f l u e n c e o f ageon CAM i n d u c t i o n an d t h e g r a d u a l i n c r e a s e o f CAM genee x p r e s s i o n s e e n i n u n s t r e s s e d p l a n t s .C u s h m a n e t a l . ( 3 )s u g g e s t t h a t t h e r e s p o n s e t o s a l ts t r e s s i n M. c r y s t a l l i n u mi sd e p e n d e n ton a ' d e v e l o p m e n t a lp r o g r a m . 'O t h e r s h y p o t h e -s i z et h a t t h e i c e p l a n t ' ss t r e s s r e s p o n s e i s t r i g g e r e db y d e -c r e a s e s i n t u r g o r . T h e y a t t r i b u t ed i f f e r e n c e s i n PEPCasee x p r e s s i o nb e t w e e ny o u n g an d o l d p l a n t st o t h e c u m u l a t i v ee f f e c t so f d i u r n a l c h a n g e si n w a t e r s t a t u s t h a t b e c o m e mored r a m a t i c as p l a n t sag e ( 1 2 ) .O ur d a t a ar e n o t e a s i l yaccom-m o d a t e db y e i t h e rm o d e l . T he p u t a t i v ed e v e l o p m e n t a lp r o -gram t h a tm o d u l a t e s t h e CAM r e s p o n s e a t t h e m o l e c u l a r

Ta b l e I . P i n i t o lL e v e l si n S t r e s s e da n d U n s t r e s s e dM . c r y s t a l l i n u mo fVa r i o u sA g e s

C a r b o h y d r a t e sw e r e e x t r a c t e df r o m l e a fa n d a x i l l a r yt i s s u ea n dr e s o l v e db y H P L Ca sd e s c r i b e di n " M a t e r i a l sa n d M e t h o d s . "M a t e -r i a lf r o m t h r e et o f i v ep l a n t sw a s p o o l e df o re a c h s a m p l e .Va l u e ss h o w na r et h em e a no f t h r e eHPLC r u n so fe a c h s a m p l e .S Dw e r ec a l c u l a t e df r o mv a r i a t i o nb e t w e e nHPLC r u n s .

P l a n tA g ea t P i n i t o lC o n t e n tS t a r to fS t r e s s U n s t r e s s e d S t r e s s e d

w e e k s u m o l / gf r e s hw t3 N D a 3 . 0 0 . 26 0.70 2 . 4 0 . 18 . 5 0 . 6 0 . 1 2 . 8 0 . 1

a N o t d e t e c t e d ; d e t e c t i o nl i m i t :- 2 5 p m o l / i n j e c t i o n .

l e v e ld o e s n o t s u p p r e s st h ei n d u c t i o no fI m t lo rt h ea c c u m u -

l a t i o no fp i n i t o li n y o u n g ,s t r e s s e dM . c r y s t a l l i n u m ,n or d oe si t s i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h el e v e l so fI m t lmRNA i n u n s t r e s s e dp l a n t s .L i k e w i s e ,t h ei n d u c i b i l i t yo fI m t li n o l d e rp l a n t sa n dt h eb a c k g r o u n dl e v e l so fI m t li n p l a n t so f i n c r e a s i n ga g e d on o t a p p e a r t o b e a u g m e n t e db y d i u r n a lt r a n s i e n tr e d u c t i o n si n w a t e r s t a t u s .T h e r e g u l a t i o no f t h eCAM r e s p o n s e ( a sg a u g e d b yP p c la n d G p d lmRNA l e v e l s ) ,t h e r e f o r e ,d i f f e r si ns o m er e s p e c t sf r o m t h er e g u l a t i o no f o t h e ra s p e c t so f s t r e s sa d a p t a t i o n( s u c ha s o s m o r e g u l a t i o na n d / o r o s m o p r o t e c t i o n ,a s g a u g e db y I m t lmRNA e x p r e s s i o n ) .I t a p p e a r sa s t h o u g ht h e r ei s n o t a s i n g l e s i g n a lo r p a t h w a yt h a tc o o r d i n a t e lr e g u l a t e sm o l e c u l a rr e s p o n s e s t o o s m o t i c s t r e s si n t h ei c ep l a n t .R a t h e r ,t h er e s p o n s et o t h ee n v i r o n m e n ti nM . c r y s t a l -l i n u m i s l i k e l yt o b e c o m p l e x ,a n d t h er e g u l a t i o no f s t r e s s -

r e s p o n s i v eg e n e sm ay i n v o l v es e v e r a ls i g n a l so rt h ei n t e r p l a yo fm u l t i p l ec o n t r o lm e c h a n i s m s .

A C K N O W L E D G M E N T S

We t h a n k D r .J o h n C . T h o m a sa n d D r .J o h n C . Cushman f o rh e l p f u ld i s c u s s i o n sa n d c r i t i c a lr e a d i n g o f t h em a n u s c r i p t . We a r ev e r y g r a t e f u lt o P a t Adams f o rc a r r y i n go u t HPLC a n a l y s i s .

L I T E R A T U R EC I T E D

1 . B o h n e r tH J ,O s t r e mJ A , Cushman J C ,De R o c h e rE J ,M i c h a l -o w s k i C B , R i c k e r sJ , M e y e rG, Vernon DM , K r u e g e rM,Va s q u e z - M o r e n oL ,Ve l t o nJ , H o e f n e rR , S c h m i t tJ M( 1 9 8 8 )M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m :a h i g h e rp l a n tm o d e lf o r t h es t u d yo fe n v i r o n m e n t a l l yi n d u c e dc h a n g e si ng e n ee x p r e s s i o n .P l a n t M o lB i o lR e p o r t e r6 : 1 0 - 2 8

2 . C hu C , D a i Z , Ku M S B , E d w a r d sGE ( 1 9 9 0 )I n d u c t i o no fc r a s s u l a c e a n a c i dm e t a b o l i s mi n t h e f a c u l t a t i v eh a l o p h y t eM e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u mb y a b s i s c i ca c i d .P l a n t P h y s i o l9 3 :1 2 5 3 - 1 2 6 0

3 . Cushman J C ,M i c h a l o w s k iC , B o h n e r t H J ( 1 9 9 0 )D e v e l o p -m e n t a lc o n t r o lo fc r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s mi n d u c i b i l i t yb ys a l t s t r e s si n t h e c o m m o n i c e p l a n t .P l a n tP h y s i o l9 4 :1 1 3 7 - 1 1 4 2

4 . H o l t u mJ A M , W i n t e rK ( 1 9 8 2 )A c t i v i t yo f e n z y m e so f c a r b o nm e t a b o l i s md u r i n g t h ei n d u c t i o no fc r a s s u l a c e a na c i dm e t a b -o l i s m i n M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u mL .P l a n t a 1 5 5 :8 - 1 6

5 . O s t r e mJ A , O l s e n S W ,S c h m i t t J M , B o h n e r tH J ( 1 9 8 7 )S a l ts t r e s si n c r e a s e s t h el e v e lo ft r a n s l a t a b l emRNA f o rp h o s p h o e n -

1 6 9 7

7/27/2019 crysanthimum CAM.pdf

4/4

1 6 9 8 V E R N O NA N D B O H N E RT

o l p y r u v a t ec a r b o x y l a s ei n M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m .P l a n tP h y s i o l8 4 :1 2 7 0 - 1 2 7 5

6 . O s t r e mJ A , Ve r n o nDM , B o h n e r tH J ( 1 9 9 0 )I n c r e a s e de x p r e s -s i o no f a g e n e c o d i n gf o rN A D - g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s ed u r i n g t h et r a n s i t i o nf r o m C 3 p h o t o s y n t h e s i st o c r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s mi n M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s -t a l l i n u m .J B i o lC h e m 2 5 6 :3 4 9 7 - 3 5 0 2

7 . P a u l M J , C o c k b u r nW ( 1 9 8 9 )P i n i t o l ,a c o m p a t i b l es o l u t ei nM e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u mL ? .J E x pB o t 4 0 :1 0 9 3 - 1 0 9 88 . S c h m i t tJ M ,M i c h a l o w s k iC M ,B o h n e r tH J ( 1 9 8 8 )G e n ee x p r e s -

s i o nd u r i n g CAM i n d u c t i o n u n d e r s a lt s t r e s si n m e s e m b r y a n -t h e m u m :c D N A l i b r a r ya n d i n c r e a s e dl e v e l so f mRNA f o rp h o s p h o e n o lp y r u v a t e c a r b o x y l a s ea n d p y r uv a t e o rt h op h os -p h a t e d i k i n a s e .P h o t o s y n t hR e s1 7 :1 5 9 - 1 7 1

P l a n tP h y s i o l .Vo l .9 9 , 1 9 9 2

9 . T i n g I P ( 1 9 8 5 )C r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s m .A n n u R e vP l a nP h y s i o l3 6 :5 9 5 - 6 2 2

1 0 .Ve r n o n DM , B o h n e r t H J ( 1 9 9 2 )A n o v e l m e t h y l t r a n s f e r ai n d u c e db y o s m o t i cs t r e s si n t h ef a c u l t a t i v eh a l o p h y t eM e s e mb r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m .E M B OJ . 1 1 :2 0 7 7 - 2 0 8 5

1 1 .Ve r n o nDM , O s t r e mJ A , S c h m i t tJ M , B o h n e r tH J ( 1 9 8 8 )P E P -C a s e t r a n s c r i p t l e ve l si n M e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u md e -

c l i n er a p i d l yu p o n r e l i e ff r o m s a l t s t re s s .P l a n tP h y s i o l 8 6 :1 0 0 2 - 1 0 0 41 2 .W i n t e rK , Gademann R ( 1 9 91 ) D ai l yc h a n g e si nC O 2a n d w a t e r

v a p o r e x c h a n g e ,c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e ,a n d l e a fw a t e r r e -l a t i o n si n t h eh a l o p h y t eM e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u md u r -i n gt h e i n d u c t i o no fc r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s mi n r e s p o n s et o h i g h s a l i n i t y .P l a n tP h y s i o l9 5 :7 6 8 - 7 7 6