Cyclin E Ablation in the Mouse Seminario 3 Cell, August 2003.

Cyclin E Ablation in the Mouse

Seminario 3Cell, August 2003

CICLO CELULAR EN EUCARIOTES

CICLO CELULAR

CONTROL DEL CICLO• REGULADORES POSITIVOS: Proteínas cinasa

heterodiméricas que contienen una subunidad reguladora (Ciclinas A,B,D,E) y una subunidad catalítica (Cdk). Regulan la actividad de múltiples proteínas que participan en la replicación del DNA y la mitosis, a través de la fosforilación de las mismas en sitios reguladores específicos,con la activación de algunas y la inhibición de otras.

• Las ciclinas D y E (o ciclinas G1) son proteínas que funcionan principalmente durante la fase G1 y en la transición de G1-S.

• Las ciclinas A y B funcionan durante la fase S, G2 y mitosis temprana.

• En células en G0 no hay expresión de ciclinas ni de Cdks.

CONTROL DEL CICLO• REGULADORES NEGATIVOS: • Proteína RB (pRB):reprime la expresión genética de los

reguladores transcripcionales E2Fs,que transactivan genes importantes para la entrada en S.

• INK4:grupo de proteínas que bloquean la actividad cinasa-ciclina D dependiente (cdk4-cdk6) produciendo arresto en G1.Su expresión es tejido dependiente.

• Inhibidores de cdk:proteínas p21,p27,p57.

• P53:regulador arquetípico del ciclo y el gen más frecuentemente mutado en cáncer.asegura que frente a un daño genotóxico,las células se detengan en G1 y traten de reparar su DNA antes de la replicación.El gen de p21 es otro target de p53.En algunos tipos celulares si se sobreepresa induce apoptosis(genes suicidas BAX)

D CICLINAS

• Controlada por mitógenos extracelulares (factores de crecimiento).

• Se asocian a cdk4 y cdk6,fosforilando pRB,lo que permite la deshinibición de los factores de transcripción E2Fs.,permitiendo el ingreso a S.

E CICLINAS• Se cree que completan la fosforilación de pRB.

• Independientes de la estimulación por mitógenos;controlada por mecanismos autónomos.

• Pico en el límite G1/S.

• Críticas para la proliferación de pRB-.

• Sustratos putativos:proteínas involucradas en la iniciación de la replicación del DNA,proteínas que gobiernan la duplicación del centrosoma,biosíntesis de histonas y progresión del ciclo celular.

Resúmen

• Se cree que las ciclinas tipo E (E1 yE2) dirigen la entrada a la fase S. Se ha asumido que estas dos ciclinas son críticas para la proliferación de todos los tipos celulares. Este trabajo demuestra que las ciclinas E son prescindibles para el desarrollo murino. Sin embargo, la ausencia de ciclina E altera severamente la endorreplicación de las células gigantes del trofoblasto y de los megacariocitos.Las células deficientes en ciclina E proliferan activamente en condiciones de ciclado contínuo,pero no son capaces de reingresar al ciclo desde G0,por no poder incorporar las prot.MCM al orígen de replicación durante la progresión G0-S. Se encontró también que las células deficientes son resistentes a la transformación oncogénica.

GENERACION DE RATONES DEFICIENTES EN CICLINAS E1 Y E2

• Para realizar un testeo riguroso del requerimiento de las ciclinas E en el desarrollo y la oncogénesis,se generaron ratones que carecen de ciclina E1 o E2 delecionando el gen de interés en stem cells embrionarias.

• En el caso de ciclina E1 se delecionaron los exones codificantes 2-11.

• En el caso de E2, los exones codificantes 1-8.• Los ratones homocigotas ciclina E1-/- y E2-/-

fueron generados utilizando métodos std., y la ausencia de los exones delecionados fue verificada por Southern Blotting.

Aislamiento de stem cells embrionarias WT

Reemplazo de exones 2-11 por recombinación homóloga (se elimina fragmento Not I - Sca I de 10kb)

Cultivo en medio de selección(medio + neomicina)

10/198 clones recombinaron en locus E1

Generación de ratones E1 +/-

Generación de ratones deficientes en Ciclina E1 y Ciclina E2

Transfección con construcción dirigida al gen E1

Aislamiento de stem cells embrionarias E1 +/-

Reemplazo de exones 1-8 por recombinación homóloga (se elimina fragmento Not I - Spe I de 14kb)

Cultivo en medio de selección(medio + puromicina)

4/320 clones recombinaron en locus E2

Generación de ratones E1+/- E2+/-Por cruzamiento se obtuvieron los dobles homocigotas E1-/- E2-/-


Transfección con construcción dirigida al gen E2

Southern blot para verificar exones delecionados1) Extracción de DNA genómico2) Digestión con enzimas de restricción3) Electroforesis en gel de agarosa4) Desnaturalización del DNA5) Transferencia a nitrocelulosa6) Hibridización con sondas radiactivas7) Autorradiografía

•Digestión con ScaI y SpeI•Sonda cDNA E1 exones 4-12 y región 3´UTRE1 •Digestión con EcoRI

•Sonda cDNA E2 exones 1-6 E2

PuroNeo

7.62.6

2.8

9.0


Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis

Se testearon 3 grupos: WT; E1 -/- y E2 -/-

E1 -/-

Nacieron de acuerdo con el ratio mendeliano y no se diferenciaron del WT

Histopatologicamente revelaron morfogénesis normal

Expectativa de vida normal

Apariencia Normal en toda su vida


Se testearon 3 grupos: WT; E1 -/- y E2 -/-

E2 -/-

Nacieron de acuerdo con el ratio mendeliano

Inicialmente no se diferenciaron del WT

Presentaron un 50% estériles, reducido tamaño testicular y menor cantidad de esperma

Paredes de los tubos seminíferos mas gruesos y menos células espermatogénicas

Meiosis anormal frecuente dentro de los espermatocitos y presencia de células multinucleares dentro del epitelio seminífero


Observación

Ciclina E2 es requerida para el normal desarrollo de células germinativas en machos y jugaría un rol importante en la meiosis

Las hembras deficientes de ciclina E2 se desarrollaron normal y eran totalmente fértiles

Además el desarrollo y su expectativa de vida fueron normales


Cruzamiento entre E1 y E2 y se generaron ratones que expresaban un solo alelo

Ciclina E1 -/- E2 +/- y Ciclina E1 +/- E2 -/-

Los primeros fueron iguales al control

Los segundos presentaron hipoplasia testicular e infertilidad que fue más pronunciada que cuando solo eran deficientes de E2


Estos análisis fenotípicos sugieren:

Las ciclinas E interactúan en sus funciones del ciclo celular

Que la expresión de un alelo es suficiente para el normal desarrollo

Otra explicación sería que la proliferación de ciertos tejidos no requieren ciclinas E

Anormalidades Testiculares en ratones Ciclina E-(A) Cortes Histologicos teñidos con hematoxylina y eosina

Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Trofoblastos

Se cruzaron E1- y E2-

Ningún doble mutante nació vivo

Se recogieron embriones en distintos estados de desarrollo:

Día 10,25 : Cantidad de embriones vivos según lo esperado

Día 10,75 : 50% de los embriones estaban vivos y tenían un desarrollo retardado comparado con el WT

Día 11,5 : no se encontraron embriones vivos


Estudios histopatológicos determinaron que a pesar del crecimiento retardado, estos embriones desarrollaron una morfogénesis normal y sin señales de lesiones patológicas

En contraste, tejidos extraembrionarios revelaron anormalidades en las placentas

Los trofoblastos muy prominentes en la placenta de WT, estaban casi desaparecidos en los mutantes


Se observaron pequeños trofoblastos con núcleos mas pequeños

En WT usualmente los trofoblastos contienen hasta 1000N, en los mutantes se observaron alrededor de 100N, esto sugiere que la Ciclina E actúa en la endoreplicación

Dada la función central de los trofoblastos en la placenta, nuestra hipótesis que esto causaría la letalidad en los embriones

Fenotipo de los embriones de la Ciclina E1−/−E2−/− (A) Supervivencia de embriones E1−/−E2−/− (B)Embriones WT y E1−/−E2−/− en el día 10.75de gestación(C) Cortes histológicos de placentas de WT y E1−/−E2−/− en el día10.5 de gestación. En las flechas se ven los nucleos de trofoblastos (D) Distribución ploide en trofoblastos

localizada médula ósea productora de plaquetas núcleo lobulado y poliploide ENDORREPLICACIÓN

Megacariocito

Las células gigantes del trofoblasto necesitan ciclina Epara sus rondas de replicación del DNA.

¿Qué pasa con los megacariocitos?

Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Megacariocitos

EmbrionesWT ó E1-/- E2-/-

Aislamiento de megacariocitos de hígado

Cultivo 72hs con trombopoyetina(estimulador de la endorreplicación)

Inmunofluorescencia anti CD41-FITC(marcador de plaquetas y megacariocitos)

Tinción del DNA con ioduro de propidio(agente intercalante fluorescente)

Determinación de contenido de DNAen megacariocitos por citometría de flujo


Población CD41+ : megacariocitos

CD41-FITCFluo VERDE

Se encuentra afectada la endorreplicación: este resultado junto con el dato obtenido en células gigantes del trofoblasto revela que la ciclina E es necesaria para el la ciclina E es necesaria para el proceso de endorreplicación.proceso de endorreplicación.


WTcontenido poliploide pico 32 N

E1-/-E2-/- contenido poliploide pico 8 N

ioduro de propidioFluo ROJA

Aislamiento de MEFs

Cultivo 72hs en DMEM 10% FBS

Pulso de BrdU 1h

Inmunofluorescencia con anti BrdU-FITC

Análisis de proliferación por citometría de flujo

Tinción del DNA con ioduro de propidio


Ciclo Celular Contínuo en Ausencia de Ciclinas E en Fibroblastos Embrionarios Murinos (MEFs)

iod

uro

de

pro

pid

ioF

luo

RO

JA

WTG1 55.3%S 28.9%

G2/M 15.8%

E1-/-E2-/-G1 68.0%S 18.2%

G2/M 13.8%

Pasajes tempranos de ambas líneas están en activa proliferaciónestán en activa proliferación in vitro con más células células en G1 y menos en S en las mutantes respecto de las wild type


BrdU-FITCFluo VERDE

Aislamiento de MEFs

Cultivo 7 días en DMEM 10% FBS

Recuento celulardía por día


Al día 7 el incremento en MEFs mutantes es un 70% del incremento en WT: la proliferación en células mutantes está poco afectadapoco afectada en comparación con las WT


Si se postuló que las ciclinas E:•Fosforilan RB•Inducen a la ciclina A•Degradan a p27

¿Por qué su ausencia no arresta el ciclo celular?

Tanto en embriones como en MEFs se encontraron rdos similares para mutantes y WT: las ciclinas E no se requieren para mantener un ciclo celular contínuo.las ciclinas E no se requieren para mantener un ciclo celular contínuo.


Western blot de embriones y MEFs

1) SDS-PAGE de extractos celulares2) Transferencia a nitrocelulosa3) 1° Anticuerpo: anti pRB

anti ciclina Aanti p27

4) 2° Anticuerpo: conjugado con peroxidasa5) Detección de bandas por quimioluminiscencia

Kinasa A: inmunoprecipitación y fosforilación de

H1 con -[32P]-ATP

Objetivo: Analizar si las células E1-/-E2-/-, pueden reentrar al ciclo

celular desde la fase G0.

• Tomaron células E1-/-E2-/- y WT y las estimularon para reentrar a la fase S.

• Las células fueron aquietadas por inhibición de contacto y estimuladas para entrar a la fase S en condiciones de baja densidad.

Resultados:• Las WT entran a la fase S sincronizadamente a las 12

horas • Las células E1-/-E2-/-, nunca entran a fase S.

Requerimiento de Ciclina Epara reentrar al Ciclo Celular

• Compararon la fosforilación de la pRB a las 0 h. y a las 18 h.

• WT hiperfosforilación • Seguimiento de la fosforilación a lo largo de las

18 h. • Determinaron la presencia de CDKE y CDKA

con histona H1 como sustrato.

Conclusión: en las células E1-/-E2-/- la CdKA es la causante de la fosforilación de la pRB, aunque esta se retrasa de 2-3 h.

Fosforilación de pRB??

Fosforilación e inactivación de la pRB liberación de E2F

• Estos factores son normalmente inducidos en E1-/-E2-/- ??

• CDC45 y CDC6: se expresaron normalmente tanto en células WT como en E1-/-E2-/-

Examinaron la presencia de MCM2 en las células WT y las E1-/-E2-/-.

• WT: MCM2 no estuvo unida al DNA ni en G0 ni en G1 temprana, pero a las 12 h. de la estimulación se asocia a la cromatina. Aparición de la CDKE.

• E1-/-E2-/-: Nunca unieron las MCM2 al DNA.

Los niveles libres de MCM2 fueron normales en ambos casos.

No se acoplan las MCM??

WT: • Proteína ORC2 permanece asociada al

DNA.• CDC6 activada y unida al DNA a las 12 h.

E1-/-E2-/-:• ORC2 fue asociado al DNA.• CDC6 fue unido al DNA casi al mismo

tiempo que en las WT.

Otros Complejos Pre-replicativos??

En ausencia de Ciclina E las células fallan en el ensamblaje normal de los complejos pre-replicativos, explicando su inhabilidad para entrar en el ciclo celular pero no en la continuidad del mismo.

Conclusión

-Infectaron: WT y E1-/E2-fibroblastos con retrovirus codificando:

• H-ras + c-Myc• H-ras + DN p 53• H-ras + E1A• c-Myc

-E1-/E2- no formaron focos de células.

Resistencia a la transformación oncogénica de las células deficientes en ciclina E

Resistencia a la transformación oncogénica de las células deficientes en ciclina E

M

G1

S

G2

Punto de restricción

Ciclina E

G0

● Activa E2F.● Une y activa CDC25.● Contribuye a la inactivación de RB.● Desencadena la iniciación de la replicación del DNA (fase S). ● Control del centrosoma.● Control de la biosíntesis de histonas vía fosforilación del p220.

Ciclina E. Acciones postuladasCiclina E. Acciones postuladas

G1Ciclina D CDK 4,6

DNA

Rb

DNA

E2F

PP

P

P

Se favorece la transcripción de genes que permiten superar el punto de restricción en el ciclo celular.

Rb

E2F

Proteina del retinoblastoma

Factor de transcrIpción

MCiclina B CDK 1

S

Ciclina A CDK 2

G2

Ciclina A, B CDK 1

Ciclina E CDK 2

CDC25

Ciclina E. Resultados

● Es prescindible para la embriogénesis normal del ratón.

● Es importante para el desarrollo de Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans.

Ciclina E. Resultados

● Efecto paradojal en la embriogénesis normal del ratón.

● Es esencial para el desarrollo normal de placenta de mamíferos. ● No es requerida para el desarrollo del embrión con excepción del sistema cardiovascular (requerimiento diferencial).

● No es esencial para el ciclo celular continuo.

● Experimentos con la espermatogénesis.● Durante el ciclo celular continuo, hay niveles normales de MCM (factor de inicio de la replicación) pero falla en su unión al origen de replicación, sin embargo esta función es favorecida por otras proteínas.

Análisis ``in vitro´´ de células deficientes en ciclina E


● Es importante para la reentrada al ciclo desde la quiescencia (G0) y en las células con endoreplicación.

● Endoreplicación (síntesis de DNA sin mitosis) Experimentos con las células del trofoblasto y megacariocitos.● La falla de la unión de MCM al origen de replicación, no es cumplida por otras proteínas.



● Son resistentes a la transformación por varios pares de oncogenes.

● Los niveles de P21 son normales. Estos son (-) de CDK es decir (-) la fase S.● Hay un umbral de la actividad de CDK que es requerida para la transformación oncogénica.● Este umbral se puede alterar por: CDK (de P21) o eliminar los activadores de las quinasa (ciclinas).



Inhibidores de fase S

Ciclina D CDK 4,6+

Rb

E2F

DNA

Proteina del retinoblastoma no fosforilada

Factor de transcripción

Ciclina E CDK 2+

p21p57

p27

Mecanismo de degradación de p27

G1 temprana

G1 tardía

RecomendaciónSi una clase le produce dolores de

cabezaSONRIA

SIEMPRE

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

Es una técnica que permite la medición simultánea de múltiples características de células en suspensión.

Se utilizan anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos para la marcación de proteínas específicas de cada célula ( análisis de poblaciones celulares) y colorantes específicos para determinación de mortalidad, proliferación, etc.

Estructura Básica de un Estructura Básica de un Citómetro de FlujoCitómetro de Flujo

SISTEMA FLUÍDICOPermite la toma de la muestra y el traslado de las células.SISTEMA ELECTRÓNICOConvierte las señales ópticas en señales digitales para su análisis en la computadora.SISTEMA ÓPTICOPara la generación y medición de las señales lumínicas.

SISTEMA ÓPTICOSISTEMA ÓPTICO

OPTICA DE EXCITACIÓNLáserLentes para enfocar y dirigir el haz del láser

OPTICA DE LECTURALentes de recolección de la luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas .Sistema de espejos y filtros para dirigir longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.

1) TAMAÑO celular relativo ( Forward Scater o FSC)

2) GRANULARIDAD o complejidad interna relativa (Side Scater o SSC)

3) Intensidades relativas de emisión de FLUORESCENCIA ( FL1, FL2, FL3 ,FL4)

PARÁMETROS CELULARES MEDIDOSPARÁMETROS CELULARES MEDIDOS

FSC y SSCFSC y SSC

RIGHT ANGLE LIGHT DETECTOR (COMPLEJIDAD CELULAR)

HAZ DE FORWARD LIGHT DETECTOR

LASER (AREA DE SUPERFICIE CELULAR)

FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA

- SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES

-SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER

SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA

-SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD

-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER

Análisis de DatosAnálisis de Datos

Histograma Dot PlotAnálisis de un parámetro único Gráfico de dos parámetros

Deoxi-timidina Bromodeoxi-uridina

Figure 4. Rescue of Cyclin E1−/−E2−/− Lethality by Tetraploid Blastocyst Complementation(A) Survival of the rescued embryos at various stages of development. +++ indicates normal development; ++− indicates that a fraction of embryos were found dead at this stage.(B) Normal appearance of rescued E1−/−E2−/− animals at postnatal day (P)1. A wild-type (WT) neonate is shown for comparison.(C) Ploidy distribution of WT and cyclin E1−/−E2−/− megakaryocytes cultured in vitro for 3 days in the presence of thrombopoietin. Peaks representing each ploidy class are labeled.(D) Cardiovascular abnormalities in cyclin E1−/−E2−/− embryos. Magnetic resonance imaging of cardiac malformations in E1−/−E2−/− embryos. Scale BARS = 1 mm; axes: d, dorsal; v, ventral; r, right; l, left. All images are transverse sections from day 15.5 embryos. Panels 1, 3, and 5 are images from a wild-type embryo. Abbreviations: sas, secondary atrial septum; pas, primary atrial septum; ra, la, right and left atria, respectively; rv, lv, right and left ventricles, respectively; ivs, interventricular septum; a-ao, ascending aorta; d-ao, descending aorta; ao-a, aortic arch; pa, pulmonary artery; tr, trachea; and es, esophagus. Panel 6 is a 3D reconstruction (left oblique view) of normal cardiac anatomy; note the aortic arch on the left of the trachea. Panels 2, 4, and 7 are images from a cyclin E-deficient embryo, and panel 8 is a 3D reconstruction of mutant cardiac anatomy. These show a primum atrial septal defect (ASDp, panel 2), a ventricular septal defect (VSD, panel 4), and a right-sided aortic arch that arises from the right ventricle (panels 7 and 8), i.e., double-outlet right ventricle.

Date post:	24-Jan-2016
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