Boletín de la Sociedad Argentina de Botánica

Volumen XVIII, N9 3-4 (Enero 1979), págs. 101-107

EFECTOS DE LA SACAROSA Y LA SORBITA SOBRELA COMPOSICION Y ACTIVIDAD DE PEROXIDASAS

EN LOS COLEOPTILOS DE TRIGO 1

POR GLORIA M. DE LUCA d’ORO y CARLOS A. GUZMAN 2

ABSTRACT

Peroxidase activity and molecular composition variations were studied in wheatcoleoptyles which had been treated for twelve hours with different sorbitol andsucrose concentrations. From 5 X 101 M solutions on, changes occurred both inthe electrophoretic patterns, with bands decreasing in number and in activity, whichshowed a marked reduction.

It is concluded that, these changes were caused by water potential modifica¬tions and by sorbitol and sucrose molecular influence.

INTRODUCCION

El propósito de este trabajo fue analizar la manera que un azúcary un azúcar alcohol exógenos, sacarosa y sorbita, respectivamente, influ¬yen en la composición y actividad de las peroxidasas en un órganono fotosintetizante, cual es el coleóptilo de trigo.

La sacarosa constituye la mayor reserva de carbohidratos de lasplantas superiores y es el más importante dentro de los disacáridos noreductores. La sorbita, que estructuralmente deriva de la reducciónde la fructosa, es el alcohol azucarado más comúnmente encontrado enlos vegetales y procede únicamente de las plantas. Los alcoholes delos azúcares son muy semejantes en sus solubilidades a los hidratos decarbono, pero desaparecen en ellos todas las propiedades condicionadaspor la presencia del grupo carbonilo, por lo que su estabilidad esmayor y su química más sencilla. (Klages, 1968; Davies, 1969.)

1 Trabajo realizado en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultadde Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba.

2 Miembro de la Carrera del Investigador, Consejo Nacional de Investiga¬ciones Científicas y Técnicas, Buenos Aires.

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Las peroxidasas son enzimas ferroporfirínicas que catalizan laoxidación de una amplia variedad de compuestos para lo cual requie¬ren un dador de oxígeno y un dador de hidrógeno, mostrando distintasactividades con diferentes dadores de hidrógeno. (Mann, 1931.)

Las peroxidasas de las plantas están caracterizadas por una grancantidad de formas moleculares (isoenzimas) separables, entre otrosmétodos, por electroforesis. El estudio de las isoenzimas ha podidodemostrar que existen bandas comunes a todos los órganos de las plan¬tas y bandas características, asignándole a estas últimas un papel fisio¬lógico específico. (Wise y Morrinson, 1971.)

El importante papel que desempeñan las peroxidasas en los pro¬cesos de oxidación de la$ plantas ha sido ampliamente investigado.Estudios sobre la ontogenia han podido demostrar una profunda modi¬ficación en los modelos electroforéticos y en la actividad de peroxidasasdurante los procesos de diferenciación y desarrollo. (Verma y vanHuystee, 1970; Evans y Alldridge, 1965; Shannon, 1968; Siegel y Gals-ton, 1967; Alvarez, 1968; Conklin y Smith, 1971.) Las mismas varia¬ciones se han podido comprobar con distintos regímenes hídricos.(Stafford, 1974.)

MATERIAL Y METODOS

Se usaron cariopses de Triticum aestivum L. cultivar “Oncativo”que, previo lavado, fueron sometidos a imbibición durante 15 min.La operación se realizó en recipientes de plástico sobre una rejilla delmismo material y con agua destilada. Las semillas germinaron en oscu¬ridad y a 22° C ± 2o C. Cuando los coleóptilos alcanzaron una longi¬tud de 3 cm fueron cortados y colocados de inmediato en agua desti¬lada; luego fueron lavados dos veces con agua estéril y colocados enfrascos con distintas concentraciones de sorbita y sacarosa; 1 X 10‘4,1 X 10"3, 1 X 10'2, 1 X 10"\ 5 X 10 1 y 1 M y utilizando como testigoagua destilada. Estas soluciones fueron previamente esterilizadas du¬rante 30 min a 120° C. El material fue mantenido en la oscuridaddurante 12 hs y posteriormente homogeneizado en un mortero en unbaño de hielo con buffer de fosfato 0,067 M, pH 7 y arena lavada.El homogeneizado fue centrifugado a 3.000 X g durante 15 min. Conlos sobrenadantes se hicieron diluciones convenientes para la mediciónde proteínas y actividad enzimática. Para realizar la separación elec-troforética los extractos fueron sembrados sin diluir.

1. Actividad enzimática

Para la determinación de l;j actividad enzimática se midieron loscambios de D. O. durante 2 min a 485 nm en un espectrofotómetroBeckman modelo D U-2; la mezcla de reacción fue: 2 mi de muestra,1 mi de buffer de fosfato 0,067 M, pH 7, 0,3 mi de agua bidestilada,

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SORBITA SACAROSA

Fig. 1. — Modelo electroforético de peroxidasas de coleóptilos de trigo tratadoscon distintas concentraciones de sorbita y sacarosa, a: testigo, b: 1 X 10 4 M;c: 1 X 10-3 M; d: 1 X 10'2 M; e: 1 X 10’1 M; f: 5'X 10"1 M; g: 1 M. Elrevelado de las diferentes formas moleculares se realizó utilizando peróxidode hidrógeno y bencidina como dadores de oxígeno e hidrógeno respectiva¬mente. Los resultados son el promedio de seis determinaciones de corridasno simultáneas.

0,1 mi de peróxido de hidrógeno 3 X 10“3 M y 0,1 mi de p-fenilen-diamina 1%. (Luck, 1965). La actividad específica se expresó comoabsorbencia X min'1 X mg prof1. Las proteínas fueron determinadassegún Kalckar ( 1947 ).

2. Composición enzimática

En corridas no simultáneas, la separación de isoperoxidasas seefectuó por electroforesis vertical en soporte de gel de almidón usandoen las cubetas buffer de borato 0,3 M, pH 8,6. Se aplicó al gel unacorriente de 18 voltios cm'1 durante 8 hs a 4o C según técnica deSmithies (1955). El revelado de las isoenzimas de peroxidasas se reali¬zó sobre las mitades cortadas de los geles, utilizando como mezclade reacción: 20 mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 4,6; 20 mi deperóxido de hidrógeno 0,1 M y 10 mi de bencidina 0,01 M en soluciónhidroalcohólica al 50%. (Isaac y Winch, 1947), utilizando buffer deacetato en lugar de fosfato. Luego de revelado el gel fue lavado

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4-- Sacarosa

— Sorbita•--o

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Concentración en MolesFig. 2. — Curva de actividad de peroxidasas en coleóptilos de trigo tratados con

distintas concentraciones de sorbita y sacarosa. La misma fue llevada a caboutilizando p-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno como dadores de hidró¬geno y oxígeno respectivamente. Los resultados son el promedio de seisdeterminaciones.

con agua destilada y fijado con una mezcla de: agua-metanol-ácidoacético desnaturalizado en una proporción de 70:30:5 mi, según técnicade Guzmán et al (1973).

3. Determinación de Peso Seco

El material tratado fue pesado y colocado en una estufa durante48 hs a 105° C. Posteriormente fue transferido a un desecador durante12 hs, al cabo de las cuales se pesó nuevamente.

RESULTADOS

1. ElectroforesisLos esquemas de las corridas electroforéticas se muestran en la

fig. 1, donde las bandas de isoenzimas de peroxidasas se numeraron deacuerdo a la nomenclatura internacional ( IUPAC-IUB, 1972. )

En la sorbita los coleóptilos revelaron 11 formas moleculares:4 anódicas y 7 catódicas. Desde el agua destilada hasta concentracio¬nes de sorbita de 0,1 M el modelo se mantuvo constante con tres ban-

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das anódicas: 1, 3, 4 y siete bandas catódicas: 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11.En las concentraciones de 0,5 y 1 M la banda 1 tuvo una mayor migra¬ción y aparentemente menor actividad enzimática, apareciendo la ban¬da 2 como desdoblamiento de la 1. En las formas catódicas desapa¬reció la banda 9, teniendo las bandas 10 y 11 una menor migración.En los coleóptilos colocados en soluciones de sacarosa se observaron14 bandas: 7 anódicas y 7 catódicas. Si bien aquí fue mayor el númerode formas de peroxidasas los resultados fueron similares a los de sor-bita, manteniéndose los modelos electroforéticos constantes con 7 for¬mas anódicas y 7 catódicas desde el testigo hasta concentracionesde 0,1 M y observándose variaciones con concentraciones de 0,5 y 1 M;en éstas se notó la desaparición de las bandas 7 y 14, teniendo unamayor migración la banda > 1 y menor movilidad electroforética lasbandas 10, 11 y 12.

2. Actividad enzimática

La actividad enzimática se muestra en las curvas de la fig. 2.La misma se mantuvo con pocas variaciones en los coleóptilos tratadoscon concentraciones bajas de sorbita y sacarosa, disminuyendo leve¬mente para 0,1 M y en forma apreciable en aquellos tratados con con¬centraciones de 0,5 M y 1 M. -

Se hicieron mediciones en las soluciones de sorbita y sacarosaposterior al tratamiento, pudiendo comprobarse la difusión de peroxi¬dasas a las mismas, siendo su actividad equivalente a la centésimaparte de las actividades de las peroxidasas encontradas en los extractosutilizados.

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3. Determinación de Peso Seco

Los porcentajes de peso seco final en los coleóptilos tratados sepresentan en la tabla 1.

Tabla 1. Tabla comparativa del peso seco final de coleóptilos de trigotratados con distintas concentraciones de sorbita y sacarosa. Los resul¬tados son el promedio de dos determinaciones.

Porcentaje de Peso SecoConcentraciónmolar SorbitaSacarosa

Agua1 X 10-41 X 10-31 X 10-21 X ío-i5 X 10-1

4,8 4,85,2 4,85,5 4,95,5 4,95,7 5,3

10,1 9,713,81 19,6

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DISCUSION Y CONCLUSIONES

En este estudio las observaciones tienen en cuenta la caída delas actividades enzimáticas y las modificaciones de los modelos elec-troforéticos.

Si se considera que la sorbita y la sacarosa modifican el estadohídrico, de los resultados obtenidos se puede deducir que las levesdisminuciones de la actividad de peroxidasas observadas en las con¬centraciones hasta 0,1 M, no serían debidas a las mismas, ya queéstas son prácticamente inapreciables, como puede deducirse de lacomparación de los pesos secos (Tabla 1). Sí podríamos pensar quela caída sostenida de la actividad enzimática y la variación del modeloelectroforético que se observa en las concentraciones 5 X 10 1 M y 1 M,podría ser debida en parte a modificaciones en el potencial agua (Todd,1972; Stafford, 1974), a las cuales se sumaría la influencia de la natu¬raleza molecular tanto de la sorbita como de la sacarosa.

Al igual que lo observado por van Huystee y Turcon (1973) secomprobó la difusión de peroxidasas al medio, pero la cantidad delas mismas no indicaría influencia en la disminución de su actividad,ya que la proporción se mantuvo constante aun para los testigos. Tam¬bién Guzmán et al. (1975) encontraron que las peroxidasas podíandifundir al exudado gomoso de Fagara coco.

En cuanto a las formas moleculares (fig. 1), los resultados obte¬nidos nos muestran cambios en el número de bandas de isoenzimascon actividad de peroxidasas en concentraciones de 5 X 10"1 y 1 M.La disminución de tres bandas nos indicaría la destrucción, la inhibi¬ción de la síntesis o bien la despolimerización de algunas peroxidasascomo consecuencia de modificaciones del estado hídrico y la influen¬cia de la naturaleza de las soluciones. Scandalios (1969) sugiere quela puesta en evidencia de una forma molecular en un momento dado,puede no estar regulada directamente por el genoma.

Se observa, además, una reducción en la cantidad absoluta deperoxidasas en las concentraciones 5 X 10'1 y 1 M como se infierede la menor intensidad de la tinción de algunas bandas.

Las diferencias encontradas en los testigos pueden deberse a lige¬ras variaciones del material, influenciado en parte por las oscilacionesde la temperatura ( ± 2o C ).

AGRADECIMIENTOS

Deseamos agradecer a la Estación Experimental Agrícola de Mar¬cos Juárez (INTA), Prov. de Córdoba, por suministrarnos el materialvegetal, y al Dr. Augusto Arce por la revisión de los manuscritos delpresente trabajo.

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