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Introduccin

La tcnica de aspiracin foliculartransvaginal guiada por ultrasonografa(OPU,Ovum Pick-Up), desarrollada ori-ginalmente para la reproduccin asistidaen la especie humana(Lenz & Lauritsen,1982) , es usada por primera vez, enganado vacuno en Holanda al final de lasdcada de los 80(Pieterse et al., 1988) . Elempleo de la OPU de forma rutinaria en

reproduccin asistida veterinaria se iniciaen 1994(Kruip et al. 1994) .

En la actualidad, y segn datos dela Asociacin Europea de Transferenciade Embriones (AETE), el nmero totalde sesiones de OPU realizadas solo enEuropa en 2008 fue de 3.753, lo quesupone un aumento del 81% con respec-

to al ao anterior. Con una produccin, enese ao, de 6.751 embriones transferiblesy una media de eficiencia de produccin

de embriones de 180 por sesin. En2008, cuatro pases de Europa (PasesBajos, Alemania, Italia y Francia) aplicaronsistemas de OPU/PIV para la produccincomercial de embriones(Merton, 2009) .

La OPU es una tcnica con muchasposibilidades ya que puede ser usada envacas adultas en varios estados fisiolgi-

cos: cclicas, no cclicas, durante el primertercio de la gestacin y en las que noresponden a estmulos hormonales, pero

OVUM PICK UP (OPU) en bovinos:Aplicaciones en Biotecnologa

de la reproduccinDr. Salvador Ruiz Lpez

Dpto. Fisiologa. Facultad de VeterinariaUniversidad de Murcia

E-mail: sruiz@um.es - www.um.es/grupo-fisiovet

En 1981, naci el primero ternero (Virgil ) mediante la aplicacin de sistemas de produccin

in vitro de embriones (PIV). Hasta la fecha, se puede estimar que ms de 200.000 ternehan nacido en todo el mundo mediante PIV (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006) .

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tambin en animales viejos con desrde-nes reproductivos de origen no gentico(Galli et al., 2001) , y en terneras y novillasprepberes a partir del 6-8 mes de edad(Taneja et al., 2000) .

La OPU supone una alternativa a la PIV de embriones bovinos realizada mediante elempleo de ovocitos procedentes de mata-dero. En la OPU trabajamos con ovocitosobtenidos de vacas vivas utilizando materialgentico de origen conocido. Se consigueproducir mediante esta tcnica un mayornmero de embriones (hasta 100 embrionesal ao por vaca) que los obtenidos median-te protocolos estndar de transferencia

embrionaria (TE). La aplicacin conjuntade ambas tecnologas (OPU/PIV) permite laproduccin de ms de 50 terneros por vacadonante y ao. Por lo que, ambas se con-vierten en las herramientas adecuadas paraobtener nacimientos adicionales de donan-tes de alto valor gentico que no puedenser sometidos a un programa convencionalde superovulacin (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006 ).

La recuperacin repetida de ovocitosmediante OPU permite obtener la mayordescendencia posible de animales con

alto valor gentico y acelerar los procesosde seleccin y mejora animal (va paternay materna) a la vez que supone una fuen-te extraordinaria de ovocitos para clona-cin y transgnesis(Ding et al., 2008) .

Factores que afectana la OPU

Despus del desarrollo inicial de latcnica de OPU, se han llevado a cabomuchos estudios investigando diversosfactores que puedan incrementar losresultados. stos pueden ser divididos enfactores tcnicos y biolgicos.

1. Factores Tcnicos. Se ha inves-tigado sobre la geometra de la aguja

de aspiracin y la presin de vaco(Bols et al., 1995, 1996) con lo que se haconseguido mejorar la calidad de losovocitos recogidos reduciendo el nmerode ovocitos denudados, aunque sin quese haya provocado un incremento delnmero total de ovocitos obtenidos porsesin de OPU. La mejora tcnica mssignificativa ha sido la sustitucin de laaguja original de 50 cm de longitud poruna aguja mucho ms corta (7 cm), est-ril, descartable y fcilmente reemplazableentre diferentes donantes, reduciendo asel riesgo de contaminacin. Adems, estasagujas tienen un volumen muerto menorlo que minimiza el tiempo en el que los

complejos cmulo-ovocito (COCs) estnexpuestos a un ambiente desfavorable ypermite la obtencin de fluido folicularde folculos individuales para propsitosde investigacin.

2. Factores Biolgicos. Entre stospodemos incluir los siguientes: el animaldonante, la pre-estimulacin hormonal, eltiempo y frecuencia de la OPU y la expe-riencia del operador.

Animal donante . Al igual que en lossistemas MOET, la vaca donante puedeexplicar aproximadamente un 20% dela variacin observada en trminos deovocitos por OPU y de eficiencia en laproduccin de embriones.

Pre-estimulacin con FSH (Fig. 1). Lamejora ms significativa con respecto alrendimiento en la calidad de los ovocitos

y, por consiguiente para la produccinde embriones fue la pre-estimulacinhormonal previa a la OPU mediante eluso de gonadotropinas(De Roover et al., 2005, 2008). Muchos autores han

Figura 1. Imagen ecogrfica de ovario de vaca que ha sido previamente estimulado con FSH (izquierda) y ovario sin estimulacin (derecha), donde se aprecia unfolculo y un cuerpo lteo.

Figura 2. La experiencia del operador es de gran importancia para la obtencin de buenos resultados en PU.

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descrito un efecto positivo general de lapre-estimulacin con FSH antes de la OPUsobre el desarrollo posterior de los ovocitos.Blondin et al . (1997) observaron que elmejor desarrollo aparece cuando la estimu-lacin es seguida por 48 h de la aspiracin.Chaubal et al. (2006) realizan un estudiocomparativo entre sistemas de OPU con ysin estimulacin hormonal y concluyen que,la retirada del folculo dominante seguidade la administracin de FSH y de OPU 48 h

ms tarde, fue el mejor protocolo en basea la respuesta folicular, la recuperacin deovocitos y la produccin de embriones. Elensayo fue realizado con xito, durante 10semanas seguidas. Estos autores empleanuna dosis semanal nica de FSH, reducidaen comparacin con la dosis completaestndar que se utiliza en la ovulacinmltiple de rutina y el sistema MOET. Estesistema adems de evitar la hiperestimula-cin ovrica reduce el estrs asociado conmltiples inyecciones de FSH.

Aunque los sistemas de estimulacinhormonal pueden dar lugar a una mayorproduccin de embriones por vaca yOPU, el rendimiento de embriones porunidad de tiempo por vaca puede no sersuperior, ya que la estimulacin hormonalslo puede hacerse una vez a la semana(Merton et al., 2003) . Sin embargo, lacombinacin de un perodo de OPU conestimulacin con uno sin estimulacin enla misma semana puede dar lugar a una

produccin de embriones superior por

unidad de tiempo y animal.La desventaja de usar la pre-estimula-

cin es la reintroduccin de hormonas y,por lo tanto, se pierde una de las consi-deradas ventajas (la no necesidad de usode hormonas en la OPU) con respecto alos sistemas MOET. Aunque en el casode la OPU no son necesarias mltiplesinyecciones y un manejo extra, lo querepresenta una ventaja desde el punto devista del bienestar animal.

Frecuencia de OPU . El intervalo entresesiones de OPU tiene influencia sobrela cantidad y calidad de los ovocitosobtenidos. El periodo de tiempo entre dosaspiraciones afecta, de forma significa-tiva, la tasa de produccin de ovocitos.Obtenindose un mayor nmero en el da

7 en comparacin con la obtencin cada3 4 das. Sin embargo, la calidad de losovocitos, en cuanto al nmero de capasde clulas del cmulo, resulta mayor conOPU a intervalos de 3 das y menor conintervalos de 7 das, el desarrollo embrio-nario tambin se ve afectado (197%vs . 135%)(Merton et al., 2003) . Estosresultados son coincidentes con la hip-tesis de que el folculo dominante ejerceun efecto negativo sobre el posteriordesarrollo de los ovocitos. Con la tcnicams utilizada de obtencin cada 3-4 das(lunes/jueves) 2-5 das (lunes/mircoles)no se ve afectado el nmero de ovocitosrecogidos por sesin, sin embargo, la cali-dad fue mayor en el intervalo de 2 das,lo que puede ser atribuido al efecto delfolculo dominante.

Experiencia del operador (Fig. 2 ). Latcnica de OPU se realiza por 1 2 per-

sonas y, en determinadas empresas, lamisma persona lleva a cabo el desarrollode la tcnica de una forma similar duran-te aos, usando las mismas condicionestcnicas. La experiencia del operador (enun sistema de una sola persona) o deloperador y el ayudante (en un sistemade dos personas) tiene un efecto sig-nificativo en el nmero y la calidad delos ovocitos recolectados (Merton et al.,2003 ) y hasta cierto punto una adecuadaseleccin de los operadores y/o asistentespuede ayudar a mejorar los resultados.

Metodologa y tcnicade OPU

La OPU precisa de la tranquiliza-cin previa del animal, sta se llevara cabo con el animal en pie en unpotro de contencin, mediante xilacina(i.m.) al 2% (Rompn, 025 ml/100 kg).Posteriormente, se debe administrar pro-cana (Procasel 2%, 3-4 ml para novillas,5-7 ml vacas adultas) va epidural (Fig.3), para reducir los esfuerzos expulsivosy facilitar la manipulacin del ovario. Tras

el vaciamiento del recto y la limpieza ydesinfeccin de la vulva y rea perinealse introducir el transductor en la vagina,convenientemente lubricado y protegidopor una cubierta sanitaria de ltex.

Para la visualizacin de los folcu-los ovricos empleamos un ecgrafoPie Medical (mod. FalcoVET) equipadocon una sonda transvaginal (Pie MedicalR-10) de 5-75 MHz y un handgrip omango de OPU de 60 cm de longituddonde se colocar la gua de puncin (Fig.4). Por la gua se introducir una agujade puncin desechable (20 G, 09 x 70mm) conectada a un tubo estril de 50ml mediante una conduccin de Tefln.El equipo de OPU se completa con unabomba de vaco accionada por pedal conla que se aplicar una aspiracin constan-

Figura 3. Administracin de inyeccin epidural de procana (detalle).

Figura 4. Foto supe-rior: sonda transva-ginal, mango de PU y gua de puncin.Foto inferior: sondamontada para PU (detalle).

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te de 50-53 mm Hg (20 ml/min). El tubode recogida debe mantenerse atemperadoa 37C en bao termosttico.

Los ovarios se posicionarn va rectaldelante de la sonda para ovricos visiblesde ms de 3 mm de dimetro. Antes deiniciar la sesin de puncin se drenar elsistema aspirando una pequea cantidadde medio de recogida. Tras la aspiracin

de cada 3-4 folculos se realizar unlavado exhaustivo del fluido folicular enla aguja de aspiracin y en el sistema derecoleccin con medio de lavado y recogi-da [PBS suplementado con heparina sdi-ca (22 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)].

El fluido obtenido de cada animalcontenido en un tubo de recogida de 50ml ser inmediatamente filtrado (50 m

), los restos de sangre sern eliminadospor continuos lavados en PBS fresco y sepasar a una placa de Petri para localizary evaluar morfolgicamente bajo este-reomicroscopio los complejos cumulus-ovocito (COCs) aspirados (Fig. 6).

Clasificaremos los COCs obtenidos encinco categoras, segn homogeneidad,morfologa del citoplasma y compactibi-lidad de las clulas del cmulo(Oropezaet al., 2004) :

- Categora I: Ovocitos con ms de trescapas de clulas de cmulo com-pactas y con citoplasma homogneouniformemente granulado.

- Categora II: Ovocitos con menos detres capas de clulas del cmulo ycitoplasma generalmente homogneo.

- Categora III: Ovocitos con una solacapa de clulas del cmulo y cito-plasma de aspecto irregular conreas oscuras.

- Categora IV: Ovocitos denudados.

- Categora V: Ovocitos maduradosinvivo, con cmulo expandido.

Los COCs de las categoras I-III seconsiderarn aptos para su procesamien-to en maduracin, fecundacin y pos-Figura 5. Sujecin del ovario (mano izquierda) y manejo del mango de PU (mano derecha).

Tabla 1. Recuperacin y capacidad de desarrollo embrionario de ovocitos de OPU en ganado bovino en diferentes estados reproductivos y con y sin pre-estimula-cin hormonal.

Tipo animalDonante

NOPUs

N ovosOPU/animal

N ovos viablesOPU/animal

% Blastos /OPU / animal Referencias

VacasLactantes 34 72 50 11

Bungartz et al.(1995)

VacasSecas 40 69 44 10

VacasGestantes 36 50 48 04

Terneras 41 57 39 05

TernerasGestantes 130 39 18 04 Rust et al.

(1999) VacasGestantes 214 41 20 04

Vacasen puerperio 780 57 38 08

Kniep(2001)

VacasLactantes 80 89 57 13

Oropeza et al. (2004)

Vacas estimuladascon FSH 60

34 -71(segn dosis FSH) 26 - 58 09 - 24

De Roover et al .(2005)

Vacassin estimulacin 30 39 - 53 38 - 52 08 -14

Chaubal et al .(2006) Vacas estimuladascon FSH 30 49 - 106 48 - 101 11 - 24

VacasSecas 84 51 42 -

Ruiz et al.(2009a, b)

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terior produccinin vitro de embriones,los ovocitos de categoras IV y V no seutilizarn para PIV, considerndose ovo-citos no viables.

Resultados

En la tabla 1 mostramos algunosresultados de obtencin de ovocitos yembriones producidos por OPU/PIV endistintos tipos de animales con y sin pre-estimulacin hormonal.

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Figura 7. COCs categoras I y II aptos para su procesamiento en produccin in vitro de embriones.

Figura 6. Filtrado del lquido folicular obtenido en PU (izquierda). Bsqueda y evaluacin morfolgica por estereomicroscopio de los C Cs aspirados (derecha).

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