Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo
DARJAN ANDREJC
INDUKCIJA APOPTOZE V HUMANIH CELIČNIH LINIJAH LIMFOCITOV B S STIMULACIJO RECEPTORJA EP4
EP4 RECEPTOR STIMULATION INDUCES APOPTOSIS IN
HUMAN B CELL LINES
DIPLOMSKA NALOGA
Ljubljana, 2010
Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo, na Katedri za klinično
biokemijo, pod mentorstvom izr. prof. dr. Irene Mlinarič-Raščan, mag. farm.
ZAHVALA
Za strokovno pomoč pri izdelavi diplomske naloge se iskreno zahvaljujem mentorici izr.
prof. dr. Ireni Mlinarič-Raščan, mag. farm.
Zahvaljujem se tudi mlademu raziskovalcu asist. Matevžu Prijatelju, mag. farm., ki me je
usmerjal in mi pomagal pri izvajanju laboratorijskega dela diplomske naloge.
Za vso prijaznost sem prav tako hvaležen vsem ostalim zaposlenim na Katedri za klinično
biokemijo.
Nenazadnje hvala tudi staršem, ki so mi omogočili študij, Katji, sestri ter vsem prijateljem,
ki so mi tekom študija stali ob strani.
IZJAVA
Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr. Irene
Mlinarič-Raščan, mag. farm.
Darjan Andrejc Ljubljana, september 2010
Predsednik diplomske komisije: prof. dr. Slavko Pečar, mag. farm.
Član diplomske komisije: izr. prof. dr. Odon Planinšek, mag. farm.
KAZALO VSEBINE
KAZALO VSEBINE ............................................................................................................I
KAZALO SLIK .................................................................................................................IV
KAZALO PREGLEDNIC ................................................................................................VI
KAZALO ENAČB.............................................................................................................VI
POVZETEK..................................................................................................................... VII
SEZNAM OKRAJŠAV ...................................................................................................... X
1 UVOD ................................................................................................................................ 1
1.1 APOPTOZA ................................................................................................................ 1
1.1.1 Razvoj limfocitov B............................................................................................... 2
1.1.2 Negativna selekcija limfocitov B .......................................................................... 3
1.2 MALIGNE BOLEZNI LIMFOCITOV B .................................................................... 3
1.2.1 Levkemije .............................................................................................................. 4
1.2.2 Limfomi................................................................................................................. 5
1.2.3 Terapija B-limfocitnih malignih obolenj .............................................................. 6
1.2.4 Modulacija apoptoze kot terapevtski pristop........................................................ 7
1.3 EP4 RECEPTOR (PROSTAGLANDINSKI RECEPTOR TIPA E4).......................... 8
1.3.1 Vloga receptorja EP4 pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških procesov ... 9
1.3.2 Vpliv EP4 stimulacije na apoptozo..................................................................... 10
1.3.3 Učinki agonistov in antagonistov receptorja EP4.............................................. 11
2 NAMEN DELA............................................................................................................... 13
3 MATERIALI IN METODE .......................................................................................... 14
3.1 MATERIALI ............................................................................................................. 14
3.1.1 Kemikalije........................................................................................................... 14
3.1.2 Kompleti za analize ............................................................................................ 14
3.1.3 Pufri in raztopine................................................................................................ 15
3.1.4 Protitelesa in fluorescenčna barvila .................................................................. 15
3.1.5 Gojišča................................................................................................................ 16
3.1.6 Laboratorijska oprema....................................................................................... 16
I
3.1.7 Humane celične linije ......................................................................................... 18
3.2 METODE DELA S CELICAMI ................................................................................ 20
3.2.1 Gojenje celic ....................................................................................................... 20
3.2.2 Subkultiviranje celičnih linij............................................................................... 20
3.2.3 Odmrzovanje celic .............................................................................................. 20
3.2.4 Štetje celic.......................................................................................................... 21
3.2.5 Priprava celičnih kultur za mikroskopiranje in pretočni citometer ................... 21
3.3 TEST ZA DOLOČANJE CELIČNE METABOLNE AKTIVNOSTI Z
REAGENTOM MTS ....................................................................................................... 23
3.4 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA ................................................................... 23
3.4.1 Fluorescenca ...................................................................................................... 23
3.4.2 Epifluorescenčna mikroskopija .......................................................................... 25
3.5 PRETOČNA CITOMETRIJA ................................................................................... 28
3.5.1 Sipanje svetlobe .................................................................................................. 28
3.5.2 Imunofluorescenca ............................................................................................. 29
3.5.3 Metode za pripravo celic za pretočno citometrijo.............................................. 30
4 REZULTATI IN RAZPRAVA...................................................................................... 35
4.1 IZRAŽANJE RECEPTORJA EP4 V HUMANIH MALIGNIH LIMFOCITIH B..... 35
4.1.1 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s pretočno
citometrijo.................................................................................................................... 36
4.1.2 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s fluorescenčno
mikroskopijo ................................................................................................................ 38
4.1.3 Določanje ekspresije EP4 receptorja na nemalignih PBMC s pretočno
citometrijo.................................................................................................................... 40
4.2 PGE1-OH ZMANJŠA METABOLNO AKTIVNOST MALIGNIH
LIMFOCITOV B ............................................................................................................. 45
4.2.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na metabolno aktivnost celic z
MTS testom .................................................................................................................. 45
4.3 PGE1-OH INDUCIRA APOPTOZO V MALIGNIH LIMFOCITIH B..................... 48
4.3.1 Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V............................................................... 48
4.4 PGE1-OH INHIBIRA PROLIFERACIJO V MALIGNIH LIMFOCITIH B............. 53
II
4.4.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na celični cikel malignih
imfocitov B................................................................................................................... 53
4.4.2 Vrednotenje celične proliferacije malignih lifocitov B s postopkom CFSE
CellTrace™ ................................................................................................................. 58
5. SKLEP ............................................................................................................................ 62
6. LITERATURA .............................................................................................................. 63
7 PRILOGE........................................................................................................................ 68
III
KAZALO SLIK
Slika 1: Zaporedje stadijev pri zorenju celic B..................................................................... 3
Slika 2: Neselektivni agonist receptorja EP4 PGE2, selektivni agonist PGE1-OH. .......... 12
Slika 3: Jablonski-jev diagram............................................................................................ 24
Slika 4: Stokes-ov premik................................................................................................... 25
Slika 5: Shema epifluorescenčnega mikroskopa................................................................. 26
Slika 6: Shema pretočnega citometra.................................................................................. 28
Slika 7: Sipanje svetlobe v pretočni citometriji .................................................................. 29
Slika 8: Primer histograma iz analize s pretočnim citometrom. ......................................... 36
Slika 9: Ekspresija receptorja EP4 na celicah NALM-6..................................................... 37
Slika 10: Posnetki malignih limfocitov B pod fluorescenčnim mikroskopom. .................. 39
Slika 11: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega
krvodajalca (CD19+). .......................................................................................................... 42
Slika 12: Primerjava relativne povprečne fluorescence označenega EP4 receptorja med
fiksiranimi in permeabiliziranimi preiskovanimi celicami in nemalignimi CD19+ celicami
iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab Imgenex)......................................................... 43
Slika 13: Primerjava relativne povprečne fluorescence med fiksiranimi in
permeabiliziranimi preiskovanimi celicami RAMOS in NALM-6 ter nemalignimi CD19+
celicami iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab Cayman)........................................... 44
Slika 14: Metabolna aktivnost celic RAMOS in MHH PREB stimuliranih s PGE1-OH... 46
Slika 15: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS, stimuliranih z 100
μM PGE1-OH (12h) ............................................................................................................ 49
Slika 16: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS na nestimulranih
celicah (12h) ........................................................................................................................ 50
Slika 17: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS. ............................. 51
Slika 18: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB........................ 52
Slika 19: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na potek celične delitve celic RAMOS in
MHH-PREB ........................................................................................................................ 55
Slika 20: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS........................ 56
Slika 21: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB ................. 57
Slika 22: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila cfse v celicah RAMOS. .. 58
Slika 23: Vsebnost barvila CFSE v nestimuliranih celicah RAMOS................................. 59
IV
Slika 24: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila CFSE v celicah MHH-
PREB ................................................................................................................................... 59
Slika 25: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi
celicami RAMOS in MHH-PREB....................................................................................... 60
Slika 26: Ekspresija receptorja EP4 na celicah RAMOS.................................................... 68
Slika 27: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB
(primarno protitelo Ab Imgenex). ....................................................................................... 69
Slika 28: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB
(primarno protitelo Ab Cayman). ........................................................................................ 70
Slika 29: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB
(primarno protitelo Ab Santa Cruz)..................................................................................... 71
Slika 30: Metabolna aktivnost celic NALM-6, KOPN-8 in SU-DHL stimuliranih s PGE1-
OH. ...................................................................................................................................... 72
Slika 31: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega
krvodajalca (CD19+). .......................................................................................................... 73
Slika 32: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS (24h). ................... 74
Slika 33: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (12h). ............. 75
Slika 34: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (24h). ............. 76
V
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS..................... 51
Preglednica 2: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB. ............. 52
Preglednica 3: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic
RAMOS............................................................................................................................... 56
Preglednica 4: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic
MHH-PREB ........................................................................................................................ 57
Preglednica 5: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in
stimuliranimi celicami RAMOS in MHH-PREB ................................................................ 60
KAZALO ENAČB
Enačba 1: Računanje koncentracije celic s hemocitometrom ............................................ 21
VI
POVZETEK
Limfociti B so nosilci specifičnega imunskega odziva, za katerega je značilna imunska
toleranca, ki pomeni sposobnost razločevanja med tujimi in lastnimi antigeni.
Najpomembnejši mehanizem, ki omogoča zgodnjo odstranitev nezrelih celic B, ki izražajo
avtoreaktivni B-celični receptor (BCR), je negativna selekcija z apoptozo. Apoptoza je
normalen fiziološki proces, ki omogoča vzdrževanje homeostaze tkiv. Napake v
mehanizmih, ki zavirajo programirano celično smrt, doprinesejo k nenadzorovani razrasti
celic, česar posledica so lahko maligna obolenja ter avtoimunske bolezni. Indukcija
apoptoze po stimulaciji BCR nezrelih limfocitov B predstavlja eno izmed glavnih
funkcijskih razlik z zrelimi limfociti B, ki se po stimulaciji BCR aktivirajo in proliferirajo.
Raziskave diferencialne genske ekspresije so pokazale, da je na nivoju transkriptoma
statistično najbolj značilna razlika med zrelimi in nezrelimi celicami B po aktivaciji BCR v
ekspresiji gena Ptger4. Ptger4 je gen, ki kodira prostaglandiski receptor EP4, ki je povezan
z vrsto različnih patogenih in fizioloških učinkov odvisnih od tkiva, v katerem se nahaja. V
limfocitih B ima receptor EP4 proapoptotično/tumorsupresorsko funkcijo, saj njegova
stimulacija posreduje inhibitorne učinke na zdravih zrelih limfocitih B. Namen
diplomskega dela je bilo ugotoviti, kje in v kakšni meri humani maligni limfociti B
izražajo receptor EP4 in kakšne učinke posreduje stimulacija receptorja EP4 na
proliferacijo maligno spremenjenih modelnih linij B limfomov in levkemij.
V diplomskem delu smo najprej z imunofenotipizacijo in analizo na pretočnem citometru
ter fluorescenčnem mikroskopu dokazali, da humani maligni limfociti B izražajo receptor
EP4. Ekspresijo smo kvantitativno primerjali z zdravimi humanimi limfociti in ugotovili,
da celični liniji RAMOS in NALM-6 izražata znatno več receptorja kot primarni zreli
CD19+ B limfociti. Pri eksperimentalnem delu smo se poslužili farmakološkega pristopa,
saj smo izbrane celične linije stimulirali s specifičnim agonistom receptorja EP4, PGE1-
OH. Z merjenjem metabolne aktivnosti celic z reagentom MTS smo ugotovili, da
stimulacija receptorja EP4 s PGE1-OH, posreduje inhibitorne učinke na rast maligno
spremenjenih B celic. Z Annexinom V, ki označuje celice v zgodnjem stadiju apoptoze,
smo ugotovili, da celice po stimulaciji s selektivnim agonistom vstopijo v programirano
celično smrt. V nižjih koncentracijah pa selektivni agonist receptorja EP4, PGE1-OH, na
izbranih celicah povzroči zastoj v G0/G1 fazi cličnega cikla, ki se odraža v zmanjšanem
številu celičnih delitev stimuliranih celic. Zaradi povečanega izražanja receptorja EP4 na
VII
nekaterih celičnih linijah B limfomov in levkemij ter zaradi posredovanja inhibitornih
učinkov na rast maligno spremenjenih B celic predstavlja receptor EP4 potencialno tarčo
za zdravljenje oz. podporno terapijo nekaterih vrst B levkemij in limfomov.
VIII
ABSTRACT
B cells play a major role in adaptive immune response, which has the ability to distinguish
between self and non-self antigens. The most significant pathway for early removal of
immature auto-reactive B cells is the negative selection via apoptosis. Apoptosis is a
normal physiological process which maintains the tissue homeostasis. Errors in inhibition
of programmed cell death contribute to uncontrolled cell division which can lead to
malignancies and autoimmune disorders. B cell receptor (BCR) trigerred apoptosis is one
of the major functional differences when comparing immature to mature B cells, since
mature B cells succumb to rapid proliferation instead of apoptosis. Recent research has
identified Ptger4 as one of the genes, whose expression differs the most between mature
and immature B-cells upon BCR triggering. Ptger4 codes for the prostaglandin E receptor
type 4 (EP4) and has different physiological or pathological functions, depending on the
type of tissue it is expressed in. In B cells, EP4 has been identified as a negative feedback
regulator of proliferation in response to BCR signals. Its tumorsuppresive function
contributes to inhibition of growth in non-malignant mature murine B cells. The aim of our
research was to investigate the expression of EP4 receptor and estimate the
pharmacological effects on proliferation in human B cell lymphoma cells.
Using flow cytometry and fluorescence microscopy we showed that human B lymphoma
cells express abundant amounts of EP4 receptor. We compared the expression of EP4
receptor in malignant B cells with non-malignat B cells isolated from peripheral blood of a
healthy donor and determined that RAMOS and NALM-6 cells express significantly
higher amounts of EP4 receptor compared to healthy CD19+ B cells. To asses the
functional charateristics of EP4 receptor we used pharmacological aproach using EP4
receptor selective agonist PGE1-OH. Assesing the metabolic activity of PGE1-OH
stimulated cells with MTS showed that EP4 receptor conveys inhibitory effects on cell
growth. Annexin V assay which indicates early stages of apoptosis clearly showed that the
apoptotic pathway of cell death is initiated in PGE1-OH stimulated B cell lines. In lower
concetrations selective agonist PGE1-OH induced cell cyle G0/G1 arrest of treated cells,
which results in lower count of cell division cycles. Greater expression of EP4 receptor in
the human B lymphoma cells along with its function as a growth supressor of malignant B
cells makes EP4 receptor a new prommising target for therapy of some B lymphomas and
leukemias.
IX
SEZNAM OKRAJŠAV
ALL ..............................akutna limfocitna levkemija
angl...............................angleška beseda
AP-1 ............................. transkripcijski faktor
B-ALL ..........................B -celična akutna limfoblastna levkemija
Bcl-2 .............................produkt gena bcl-2, ki preprečuje apoptozo
Bcl-6 .............................produkt gena bcl-6, ki preprečuje diferenciacijo limfocitov
B-CLL ..........................B-celična kronična limfocitna levkemija
Bcl-XL..........................produkt gena bcl-xl, ki preprečuje apoptozo
BCR..............................B-celični receptor
BL .................................Burkittov limfom
BSA ..............................goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumine)
CD ................................celični označevalec (angl. cluster of differentiation)
CD8+ ............................ limfociti T z markerjem CD8+ (citotoksični limfocit)
CFDA-SE .....................N-sukcinimidil 6-fluoresceinkarboksilat diacetat (“predbarvilo”
CFSE)
CFSE ............................N-sukcinimidil 6-fluoresceinkarboksilat (fluorescentno barvilo)
CLL ..............................kronična limfocitna levkemija
DAPI ............................diamidino-2-fenilindol; fluorescenčno barvilo za DNA
EP4 ...............................prostaglandinski receptor E tipa 4
EPV ..............................Epstein-Barr virus
Fas ................................površinska molekula celic TC, tarča za TNF
FITC............................. fluorescein izotiocianat; fluorescenčno barvilo
GPCR ........................... receptor sklopljen z G -proteinom (angl. G-protein coupled
receptor)
HS1...............................nuklearni transkripcijski faktor
HSV ..............................herpes simplex virus
IFN-γ (α/β) ................... interferon γ (α/β)
Ig................................... imunoglobulin
IgM ............................... imunoglobulin oz. protitelo tipa M
IL .................................. interlevkin
MAPK ..........................z mitogenom aktivirana proteinska kinaza
X
XI
M-CSF .........................makrofagne kolonije stimulirajoči faktor (angl. macrophage-
colony-stimulating fractor)
MHC II ........................poglavitni histokompatibilni kompleks tipa II (angl. class II major
histocompatibility complex)
MTS .............................zmes 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-
sulfofenil)-2H-tetrazola v obliki soli in fenazin etosulfata (reagent
za test metabolne aktivnosti celic)
NF-κB...........................nuklearni traskripcijski faktor κB
PAX5 ............................gen, ki kodira protein, ki zavira diferenciacijo celic
PBMC ..........................celice iz periferne krvi z okroglim jedrom (limfociti, monociti)
PBS ............................... fosfatni pufer s soljo
PFA ..............................paraformaldehid
PGE1-OH ....................hidroksiliran prostaglandin E1; selektivni agonist receptorja EP4
PGE2 ............................prostaglandin E2
PI ..................................propidijev jodid
Ptger4...........................gen, ki kodira receptor EP4
RANKL........................ ligand aktivatorja receptorja jedrnega faktorja NF-κB (angl.
receptor activator for NF-κB ligand)
PE ................................. fikoeritrin (angl. Phycoerythrin); fluorescentno barvilo
TNFR1 ......................... receptor za dejavnik tumorske nekroze tipa 1
TNF-α...........................dejavnik tumorske nekroze (angl. tumor necrosis factor)
TRAIL .........................apoptozo inducirajoči ligand, soroden TNF (angl. TNF related
apoptosis inducing ligand)
VEGF-A .......................vaskularni endotelijski rastni faktor A
1 UVOD
1.1 APOPTOZA
Apoptoza ali programirana celična smrt je kompleksen biokemični proces, ki se sproži kot
odziv celice na specifične dražljaje. Proces apoptoze je natančno programiran in kodiran v
celičnem genskem zapisu. Določeni fiziološki ali patofiziološki dejavniki so sposobni
aktivirati genski program, ki vodi v razgradnjo celičnih struktur in celično smrt (1).
Apoptoza je normalen fiziološki proces, ki omogoča vzdrževanje homeostaze tkiv.
Posledično se napake v uravnavanju apoptoze in nepravilnosti pri poteku apoptoze
odražajo kot razvojne nepravilnosti in kot bolezni (2). Bolezni, za katere je značilen
spremenjen potek apoptoze, lahko razdelimo na bolezni, pri katerih prihaja do
preobsežnega odmiranja celic, in bolezni, pri katerih je apoptoza zavrta. Preobsežna
apoptoza je prisotna pri nevrodegenerativnih boleznih (Alzheimerjeva, Parkinsonova,
Huntingtonova bolezen), akutnem miokardnem infarktu, poškodbah zaradi ishemije pri
kapi itd. Zaviranje celične smrti pa spremlja nenadzorovano razrast celic pri malignih
obolenjih ter avtoimunski bolezni (3).
Za apoptotično celico so značilne naslednje morfološke spremembe: izguba kontaktov s
sosednjimi celicami, kondenzacija citoplazme, kondenzacija kromatina, krčenje in gubanje
celične membrane, sprememba celične površine, fragmentacija jedra in celice (2).
Glavne efektorske molekule apoptotične smrti so kaspaze. To so visoko specifični
proteolizni encimi iz skupine cisteinskih proteaz, ki cepijo peptidno verigo za aspartatom.
V celici jih najdemo v obliki neaktivnega proencima, ki se aktivira po sprožitvi
apoptotskega dražljaja (4). Nekatere raziskave dokazujejo, da imajo poleg kaspaz
pomembno vlogo pri apoptozi tudi kalpaini, katepsini in drugi tipi proteaz, ki so udeleženi
predvsem pri alternativnih poteh prenosa apoptotskega signala (5).
Pri apoptozi poteče kaskada biokemijskih reakcij, ki privede do morfoloških sprememb,
vidnih tudi pod mikroskopom. Celica se skrči, na površini se pojavijo mehurčkasti izrastki,
jedro in mitohondriji se razgradijo, DNA pa se razreže na krajše fragmente. Celica se
razdeli na več apoptotskih telesc, ki jih fagocitirajo ostale celice imunskega sistema. V
nasprotju z nekrozo proces apoptoze ne škoduje sosednjim celic in ne povzroča vnetja.
Apoptozo lahko sprožijo zunanji dejavniki, ki se vežejo na membranske receptorje, ali pa
znotrajcelični signali, ki delujejo na mitohondrije. Za večino celičnih učinkov je ključno
delovanje proteinaz kaspaz.
1
Ločimo torej več vrst indukcije apoptoze:
Intrinzična pot indukcije (razkroj se začne v celici ob doseženi kritični
dolžini telomere na kromosomu, radiaciji, stresu ob stradanju, kemijski ali
virusni okužbi, signalih iz mitohodrija ...)
ekstrinzično pot indukcije (razkroj se začne od zunaj; signali so: »smrtni«
ligandi (Fas, TNFR1, DR3), virus …)
aktivacija sistema perforin/grancim (citotoksični limfociti T CD8+ ob
določenih dražljajih izločijo perforin, ki naluknja celično membrano, in
grancim, ki aktivira kaskado kaspaz) (1)
1.1.1 Razvoj limfocitov B
Limfociti B nastanejo v kostnem mozgu, kjer so zaščiteni pred eksogenimi antigeni.
Matična celica se razvije v progenični limfocit B (pro-B celica). Iz nje se razvije predhodni
limfocit B (pre-B celica), ki na svoji površini izrazi predhodni BCR receptor (pre-BCR).
Na težko verigo tega imunoglobulinskega receptorja se veže nadomestna oz. surogantna
lahka veriga, ki je po zgradbi homologna lahkim verigam, nima pa variabilne regije. Sledi
razvoj do nezrelega limfocita B, ki prične s sintezo lahkih verig, ki lahko prepoznajo
antigen. Sestavljena molekula IgM se izrazi na celični površini kot B-celični receptor
(BCR) (1,6). Nezreli limfociti B podležejo selekciji klonov. Če IgM receptor veže telesu
lastni antigen, ga mehanizmi negativne selekcije izločijo in ponavadi se inducira apoptoza.
Nezreli limfociti B nato zapustijo kostni mozeg in od tu naprej govorimo o zrelih
limfocitih B (6).
2
Slika 1: Zaporedje stadijev pri zorenju celic B.
Prve celice, ki jih lahko uvrstimo v B-celično vrsto, so progenični limfociti B ali pro-B celice. Ti izražajo
nekatere površinske proteine, ki so značilni za B-celično vrsto. Za naslednjo razvojno stopnjo je značilna
ekpresija težke verige µ, ki je sestavljena iz variabilne (V) in konstantne (C) regije. Te celice imenujemo
predhodni limfociti B ali pre-B celice. Težka veriga µ v povezavi z nadomestno lahko verigo tvori tako
imenovani predhodni B-celični receptor. V naslednjem stadiju zorenja celice B uspešno sintetizirajo lahke
verige κ ali λ in izražajo na celični površini sestavljeno posebno obliko molekule IgM ali B-celični receptor
(BCR). Tem celicam pravimo nezreli limfociti B. Takšna celica se sprosti iz kostnega mozga v krvni obtok,
kjer je še naivna, a zrela (se še ni srečala s tujim antigenom). V perifernem limfatičnem tkivu dokončno
dozori v zrel limfocit (6).
1.1.2 Negativna selekcija limfocitov B
Nezreli limfociti B so prve celice B, ki izražajo fenotipsko obliko B-celičnega receptorja
(BCR). Kot taki predstavljajo pomembno stopnjo v razvoju limfocitov B, ker se celice, ki
izražajo avtoreaktivne BCR, fizično odstranijo ali funkcijsko onesposobijo.
Najpomembnejši mehanizem, ki omogoči razvoj tolerance do lastnih antigenov na stopnji
nezrelih celic B, je apoptoza avtoreaktivnih limfocitov B ali tako imenovana negativna
selekcija. Indukcija apoptoze po aktivaciji BCR nezrelih limfocitov B predstavlja tudi
glavno funkcijsko razliko z zrelimi limfociti B, ki se po navzkrižnem povezovanju BCR
aktivirajo in proliferirajo (7).
1.2 MALIGNE BOLEZNI LIMFOCITOV B
Vsaka stopnja v procesu normalnega zorenja B limfocitov je potencialno podvržena
maligni preobrazbi z nenadzorovanim pomnoževanjem dominantnega subklona, ki vodi v
razvoj levkemije in limfoma. Najbolj rizične so faze v zorenju, v katerih se dogaja veliko
sprememb na DNA zapisih za težke in lahke verige imunoglubulina (6).
3
Kromosomske translokacije, ki zajemajo lokuse imunogobulinov, so znak večih vrst B
celičnih malignomov, vendar niso edini faktor v patogenezi limfocitov B. Preživetje večine
B limfomov in levkemij je odvisno od ekspresije BCR in njegovega proženja. Nedavne
raziskave o faktorjih iz mikrookolja limfocitov, ki povzročajo malignosti, ponujajo veliko
novih strategij zdravljenja (8).
1.2.1 Levkemije
Levkemije izvirajo iz kostnega mozga, od koder se prekomerno pomnožene celice selijo v
krvni obtok. Ta namnožitev malignih celic onemogoča nastajanje zdravih celic v kostnem
mozgu. Delimo jih na akutne in kronične ter, glede na vrsto levkocitov, na limfocitne oz.
limfoblastne in na mieloidne oz. nelimfocitne levkemije, ki prizadenejo ostale vrste krvnih
celic, razen limfocitov. Iz teh dveh delitev dobimo torej 4 glavne skupine levkemij. Večina
limfocitnih levkemij prizadene limfocite B (8).
Kot pri ostalih malignih boleznih so tudi levkemije posledica mutacije DNA. Določene
mutacije povzročajo levkemijo z deaktivacijo tumor supresorskih genov, aktivacijo
onkogenov, motnjo v regulaciji celičnega cikla ali nastankom fuzijskih genov iz katerih
nastanejo fuzijski proteini. Primer je fuzijski protein BCR-ABL, ki se translacira iz
fuzijskega gena t.i. Philadelphia kromosoma. Te mutacije so lahko spontane, posledica
sevanj, radikalov ali izpostavitve karcinogenim substancam.
Študije v zadnjih letih so potrdile, da levkemične celice posedujejo nepravilnosti v eni ali
več apoptotičnih poteh, kar jim daje prednost za preživetje v primerjavi z normalnimi
celicami. Poleg tega so nepravilnosti v apoptotičnem odzivu povezane s slabšim odzivom
na kemoterapijo, z odpornostjo na terapijo ter s tem povezanim krajšim preživetjem
bolnikov z levkemijo (9).
B-celična kronična limfocitna levkemija (B-CLL) je neozdravljiva bolezen, ki je dokaj
pogosta med starejšo kavkazijsko populacijo. Za B-CLL je značilno progresivno kopičenje
monoklonalnih B celic, kar je lahko posledica različnih dejavnikov, ki skupno vodijo v
povečano življenjsko dobo celic, povečano sposobnost proliferacije in zmanjšano celično
smrt (10). V zadnjih letih so pri B-CLL ugotovili pomembno vlogo receptorja BCR in
antigenov, ki jih prepoznava. Bolnike z B-CLL delimo na tiste, ki imajo prisotne mutacije
v genih IgVH, ki nosijo zapis za levkemični receptor BCR, ter na tiste brez mutacij BCR.
Kljub temu lahko pri obeh skupinah najdemo podobnosti v aminokislinskem zaporedju
4
receptorja BCR. Antigeni, ki jih mutirani BCR-ji prepoznavajo, so v nekaterih primerih
antigeni mikrobov, velikokrat pa so to avto-antigeni, saj približno polovica CLL limfocitov
B izloča avtoreaktivna protitelesa. Ta odkritja kažejo na to, da CLL B limfociti izvirajo iz
avto-reaktivnih B celičnih prekurzorjev, ki so kljub različnim mehanizmom negativne
selekcije ohranili neprimerno specifičnost za vezavo antigenov (11).
Akutna limfoblastna levkemija (B-ALL) je rak nezrelih B limfocitov, ki se pretirano
namnožijo v kostnem mozgu in tako onemogočajo zdravim celicam normalno rast. Če
bolezen ni pravočasno zdravljena, smrt lahko nastopi v nekaj tednih, saj hitro metastazira
po organizmu. Točen vzrok še ni poznan, največkrat pa je ALL pri otrocih povezana s
kromosomsko translokacijo t(12; 21)(p13; q22), ki kodira TEL-AML1 fuzijski protein.
Proteina TEL in AML1 naj bi imela regulatorsko vlogo v diferenciaciji limfocitov. Njuna
mutacija te poti poruši in nastane motnja v zgodnjih stopnjah limfocita B. Najpogostejši
vzrok pri odraslih je kromosomska translokacija t(9; 22) oz. že zgoraj omenjeni
Philadelphia kromosom, zaradi katere se sintetizira fuzijski protein BCR-ABL (9,12).
1.2.2 Limfomi
Limfom je maligni tumor, ki izvira iz limfocitov B, za katerega je značilna nenadzorovana
klonska ekspanzija v perifernih limfatičnih organih. Večina limfomov je B-celičnih in
predstavljajo različne razvojne stopnje v zorenju limfocitov B. Nastanek limfomov je
večstopenjski proces, h kateremu prispevajo številne genetske spremembe, dejavniki iz
okolja in okužbe. Za večino limfomov B z zrelim fenotipom so značilne recipročne
kromosomske translokacije, ki vključujejo enega izmed imunoglobulinskih genskih
segmentov in proto-onkogen (npr. c-myc). Translocirajo se tudi geni, vključeni v celični
cikel (npr. gen za ciklin D1), blokado diferenciacije (npr. bcl-6, PAX-5) ali preživetje celic
(npr. bcl-2). Posledica takih translokacij je, da aktivirani imonoglobulinski lokus nadzoruje
translocirani gen in povzroči njegovo nenadzorovano, konstitutivno ekspresijo (8). Poleg
tega so pogoste tudi mutacije, ki inaktivirajo tumor supresorske gene (p53, p16). Izražanje
večine teh genov normalno nadzorujejo signali, ki izvirajo iz receptorja BCR. Preživetje
večine B limfomov je tudi sicer odvisno od ekpresije BCR in aktivacija BCR preko
antigena je pomemben dejavnik pri patogenezi mnogih limfomov (8). Visoka pogostost
kroničnih bakterijskih ali virusnih okužb pri bolnikih z limfomom ter povišana incidenca
limfoma pri bolnikih z avtoimunskimi obolenji ali prejemniki presadkov kaže na možno
5
vpletenost eksogenih ali avto-antigenov pri patogenezi nekateri limfomov. Stimulatorni
signali iz reaktivnih limfocitov T, okoliških citokinov in rastnih faktorjev lahko tudi do
neke mere prispevajo k napredovanju limfomov.
Pozornost vzbuja tudi ugotovitev iz primerjalne analize, da je Ptger4 signifikantno manj
izražen v najbolj pogosti agresivni maligni bolezni limfocitov B, tj. difuznem
velikoceličnem limfomu B, kar nakazuje, da primanjkljaj negativne proliferativne funkcije
Ptger4 zagotovo prispeva k povečani rasti humanega limfoma B (13) .
Burkittov limfom (BL) je agresiven limfom zrelih limfocitov B, večinoma povezan s
kromosomsko translokacijo proto-onkogena c-myc iz 8. kromosoma k lokusu za težko
verigo IgH na 14. kromosomu. Kot zelo močan onkogen je c-myc tako v limfocitih B
neprekinjeno aktiven. Kodira zapis za transkripcijski faktor, ki poveča ekspresijo genov, ki
vplivajo na celično proliferacijo (ciklini), ter vpliva tudi na rast celice. Zavira apoptozo z
znižanjem izražanja genske družine bcl-2 in z zvišanjem ribosomske RNA in proteinov
(14).
Burkittov limfom je dolgo časa veljal za bolezen, ki jo povzroča Epstein-Barr virus (EPV),
saj se je BL pojavljal pri afriških EPV pozitivnih otrocih. Hipoteza je bila ovržena, ko so
drugje po svetu našli EPV negativen BL. Podrobnejše študije razkrivajo, da EPV ni pogoj
za razvoj BL, ampak le olajša preživetje limfocitom B s translociranim c-myc, iz katerih
se BL razraste (15,16).
Burkittov limfom ni edini limfom, pri katerem je translociran c-myc. C-myc translokacijo
so našli tudi v celicah velikoceličnega difuznega limfoma B. Ločevanje med njima je
nujno, saj je terapija precej drugačna in pri pacientih z lažno določenim Burkittovim
limfomom povzroča relaps. WHO zaenkrat nima dovolj izpopolnjenih smernic za
diagnozo, saj še ne temeljijo na genskem profiliranju. V raziskavi so z genskim
profiliranjem dokazali, da je mesto preloma na lokusu c-myc bistveno za ločevanje med
navedenima limfomoma ter za izzid zdravljenja bolezni (16).
1.2.3 Terapija B-limfocitnih malignih obolenj
Pri akutni limfoblastni levkemiji (ALL), ki je pogostejša pri otrocih, je zdravljenje
potrebno takoj, saj prekomerno namnožene maligne celice preprečujejo nastajanje
normalnih krvnih celic v kostnem mozgu. Simptomatsko zdravljenje se osredotoča na
6
bolezen kostnega mozga in preprečevanje širjenja metastaz v druga tkiva. Levkemije
zdravimo v prvi vrsti s kemoterapijo (alkilirajoči citostatiki, antimetaboliti, alkaloidi,
inhibitorji topoizomeraze …), smernice pa opisujejo tudi radioterapijo, presaditev kostnega
mozga, glukokortikoide (deksametazon, prednizolon), rastne faktorje ter kombinacijo teh
(17).
Kronična limfocitna levkemija (CLL) se pogosteje pojavlja pri starejši kavkazijski
populaciji in velja za neozdravljivo. Bolezen lahko zdravimo simptomatsko, a to v
zgodnjem stadiju ni potrebno. Paciente s slabšo klinično sliko v poznejših stadijih CLL
zdravijo s podobnimi pristopi kot ALL. (17,11). Imatinib kot selektivni inhibitor BCR-
ABL tirozin kinaze (produkt fuzijskega proteina pri Philadelphia kromosomu) se s pridom
uporablja v terapiji kroničnih levkemij (18). Novejši pristopi uporabljajo ciljane terapije z
monoklonskimi protitelesi proti membranskim markerjem limfocitov B. Alemtuzumab
proti CD52, rituxumab in ofatumumab proti CD20. Ofatumumab, ki je bil odobren za
zdravljenje CLL okrobra 2009, je usmerjen proti manjšemu epitopu na CD20 kot
rituximab, ki je bližje celični membrani. Sklepajo, da je ravno zato ofatumumab
učinkoveitejši, ker je delovanje komplementa bližje membrani močnejše in tako ubije več
tarčnih celic (19).
Odkrili so novega možnega kandidata za tarčo imunoterapije malignih bolezni limfocitov
B − celični marker CD74 oz. poglavitni histokompatibilni kompleks II (angl. major
histocompatibility complex II; MHC II). Humano protitelo Anti-CD74 (milatuzumab) že
kaže vzpodbudne učinke. Predvsem učinkoviti so konjugati z radioizotopi, toksini, RNA-
zami, saj CD74+ celice hitro internalizirajo anti-CD74 protitelo in ta učinkuje ciljano,
znotraj celice (20).
1.2.4 Modulacija apoptoze kot terapevtski pristop
Patogeneza mnogih bolezni je tesno povezana z napakami v regulaciji apoptoze.
Ocenjujejo, da sta prevelika ali premajhna celična smrt vzrok polovici bolezni in za mnoge
od teh še ni učinkovitega zdravljenja (3,21). Razjasnitev molekularnih mehanizmov
apoptoze ponuja širok nabor potencialnih terapevtskih tarč za modulacijo tega procesa,
tako v pro- kot antiapoptoznem smislu. Glede na molekularno tarčo so v razvoju različni
pristopi, med temi so (21):
7
- nizkomolekularne učinkovine, ki so inhibitorji ali stimulatorji encimov kaspaz in
drugih proteaz;
- rekombinantni proteini, protitelesa (agonistična ali antagonistična), ki so mimetiki
ali antagonisti signaliziranja preko receptorjev smrti (TNF, TRAIL, CD95) na
celični površini;
- microRNA (miRNA), ki utišajo izražanje neželenih proteinov (npr. proteini, ki
prispevajo k preživetju tumorskih celic);
- peptidi ali organske spojine, ki ovirajo pomembne interakcije med proteini (21).
1.3 EP4 RECEPTOR (PROSTAGLANDINSKI RECEPTOR TIPA E4)
Receptor EP4 oz. njegov gen Ptger4 je bil odkrit z diferencialno analizo mRNA med zrelo
in nezrelo populacijo limfocitov B po stimulaciji BCR receptorja. S tehnologijo mikromrež
so najprej odkrili vrsto genov, katerih prepisovanje se poveča po BCR stimulaciji. Le nekaj
je bilo takih, ki so specifično povezani z razmnoževalnim odzivom limfocitov B. Ugotovili
so, da se nezreli limfociti na stimulacijo BCR ne odzovejo s proliferacijo. S to
diferencialno analizo izražanja genov so največjo vlogo v razmnoževanju celic B pripisali
genu Ptger4, ki kodira EP4 podtip receptorja za prostaglandin E2 (PGE2) (13).
Receptor EP4 je eden od štirih prostaglandinskih receptorjev tipa E, ki se odzivajo na
prostaglandin E2. Prostaglandinske receptorje tipa E so na podtipe ločili najprej po
kvalitativnih kriterijih – določili so jih glede na odzivnost tkiva na določen ligand (22).
Kasneje so jih ločili tudi kvantitativno in pa določili njihove signalizacijske posebnosti.
Vsi podtipi receptorjev so izraženi na plazemski membrani, receptorja EP3 in EP4 pa tudi
na jedrni (23). EP3 in EP4 sta tudi najbolj razširjena saj so njuno mRNA našli v praktično
vseh tkivih. Izražanje receptorja EP1 je precej omejeno, njegovo mRNA so našli le v
nekaterih organih, npr. ledvicah, pljučih in želodcu. Najmanj pogost je receptor EP2,
vseeno pa je stopnja izražanja tega receptorja v prisotnosti stimulusa precej velika. V
mišjih limfocitih B so najprej določili izražanje receptorjev EP2 in EP4 (22). Izbijanje
gena Ptger4, ki kodira receptor EP4, je namreč v »knockout miškah« povzročilo popolno
neodzivnost limfocitov B na PGE2, ki je naravni ligand prostaglandinskih receptorjev tipa
E. Iz tega sklepajo, da je pomen receptorja EP2 pri signalizaciji zelo majhen oz. ničen (13).
8
Receptor EP4 je s proteinom G sklopljen receptor (angl. G protein coupled receptor −
GPCR), sestavljen iz 488 aminokislin. Na zunanjem delu celice je N-terminalni del, temu
sledi 7 transmembranskih hidrofobnih domen receptorja in nato dolg C-terminalni del iz
156 aminokislin. Slednji vsebuje 38 serinskih in treoninskih ostankov, ki so pomembni pri
internalizaciji receptorja. Pomemben je tudi cisteinski ostanek med prvimi 15 AK, saj
omogoča vezavo ligandov in sklapljanje z G proteinom (22,24).
Dolg C-terminalni rep ima veliko determinant za fosforilacijo, desenzibilizacijo in
internalizacijo. Odstranitev tega dela ni zmanjšala fiziološkega odziva celice na stimulacijo
receptorja, močno pa se je zmanjšala desenzibilizacija (24).
Potrdili pa so tudi, da Ptger4 preko negativne povratne zanke zakasnjeno vpliva na
robusten proliferativni odgovor limfocitov B, ki ga sproži aktivacija antigenskega
receptorja BCR. S stimulacijo BCR receptorja se v nekaj urah poveča ekspresija receptorja
v celici in tudi na plazemski membrani (13).
1.3.1 Vloga receptorja EP4 pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških
procesov
PGE2 je edini naravni ligand prostaglandinskih receptorjev tipa E in vpliva na osnovne
fiziološke funkcije, kot so modulacija imunskega sistema, vnetje, tvorba kosti, nosečnost,
rojstvo, gastrointestinalni transportni procesi, ledvična hemodinamika ter številne druge
funkcije (25,26). PGE2 ima pomembno vlogo tudi pri tumorski rasti, celični proliferaciji in
apoptozi (27).
Osrednja vloga receptorja EP4 pri posredovanju učinkov PGE2 je dokazana pri številnih
fizioloških in patofizioloških spremembah.
Med drugim je bilo dokazano da PGE2 prek receptorja EP4:
ščiti celice želodčne sluznice pred apoptozo (28);
ohranja homeostazo tankega črevesja z ohranjanjem integritete sluznice in z
zmanjševanjem imunskega odziva (29);
pomembno vpliva na kancerogenezo tankega in debelega črevesja in na razvoj
adenomatosus polyposis coli, ker sodeluje pri tvorbi polipov (poleg EP1 receptorja)
(27);
ščiti hepatocite, tako da preprečuje apoptozo pri njihovi okvari, preko indukcije
antiapoptotičnih proteinov (Bcl-XL) iz družine Bcl-2 (30)
9
sodeluje pri nastanku proteinurije, saj vpliva na integriteto aktinskega citoskeleta
podocitov; pri povišanem glomerularnem pritisku stimulacija EP4 spremeni
dinamiko citoskeleta podocitov in s tem vpliva na filtracijsko sposobnost
glomerulov (31);
indukcija gena Ptger4 (poleg genov za ciklin D2, transkripcijski faktor AP-1,
MAPK,...) ima pomembno vlogo pri infekciji trigeminalnega ganglija z virusom
herpes simplex-1 (HSV-1) in pri njegovi reaktivaciji (32);
inducira tvorbo vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja A (VEGF-A) v
gladkih mišicah dihalnega sistema (33);
poveča resorpcijo kosti (34)in inducira ekspresijo RANKL (angl. receptor activator
for NF-κB ligand) v osteoblastih ter sinergistično z RANKL in M-CSF (angl.
macrophage-colony-stimulating fractor) spodbuja diferenciacijo osteoklastov iz
prekurzorskih celic (35);
sodeluje pri patogenezi revmatoidnega artritisa (36);
vpliva na zapiranje ductusa arteriosusa; pomankanje EP4 receptorja vodi v
perinatalno smrt, ki je povezana s persistentnim odprtjem duktusa arteriosusa (angl.
patent ductus arteriosus-PDA) (37);
avtokrino inhibira aktivacijo makrofagov; inhibira tvorbo citokinov TNF-α, IL-1β
in IL-12; inhibira ekspresijo poglavitnega histokompatibilnega kompleksa tipa II in
s tem antigen predstavitveno vlogo makrofagov (38);
preusmeri celični imunski odziv iz fenotipa Th1 (angl. T-helper type 1) v fenotip
Th2 (angl. T-helper type 2) s spodbujanjem tvorbe IL-4, IL-5 in IL-10 in z
inhibicijo tvorbe IL-2, IFN-γ in IL-12 (25,39).
1.3.2 Vpliv EP4 stimulacije na apoptozo
Stimulacija receptorja EP4 ima različen fiziološki učinek, odvisen od tkiva, v katerem je
stimuliran. V zrelih limfocitih B skrbi za kontrolirano klonsko ekspanzijo po aktivaciji
določenega klona (13).
Murn in sodelavci so nedvoumno dokazali, da je EP4 poglavitni, verjetno pa tudi edini
receptor, ki je odgovoren za PGE2-posredovano zavoro razmnoževanja celic B. Rezultat so
uspeli potrditi s farmakološkim pristopom, kjer je imela stimulacija EP4 receptorja s
10
specifičnimi agonisti podoben učinek kot PGE2, stimulacija ostalih poznanih receptorjev
za PGE2 pa ni vplivala na razmnoževanje celic B (13).
EP4 receptor je torej v manjši meri vedno prisoten v limfocitih B, njegova ekspresija pa se
v zrelih limfocitih B signifikantno poveča. Ugotovili so, da se EP4 stimulira že v majhni
prisotnosti njegovega edinega do sedaj poznanega naravnega liganda PGE2. To v zrelih
limfocitih B povzroči zaustavitev proliferacije aktiviranega klona in preprečitev
nekontroliranega razmnoževanja. Ptger4 so tako v nasprotju s pričakovanji identificirali
kot negativni povratni regulator, ki bi celice B lahko ščitil pred prekomernim
razmnoževanjem (13).
1.3.3 Učinki agonistov in antagonistov receptorja EP4
Učinki prostaglandinov so zelo raznovrstni, saj delujejo v skoraj vseh tkivih in celicah.
Najbolj pogost učinek je relaksacija in kontrakcija različnih gladkih mišic. Velik pomen
imajo tudi v možganih in celotnem živčnem sistemu, saj modulirajo nevronsko aktivnost,
bodisi z inhibicijo ali stimulacijo sproščanja nevrotransmiterjev, senzibiliziranjem
senzoričnih vlaken ali z indukcijo centralnih učinkov (npr. vročina ali spanje).
Prostaglandini prav tako pozitivno ali negativno regulirajo aktivnost trombocitov in so
vpleteni v žilno hemostazo in homeostazo. Pomembno funkcijo pa imajo tudi v modulaciji
apoptoze (23).
Edini naravni agonist receptorja EP4 je PGE2, ki pa ni selektiven samo za EP4, ampak
deluje na vse prostaglandinske receptorje tipa E (13). Receptorja EP3 in EP4 imata
najvišjo afiniteto za PGE2 (Kd > 1 nM), medtem ko receptorja EP1 in EP2 vežeta PGE2 z
nekoliko nižjo afiniteto (Kd > 10 nM) (40).
V zadnjih letih so razvili novo serijo selektivnih ligandov za receptorje EP, in sicer
agoniste ONO-DI-004 (EP1), ONO-AE1-259 (EP2), ONO-AE-248 (EP3) in ONO-AE1-
329 (EP4) ter antagoniste ONO-8713 (EP1), ONO-AE3-240 (EP3) in ONO-AE-208 (EP4)
(41).
Učniki antagonistov in agonistov se razlikujejo glede na vrsto celice. Stimulacija z novimi
agonisti EP4 pospeši kostno remodelacijo (42), zavre kolitis in poškodbo sluznice v
črevesju (43), inducira angiogenezo in vivo (44).
Tudi inhibicija z antagonisti EP4 ima svoje učinke: zavre bolečino in vnetje pri artritisu
(45), inhibira metastaziranje raka na dojki (46), zavre osteolizo zaradi kostne metastaze
mišjih malignih melanoma celic (47).
11
Slika 2: Neselektivni agonist receptorja EP4 PGE2, selektivni agonist PGE1-OH.
PGE2 (dinoproston) (LogP = 2.79) levo in PGE1-OH (LogP = 1.64) desno
12
2 NAMEN DELA
Odziv limfocitov B na stimulacijo B-celičnega receptorja (BCR) je pogojen s stopnjo
razvoja. Zrele celice B se odzovejo z intenzivno proliferacijo, nezrele pa z apoptozo.
Signalni mehanizmi, ki pri zrelih celicah sprožijo proliferacijo preko BCR, so dobro
poznani, manj znani pa so mehanizmi, ki zaustavijo rast in sprožijo apoptozo pri nezrelih
limfocitih B. Predhodne raziskave diferencialne genske ekspresije s pomočjo mikromrež so
pokazale, da je na genskem nivoju največja razlika med zrelimi in nezrelimi celicami B po
stimulaciji BCR v ekspresiji gena Ptger4, ki kodira prostaglandinski receptor EP4 (13).
Namen diplomskega dela je ugotoviti, kje in v kakšni meri humani maligni limfociti B
izražajo receptor EP4 in ali stimulacija receptorja EP4 v humanih modelnih linijah B
levkemij in limfomov vodi v zastoj celične rasti in apoptozo. V predhodnih študijah je bilo
namreč ugotovljeno, da stimulacija prostaglandinskega receptorja EP4 v nezrelih mišjih
limfocitih (celična linija WEHI-231) zavre proliferacijo celic.
V prvem delu diplomske naloge bomo s pomočjo uporabe pretočne citometrije in
fluorescenčne mikroskopije ugotavljali prisotnost receptorja na izbranih celicah ter
poizkušali ovrednotiti razliko v njegovi ekspresiji med zdravimi in maligno spremenjenimi
limfociti B.
V drugem delu diplomske naloge bomo s pomočjo testov celične metabolne aktivnosti ter
uporabo specifičnih agonistov ugotavljali, kakšne učinke povzroči stimulacija receptorja
EP4 na izbrane celice. S pomočjo pretočne citometrije bomo ovrednotili vpliv stimulacije
receptorja EP4 na celični cikel in proliferacijo ter preučili morebitno indukcijo
programirane celične smrti preko receptorja EP4.
13
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 Kemikalije
Kemikalija Proizvajalec
absolutni etanol (99 %) KEFO, Ljubljana, Slovenija
DMSO Merck Chemicals, Darmstadt, Nemčija
Triton-X 10 % Sigma – Aldrich, MO, ZDA
PFA 10 % Sigma – Aldrich, MO, ZDA
Goveji serumski albumin (BSA) Sigma – Aldrich, MO, ZDA
70 % etanol Merck Chemicals, Darmstadt, Nemčija
Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent (reagent MTS)
Promega, Madison, WI, ZDA
PGE1-OH Cayman chemical, MI, ZDA
Propidijev jodid
Raztopina tripanskega modrila (angl.
Trypan Blue solution)
Sigma – Aldrich, MO, ZDA
ProLong® Gold Antifade Reagent
Invitrogen
3.1.2 Kompleti za analize
Komplet Proizvajalec
FITC Annexin V - komplet za detekcijo
apoptoze (APOAF-50TST)
Sigma – Aldrich, MO, ZDA
CellTrace™ CFSE - komplet za
vrednotenje celične proliferacije
Invitrogen
PI/RNase Staining Buffer (550825) (komplet za vrednotenje celičnega cikla)
BD Pharmingen™
14
3.1.3 Pufri in raztopine
Pufri in raztopine Sestava
10 x PBS (10-kratni fosfatni pufer s soljo,
pH 7˙4)
NaCl 80 g
KCl 2 g
Na2HPO4*12H2O 36.3 g
KH2PO4 2.4 g
ultračista H2O dopolnimo do 1,0 L
Natehtamo sestavine, raztopimo v vodi, uravnamo pH in avtoklaviramo.
1xPBS 10 x PBS redčimo 1 : 10 z avtoklavirano
ultračisto H2O
3.1.4 Protitelesa in fluorescenčna barvila
Poliklonsko kunčje primarno protitelo proti
N-terminalnemu delu humanega EP4
receptorja: IMG-71758; 1 mg/ml
Imgenex
Poliklonsko kunčje primarno protitelo proti
C-terminalnemu delu humanega EP4
receptorja: 101775; 1 mg/ml
Cayman chemical, MI, ZDA
Poliklonsko kunčje primarno protitelo proti
C-terminalnemu delu humanega EP4
receptorja: (H-160): sc-20677; 200 µg/ml
Santa Cruz Biotechnology
Monoklonalno mišje protitelo proti
humanemu markerju CD3, konjugirano s
PE-Cy™7: 557851
BD Pharmingen™
Monoklonalno mišje protitelo proti
humanemu markerju CD19, konjugrano z
barvilom PE: 555413
BD Pharmingen™
Sekundarno kozje protitelo proti Fc regiji
kunčjega IgG, konjugirano z barvilom Alexa
Fluor® 488; A-11008 ; 2 mg⁄mL
Invitrogen
15
barvilo Hoechst 33342 (za obarvanje
celičnih jeder) c=1,66 mM
Invitrogen
3.1.5 Gojišča
Gojišče Sestava
Medij RPMI 500 ml RPMI-1640
50 ml FBS
5,125 ml 200 mM L-glutamin
5 ml antibiotik/antimikotik 100 x
0,5 ml 50 mM 2-merkaptoetanol
3.1.6 Laboratorijska oprema
Aparatura/material Proizvajalec
Avtoklav A-21, Kambič laboratorijska oprema,
Semič, Slovenija
Cell-quest ® software za obdelavo
podatkov na FACS
Becton Dickinson
Centrifuge Tehtnica CENTRIC 322A,Železniki, Slo
Tehtnica CENTRIC 150, Železniki, Slo
Eppendorf Centrifuge 5415 R, Hamburg,
Nemčija
centrifugirke (15 in 50 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija
Cytofuge Statspin
Flow tubes Invitrogen
fluorescenčni mikroskopski sistem CellR :
fluorescenčni mikroskop IX81, svetlobni
vir MT-20, vrteči disk DSU
Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg,
Nemčija
Hemocitometer Brand Neubauer (BNlau Brand)
hladilnik/zamrzovalnik Gorenje, Velenje, Slovenija
Inkubator Heraus Holding GmbH, Hanau Nemčija
16
invertni svetlobni mikroskop (Olympus
CK40)
Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg,
Nemčija
komora z laminarnim pretokom zraka
(LAF)
Waldner Electronics FAZ 3, Wangen,
Nemčija
Krioviale TPP, Trasadingen Švica
krovna stekla Assistent, Sondheim, Nemčija
mikrocentrifugirke (0,5 mL; 1,5 mL in
2mL)
Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija
mikrotitrske ploščice za gojenje celičnih
kultur (s 6, 12, 24 ali 96 vdolbinami)
TPP, Trasadingen Švica
mikrotitrski čitalec (Safire2TM Genios) Tecan, Genios, Zürich, Švica
multikanalne pipete (100, 300 μL) Eppendorf, Hamburg, Nemčija
nastavki za pipete (do 10, 200, 300 ali 1000
μL)
Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija
Pipete 100 – 1000 μL (Biohit)
20 – 200 μL (Biohit)
0,5 – 10 μL (Biohit)
0,1 – 2,5 μL (Biohit)
plastične sterilne poliestrske ploščice za
gojenje celičnih kultur z različnim številom
vdolbinic − 6, 12, ali 24;
TPP® Techno Plastic Products, Trasadigen,
Švica
pretočni citometer FASC Calibur Becton Dickinson
programska oprema za Tecan Magellan V3.X IVD
računalniška programska oprema: CellR Olympus
serološke pipete za enkratno uporabo
(volumni 5, 10, 25, 50 mL)
TPP, Trasadingen Švica
stekleničke za gojenje celičnih kultur (s 25,
75 in 150 cm2 rastne površine)
TPP, Trasadingen Švica
Stresalnik Vibromix 314 EVT Tehtnica
ultrasonični homogenizator 4710 Call-Rarner Instrument Co., Chicago, ZDA
ultrazvočna sonda Ultrasonic Homogenizer 4710 series
vodna kopel Mikro+Polo, Maribor, Slovenija
17
Memmert, Schwabach, Nemčija
vorteks (Vortex GENIE 2) Scientific Industries, Orlando, Florida,
ZDA
zamrzovalnik -80 ºC Forma Scientific
Midland, ON, Kanada
3.1.7 Humane celične linije
Humane celične linije izvirajo iz malignih človeških tkiv. So ustaljene oz. nesmrtne, kar
pomeni, da so se sposobne deliti neštetokrat (48), za razliko od nemalignih celic, katerih
število delitev je odvisno od dolžine telomere na koncu vsakega kromosoma. Telomera se
ob vsaki delitvi skrajša in ko doseže kritično dolžino, se ne more več deliti. Doseže t.i.
Hayflick-ovo mejo. (49).
Predpostavljajo, da mora celica iz ustaljene celične linije za svojo »nesmrtnost«
izpolnjevati več pogojev. Aktivacija TERT (telomerazne reverzne transkriptaze), ki
neprestano podaljšuje telomere na koncu kromosov in skrbi, da se celica nikoli ne
»postara«. Za zmožnost neprestane delitve celice so potrebni še izguba tumorsupresorske
funkcije p53 in pRb, aktivacija Ras ali myc proto-onkogena in aberacija PP2A proteinske
fosfataze (50).
RAMOS (ACC 603)
Celična linija humanega Burkittovega limfoma, pridobljena iz peritonealne tekočine 3-
letnega dečka z Burkittovim limfomom leta 1972. Celice so bile EBV negativne in izražajo
nezreli fenotip limfocitov B.
Okrogle celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna koncentracija 0,5−1,5 x 106 celic/ml.
Podvojevalni čas je pribl. 48h.
Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD34 -, CD37 +, CD38 +,
cyCD79a +, CD80 +, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -,
sm/cylambda + (48).
18
NALM 6 (ACC 128)
Celična linija levkemije (humani pre-B limfociti). Pridobljena iz perfirerne krvi 19-letnega
moškega z ALL leta 1976. Okrogle, majhne celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna
koncentracija 1−2 x 106 celic/ml. Podvojevalni čas je pribl. 36h.
Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD19 +, CD37 -, cyCD79a +, CD80 -, CD138 +,
HLA-DR +, sm/cyIgG -, cyIgM +, smIgM -, sm/cykappa -, sm/cylambda - (48).
MHH-PREB-1 (ACC 354)
Celična linija humanega B-limfocitnega limfoma. Pridobljena iz bezgavk 5-letenega dečka
z B-limfoblastnim ne-Hodginovim limfomom leta 1994. Okrogle, ki rastejo v suspenziji.
Optimalna koncentracija 0,5−2 x 106 celic/ml. Podvojevalni čas je pribl. 20−24h.
Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD37 +, CD38 +,
cyCD79a +, CD80 -, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -,
sm/cylambda + (48).
SU-DHL (ACC 571)
Celična linija humanega B-limfocitnega limfoma. Pridobljena iz bezgavk 17-letne ženske z
B-limfoblastnim ne-Hodginovim limfomom leta 1994. Okrogle do polimorfne celice, ki
rastejo v suspenziji v grudicah. Optimalna koncentracija 0,1−1 x 106 celic/ml. Podvojevalni
čas je pribl. 40h.
Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD34 -, CD37 +, CD38 -,
cyCD79a +, CD80 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -, sm/cylambda
+(48).
KOPN-8 (ACC 552)
Celična linija levkemije (humani pre-B limfociti). Pridobljena iz perfirerne krvi 3-mesečne
deklice z preB-celično akutno limfoblastno levkemijo (BCP-ALL) v letu 1977. Okrogle,
majhne celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna koncentracija 0,5−1,5 x 106 celic/ml.
Podvojevalni čas je pribl. 48h.
Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 (+), CD34 -, CD37 +, CD38
+, cyCD79a +, CD80 -, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, smIgM -, cyIgM +, sm/cykappa
-, sm/cylambda - (48).
19
PERIFERNE MONONUKLEARNE KRVNE CELICE (PBMC; angl: peripheral
blood mononuclear cells):
PBMC so zdravi levkociti z negranuliranim okroglim jedrom. Pridobljene so iz polne krvi
zdravega darovalca s postopkom ekstrakcije s fikolom.
PBMC so primarna celična kultura. Vsebujejo limfocite B in T, monocite ter naravne
celice ubijalke. V primerjavi s celično linijo se razlikujejo v tem, da niso nesmrtne in da se
se ne delijo v neskončnost. Ravno nasprotno, so zelo občutljive in v nekaj dneh odmrejo,
zato jih odmrznemo tik pred eksperimentom. Dobro oponašajo pogoje in vivo.
3.2 METODE DELA S CELICAMI
Za ustrezno delo s celicami moramo najprej zagotoviti aseptične pogoje prostorov in
površin. Delo opravljamo v komori z laminarnim pretokom zraka (komora LAF), ki je
nameščena v prostorih, kjer velja poseben režim čistote (namenska zaščitna oblačila in
obutev). LAF komora zagotavlja sterilne pogoje z omejenim dostopom ter stalnim
pretokom filtriranega zraka na delovno površino (zrak onemogoča dostop kontaminantom
in prahu). Komoro pred uporabo razkužimo s polurnim obsevanjem z ultravijolično
svetlobo. Tik pred pričetkom dela pa površine komore očistimo s 70-odstotnim etanolom.
Pri delu uporabljamo zaščitne rokavice, ki jih razkužimo s 70-odstotnim etanolom.
3.2.1 Gojenje celic
Celice smo gojili v mediju RPMI z dodatki. Gojili in redčili smo jih v plastenkah ali
ploščicah za celične kulture v inkubatorju, ki zagotavlja ustrezne pogoje za rast celic
(temperatura 37 °C, 100-odstotna vlažnost ter atmosfera s 5-odstotnim CO2).
3.2.2 Subkultiviranje celičnih linij
Za zagotavljanje ustreznega števila celic smo jih morali subkultivirati. Celice rastejo v
suspenziji. Za doseganje optimalne rasti smo morali celice redčiti z medijem RPMI,
segretim na 37 °C.
3.2.3 Odmrzovanje celic
Celične kulture shranjujemo v krioampulah pri -80 ºC v zmrzovalniku ali pri -180 ºC v
Dewarjevi posodi s tekočim dušikom. Celice so shranjene v 10-odstotnem
20
dimetilsulfoksidu (DMSO), ki je citotoksičen, zato se mora postopek odmrzovanja izvesti
hitro. Krioampulo s celicami smo takoj prenesli iz zmrzovalnika oz. tekočega dušika v
vodno kopel, segreto na 37 ºC in jo rahlo stresali, da smo pospešili odmrzovanje.
Odmrznjeno vsebino smo prenesli v 15 mL centrifugirko, v katero smo predhodno
odpipetirali 10 mL medija RPMI, segretega na 37 ºC. Suspenzijo smo centrifugirali 5
minut pri 1200 obr./min. Nastali supernatant smo odpipetirali in celice resuspendirali v
ustreznem volumnu medija RPMI, segretega na 37 ºC. Celično suspenzijo smo prenesli v
sterilno mikrotitrsko ploščico za gojenje celičnih kultur in jo inkubirali v CO2 inkubatorju.
3.2.4 Štetje celic
Celice smo šteli s pomočjo hemocitometra pod invertnim mikroskopom. Ta metoda
omogoča štetje celic v znanem volumnu in izračunanje koncentracije celic (št. celic/mL).
Pod sterilnimi pogoji smo odpipetirali 20 μL celične suspenzije in jo prenesli v
mikrocentrifugirko. Dodali smo 20 μL tripanskega modrila, ki obarva poškodovane in
mrtve celice modro. Zmes smo dobro premešali s pipeto in jo nanesli na hemocitometer.
Nadalje smo prešteli žive in mrtve celice v štirih poljih, določili povprečno število živih in
mrtvih celic na mililiter ter izračunali odstotek mrtvih celic. Pri zdravi populaciji celic
odstotek mrtvih celic ne presega 10 %.
4104
/.
DFDCBA
mlcelicŠt
A, B, C, D…………število živih/mrtvih celic v posameznem polju hemocitometra
DF…………………….faktor redčenja
Enačba 1: Računanje koncentracije celic s hemocitometrom
3.2.5 Priprava celičnih kultur za mikroskopiranje in pretočni citometer
Fiksacija celic
Poznamo tri načine trajne ohranitve strukturne organizacije celice. Fiksacija s
premreževanjem, fiksacija s precipitacijo ter fiksacijo z zamrzovanjem. Fiksacija s
premreževanjem je najpogosteje uporabljena metoda v fluorescenčni mikroskopiji.
Najpogosteje uporabljeni reagenti so aldehidi, ki preko tvorbe inter- in intra-molekularnih
21
kovalentnih vezi z aminsko skupino omogočajo premreženje proteinov in nukleinskih
kislin.
Formaldehid je pogosto reagent izbire. Za fiksacijo celic smo uporabili 4-odstotno
raztopino paraformaldehida v PBS.
Permeabilizacija celic
S permeabilizacijo celične membrane omogočimo vstop fluorescenčnih barvil in primarnih
ter sekundarnih protiteles. Za permeabilizacijo lahko uporabimo organska topila oz.
detergente.
Za permeabilizacijo celic smo uporabili detergent Triton X–100, ki učinkovito
permeabilizira celične membrane, hkrati pa ne vpliva na proteinske interakcije ter
spremembo epitopov.
Zaradi visoke viskoznosti Tritona X-100 smo najprej pripravili 20-odstotno raztopino
Tritona X-100 v PBS, ki smo jo po potrebi redčili do delovne, 0.5-odstotne raztopine
Tritona X-100 v PBS.
Zmanjšanje nespecifične vezave protiteles
Da zmanjšamo nespecifično vezavo primarnih in sekundarnih protiteles v celici, celične
kulture pred inkubacijo s protitelesi inkubiramo z raztopino proteinov, ki tekmujejo za
nespecifična vezavna mesta. V ta namen se lahko uporablja raztopina govejega serumskega
albumina (BSA), raztopina kazeina, raztopina gelatina oz. serum živali, v kateri so
proizvedena sekundarna protitelesa.
Pri svojem delu smo uporabili 3-odstotno raztopino BSA.
Inkubacija s protitelesi
Po predhodni obdelavi celic (fiksacija in/ali permeabilizacija, zmanjšanje nespecifične
vezave protiteles) so celice pripravljene za inkubacijo s primarnimi protitelesi, ki so
usmerjena proti določenemu proteinu. Protitelesa hranimo pri 4 °C ali na -20 °C, odvisno
od zahtev proizvajalca. Primarna protitelesa optimalno razredčimo v 3-odstotni raztopini
BSA in jih dodamo k celicam. Po končani inkubaciji celice speremo z 1 x PBS
(centrifugiranje celične suspenzije na 1200 rpm 5 min, dekantiranje supernantanta in
redispergiranje v 1 mL PBS). Nato dodamo sekundarna protitelesa, ki so ravno tako
razredčena v 3-odstotni BSA. Sekundarna protitelesa so usmerjena proti Fc regiji
22
primarnih protiteles in so lahko označena s specifičnim encimom, radioaktivnim izotopom,
fluorescentnim barvilom.
3.3 TEST ZA DOLOČANJE CELIČNE METABOLNE AKTIVNOSTI Z
REAGENTOM MTS
Test za določanje metabolne aktivnosti celic je kolorimetrična metoda za merjenje
aktivnosti metabolnih encimov, ki reducirajo reagent MTS v formazan vijolične barve.
Reagent MTS je zmes 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-
sulfofenil)-2H-tetrazola v obliki soli in fenazin etosulfata (angl. phenazine ethosulfate;
PES), ki je reagent za prenos elektronov. Tetrazolijeva sol prehaja v celice, kjer se pod
vplivom reducirajočih reagentov v mitohondrijih reducira do formazana. Količina
nastalega formazana je sorazmerna številu živih metabolno aktivnih celic in lahko jo
merimo spektrofotometrično pri 490 nm na mikrotitrskem čitalcu (Safire2TM Genios).
Postopek:
Po stimulacji celic z 1, 10 in 100 μM PGE1-OH ter vzporedno z ustrezno količino
DMSO smo test izvajali v časih 24, 48 in 72 ur v mikrotitrskih ploščicah s 96
vdolbinicami. V vsako vdolbinico smo dodali 100 μL predhodno stimulirane oz.
kontrolne celične suspenzije. Nato smo ob želenem času dodali 10 μL reagenta
MTS. Vsak vzorec je imel 2 tehnični ponovitvi. Po treh urah inkubacije v
inkubatorju za gojenje celic (37 ºC, 5 % CO2) smo z mikrotitrskim čitalcem Tecan
Safire2 izmerili absorbanco nastalega formazana pri 490 nm. Večja kot je bila
izmerjena absorbanca, večja je bila metabolna aktivnost celic. Istočasno smo test
izvedli tudi z medijem RPMI in 10 μL MTS brez celic, s čimer smo določili
absorbanco ozadja (slepa kontrola), ter jo odšteli od absorbance vzorcev.
3.4 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA
3.4.1 Fluorescenca
Pojav, pri katerem molekula absorbira in posledično emitira vidno svetlobo, imenujemo
fotoluminiscenca. Le-to delimo na fosforescenco in fluorescenco. Kadar molekula emitira
vidno svetlobo po prenehanju izpostavitve ekscitacijski svetlobi, imenujemo ta pojav
23
fosforescenca. Če pa emisija vidne svetlobe poteka samo med izpostavitvijo ekscitacijski
svetlobi, se ta pojav imenuje fluorescenca.
Fluorescenca je pojav, ki ga je prvič opazoval Sir George Gabriel Stokes leta 1852,
fizikalno pa ga je opisal Alexander Jablonski leta 1935. Molekule, ki imajo sposobnost
fluorescence, imenujemo fluorofori. Kadar fluorofor v t. i. osnovnem energijskem stanju
absorbira svetlobno energijo (foton), pride do sprememb v elektronskem, vibracijskem in
rotacijskem energijskem stanju fluorofora. Vibracijska relaksacija in fluorescenca sta
poglavitni poti vračanja fluoroforov v osnovno energijsko stanje.
Pojav fluorescence najlažje predstavimo z Jablonski-jevim diagramom (slika 3), kjer so
predstavljena energijska stanja molekule. Fluorofor, ki ni absorbiral energije, se nahaja v
najnižjem vibracijskem stanju osnovnega stanja S0. Kadar fluorofor absorbira svetlobo, se
vsa energija fotona, ki je odvisna od valovne dolžine, prenese na fluorofor. Če je ta
energija večja, kot je potrebno za preskok elektrona iz osnovnega v vzbujeno energetsko
stanje, bo molekula podvržena tudi rotacijskim in vibracijskim spremembam. Zato obstaja
širok interval valovnih dolžin, ki lahko povzročijo ekscitacijo molekule. Minimalna
energija, potrebna za fluorescenco, je tista, pri kateri pride do prehoda elektrona iz
osnovnega S0 v vzbujeno stanje S1.
Slika 3: Jablonski-jev diagram
Energija oddanega fotona je zaradi interne konverzije in vibracijske relaksacije do
najnižjega vibracijskega stanja S1 manjša kot energija absorbiranega fotona. Spekter
emitirane svetlobe je zato pomaknjen k daljšim valovnim dolžinam, kar imenujemo
Stokes-ov premik (slika 4). Dolžina Stokesovega premika je odvisna od fluorofora in večji
kot je Stokesov premik, lažje ločimo emitirano svetlobo od ekscitacijske svetlobe (51).
24
Slika 4: Stokes-ov premik
Stokesov premik je posledica izgube energije fluorokroma v višjih energjskih stanjih. Tako je absorbcijska
energija večja od emisijske in zato ima emisijska svetloba manjšo energijo in s tem večjo valovno dolžino od
absorbcijske.
3.4.2 Epifluorescenčna mikroskopija
Fluorofori po absorpciji svetlobe zaradi Stokesovega premika emitirajo svetlobo daljših
valovnih dolžin. Zato je osvetlitev vzorca, označenega z fluoroforom, z izbrano valovno
dolžino in nato zaznavanje šibkejše fluorescenčne svetlobe daljše valovne dolžine, osnovni
princip fluorescenčnega mikroskopa. Tip fluorescenčnega mikroskopa, kjer isti objektiv
uporabljamo tako za kondenzor ekscitacijske svetlobe kot za zbiranje emitirane
fluorescenčne svetlobe, imenujemo epifluorescenčni mikroskop (slika 5). Zaradi skupne
optične poti ekscitacijske in emitirane svetlobe mikroskop uporablja dikromatično
ogledalo, ki odbija svetlobo manjših valovnih dolžin in prepušča svetlobo večjih valovnih
dolžin. Optični sistem vodi ekscitacijsko svetlobo preko ekscitacijskega filtra, ki prepušča
svetlobo izbrane valovne dolžine. Le-ta se na dikromatičnem ogledalu pod kotom 90 0
odbije do objektiva, ki deluje kot kondenzor ekscitacijske svetlobe, in osvetli vzorec.
Ekscitacijska svetloba potuje skozi vzorec in stran od objektiva, ki v tej stopnji služi kot
zbiralec emitirane svetlobe. Optični sistem vodi emitirano svetlobo preko dikromatičnega
ogledala, ki prepušča samo svetlobo daljših valovnih dolžin in preko emisijskega filtra do
detektorja, kjer se tvori slika vzorca (52).
25
Slika 5: Shema epifluorescenčnega mikroskopa
Ugotavljanje lokalizacije receptorja EP4 v celicah z uporabo fuorescenčne mikroskopije
Označevanje celičnih jeder
Fluorescenčno barvanje celičnih jeder se pogosto porablja za ugotavljanje statusa celičnega
cikla in za razlikovanje med različnimi celičnimi populacijami. Hkrati nam jedro pomaga
pri preučevanju in prostorski umestitvi drugih celičnih struktur v celici. Najpogosteje
barvila delujejo kot interkelatorji DNA (etidijev bromid, propidijev jodid) ter preko vezave
v mali žleb DNA (DAPI, Hoechst).
Hoechst 33342 (Ek. maks.: 350 nm / Em. maks.: 461 nm; filter: DAPI)
Hoechst, barvilo bis-benzimidinskega tipa, prosto prehaja celično membrano in se veže v
mali žleb DNA, pri čemer regije, bogate z AT pari, močno ojačajo fluorescenco. Zaradi
ekscitacije v UV področju in relativno velikega Stokesovega premika je barvilo uporabno
za kombinacijo z drugimi fluorofori. Primerno je za barvanje fiksiranih in živih celic.
Osnovno raztopino barvila Hoechst 33342 (1,66 mM) pred uporabo redčimo s PBS do
delovne koncentracije 8 μM.
Označevanje receptorja EP4
Receptor EP4 smo s fluoroforom označili s pomočjo primarnih in sekundarnih protiteles.
26
Primarna protitelesa:
Uporabili smo tri različna primarna, v kuncu proizvedena, poliklonska protitelesa, ki se
specifično vežejo receptor EP4. Uporabili smo eno protitelo proti zunajceličnemu delu (N-
terminalni del) receptorja EP4 proizvajalca Imgenex, katerega smo redčili 1:200 v 3%
BSA v PBS. Uporabili smo tudi dve protitelesi proti znotrajceličnemu delu receptorja EP4
(C-terminalni del), ki smo ju redčili 1:100 (protitelo proizvajalca Cayman) in 1:40
(protitelo proizvajalca SantaCruz) v 3% BSA v PBS.
Sekundarna protitelesa:
Za zaznavo primarnih protiteles smo uporabili v kozi proizvedena anti-kunčja IgG,
konjugirana z barvilom AlexaFluor 488. Z redčenjem osnovne raztopine sekundarnih
protiteles (2 mg/mL) z 3% BSA v PBS smo pripravili delovno raztopino sekundarnih
protiteles s koncentracijo 0,4 ug/mL.
Postopek priprave preparata za opazovanje pod fluorescenčnim mikroskopom:
Odstranili smo celični medij nad kulturo,
enkrat smo sprali s PBS,
fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min),
spirali smo s PBS,
permeabilizirali smo z 0,5-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min),
inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA v PBS (30 min),
inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 (60 min)*,
spirali smo s PBS,
inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles (1 : 5000 v 3-odstotni BSA) in
barvilom Hoechst (8 μM) (60 min),
spirali smo s PBS,
celice smo nanesli na objektna stekelca z napravo Cytofuge,
delno smo osušili celice in dodali ProLong Antifade reagent ter pokrili s
krovnim stekelcem.
* V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles.
27
3.5 PRETOČNA CITOMETRIJA
(angl. flow cytometry), tudi: FACS (angl. fluorescence-activated cell sorting)
Pretočna citometrija je tehnika, s katero merimo in analiziramo lastnosti posameznih celic,
ki v suspenziji ena za drugo potujejo skozi ozek snop laserske svetlobe. Pri prehodu skozi
izvor svetlobe odda posamezna celica svetlobne signale, ki so odvisni od njenih lastnosti.
Analiziramo lahko več sto celic na sekundo, kar nam omogoči zanesljiv vpogled v
fizikalne in biokemične lastnosti celic. Svetlobni žarek zadene celico, se odbije, lomi ali pa
absorbira v fluoroforih, ki nato emitirajo svetlobo daljše valovne dolžine, ki jo zaznamo z
detektorjem. Fotodetektorji pretvorijo svetlobne signale v električne, ki jih izmerimo,
obdelamo z ustrezno programsko opremo in prikažemo v obliki točkovnih diagramov in/ali
histogramov. Dobimo podatek o velikosti in granuliranosti celic ter vrsti in moči
fluorescenčnih signalov.
Slika 6: Shema pretočnega citometra
Glavni sestavni deli pretočnega citometra so vir svetlobe, pretočni sistem za regulacijo toka nosilne tekočine
skozi ustrezen svetlobni žarek, optični sistem za fokusiranje in usmerjanje svetlobe, elektronika, ki omogoča
merjenje intenzitete svetlobnega signala ter računalniški sistem z ustrezno programsko opremo za analizo
dobljenih podatkov.
3.5.1 Sipanje svetlobe
Pri interakciji laserskega žarka z vzorcem večina fotonov neovirano prispe skozi tok celic.
Nekateri pa zaradi ovirane poti skozi vzorec spremenijo svoje lastnosti, kar opazimo kot
odboj oz. razprševanje svetlobe. Dva fotodetektorja merita količino razpršene svetlobe, ki
jo oddaja obsevana celica (oddana svetloba je enake valovne dolžine kot obsevalna
28
svetloba). Prvi detektor je FALS (angl. forward angle light scatter), ki se nahaja v liniji
poti laserskega žarka (tj. na nasprotni strani toka) in omogoča zaznavo uklonjene svetlobe.
Parameter, ki ga najpogosteje imenujemo »prednje sipanje« (angl. forward scatter, FSC),
nastane zaradi kontakta s celičnimi membranami in je sorazmeren velikosti celice; čim
večja je celica, tem večje bo sipanje svetlobe in višji bo signal na detektorju, ki sprejema
razpršeno svetlobo iz smeri laserskega žarka (odbojni kot žarka je majhen).
Ker so celice prosojne, prehaja veliko fotonov tudi skozi citoplazmo. Če pride do
interakcije z organeli (endoplazemski retikulum, jedro, ...), bo prišlo do odboja fotona
pravokotno od smeri laserskega žarka. Fotodetektor RALS (angl. right angle light scatter)
se nahaja pravokotno od poti laserskega žarka in omogoča zapis drugega parametra −
»stransko sipanje« (angl. side scatter), ki je premosorazmerno kompleksnosti (zrnatosti oz.
granuliranosti) posamezne celice; več kot je organelov oz. membranskih strukur, večje bo
stransko sipanje in višji bo signal. S takšno analizo določujemo morfološke lastnosti celic
kot sta velikost in zrnatost oz. granuliranost.
Slika 7: Sipanje svetlobe v pretočni citometriji
Pri interakciji s celico se svetloba razprši v dve smeri; dobimo prednje in stransko sipanje.
3.5.2 Imunofluorescenca
Poleg morfoloških lastnosti lahko s pretočnim citometrom analiziramo funkcionalne
lastnosti celic. Pretočni citometer ima dva do štiri fluorescenčne detektorje, ki merijo
svetlobo večjih valovnih dolžin od vzbujevalne (laserske) svetlobe. Vsak detektor prejema
emitirano fluorescenčno svetlobo določene valovne dolžine in na ta način meri signal, ki ga
oddaja določeno fluorescenčno barvilo. Fotodetektorji pretvorijo svetlobne signale v
električne, izmerjene vrednosti električnih signalov po računalniški obdelavi pa prikažemo
matematično in grafično. Na ta način lahko o vsaki celici, poleg podatkov o njeni relativni
29
velikosti in zrnatosti (FSC in SSC), dobimo še informacijo o vrsti in jakosti oddanih
fluorescenčnih signalov.
Razvrščanje celic glede na velikost in zrnatost omogoči razločitev belih krvnih celic na
posamezne populacije. Če želimo razločevati med podvrstami limfocitov, jih je potrebno
razvrstiti glede na prisotnost posameznih označevalskih molekul (ponavadi na površini
celice), katerih navzočnost ugotavljamo s specifičnimi protitelesi.
Prisotnost specifičnih antigenov na površini celic ali v njihovi notranjosti lahko določimo z
imunofluorescenčnimi tehnikami, pri katerih uporabljamo za želeni antigen specifična
protitelesa, ki so konjugirana s fluorokromi. Fluorokromi so barvila, ki absorbirajo
svetlobo določene valovne dolžine, oddajajo pa svetlobo večje valovne dolžine; pri
imunofluorescenčnih tehnikah vzorec obsevamo z vzbujevalno (ekscitacijsko) svetlobo, ki
jo fluorokromi absorbirajo, merimo pa relativno intenziteto oddane (emitirane) svetlobe, ki
odraža količino imunskih kompleksov.
Metoda pretočne citometrije je v osnovi enaka metodi fluorescenčne mikroskopije s to
razliko, da je odčitavanje odstotka obarvanih celice avtomatizirano, hitrejše in
objektivnejše. Odstotek pozitivnih celic (celice, ki po reakciji s fluorescenčno označenimi
protitelesi fluorescirajo) lahko zanesljivo izračunamo v primeru, da lahko jasno ločimo
med pozitivnimi in negativnimi celicami (53).
3.5.3 Metode za pripravo celic za pretočno citometrijo
a) Ugotavljanje izražanja receptorja EP4 s pomočjo imunofenotipizacije
Imunofenotipizacija je tehnika, s katero določamo proteine, izražene na celični membrani
ali znotraj celice. Obstajata posredna in neposredna tehnika označevanja proteinov s
protitelesi. Pri neposredni tehniki uporabljamo le eno vrsto protiteles: flourescenčno
označena in usmerjena proti želenemu proteinu. Pri posredni tehniki s primarnimi
(fluorescenčno neoznačenimi) protitelesi dosežemo specifično vezavo na želen protein, s
sekundarnimi protitelesi, ki so konjugirana s fluorokromom, pa označimo primarna
protitelesa, saj je Fab regija sekundarnega protitelesa usmerjena proti Fc regiji primarnega
protitelesa. (53).
Podobno kot v primeru priprave preparatov za fluorescenčno mirkoskopijo smo tudi tu
uporabili tri različna primarna, v kuncu proizvedena, poliklonska protitelesa, ki se
specifično vežejo receptor EP4. Uporabili smo eno protitelo proti zunajceličnemu delu (N-
30
terminalni del) receptorja EP4 proizvajalca Imgenex, katerega smo redčili 1:200 v 3%
BSA v PBS. Uporabili smo tudi dve protitelesi proti znotrajceličnemu delu receptorja EP4
(C-terminalni del), ki smo ju redčili 1:100 (protitelo proizvajalca Cayman) in 1:40
(protitelo proizvajalca SantaCruz) v 3% BSA v PBS. Za zaznavo primarnih protiteles smo
uporabili anti-kunčja IgG, konjugirana z barvilom AlexaFluor 488. Z redčenjem osnovne
raztopine sekundarnih protiteles (2 mg/mL) z 3% BSA v PBS smo pripravili delovno
raztopino sekundarnih protiteles s koncentracijo 0,4 ug/mL).
Z namenom razlikovanja med receptorjem EP4 na površini celice oz. znotraj celice smo
označevali nefiksirane celice, fiksirane celice ter fiksirane in istočasno permeabilizirane
celice. Če želimo označiti samo proteine na zunanjem delu membrane, celic namreč ne
smemo permeabilizirati s Triton-X, saj ta naluknja membrano in omogoča protitelesu
prosto difuzijo v notranjost celice. V primeru permeabilizacije označimo proteine zunaj in
znotraj celice.
Postopek za označevanje receptorja EP4 na suspenzijskih malignih celicah:
Odstranili smo celični medij nad kulturo (5 x 105 celic),
fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min)*,
spirali smo s PBS,
permeabilizirali smo z 0,5-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min)**,
spirali s PBS
inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA (30 min),
inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 v 3-odstotni BSA (60
min)***,
spirali smo s PBS,
inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles (1 : 5000 v 3-odstotni BSA)
(60 min),
spirali smo s PBS,
resuspendirali smo celice v 500 μL PBS
analizirali smo na pretočnem citometru
*Nefiksiranih celic nismo fiksirali in permeabilizirali.
**Samo fiksirane celice niso bile permeabilizirane.
***V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles, le sekundarna.
31
Postopek za označevanje receptorja EP4 na primarnih zrelih limfocitih B (CD19+):
Odstranili smo celični medij nad suspenzijo PBMC (5 x 105 celic),
fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min)*,
spirali smo s PBS,
permeabilizirali smo z 0,2-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min)**,
spirali s PBS
inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA (30 min),
inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 v 3-odstotni BSA (60
min)***,
spirali smo s PBS,
inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles Alexa Fluor 488 (1 : 5000 v
3-odstotni BSA) in protiteles antiCD19 (1 : 20 v 3-odstotni BSA) (60 min),
spirali smo s PBS,
resuspendirali smo celice v 500 μL PBS
analizirali smo na pretočnem citometru
*Nefiksiranih celic nismo fiksirali in permeabilizirali.
**Samo fiksirane celice niso bile permeabilizirane.
***V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles, le sekundarna.
b) Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V
Apoptozo lahko dokazujemo v celicah na več načinov, saj na njih poteka veliko
morfoloških sprememb, ki jih je s sodobnimi tehnikami preprosto ugotoviti. Ena od takih
sprememb je nestabilnost celične membrane, ki nastopi precej zgodaj v procesu apoptoze.
Zaradi nestabilnosti celične membrane se fosfolipid fosfatidilserin, ki je sicer v
neapoptotični celici na citosolni strani celične membrane, izpostavi na zunanjo,
eksoplazmatsko stran celice.
Annexin V je protein, ki se z veliko afiniteto veže na fosfatidilserin. Če s fluorescenčno
označenim Annexinom označujemo celice, ki imajo fosfatidilserin na zunanji strani,
dobimo obarvane celice oz. zaznamo Annexin- pozitiven rezultat na pretočnem citometru.
Pozitiven rezultat dajo tako žive celice v procesu apoptoze kot mrtve celice, ne glede na
način, na katerega so umrle (apopoza ali nekroza). Pozitivne za apoptozo so torej le tiste
32
celice, ki so pozitivne na Annexin in hkrati še žive. S tem namenom celice obarvamo še s
propidijevim jodidom (PI), ki prodira le v mrtve celice, žive pa se ne obarvajo. Torej bodo
celice pozitivne za apoptozo tiste, ki bodo Annexin pozitivne in PI negativne.
Postopek priprave vzorca za označevanje z Anexinom V:
Po stimulacji s 100 μM PGE1-OH smo v času 12 in 24 ur sprali celice s PBS in
jih resuspendirali v 250 μL raztopine 1 x Binding Buffer s koncentracijo 0,5 x
106 celic/ml,
dodali smo 2,5 μL FITC Annexina V in 5 μL PI,
nežno smo premešali in inkubirali 10 min v temi, pri sobni temperaturi (23 °C)
analizirali smo na pretočnem citometru v roku 60 min.
Za pomoč pri kompenzaciji prekrivanja signalov, smo celice pobarvali posebej s
FITC Annexinom V in posebej s PI. Tako smo z barvanjem samo z Annexinom V
določili mejo, ki loči apoptotične celice od neapoptotičnih in z barvanjem samo s PI
mejo, ki loči apoptotične (še vedno žive) celice od mrtvih.
c) Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na spremembe v celičnem ciklu
celic
Razmerje med celicami v posameznih fazah celičnega cikla ugotavljamo na podlagi
količine DNA, ki se nahaja v celici. Propidijev jodid (PI) je fluorescentno barvilo, ki se
interkelira v DNA in RNA. Pri analizi celičnega cikla želimo opazovati le količino DNA,
zato RNA z dodatkom eksogenih RNAz razgradimo. Celice v G2 in M fazi imajo
dvakratno količino DNA, torej je fluorescenca dvakrat višja v primerjavi s celicami v G0
in G1 fazi. Celice v S fazi imajo količino DNA nekje med tema vrednostima (54).
Postopek priprave preparata za ugotavljanje sprememb v celičnem ciklu :
Po stimulaciji celic z 10 μM PGE1-OH smo v času 24 in 48 ur ostranili celični
medij nad kulturo (5 x 106 celic),
celice smo resuspendirali v 200 μL hladnega PBS in dobro
premešali/prepipetirali,
dodali smo 2 ml etanola ohlajenega na -20 °C in premešali,
inkubirali smo na -20 °C(60 min,)
33
premešali in spirali smo s PBS (2500 rpm, 5min),
resuspendirali smo v 500 μL PBS,
dodali smo 5 μL RNAze in 20 μL PI in premešali,
inkubirali smo na 37°C (30 min),
analizirali smo na pretočnem citometru v roku 60 min.
d) CellTrace™ postopek za vrednotenje celične proliferacije
CFDA-SE je brezbarvno »pred-barvilo«, ki z difuzijo prehaja v celice, kjer mu esteraze
odcepijo obe acetatni skupini (nastane CFSE!) in s tem postane močno fluorescenten. S
svojo sukcinimidilno skupino se kovalentno veže na aminske ostanke v citosolu. Uporablja
se večinoma za in vivo »sledenje« (ang. tracing) obarvanim celicam, saj ostane v celici tudi
do osem tednov. Obarvane celice se ne razbarvajo tudi po fiksaciji. S celično delitvijo se
količina barvila razpolovi v hčerinski celici, kar povzroči padec fluorescence hčerinskih
celic (glede na materinsko) za polovico. Tako lahko v časovnih intervalih spremljamo
generacije celičnih linij ter ugotavljamo hitrost in pogostost delitve (55).
Postopek za označevanje celic s CFSE:
Vzeli smo 1,5 x 106 celic in odstranili medij nad kulturo,
celice smo resuspendirali v 1 mL na 37 °C segretega PBS,
dodali smo 3 μL 5 mM reagenta CFDA-SE, da smo dosegli koncentracijo 15
μM,
inkubirali smo15 min na 37 °C,
sprali in resuspendirali smo v 1 mL svežega medija RPMI za gojenje (37 °C),
inkubirali smo 30 min na 37 °C,
celicam dodali smo 12 mL svežega medija RPMI (37 °C)in jih razdelili v
mikrotitrske ploščice (6 vdolbinic, v vsako po 2mL).
V tri vdolbinice smo dodali 0,4 μL 50 mM PGE1-OH (s tem smo dobili
koncentracijo 10 μM), ostale tri pa so služile kot kontrola.
V času 24, 48, 72, 96 ur smo merili fluorescenco živih celic.
34
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
Ena izmed bistvenih razlik med nezrelimi in zrelimi limfociti B je njihov odziv na
stimulacijo antigenskega receptorja BCR, po katerem gredo nezreli limfociti B v apoptozo,
zreli pa v aktivacijo in proliferacijo. Ta razlika je bila ovrednotena na transkripcijskem
nivoju s pomočjo mikromrež in največja razlika med zrelimi in nezrelimi limfociti B po
stimulaciji BCR se je pokazala v izražanju gena Ptger4, ki kodira prostaglandinski receptor
EP4. Na mišji celični liniji A20 (limfom zrelih limfocitov B) so dokazali, da se po
stimulaciji BCR z antiIgM (agonist BCR) poveča ekspresija EP4 na celični membrani.
Fiziološka stimulacija EP4 receptorja naj bi delovala kot negativna povratna zanka pri
klonalni ekspanziji aktiviranega zrelega limfocita B in zato so Ptger4 označili kot tumor
supresorski gen (13).
Na podlagi te trditve smo hoteli v prvem delu diplomske naloge preveriti, kakšna je
ekspresija receptorja EP4 na humanih levkemičnih linijah limfocitov B. To smo ugotovjali
s specifičnimi protitelesi, usmerjenimi proti iskanemu receptorju. Obarvane celice smo
analizirali s pretočno citometrijo ter fluorescenčno mikroskopijo. Rezultate smo primerjali
z ekspresijo receptorja na zdravih humanih limfocitih.
V drugem delu diplomske naloge smo raziskovali, kako in v kakšni meri se maligni
lmfociti odzivajo na stimulacijo receptorja EP4. Celično metabolno aktivnost in viabilnost
smo preverjali s testom MTS, kasneje pa smo z različnimi tehnikami poskušali dokazati, da
gre po stimulaciji receptorja EP4 za programirano celično smrt − apoptozo in ne za
nekrozo.
4.1 IZRAŽANJE RECEPTORJA EP4 V HUMANIH MALIGNIH
LIMFOCITIH B
Receptor EP4 so odkrili v večini človeških tkiv. Nahaja se na celični in tudi jedrni
membrani (56). Naše poskuse smo zasnovali na humanih celičnih linijah limfocitov B v
različnih stopnjah razvoja. Najprej smo želeli ugotoviti, ali izbrane levkemične celice
izražajo receptor EP4, kje je ta lociran in v kakšni meri ga izražajo v primerjavi z zdravimi
zrelimi limfociti B iz periferne krvi. Analize smo opravljali s pretočnim citometrom (4.1.1)
in fluorescenčnim mikroskopom (4.1.2).
35
4.1.1 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s
pretočno citometrijo
Na voljo smo imeli 3 različna protitelesa proti receptorju EP4. Protitelo proizvajalca
Imgenex (v nadaljevanju Ab Imgenex) je usmerjeno proti zunanji N-terminalni domeni,
protitelesi proizvajalca Cayman (v nadaljevanju Ab Cayman) in Santa Cruz (v
nadaljevanju Ab Santa Cruz) pa proti notranji C-terminalni domeni. Slednja sta usmerjena
proti različnim epitopom, vsa protitelesa pa so poliklonalna. Z Ab Imgenex smo želeli torej
dokazati lokalizacijo receptorja na membrani, z ostalima dvema pa podkrepiti te hipoteze.
Celice smo označili s protitelesi po postopku, opisanem v poglavju 3.5.3.a, in jih analizirali
s pretočnim citometrom.
Jakost fluorescence (log) Slika 8: Primer histograma iz analize s pretočnim citometrom.
Abcisa predstavlja jakost fluorescence, ordinata pa število celic. Na enem histogramu lahko prikažemo tudi
več vzorcev hkrati, ki so označeni z drugačno barvo.
36
Celice NALM-6
Nefiksirane Fiksirane Fiksirane in permeabilizirane
Slika 9: Ekspresija receptorja EP4 na celicah NALM-6.
Legenda:
Črke na sliki pomenijo vrsto primarnega protitelesa, s katerim so bile celice inkubirane:
A - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Imegenex (proti zunanjemu N-term. delu receptorja);
B - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Cayman (proti notranjemu C-term. delu receptorja);
C - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Santa Cruz (proti notranjemu C -term. delu receptorja);
številke pa različne obdelave celic pred inkubacijo s protitelesi:
1 in 2 − nefiksirane, nepermeabilizirane celice;
3 − fiksirane, nepermeabilizirane celice;
4 − fiksirane in permeabilizirane celice.
Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih
protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).
Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os). Detektor (FL-1) smo
nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost fluorescence od 10. Tako smo
postavili mejo (navpična črta) med EP4 negativnimi in EP4 pozitivnimi celicami (prikazano na histogramu
A1). Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete
protitelesa do epitopa.
Histogrami ostalih preiskovanih celic so v prilogi (slike 26-29).
37
Iz histogramov A4, B4 in C4 (slika 9) je razvidno, da so fiksirane in permeabilizirane
celice NALM-6 za EP4 receptor 100-odstotno pozitivne. To pomeni, da je receptor v
celicah definitivno prisoten. Kot je razvidno iz slik 26-29 v prilogi je receptor prisoten tudi
na ostalih preiskovanih celicah RAMOS, MHH-PREB, KOPN-8, SU-DHL.
V določeni meri lahko sklepamo tudi o natančnejši lokaciji receptorja v celici. Histogram
A3 z Ab Imgenex, ki je usmerjeno proti zunanjemu epitopu (N-terminalna domena) EP4
receptorja, nam na naše presenečenje razkrije, da delež celic NALM-6, ki imajo receptor
na membrani, ni stoodstoten. Zanimivo pa je, da dobimo delno pozitiven rezultat, a v
manjši meri, tudi pri nepermeabiliziranih celicah s protitelesi Ab Cayman in Ab Santa Cruz
(B3 in C3), ki sta usmerjena proti notranjemu delu receptorja in bi morala dati pozitiven
rezultat le na permeabiliziranih celicah. Podobne rezultate smo pridobili tudi z analizo
ostalih preiskovanih celičnih linij (priloga: slika 26-29). Glede na to, da so nefiksirane in
nepermeabilizirane celice vseh linij EP4 negativne, sklepamo, da lahko postopek fiksacije
celic v določeni meri naluknja celično membrano in olajša protitelesom vstop v celico.
Iz teh rezultatov zato težje sklepamo o natančnejši lokalizaciji EP4 receptorja. Zaenkrat
smo razvili dve predpostavki. Prva, očitnejša, je, da je receptor lociran znotraj celice oz. da
je internaliziran pod membrano. Opazili so namreč, da se receptor EP4 izrazi na membrani
zrelega mišjega limfocita B šele potem, ko celice stimuliramo z antiIgM po sprožitvi BCR
(13). To bo predmet prihodnjih raziskav.
Druga predpostavka pa je, da je epitop na zunanji strani membrane, ki ga prepozna
primarno protitelo Imgenex, pokrito z mucini in tako protitelo fizično ne more do njega,
permeabilizacija s Triton-x pa te mucine odstrani. Pokazali so namreč, da imajo rakave
celice izraženo veliko količino mucinov na površini kot odgovor na dražljaje iz okolja.
(57).
4.1.2 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s
fluorescenčno mikroskopijo
Za podkrepitev rezultatov iz pretočnega citometra smo naredili še nekaj posnetkov pod
fluorescenčnim mikroskopom. Postopek, s katerim smo obarvali celice, je opisan v
poglavju 3.4. Zaradi zaključkov rezultatov iz 4.1, ki kažejo, da se naše preiskovane celice
stoodstotno obarvajo le s permeabilizacijo celic, smo izdelali le preparate iz celic, ki smo
jih pred tem fiksirali in permeabilizirali.
38
Kontrola N - term C - term
Slika 10: Posnetki malignih limfocitov B pod fluorescenčnim mikroskopom.
39
Legenda:
A – RAMOS; B – NALM-6; C – MHH-PREB; D – KOPN-8; E – SU-DHL
1 – kontrola (celice inkubirane brez primarnih protiteles, le s sekundarnimi)
2 – celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Imegenex
3 - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Cayman
Celice smo snemali pod 100-kratno povečavo s fluorescenčnim mikroskopom (OLYMPUS BX50). Za vsak
posnetek smo posneli 10 rezin v razmiku 1 μm po koordinatni osi z (torej od vrha do dna celice). Na sliki 10
so prikazane optične rezine, ki potekajo preko prereza celice. Posnetki so obdelani z algoritmoma
»Backround Substraction« in »3D Blind deconvolution«, ki odstrani svetlobo, ki ne spada v preiskovano
optično rezino, ter jo prišteje v ravnino, iz katere izvira. Jedro je obarvano z barvilom HOECHST in emitira
svetlobo modre barve (področje DAPI). Uporabili smo dve primarni protitelesi proti EP4: za zunanjo domeno
receptorja Ab Imgenex in za notranjo domeno Ab Cayman. Sekundarna protitelesa s kovalentno vezanim
FITC (Alexa Fluor 488) uperjena proti Fc regiji primarnega protitelesa so na slikah obarvana zeleno. Slike so
bile posnete pri istih barvnih nastavitvah in pri isti izpostavitvi (100 ms), zato so med seboj primerljive.
S primerjavo med sličicami, ki prikazujejo kontrolo (stolpec 1), in sličicami, na katerih so
celice inkubirane še s primarnimi protitelesi (stolpec 2 in 3), smo potrdili predhodne
ugotovitve, pridobljene s pretočnim citometrom: vse maligne celice izražajo receptor EP4,
ta pa se nahaja v citosolu oz. ob celični membrani limfocitov B.
Za natančnejšo lokalizacijo preiskovanega receptorja na sličicah nimamo dovolj
informacij, saj v času izvedbe eksperimenta označevalcev, ki bi nazorno pobarvali
membrano celice, ni bilo na voljo. V nasprotnem primeru bi morda lahko kolokalizirali
receptor s celično membrano in z gotovostjo trdili ali se receptor EP4 nahaja ob jedrni
membrani, v citosolu ali pa je izražen tudi na celični membrani.
4.1.3 Določanje ekspresije EP4 receptorja na nemalignih PBMC s
pretočno citometrijo
Potem ko smo dokazali ekspresijo receptorja EP4 na humanih malignih celičnih linijah
limfocitov B, nas je zanimalo, kakšen je nivo ekspresije v primerjavi z limfociti B iz krvi
zdravega krvodajalca. Uporabili smo mononuklearne celice iz periferne krvi (angl.
Peripheral blood mononuclear cells − PBMC). PBMC sestavljajo, limfociti B in T,
monociti in celice ubijalke (NK; angl: natural killer cells). Za razlikovanje med
posameznimi podvrstami celic smo poleg receptorja EP4 označevali tudi antigen CD19
(angl: cluster of differentiation 19) , ki je specifičen za limfocite B. Ta je prisoten na
40
celicah B v vseh stopnjah, razen na plazmatkah. V ta namen smo uporabili zajčja
monoklonalna protitelesa proti humanemu CD19 označena s konjugiranim fikoeritrinom
(angl. phycoerythrin; PE), ki ga zazna detektor FL2 na pretočnem citometru.
PBMC smo odmrznili po enakem postopku kot celice iz celične linije in jih pustili 24 ur v
inkubatorju v mediju RPMI. Nato smo pripravili tri serije po pet vzorcev (vsak 0,5 x 106
celic). Prva dva vzorca sta nam služila kot negativna kontrola (vz. 1: brez primarnih in
sekundarnih protiteles; vz. 2: brez primarnih, samo sekundarna protitelesa), naslednja dva
kot kontrole za kompenzacijo prekrivanja fluorescenc (vz. 3: samo antiCD19, vz. 4: samo
antiEP4), ter vzorec 5: s primarnimi (Ab Imgenex ali Ab Cayman) in sekundarnimi
protitelesi (Alexa Fluor 488) proti receptorju EP4 ter protitelesa antiCD19. Prva serija
vzorcev je vsebovala nefiksirane, nepermeabilizirane, druga serija fiksirane,
nepermeabilizirane, tretja pa fiksirane in permeabilizirane celice, torej enako, kot smo to
naredili pri celičnih linijah. Receptor EP4 smo v prvem eksperimentu označili z Ab
Imgenex, v drugem pa z Ab Cayman.
Pripravo vzorcev smo izvedli po postopku 3.5.3 a.
41
Slika 11: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega krvodajalca (CD19+).
Slika 11 prikazuje analizo nefiksiranega in nepermeabiliziranega vzorca PBMC, kjer smo istočasno označili
receptor EP4 ter CD19.
Na 1A in 1B sta histograma vseh PBMC. Vidimo več populacij, ki se ločijo glede na velikost in
granuliranost. Z leve proti desni: limfociti, monociti. Na histogramih 2A so prikazane vse PBMC in jakost
fluorescence za EP4 receptor. Vse celice, ki imajo večjo fluorescenco od 10, so pozitivne za receptor EP4.
42
Na 2B so vse PBMC in jakost fluorescence za CD19. Mejo, ki loči CD19 pozitivne od negativnih, dobimo iz
histograma 4, kjer vidne populacije ločimo z vodoravno črto (rdeča puščica) in na ordinati odčitamo
vrednost. Vse celice, ki imajo fluorescenco večjo od te vrednosti (v tem primeru 102), smatramo za CD19
pozitivne. Na tak načim lahko iz histograma 2B izvzamemo le CD19 pozitivne celice (skupina R3 na
histogramu 2B) in jih prikažemo na histogramu 3B. Ta prikazuje torej vse CD19 pozitivne celice. Iz 3B
histograma izvzamemo le “čisto” populacijo limfocitov B brez celičnega debrija (skupina R10 na 3B) in na
tej populaciji preučujemo izražanje receptorja EP4 (histogram 3A). Na histogramu 3A imamo sedaj samo
limfocite B, ki jih pri vrednosti jakost fluorescence = 10 razdelimo na EP4 negativne (M1) in EP4 pozitivne
(M2). V tabeli pod histogramom je z rdečim okvirčkom označena povprečna fluorescenca EP4 pozitivne
populcije limfocitov B. Ostali histogrami so v prilogi (slika 31).
Primerjali smo jakosti povprečne fluorecence fiksiranih in permeabiliziranih celic, saj
predvidevamo, da le na ta način označimo celokupno količino receptorja EP4.
Slika 12: Primerjava relativne povprečne fluorescence označenega EP4 receptorja med fiksiranimi in
permeabiliziranimi preiskovanimi celicami in nemalignimi CD19+ celicami iz periferne krvi zdravega
krvodajalca (Ab Imgenex).
Slika prikazuje jakost povprečne fluorescence sekundarnih protiteles označenih z Alexa Fluor 488. To
sekundarno protitelo je usmerjeno proti Fc regiji primarnega protitelesa, ki pa selektivno veže epitop na
receptorju EP4. Vrednost je normalizirana na fluorescenco zdravih CD19+ B limfocitov iz PBMC, kar
omogoča lažjo primerjamvo jakosti fluorescenc, ki so sorazmerne z izražanjem receptorja EP4.
43
Slika 13: Primerjava relativne povprečne fluorescence med fiksiranimi in permeabiliziranimi preiskovanimi
celicami RAMOS in NALM-6 ter nemalignimi CD19+ celicami iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab
Cayman).
Slika prikazuje jakost povprečne fluorescence sekundarnih protiteles označenih z Alexa Fluor 488. To
sekundarno protitelo je usmerjeno proti Fc regiji primarnega protitelesa, ki pa selektivno veže epitop na
receptorju EP4. Vrednost je normalizirana na fluorescenco zdravih celicih CD19+, da lahko med sabo lažje
primerjamo jakosti fluorescenc, ki so sorazmerne z izražanjem receptorja EP4.
Na sliki 12 je razvidno, da imajo celice RAMOS in NALM-6, označene z protitelesom
proti EP4, ki prepozna N-terminalni del receptorja, dvakrat višjo povprečno fluorescenco,
kot enako pripravljen vzorec CD19+ zrelih B limfocitov. Podoben rezultat vidimo tudi na
sliki 13, kjer smo uporabili protitelo proti EP4, ki prepozna C-terminalni del receptorja. V
tem primeru je povprečna fluorescenca celic RAMOS in NALM-6 kar 4 – 5 krat višja od
CD19+ zrelih B limfocitov izoliranih iz periferne krvi zdravega krvodajalca. Maligno
spremnjene celice, ki izražajo večjo količino preiskovanega receptorja so potencialne tarče
za terapijo z agonisti receptorja EP4, saj lahko razlike v izražanju farmakološke tarče
vodijo v selektivno modulacijo maligno spremenjenih celic z agonisti ali antagonisti
receptorja EP4.
Ostale celice MHH, KOPN-8 in SU-SHL (slika 12) imajo po tem kriteriju izraženega
nekoliko manj EP4 receptorja kot zdravi limfociti.
44
Kot v predhodnih eksperimentih, kjer smo ugotavljali ekspesijo receptorja EP4 na maligno
spremenjenih celicah, smo tudi tu ugotovili, da s permeabilizacijo fiksiranih celic
dosežemo večje obarvanje receptorja EP4, ko uporabimo protitelo, ki prepozna N-
terminalni del receptorja. Glede na to, da zdravi CD19+ limfociti B na svoji membrani
nimajo presežka mucinov, ki bi lahko zakrivali vezavno mesto protitelesa Ab Imgenex,
lahko sklepamo, da se del receptorjev nahaja tudi znotraj celice bodisi v citosolu ali na
drugih membranskih strukturah v celici. Natančnejša lokalizacija in farmakološka
aktivnost različno lokaliziranega receptorja EP4 bo predmet prihodnjih raziskav.
4.2 PGE1-OH ZMANJŠA METABOLNO AKTIVNOST MALIGNIH
LIMFOCITOV B
Potem ko smo v humanih celičnih linijah ovrednotili nivo ekspresije EP4 receptorja, smo v
naslednjem koraku preizkušali, kakšen je farmakološki odziv celic na stimulacijo tega
receptorja. Celice smo inkubirali v prisotnosti selektivnega agonista za receptor EP4,
PGE1-OH, in merili njihovo metabolno aktivnost s testom MTS (opisan v poglavju 3.3).
4.2.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na metabolno
aktivnost celic z MTS testom
Iz vsake celične kulture smo vzeli 6 alikvotov po 1 ml kulture (0,1 x 106 celic/ml) in
odpipetirali vsak alikvot v svojo vdolbinico na mikrotitrski ploščici s 24 vdolbinicami. Prvi
alikvot je služil kot kontrola celic, ki smo jih inkubirali le v popolnem mediju RPMI. Drugi
in tretji alikvot sta služila kot kontroli topila. DMSO je citotoksičen, zato bi lahko dobili
lažno pozitivne rezultate, saj je DMSO v našem primeru topilo za PGE1-OH.
V naslednje 3 alikvote smo dodajali agonist PGE1-OH v različnih koncentracija. V četrti
alikvot smo dodali 2 μL PGE1-OH (redčen 1 : 100 v RPMI) in 18 μL RPMI, v petega 20
μL PGE1-OH (redčen 1 : 100 v RPMI), v šestega pa 2 μL osnovne raztopine PGE1-OH s
koncetracijo 50 mM ter 18 μL RPMI. Tako smo dobili v četrti vdolbinici 1 μM PGE1-OH,
v peti 10 μM PGE1-OH in v šesti 100 μM PGE1-OH. Vsako vdolbinico posebej smo
premešali z 1 mL pipeto, preden smo z multikanalno pipeto razdelili stimulirane kulture
vzporedno na 3 (24, 48, 72 h) mikrotitrske ploščice s 96 vdolbinicami. Iz vsakga alikvota
različno tretirane celične kulture smo vzeli 2-krat po 100 μL (dvojna tehnična ponovitev)
45
in tako dobili 6 x po 2 vzorca za vsako linijo. Poleg kultur smo v posebne vdolbinice
dodali še 2-krat po 100 μL RPMI kot slepo kontrolo. Celice smo dali v inkubator in vsakih
24 ur izvedli MTS test.
Eksperiment smo ponovili še dvakrat (3 biološke ponovitve) in podatke statistično
obdelali.
Slika 14: Metabolna aktivnost celic RAMOS in MHH PREB stimuliranih s PGE1-OH.
Stolpci prestavljajo celično metabolno aktivnost, normalizirano na kontrolo nestimuliranih celic v času 24, 48
in 72 ur. Rezultati iz analize celic KOPN-8, SU-DHL in NALM-6 so v prilogi (slika 30).
46
Izpostavili smo rezultate celic RAMOS, ki se je po 48h najhitreje odzivala na stimulacijo z
10 μM PGE1-OH (4. stolpec) in celic MHH-PREB, ki so se na isto koncentracijo PGE1-
OH odzivale počasneje (slika 14).
Iz zgornjih grafov je razvidno, da PGE1-OH kot agonist receptorja EP4 inhibitorno vpliva
na metabolno aktivnost celic. Zmanjšanje oz. prenehanje metabolne aktivnosti je odvisno
od koncentracije agonista. Pri koncentraciji PGE1-OH 1 μM je učinek slabo viden. Pri 10
μM je učinek znaten, medtem ko je koncetracija 100 μM za večino celic smrtna že po prvih
24 urah. Za natančnejšo korelacijo med koncetracijo in odzivom bi bilo potrebno izvesti
ekspreriment z linearnim povečevanjem koncentracij in ne logaritemskim, kar pa prvotno
niti ni bil naš namen.
Pri RAMOS smo glede na ostale celice ugotovili najhitrejši in najintenzivnejši
farmakološki odziv na stimulacijo receptorja EP4. Celice RAMOS druge po vrsti izražajo
največ receptorja EP4, kar smo določili s predhodno analizo s pretočnim citometrom
(4.1.3). Iz te primerjave bi lahko sklepali, da je odziv celic povezan s količino izraženega
receptorja EP4, vendar nam rezultati celic NALM-6 (priloga: slika 30) to hipotezo ovržejo.
NALM-6 namreč izražajo največ receptorja EP4, na testu MTS pa imajo najšibkejši odziv
na stimulacijo z 10 μM PGE1-OH. Eden imzmed verjetnih vzrokov za različen odziv celic,
kljub podobni ekspresiji receptorja EP4 je tudi diferenciacijska stopnja maligno
transformiranega B limfocita.
Namen tega testa je bil ovrednotiti učinke PGE1-OH na celice z vidika metabolične
aktivnosti oz. viabilnosti. Potrdili smo domnevo, da PGE1-OH kot agonist na receptorju
EP4 zmanjša metabolno aktivnost celic kar posledično vodi v celično smrt.
Iz tega poizkusa je nemogoče ugotoviti, za kateri tip celične smrti gre. Ali po tretiranju s
PGE1-OH nastopi nekroza ali programirana celična smrt (apoptoza) kot posledica
stimulacije receptorja EP4, bomo odgovorili v naslednjih poglavjih.
47
4.3 PGE1-OH INDUCIRA APOPTOZO V MALIGNIH LIMFOCITIH B
V predhodnih eksperimentih smo pokazali, da 100 μM PGE1-OH povzroči smrt celične
kulture v roku 24 ur. Inkubiranje z 10 μM PGE1-OH pa znantno zmanjša njihovo
metabolno aktivnost. Iz MTS testov je razvidno, da se vse celice odzivajo na podoben
način, zato smo za nadaljne preizkuse izbrali dve liniji, RAMOS in MHH-PREB. V testu
na metabolno aktivnost z MTS so se celice RAMOS najhitreje odzivale na 10 μM PGE1-
OH, MHH-PREB pa počasneje in v manjši meri.
Raziskati je bilo treba še vrsto celične smrti, ki nastopi po stimulaciji s 100 μM PGE1-OH
(poglavje 4.3.1), saj tega s testom MTS ni bilo mogoče ugotoviti. Želeli smo tudi še
preučiti, kaj se dogaja s celicami, ki so stimulirane z 10 μM PGE1-OH ( poglavje 4.4).
4.3.1 Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V
Nestabilnost celične membrane je eden zgodnejših dogodkov potem, ko celica stopi v
proces apoptoze. Fosfolipid fosfatidilserin se v tem procesu premakne iz notranje strani
membrane na njeno eksoplazmatsko površino, s čimer se izpostavi zunanjemu okolju
celice. Protein, ki se veže na fosfatidilserin z visoko afiniteto, se imenuje Annexin V in če
je ta konjugiran s fluorokromom (v našem primeru FITC), lahko služi kot občutljiva sonda
za apoptotične analize na pretočnem citometru. Fosfatidilserin se eksternalizira v zelo
zgodnji fazi apoptoze, zato lahko z barvanjem s FITC Annexinom V določimo apoptozo na
zgodnejši stopnji kot s testi, ki temeljijo na spremembah v jedru celice (npr. DNA
fragmentacija) (58).
FITC Annexin V obarva tudi celice v poznih stopnjah celične smrti, tako apoptoze kot
nekroze. Celice zato pobarvamo s FITC Annexinom V skupaj s propidijevim jodidom (PI).
PI prehaja samo v mrtve celice in tako lahko ločimo žive celice, ki so v procesu apoptoze
(PI negativne, Annexin V pozitivne), od mrtvih celic (58). Celice morajo biti pred tem
postopkom tako stimulirane, da se v njih sproži proces apoptoze. Test na pretočnem
citometru izvajamo v več časovnih točkah med potekom apoptoze.
Celice RAMOS in MHH-PREB smo najprej prešteli in določili število celic na mL medija
RPMI. Nato smo pripravili po 3 mL suspenzije vsake kulture s koncentracijo 5 x 105
celic/mL. V mikrotitrsko ploščico z 12 vdolbinicami smo za vsako linijo pripravili po tri
kontrole in tri stimulacije v volumnu 0,5 mL. Celice smo stimulirali v 100 μM PGE1-OH
48
(1μL 50 mM PGE1-OH). Postavili smo jih v inkubator za gojenje celic. V danih časih 12
in 24 ur smo vzeli vzorce, jih obarvali po postopku, opisanem v poglavju 3.5.3 b) in jih
analizirali na pretočnem citometru.
Slika 15: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS, stimuliranih z 100 μM PGE1-OH
(12h)
Na histogramu 1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R1 + R2) in PI pozitivne oz.
mrtve zgoraj (R3). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 110. Za točno število
mrtvih celic prenesemo mejo na histogram 3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z rdečim
okvirčkom). Preostale žive celice na histogramu 1 (R1 in R2) pa razdelimo na Annexin V negativne in
pozitivne. Meja na abcisi je pri 10 in je določena s pomočjo nestimuliranih celic (slika 16, histogram 1). Tako
dobimo populacijo R2, ki predstavlja PI negativne in Annexin V pozitivne celice, torej žive celice v procesu
apoptoze. Za točno število teh zajamemo na histogramu 2 Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo
vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na histogramu 3.
49
Slika 16: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS na nestimulranih celicah (12h)
Na histogramu 1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne. Pri
vrednosti fluorescnce za Annexin V = 10 postavimo mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih
neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (slika 15), kjer ta meja ni jasna. Pri
histogramih nestimuliranih celic pa upoštevamo meje za jakosti fluorescence PI, ki smo jih določili pri
stimuliranih celicah. Na enak način izračunamo števila celic posameznih skupin R. Histogrami za ostale
časovne točke in celice MHH-PREB so v prilogi (slika 32-34).
50
Preglednica 1: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS.
12 h Št. celic % 24 h Št. celic % kontrola A neg. PI neg. (R1) 6634 88,83% A neg. PI neg. 9005 94,03% A poz. PI neg. (R2) 355 4,75% A poz. PI neg. 391 4,08% A poz. PI poz. (R3) 479 6,41% A poz. PI poz. 181 1,89%
A neg. PI neg. (R1) 1288 6,44% A neg. PI neg. 158 1,35%PGE1-OH
100uM A poz. PI neg. (R2) 13314 66,57% A poz. PI neg. 6352 54,17% A poz. PI poz. (R3) 5398 26,99% A poz. PI poz. 5216 44,48%
kont
rola
12h
kont
rola
24h
stim
ulac
ija 1
2h
stim
ulac
ija 2
4h
Mrtve
Apoptotične
Žive
0%
20%
40%
60%
80%
100%
De
lež
ce
lic
Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na liniji RAMOS
Slika 17: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS.
Na grafu vidimo, da stimulacija receptorja EP4 povzroči začetek apoptoze na večini celic že po 12 urah. Po
24 urah pa so že vse celice v procesu programirane celične smrti, polovica teh pa je že mrtvih.
51
Preglednica 2: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB.
12 h Št. celic % 24 h Št. celic %
kontrola A neg. PI neg. (R1) 16392 92,94% A neg. PI neg. 124 98,41% A poz. PI neg. (R2) 536 3,04% A poz. PI neg. 1 0,79% A poz. PI poz. (R3) 710 4,03% A poz. PI poz. 1 0,79%
A neg. PI neg. (R1) 15045 81,23% A neg. PI neg. 9946 53,58%PgE1-OH 100uM A poz. PI neg. (R2) 1423 7,68% A poz. PI neg. 3932 21,18% A poz. PI poz. (R3) 2053 11,08% A poz. PI poz. 4684 25,23%
kont
rola
12h
kont
rola
24h
stim
ulac
ija 1
2h
stim
ulac
ija 2
4h Mrtve
Apoptotične
Žive
0%
20%
40%
60%
80%
100%
De
lež
ce
lic
Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na liniji MHH-PREB
Slika 18: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB.
Pri celicah MHH-PREB se po 12 urah stimulacije manjši delež živih neapoptotičnih celic (zeleni stolpci)
zmanjša na račun apoptotičnih (rumeni stolpci), po 24 urah pa se poveča število mrtvih celic (rdeči stolpci)
na račun živih apoptotičnih in neapoptotičnih.
Namen tega eksperimenta je bil odkriti, na kakšen način limfociti B po stimulaciji
receptorja EP4 umrejo: po nekrotični ali po apoptotični poti. Primerjava histogramov 1
med kontrolo (slika 16 ) in stimulacijo (slika 15) nazorno prikazuje apoptotično pot smrti.
Okvir R2 na histogramu 1 (slika 15), ki označuje žive apoptotične celice, je v stimuliranih
celicah dobro vidna, kar je neposreden dokaz, da celice umirajo po principu apoptoze.
52
Če primerjamo rezultate obeh celičnih tipov med seboj, ugotovimo, da proces apoptoze pri
celicah RAMOS poteka bistveno hitreje kot pri MHH-PREB. Ta podatek lahko
primerjamo s količino izraženega receptorja EP4, ki smo jo določili v poglavju 4.1.3:
Ekspresija EP4 na RAMOS je približno dvakrat večja od ekspresije na celicah MHH-
PREB. Rezultat, pridobljen v tem poglavju, pa sovpada tudi s podatki, pridobljenimi z
MTS testom v poglavju 4.2.1, kjer smo ugotovili, da se RAMOS bolj odziva na stimulacijo
kot MHH-PREB.
Z rezultati iz tega poglavja tako lahko potrdimo, da se s stimulacijo receptorja EP4 z
agonistom PGE1-OH sproži signalna pot, ki vodi maligen humani limfocit B v
programirano celično smrt.
4.4 PGE1-OH INHIBIRA PROLIFERACIJO V MALIGNIH
LIMFOCITIH B
Z Annexinom V smo dokazali EP4 inducirano apoptozo na celicah RAMOS in MHH-
PREB po stimulaciji s PGE1-OH. Nadalje smo želeli ugotoviti, kaj je vzrok manjši celični
metabolni ativnosti celic, ki jih stimuliramo z nižjimi koncentracijami agonista receptorja
EP4.
4.4.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na celični cikel
malignih imfocitov B
Najprej smo ugotavljali, ali stimulacija EP4 receptorja vpliva na cikel celične delitve in s
tem na proliferacijo malignih celic.
Celični cikel v grobem razdelimo na interfazo (rast in podvojevanje DNA) in mitozo
(delitev). Interfazo pa lahko razdelimo na faze G0, G1, S, in G2. V G0 celica miruje, preden
stopi v proces celične delitve, v katerega stopi s fazo G1. V G1 se prepisujejo mRNA in
posledično proteini, potrebni za podvojevanje DNA − celica raste. Na koncu te faze je “G1
kontrolna točka”, v kateri se preverja, če je vse pripravljeno za podvojevanje DNA, in v
fazi S se DNA podvoji. Nastopi G2 faza, v kateri celica še naprej pridobiva na velikosti,
sintetizira se tudi veliko proteinov, potrebnih za mitozo (mikrotubuli). Na koncu te faze, tik
pred delitvijo, je “G2 kontrolna točka”, v kateri celica preveri, če ima vse potrebno za
vstop v mitotsko delitev.
53
Za ta poskus smo vzeli 6-krat po 4 ml kulture s koncentracijo 1 x 105 celic/ml. Te celice
smo prenesli v ploščico s šestimi vdolbinicami. Naredili smo dve biološki ponovitvi: prvi
dve vdolbinici sta bila kontrolni, v drugi dve smo odpipetirali 0,8 μL DMSO, v tretji dve
pa 0,8 μL PGE1-OH (50mM v DMSO), tako da smo dobili končno koncentracijo PGE1-
OH 10 μM. Ploščico s celicami smo postavili v inkubator, po 24 in 48 urah pa smo vzeli iz
vdolbinic 2 mL kulture, jih obdelali po postopku v poglavju 3.5.3 c) in jih analizirali na
pretočnem citometru.
54
Slika 19: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na potek celične delitve celic RAMOS in MHH-PREB
Na sliki so histogrami, pridobljeni z analizo na pretočnem citometru, ki prikazujejo stimulirane celice
RAMOS (10 μM PGE1-OH) v času 0, 24, 48 ur. Posamezen histogram prikazuje število celic v odvisnosti od
jakosti fluorescence PI. Analizirano celično kulturo lahko razdelimo v štiri skupine, ki predstavljajo faze
celičnega cikla, v kateri se te celice nahajajo: M1 − faza G0/G1, M2 − faza S, M3 − faza G2/M, M4 − faza
sub G0/mrtve celice. V tabeli so podatki o deležih celic v posamezni fazi.
55
Preglednica 3: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS
DMSO PGE1-OH 10uM 0h 24h 48h
G0/G1 37,48 37,82% 41,69 43,63% 34,28 34,74% S 37,61 37,95% 35,79 37,46% 31,46 31,88% G2/M 23,29 23,50% 14,96 15,66% 16,86 17,08% sub G0/mrtve 0,72 0,73% 3,11 3,25% 16,09 16,30%
0h24h
48h
sub G0/mrtveG2/M
S G0/G1
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
del
ež c
elic
Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel linije RAMOS
Slika 20: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS
Iz 3D grafa (slika 20) je razvidno, da se v prvih 24 urah odstotek RAMOS celic z dvojnim
dednim materijalom (G2/M − zeleni stolpci) zmanjša, odstotek mirujočih (G0/G1 − rumeni
stolpci) pa poveča. Sklepamo, da se celice v G2/M fazi normalno razdelijo in obstanejo v
G0/G1 fazi.
V drugih 24 urah se zmanjša delež celic v G0/G1 in S fazi (modri stolpci), poveča pa se
odstotek mrtvih celic (rdeči stolpci). Prav tako sklepamo, da v tem časovnem intervalu
mitoza v celicah, ki so že aktivno v procesu celične delitve, poteče normalno do konca,
potem pa pride do zastoja v G0/G1 fazi. Celice zatem stopijo v cikel apoptoze, saj
stimulacija receptorja EP4 sproži kaskado proapoptotičnih signalov.
56
Preglednica 4: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB
DMSO PGE1-OH 10uM 0 h 24 h 48h G0/G1 43,94 45,17% 47,03 50,14% 35,81 59,41% S 34,74 35,72% 36,19 38,59% 18,14 30,09% G2/M 14,83 15,25% 7,03 7,50% 3,19 5,29% sub G0/mrtve 3,76 3,87% 3,54 3,77% 3,14 5,21%
0h24h
48h
sub G0/mrtveG2/M
S G0/G1
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
del
ež c
elic
Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel linije MHH-PREB
Slika 21: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB
Pri celicah MHH-PREB vidimo podoben, a počasnejši odziv kot pri RAMOS (slika 21).
Tudi tukaj pride do zastoja v fazi G0/G1 (rumeni stolpci) v prvih 24 urah. Ta delež celic se
enakomerno poveča tudi v drugih 24 urah, v nasprotju z RAMOS, kjer ta pade zaradi
indukcije apoptoze. V prvih 48 urah se delež mrtvih celic skoraj ne spremeni.
V tem podpoglavju smo torej pokazali, da 10 μM PGE1-OH kot agonist receptorja EP4
inhibira proliferacijo z zastojem celic v G0/G1 fazi celičnega cikla. Pri celicah RAMOS, ki
ima izraženega več receptorja EP4 kot MHH-PREB, pa v takšni koncentraciji inducira še
apoptozo.
57
4.4.2 Vrednotenje celične proliferacije malignih limfocitov B s postopkom
CFSE CellTrace™
Izraz CFSE se tudi v stroki velikokrat uporablja napačno namesto CFDA-SE, ki je njegov
diacetatni analog. CFDA-SE je namreč nefluorescentno “barvilo”, ki ga uporabljamo pri
tem preizkusu. Z difuzijo prehaja v celice, kjer esteraze odcepijo obe acetatni skupini
(nastane CFSE!) in s tem postane močno fluorescenten. S svojo sukcinimidilno skupino se
kovalentno veže na aminske ostanke v citosolu. Uporablja se večinoma za in vivo
»sledenje« (ang. tracing) obarvanih celic, saj ostane v celici tudi do osem tednov. S celično
delitvijo se količina barvila razpolovi v hčerinski celici, kar povzroči padec fluorescence
hčerinskih celic (glede na materinsko) za polovico. Tako lahko v časovnih intervalih
spremljamo generacije celic ter ugotavljamo hitrost in pogostost delitve (55).
Celice smo stimulirali po postopku 3.5.3 d) in jih analizirali na pretočnem citometru.
Slika 22: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila cfse v celicah RAMOS.
Na sliki vidimo 4 manjše histograme na levi, ki predstavljajo analize meritev na pretočnem citometru v časih
0, 24, 48 in 72 ur. Pod vsakim histogramom je tabela, v kateri je povprečna jakost fluorescence prikazane
populacije označena z rdečim okvirčkom. Na večjem histogramu na desni smo prikazali vse analize skupaj. Z
desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72 ur (vijolična 0 ur, oranžna 72 ur).
Vsak histogram ima na ordinati število celic, na abcisi pa jakost fluorescence za barvilo CFSE.
58
Slika 23: Vsebnost barvila CFSE v nestimuliranih celicah RAMOS
Na sliki vidimo 4 manjše histograme na levi, ki predstavljajo analize meritev na pretočnem citometru v časih
0, 24, 48 in 72 ur. Pod vsakim histogramom je tabela, v kateri je povprečna jakost fluorescence prikazane
populacije označena z rdečim okvirčkom. Na večjem histogramu na desni smo prikazali vse analize skupaj. Z
desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72 ur (vijolična 0 ur, oranžna 72 ur).
Vsak histogram ima na ordinati število celic, na abcisi pa jakost fluorescence za barvilo CFSE.
Slika 24: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila CFSE v celicah MHH-PREB.
Levi histogram prikazuje analizo nestimuliranih celic s pretočnim citometrom, desni pa analizo celic,
stimuliranih z 10 μM PGE1-OH. Z desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72, 96
ur (vijolična 0 ur, oranžna 96 ur). Zadnja meritev 96 ur je izvzeta in označena z M1. Njej smo izmerili
povprečno fluorescenco za primerjavo med stimuliranimi in nestimuliranimi celicami.
59
Preglednica 5: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi celicami
RAMOS in MHH-PREB
RAMOS Kontrola 72h PGE1-OH 72h
Povprečna fluorescenca 40,27 194,65
MHH-PREB Kontrola 96h PGE1-OH 96h
Povprečna fluorescenca 16,435 140,215
Povprečna fluorescenca CFSE v celicah RAMOS
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Kontrola 72h PGE1-OH 72h
Po
vprečn
a fl
uo
resc
enca
Povprečna fluorescenca CFSE v celicah MHH-PREB
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Kontrola 96h PGE1-OH 96h
Po
vprečn
a fl
uo
resc
enca
Slika 25: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi celicami RAMOS
in MHH-PREB
Zaradi enostavnejše statistične primerjave rezultatov celičnih linij med sabo smo se
odločili upoštevati le povprečno fluorescenco iz zadnje meritve (72 ur za RAMOS oz. 96
ur za MHH-PREB). Iz tega podatka lahko izračunamo, kolikokrat so se celice v danem
času razdelile.
Pri celicah RAMOS je v 72 urah pri nestimuliranih celicah fluorescenca padla iz 371 na
40. Če upoštevamo, da pri vsaki celični delitvi povprečna fluorescenca pade na polovico,
lahko izračunamo, da so se nestimulirane celice RAMOS razdelile približno 3-krat (1-krat
na 24h).
Pri nestimuliranih MHH-PREB pa je padla fluorescenca v 96h iz 1500 na 16, kar pomeni,
da so se celice razdelile 6-krat (1-krat na 16 h).
Pri stimuliranih RAMOS je fluorescenca padla v 72h na ~190,. Iz tega izračunamo, da so
se stimulirane RAMOS razdelile samo 1-krat.
Pri MHH-PREB je povprečna fluorescenca padla v 96h iz ~1500 na ~140. Torej so se
stimulirane MHH-PREB razdelile pa 3 do 4-krat (1-krat na 27h).
60
Iz danih podatkov lahko izračunamo, da hitrost ene delitve pri celicah RAMOS pade iz 24h
na 72h, pri MHH-PREB pa iz 16h na 27h.
Tako pridobljeni rezulati potrjujejo spremembe v razporeditvi faz celičnega cikla s PGE1-
OH tretiranih celic, saj zaustavitev celic v fazi G0/G1 po 24h vodi v zmanjšanjo število
celičnih delitev v kasnejših časovnih točkah.
Ti rezultati potrjujejo, da stimulacija receptporja EP4 posreduje inhibitorne učinke na
proliferacijo maligno spremenjenih B limfocitov, kar je posledica regulacije celičnega
cikla in nadaljne indukcije apoptoze.
61
5 SKLEP
Z izhodiščem, da stimulacija receptorja EP4 na mišjh malignih nezrelih limfocitih
povzroča apoptozo in inhibicijo proliferacije, smo v tej diplomski nalogi želeli ugotoviti ali
velja podobno tudi za humane maligne celice B. Namen je bil določiti kje in v kakšni meri
celice humanih modelnih linij limfocitov B izražajo receptor EP4 in ali stimulacija
receptorja EP4 vodi v zastoj celične rasti in apoptozo. Preizkuse smo zasnovali na
nesmrtnih oz. malignih celičnih linijah limfocitov B v različnih stopnjah zrelosti.
Prvi del diplome obsega molekularno-imunološki aspekt te naloge. Naprej smo s tremi
vrstami protiteles proti različnim epitopom receptorja EP4 celice analizirali s pretočno
citometrijo in fluorescenčno mikroskopijo. Potrdili smo, da celice vseh linij izražajo iskani
receptor. Nejasnosti so se pojavile pri lokalizaciji receptorja, kar pa bo predmet nadaljnih
razskav.
Drugi del naloge vsebuje farmakološko preverjanje odziva celic na stimulacijo receptorja
EP4 s specifičnim agonistom PGE1-OH. S testom za oceno metabolne aktivnosti celic
(MTS) smo ugotovili, da so celice, odvisno od koncetracije agonista, po stimulaciji
receptorja EP4 metabolno manj aktivne oz. mrtve. V naslednjem koraku smo ugotavljali,
za katero vrsto celične smrti gre. Z Annexinom V smo nedvoumno potrdili programirano
celično smrt na preiskovanih celicah RAMOS in MHH-PREB. Hipotezo, da je za
inhibicijo proliferacije humanih celic odgovorna stimulacija receptorja EP4, smo potrdili z
rezultati iz analize celičnega cikla. Ti potrjujejo zastoj stimuliranih celic v fazi G0/G1.
Dognanja smo podkrepili še s testom za vrednotenje celične proliferacije z barvilom CFSE,
s katerim smo ugotovili upočasnjeno delitev stimuliranih celic.
EP4 receptor so že označili kot tarčo zdravljenja B-celičnega limfoma. Jasno je, da bi
ciljanje EP4 receptorja zaradi lahke dostopnosti na površini celic B lahko predstavljalo
klinično uporabno alternativo ali dodatek h kemoterapiji pri zdravljenju B-celičnega
limfoma.
Določitev vloge Ptger4 pri nezrelih limfocitih B bi omogočilo boljše poznavanje razlik
med zrelimi in nezrelimi limfociti B, kar bi odprlo nove poti pri iskanju terapij in
terapevtikov za zdravljenje avtoimunskih bolezni, imunskih pomankljivosti in malignih
stanj imunskega sistema.
62
6 LITERATURA
1. Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 2007 Jun 1;35(4):495 -516.
2. Hunot S, Flavell RA. APOPTOSIS: Death of a Monopoly? Science. 2001 May
4;292(5518):865-866. 3. Fischer U, Schulze-Osthoff K. New Approaches and Therapeutics Targeting Apoptosis
in Disease. Pharmacological Reviews. 2005 Jun;57(2):187-215. 4. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000 Oct 12;407(6805):770-
776. 5. Stenson-Cox C, FitzGerald U, Samali A. In the cut and thrust of apoptosis, serine
proteases come of age. Biochemical Pharmacology. 2003 Oct 15;66(8):1469-1474. 6. LeBien TW, Tedder TF. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 2008
Sep 1;112(5):1570-1580. 7. Abbas KA, Lichtman HA, Cellular and Molecular Immunology. 5.izdaja, Saunders. 5.
ed. 8. Kuppers R. Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis. Nat Rev Cancer. 2005
Apr;5(4):251-262. 9. Testa U, Riccioni R. Deregulation of apoptosis in acute myeloid leukemia.
Haematologica. 2007 Jan 1;92(1):81-94. 10. Osorio LM, Aguilar-Santelises M. Apoptosis in B-chronic lymphocytic leukaemia.
Med Oncol. 1998 12;15(4):234-240. 11. Nicholas Chiorazzi, M.D., Kanti R. Rai, M.B., B.S. and Manlio Ferrarini, M.D.
Chronic Lymphocytic Leukemia [Internet]. [cited 2010 Aug 14];Available from: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra041720
12. Acute lymphoblastic leukaemia; Pui et al. The Lancet, Volume 371, Issue 9617, Pages
1030 - 1043, 22 March 2008 13. Murn J, Alibert O, Wu N, Tendil S, Gidrol X. Prostaglandin E2 regulates B cell
proliferation through a candidate tumor suppressor, Ptger4. Journal of Experimental Medicine. 2008;205(13):3091.
14. Myc - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Aug 26];Available
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Myc 15. Thorley-Lawson DA, Allday MJ. The curious case of the tumour virus: 50 years of
Burkitt's lymphoma. Nat Rev Micro. 2008 Dec;6(12):913-924.
63
16. A Biologic Definition of Burkitt's Lymphoma from Transcriptional and Genomic Profiling [Internet]. [cited 2010 Aug 25];Available from: http://www.contentnejmorg.zuom.info/cgi/content/abstract/354/23/2419
17. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, Caligaris-Cappio F, Dighiero G, Dohner H, et al.
Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2008 Jun 15;111(12):5446-5456.
18. Hagop Kantarjian, M.D., Charles Sawyers, M.D., Andreas Hochhaus, M.D., Francois
Guilhot, M.D., Charles Schiffer, M.D., Carlo Gambacorti-Passerini, M.D., Dietger Niederwieser, M.D., Debra Resta, R.N., Renaud Capdeville, M.D., Ulrike Zoellner, M.Sc., Moshe Talpaz, M.D. and Brian Druker, M.D. for the International STI571 CML Study Group. Hematologic and Cytogenetic Responses to Imatinib Mesylate in Chronic Myelogenous Leukemia [Internet]. [cited 2010 Aug 14];Available from: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa011573
19. Coiffier B, Lepretre S, Pedersen LM, Gadeberg O, Fredriksen H, van Oers MHJ, et al.
Safety and efficacy of ofatumumab, a fully human monoclonal anti-CD20 antibody, in patients with relapsed or refractory B-cell chronic lymphocytic leukemia: a phase 1-2 study. Blood. 2008 Feb 1;111(3):1094-1100.
20. Stein R, Mattes MJ, Cardillo TM, Hansen HJ, Chang C, Burton J, et al. CD74: A New
Candidate Target for the Immunotherapy of B-Cell Neoplasms. Clinical Cancer Research. 2007;13(18):5556s-5563s.
21. Fischer U, Schulze-Osthoff K. Apoptosis-based therapies and drug targets. Cell Death
Differ. 2005 Jan 21;12(S1):942-961. 22. Regan JW. EP2 and EP4 prostanoid receptor signaling. Life sciences. 2003;74(2-
3):143–153. 23. Dey I, Lejeune M, Chadee K. Prostaglandin E2 receptor distribution and function in
the gastrointestinal tract. British journal of pharmacology. 2006;149(6):611–623. 24. Bastepe M, Ashby B. Identification of a region of the C-terminal domain involved in
short-term desensitization of the prostaglandin EP4 receptor. British journal of pharmacology. 1999;126(1):365.
25. Fedyk ER, Phipps RP. Prostaglandin E2 receptors of the EP2 and EP4 subtypes
regulate activation and differentiation of mouse B lymphocytes to IgE-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996 Oct 1;93(20):10978 -10983.
26. Arakawa T, Laneuville O, Miller CA, Lakkides KM, Wingerd BA, DeWitt DL, et al.
Prostanoid Receptors of Murine NIH 3T3 and RAW 264.7 Cells. Journal of Biological Chemistry. 1996 Nov 22;271(47):29569 -29575.
27. Kitamura. Combined effects of prostaglandin E receptor subtype EP1 and subtype EP4
antagonists on intestinal tumorigenesis in adenomatous polyposis coli gene knockout
64
mice - Kitamura - 2005 - Cancer Science - Wiley Online Library [Internet]. [cited 2010 Sep 2];Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2003.tb01492.x/pdf
28. Hoshino T, Tsutsumi S, Tomisato W, Hwang H, Tsuchiya T, Mizushima T.
Prostaglandin E2 Protects Gastric Mucosal Cells from Apoptosis via EP2 and EP4 Receptor Activation. Journal of Biological Chemistry. 2003 Apr 11;278(15):12752 -12758.
29. Kabashima K, Saji T, Murata T, Nagamachi M, Matsuoka T, Segi E, et al. The
prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis, mucosal damage and CD4 cell activation in the gut. J. Clin. Invest. 2002 4;109(7):883-893.
30. Akira Ushio, Yasuhiro Takikawa. Induction of Bcl-xL is a possible mechanism of anti-
apoptotic effect by prostaglandin E2 EP4-receptor agonist in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells; Ushio A, Takikawa Y, Lin SD, Miyamoto Y, Suzuki K.; Hepatology Research: The Official Journal of the Japan Society of Hepatology
31. Martineau LC, McVeigh LI, Jasmin BJ, Kennedy CRJ. p38 MAP kinase mediates
mechanically induced COX-2 and PG EP4 receptor expression in podocytes: implications for the actin cytoskeleton. Am J Physiol Renal Physiol. 2004 Apr 1;286(4):F693-701.
32. Higaki S, Gebhardt BM, Lukiw WJ, Thompson HW, Hill JM. Effect of
Immunosuppression on Gene Expression in the HSV-1 Latently Infected Mouse Trigeminal Ganglion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002 Jun 1;43(6):1862-1869.
33. Bradbury D, Clarke D, Seedhouse C, Corbett L, Stocks J, Knox A. Vascular
Endothelial Growth Factor Induction by Prostaglandin E2 in Human Airway Smooth Muscle Cells Is Mediated by E Prostanoid EP2/EP4 Receptors and SP-1 Transcription Factor Binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 2005;280(34):29993 -30000.
34. Miyaura C, Inada M, Suzawa T, Sugimoto Y, Ushikubi F, Ichikawa A, et al. Impaired
Bone Resorption to Prostaglandin E2 in Prostaglandin E Receptor EP4-knockout Mice. Journal of Biological Chemistry. 2000 Jun 30;275(26):19819 -19823.
35. Kobayashi Y, Mizoguchi T, Take I, Kurihara S, Udagawa N, Takahashi N.
Prostaglandin E2 Enhances Osteoclastic Differentiation of Precursor Cells through Protein Kinase A-dependent Phosphorylation of TAK1. Journal of Biological Chemistry. 2005 Mar 25;280(12):11395 -11403.
36. McCoy JM, Wicks JR, Audoly LP. The role of prostaglandin E2 receptors in the
pathogenesis of rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 2002 9;110(5):651-658. 37. Nguyen M, Camenisch T, Snouwaert JN, Hicks E, Coffman TM, Anderson PAW, et
al. The prostaglandin receptor EP4 triggers remodelling of the cardiovascular system at birth. Nature. 1997 Nov 6;390(6655):78-81.
38. Nataraj C, Thomas DW, Tilley SL, Nguyen M, Mannon R, Koller BH, et al. Receptors
65
for prostaglandin E2 that regulate cellular immune responses in the mouse. J. Clin. Invest. 2001 10;108(8):1229-1235.
39. Roper R, Brown D, Phipps R. Prostaglandin E2 promotes B lymphocyte Ig isotype
switching to IgE. J Immunol. 1995 Jan 1;154(1):162-170. 40. The utilization of recombinant prostanoid receptors to determine the affinities and
selectivities of prostaglandins and related analogs. 41. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation
and immune modulation; Pharmacology & Therapeutics Volume 103, Issue 2, August 2004, Pages 147-166; Aaron N. Hata and Richard M. Breyer
42. Tanaka M, Sakai A, Uchida S, Tanaka S, Nagashima M, Katayama T, et al.
Prostaglandin E2 receptor (EP4) selective agonist (ONO-4819.CD) accelerates bone repair of femoral cortex after drill-hole injury associated with local upregulation of bone turnover in mature rats. Bone. 2004 Jun;34(6):940-948.
43. Kabashima K, Saji T, Murata T, Nagamachi M, Matsuoka T, Segi E, et al. The
prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis, mucosal damage and CD4 cell activation in the gut. J. Clin. Invest. 2002 4;109(7):883-893.
44. Rao R, Redha R, Macias-Perez I, Su Y, Hao C, Zent R, et al. Prostaglandin E2-EP4
Receptor Promotes Endothelial Cell Migration via ERK Activation and Angiogenesis in Vivo. Journal of Biological Chemistry. 2007 Jun 8;282(23):16959 -16968.
45. Clark P, Rowland SE, Denis D, Mathieu M, Stocco R, Poirier H, et al. MF498 [N-{[4-
(5,9-Diethoxy-6-oxo-6,8-dihydro-7H-pyrrolo[3,4-g]quinolin-7-yl)-3-methylbenzyl]sulfonyl}-2-(2-methoxyphenyl)acetamide], a Selective E Prostanoid Receptor 4 Antagonist, Relieves Joint Inflammation and Pain in Rodent Models of Rheumatoid and Osteoarthritis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2008 May 1;325(2):425 -434.
46. Ma X, Kundu N, Rifat S, Walser T, Fulton AM. Prostaglandin E Receptor EP4
Antagonism Inhibits Breast Cancer Metastasis. Cancer Research. 2006 Mar 15;66(6):2923-2927.
47. Prostaglandin E receptor EP4 antagonist suppresses osteolysis due to bone metastasis
of mouse malignant melanoma cells; FEBS Letters 2007 Feb 6;581(3):565-71.; Takita M, Inada M, Maruyama T, Miyaura C.
48. DSMZ [Internet]. [cited 2010 Aug 17];Available from:
http://www.dsmz.de/plant_cell_lines/main.php?menu_id=2 49. Hayflick limit - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Sep
1];Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Hayflick_limit 50. Telomerase - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Sep 1];Available
66
from: http://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase 51. Lichtman JW, Conchello J. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2005 Dec;2(12):910-
919. 52. Lichtman JW, Conchello J. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2005 Dec;2(12):910-
919. 53. Flow-Cytometry.pdf (Predmet application/pdf) [Internet]. [cited 2010 Aug
16];Available from: http://www.abdserotec.com/uploads/Flow-Cytometry.pdf 54. Cellcycle PI/RNAse staining buffer [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available from:
http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/cell_bio/live/web_enabled/80571E_550825.pdf
55. CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available
from: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34554.pdf 56. Dey I, Lejeune M, Chadee K. Prostaglandin E2 receptor distribution and function in
the gastrointestinal tract. British journal of pharmacology. 2006;149(6):611–623. 57. Hollingsworth MA, Swanson BJ. Mucins in cancer: protection and control of the cell
surface. Nat Rev Cancer. 2004 Jan;4(1):45-60. 58. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit II [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available
from: http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/cell_bio/live/web_enabled/6710KK_556570.pdf
67
7 PRILOGE
Slika 26: Ekspresija receptorja EP4 na celicah RAMOS
Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih
protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).
Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os).
Detektor (FL-1) smo nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost
fluorescence od 10. Torej smatramo vse celice z večjo jakostjo fluorescence od 10, da so receptor EP4 –
pozitivne (desno od navpične črte).
Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete
protitelesa do epitopa.
68
Slika 27: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB (primarno protitelo Ab
Imgenex).
Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih
protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).
Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os).
Detektor (FL-1) smo nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost
fluorescence od 10. Torej smatramo vse celice z večjo jakostjo fluorescence od 10, da so receptor EP4 –
pozitivne (desno od navpične črte)
Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete
protitelesa do epitopa.
69
Slika 28: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB (primarno protitelo Ab
Cayman).
Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih
protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).
Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os).
Detektor (FL-1) smo nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost
fluorescence od 10. Torej smatramo vse celice z večjo jakostjo fluorescence od 10, da so receptor EP4 –
pozitivne (desno od navpične črte).
Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete
protitelesa do epitopa.
70
Slika 29: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB (primarno protitelo Ab
Santa Cruz).
Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih
protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).
Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os).
Detektor (FL-1) smo nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost
fluorescence od 10. Torej smatramo vse celice z večjo jakostjo fluorescence od 10, da so receptor EP4 –
pozitivne (desno od navpične črte).
Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete
protitelesa do epitopa.
71
Slika 30: Metabolna aktivnost celic NALM-6, KOPN-8 in SU-DHL stimuliranih s PGE1-OH.
Stolpci prestavljajo celično metabolno aktivnost, normalizirano na kontrolo nestimuliranih celic v času 24, 48
in 72 ur.
72
Nefiksirane Fiksirane Permeabilizirane
Slika 31: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega krvodajalca (CD19+).
A - Ab Imgenex; B – Ab Cayman;
1 – nefiksirane celice; 2 – fiksirane celice; 3 – permeabilizirane celice
Slika prikazuje rezultate iz pretočnega citometra. Na celicah smo istočasno označili receptor EP4 ter CD19.
Na histogramih so po postopku opisanem pod sliko 11 izvzete že vse CD19-pozitivne celice. Vse celice
desno od navpične črte pozitivne za EP4 receptor. Te predstavljajo torej populacijo nemalignih limfocitov B
(CD19+), ki izražajo recptor EP4. V tabeli pod histogramom je z rdečim okvirčkom označena povprečna
fluorescenca EP4-pozitivne populcije limfocitov B.
Histogram A1 je že predstavljen na sliki 11 kot histogram 3A.
73
Slika 32: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS (24h).
Na histogramu A1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne (R4). Pri
vrednosti fluorescnce za Annexin V = 500 določimo navpično mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih
neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (B1), kjer ta meja ni jasna. Na histogramu
B1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R4 + R5) in PI pozitivne oz. mrtve zgoraj
(R6). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 600. Za točno število mrtvih oz. PI-
negativnih celic prenesemo mejo na histogram B3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z
rdečim okvirčkom). Žive oz. PI-negativne celice na histogramu B1 (R4 in R5) pa razdelimo na Annexin V
negativne in pozitivne. Za točno število Annexin V pozitivnih in PI negativnih zajamemo na histogramu B2
vse Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na
histogramu B3.
74
Slika 33: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (12h).
Na histogramu A1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne (R1). Pri
vrednosti fluorescnce za Annexin V = 700 določimo navpično mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih
neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (B1), kjer ta meja ni jasna. Na histogramu
B1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R1 + R2) in PI pozitivne oz. mrtve zgoraj
(R3). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 300. Za točno število mrtvih oz. PI-
negativnih celic prenesemo mejo na histogram B3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z
rdečim okvirčkom). Žive oz. PI-negativne celice na histogramu B1 (R1 in R2) pa razdelimo na Annexin V
negativne in pozitivne. Za točno število Annexin V pozitivnih in PI negativnih zajamemo na histogramu B2
vse Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na
histogramu B3.
75
Slika 34: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (24h).
Na histogramu A1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne (R4). Pri
vrednosti fluorescnce za Annexin V = 700 določimo navpično mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih
neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (B1), kjer ta meja ni jasna. Na histogramu
B1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R4 + R5) in PI pozitivne oz. mrtve zgoraj
(R6). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 120. Za točno število mrtvih oz. PI-
negativnih celic prenesemo mejo na histogram B3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z
rdečim okvirčkom). Žive oz. PI-negativne celice na histogramu B1 (R4 in R5) pa razdelimo na Annexin V
negativne in pozitivne. Za točno število Annexin V pozitivnih in PI negativnih zajamemo na histogramu B2
vse Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na
histogramu B3.
76