Molekulare Diagnostik
1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Das humane GenomDas humane Genom
protein coding &non-protein coding
satellites and single repeats
mob
ile (t
rans
posa
ble)
DNA
ele
men
ts
Alle Genome sind individuell, selbst jene eineiiger Zwillinge!
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Variationen im humanen GenomVariationen im humanen Genom• Einzelpunktmutationen (SNPs or SNVs, single nucleotide polymorphisms/variants)
synonyme (neutrale) oder nicht-synonyme (funktionelle)
• Indelskurze Insertionen oder Deletionen
• Duplikationen oder Inversionen
• Strukturelle VariationenGrößere Insertionen (z.B. Retrovirus), Deletionen, Inversionen oder Duplikationen (>100-1000bp)
• Mobile DNA elemente (Transposone)„Springen“ im Genome, machen 45% des Genoms aus
• Kurze repetitive Elemente (Satelliten DNA oder variable number tandem repeat(VNTR))6-7% des humanen Genoms
Führen oft zu CNVs
(copy-numbervariations)
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3Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
SNP-Genotypisierung
Single nucleotide polymorphisms (SNPs):
•99,5% der DNA Sequenzen aller Menschen sind ident•20% der verbleibenden 0,5% entsprechen SNPs •SNP nennt man den Austausch einer einzelnen Base:
Bsp.: GCCCCT wird zu GACCCT•SNP kommt etwa alle 1000 bp im Genom vor•Damit gibt es etwa 1-3 Millionen potentielle SNPs•The SNP consortium (TSC): Zusammenschluss von Pharma und Akademie um so viel wie möglich SNPs zu identifizieren•Öffentlich zugänglich in dbSNP•>12 Millionen sind bereits identifiziert
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4Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Vererbung von SNP• Meist nicht als einzelne SNPs sondern als Blöcke
(benachbarte SNPs) vererbt
• Blöcke bezeichnet man als Haplotyp
• Haplotyp Blöcke werden über Generationen ohne Rekombination weitervererbt (Stammbaumnachweis,Evolutionsnachweis, Populationsstudien)
• Sprich, auch wenn ein Block viele SNPs enthält, reicht die Identifizierung einiger SNPs um Haplotyp zu identifizieren
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Verbreitete Krankheiten und dazugehörende SNPs
• Die meisten Krankheiten werden nicht von einzelnen SNPs hervorgerufen, sondern durch komplexe Interaktionen mehrerer Gene, Umweltfaktoren und Lebensstil.
• Zusammenhänge zwischen Krankheit und SNPs bzw. Haplotypen werden immer wichtiger für Diagnose.
• Umso mehr Krankheiten bestimmten SNPs/Haplotypen zugeordnet werden können, umso einfacher wird ihre Diagnose.
• Diagnose durch Analyse spezifischer SNP-Muster
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SNP-abhängiger Response • Mensch und Tier:
-Medikamente führen zum gewünschten Erfolg: Heilung, Repression, Linderung (benefitial drug response)
-Medikamente führen zu keiner Besserung oder überhaupt zum Tod (adverse drug respsponse)
• Pflanzen: genet. Manipulation von/durch SNPs könnte Erntertrag erhöhen
Vorteil: Reduktion von Herbiziden, Insektiziden, Kunstdünger• Bakterien/Viren: SNPs verursachen Medikamentenresistenz
(Krankenhauskeime!!!)HIV ist schwer zu behandeln, weil Mutationsfrequenz des Virus in den SNPs sehr hoch
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Diagnose von SNPs
• Allel-spezifische (Oligonukleotid) Hybridisierung
• Allel-spezifische Oligonukleotid Ligation
• Primer Verlängerung
• Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente
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Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)
Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA Moleküle, die in einer Base variieren, mittels Hybridisierung.
Floureszenz markierte PCR Produkte werden zu immobilisierten Oligonukleotiden (=SNP Sequenzen) gegeben. Hybridisierung erfolgt extrem stringent (was nicht exakt bindet wird weggewaschen). Hinterher wird die Intensität der Floureszenz gemessen.
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9Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)
Zugabe floureszenzmarkierter PCR Produkte zu immobilisiertenOligos (oder umgekehrt), Bindung sehr stringent.
Dot-blot:
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SNP-chips zur parallelen Detektion tausender SNPs
Beinhaltet 1,8 Mill Marker für genetische Variationen (~900.000 SNPs)
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Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation
• Es werden Oligos designt, die komplementär zur Zielsequenz (zu untersuchende Sequenz, durch PCR hergestellt) sind.
• Am 5´oder 3´Ende dieses Oligos befindet sich die allelspezifische Base
• Liegt ein SNP vor:Oligonukleotid ligiert nicht an Zielsequenz
• Liegt kein SNP vor:Oligonukleotid ligiert an Zeilsequenz
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Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation
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Primer extension
• Das zu untersuchende Gen wird wiederum mittels PCR amplifiziert• Daraufhin folgt eine Einzelbasen-Erweiterung via Terminatoren
(Didesoxynukleotide, verhindert weiteren Anbau von Basen)• Ob Erweiterung erfolgte, kann mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF)
gemessen werden
+ddNTPs
Sonde:
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Sequenzierung gewisser DNA-Fragmente
• Das Sequenzieren ist meist die Untersuchungsmethode der Wahl bei SNPs
• Zwei Möglichkeiten der Primer Verlängerung:a) dye-Primers und unmarkierte Terminatoren b) Unmarkierte Primer und dye-Terminatoren
Die Produkte der Reaktion werden dann mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt.
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Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente
• 1. Sequenz: WT homozygot
• 2. Sequenz: SNP homozygot
• 3. Sequenz: 1 Allel mit SNP, 1 Allel ohne Mutation
Sequenz zeigt typischen Haplotyp, gleich mehrere SNPs als Block nebeneinander!!
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Copy-number variations (CNVs)
• Deletionen oder Duplikationen (1kbp – xMbp)• Verursacht durch Replikationsfehler und Transposone • 12% des humanen Genoms sind CNVs• Wirken meist evolutorisch positiv, aber:• Assoziiert mit Krankheiten
– Krebs (Bsp: Lungenkrebs (EGF Rezeptor))– Autismus– Schizophrenie– ...
• Detektionsmöglichkeiten:– FISH (Fluorescent in situ-hybridization)– Array-CGH (comparative genomic hybridisation)– Direktes Sequenzieren– MPLA-Analyse
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17Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
MLPA Analyse(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
• Multiplexmethode zur CNV-Detektion• Bis zu 50 Zielsequenzen können gleichzeitig
untersucht werden (Stuffer sequence Unterschiedlich lange Amplicons)
• Auftrennung mittels Kapillarelektrophorese (Fluoreszenzmarkierter Primer)
• Semi-quantitative Auswertung durch Vergleich zu Kontroll-DNA
• Auch zur Analyse von Aneuploidie (z.B.: Trisomie)
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18Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
DNA-Fingerprint(DNA Profiling, DNA test)
Dient dazu Individuen genetisch zu unterscheidenDazu verwendet man genetischen Polymorphismus (Bsp. Blutgruppen-Polymorphismus/Landsteiner).
Verfahren erzeugt für das Genom eines Individuums spezifisches DNA-Fragmentmuster. Diese Muster bezeichnet man als:
genetischer Fingerabdruck
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19Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Verwendung der Fingerprints• Vaterschaftstest (allg. Abstammungsverhältnisse)
50-100ng DNA reichen aus 1-2 µl Blutaus Spuren von Samenflüssigkeitaus Haarwurzel(n)
• Forensische Analysen• Diagnostik von Gendefekten• Reinheitsüberwachung von Zelllinien• Identifizierung von Spender und Empfängerzellen bei
Knochenmarkstransplantationen• Eiigkeitsbestimmung von Zwillingen
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20Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
DNA-FingerprintEs gibt drei Methoden genetischer Fingerprints:• RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus)• VNTRPs (Variable number of tandem repeats polymorphismus)• STRPs (Short tandem repeats polymorphismus)
Verwendete Methoden zur Bandenvisualisierung:• PCR gefolgt von Gelelektrophorese• Southern Blot
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21Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
• spezielle Klasse von DNA-Sequenz Polymorphismen• lokal auftretende DNA-Sequenzveränderungen durch:
einzelne BasenaustauscheDNA UmlagerungenDNA InsertionenDNA Deletionen
• RFLP, wenn durch Basenaustausch die Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease betroffen ist
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22Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
RFLP verursacht
• Auftreten oder Verschwinden von Schnittstellen• Schneiden der genomischen DNA führt also zu:
verkürzten DNA-Fragmentenverlängerten DNA-Fragmenten
• Veränderung des Fragmentmusters der geschnittenen genom. DNA nach Gelelektrophorese
• Verwendbar als genetische Marker (Vererbung nach Mendel), da sie co-dominant sind
• Heterozygote Individuen besitzen das mutierte (RFLP) und das normale Gen
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23Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
RFLP Analyse mittels PCR & Restriktionsverdau
• Die Allele A und B unterscheiden sich in der Schnittstelle T. Mittels PCR wird DNA amplifiziert und dann mit einem Enzym geschnitten (bei T).
• Bei Individuen AA gibt es keine Restriktionsschnittstelle
• Bei Individuen AB trägt ein Allel die Schnittstelle T, das andere nicht.
• Bei Individuen BB tragen beide Allele die Schnittstelle T.
• Menge an DNA entsprechend!!!
B1
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24Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
VNTRPs (Variable-number-of-tandem-repeats polymorphisms)
• Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viel tandemartig wiederholte Sequnzen (10-100 Nukleotide, Minisatelliten); ca. 50 Wiederholungen
• z.B. kommt bestimmte Nukleotidfolge bei einem Individuum 15, beim anderen 22-mal vor
• Führt zu unterschiedlichen Sequenzlängen zwischen homologen Regionen
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25Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
Entstehung von Satelliten DNA
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26Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
VNTRPs Analyse mittels PCR
a.) DNA mit unterschiedlich vielen Tandemrepeats
b.) PCR mittels individuell gesetzter Primer
c.) Gelelektrophorese liefert unterschiedlich lange DNA Fragmente aufgrund der unterschiedlich vielen repetitiven Sequenzen
Vorteil: durch PCR wird DNA angereichert. Schneiden der DNA ist nicht nötig!!!
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27Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
STRPs (Short tandem repeats Polymorphisms)
Verschiedene Individuen einer Population besitzen an bestimmten Stellen im Genom unterschiedlich viele tandemartig wiederholte Mikrosatelliten:
Wiederholungen 2-10 bp (gatagatagatagatagatagata)(vgl. VNTRPs 10-100 bp, Minisatelliten)
Bzgl. dieser STRPs sind so gut wie alle Individuen einer Population heterozygot und daher untereinander verschieden. Wird daher für kommerzielle Tests verwendet.
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28Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch
DNA Fingerprint mittels VNTRPs-Vaterschaftstest
• Abb. zeigt Vaterschaftstest. Die Pfleile zeigen an, wo sich das Profil des Kindes von jenem des V2 unterscheidet, damit kommt V2 nicht als Vater in Frage.
• Technik: DNA der Probanden wird mit Enzymen geschnitten, auf Agarosegel aufgetrennt, auf Trägerfolie geblottet und mittels spezifischer radioaktiv markierter Sonde(n) hybridisiert und sichtbar gemacht. Nicht radioaktiv nicht möglich, da viel zu viele Fragmente vorhanden sein würden (Überlappung).