i
Efecto fungistático de extractos y aceites esencial es de LippiaoriganoidesHBK y ThymusvulgarisL. como alternativas
de manejo de Colletotrichummusae en banano y Botrytiscinerea en fresa
Luis Alejandro Taborda Andrade
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería y Administración Maestría en Ingeniería Agroindustrial
Sede Palmira
2013
ii
Efecto fungistático de extractos y aceites esencial es
de LippiaoriganoidesHBK y ThymusvulgarisL. como alternativas de manejo de Colletotrichummusae en banano
y Botrytiscinerea en fresa
Luis Alejandro Taborda Andrade
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de Magister en Ingeniería Agroindustrial
Dirigido por:
Manuel S. Sánchez O. M.Sc. Carlos Huertas Cand a Dr
Universidad Nacional de Colombia Maestría en Ingeniería Agroindustrial
Facultad de Ingeniería y Administración Sede Palmira
2013
iii
ACTA DE SUSTENTACION
iv
La Facultad y los Jurados de tesis
no se harán Responsables de las
ideas emitidas por el autor.
Artículo 24, Resolución 04 de 1974
v
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Manuel Sánchez y a la Dra. Carmen Rosa Bonilla por permitirme integrar al
grupo de investigación de Plantas Medicinales.
Al Dr. Manuel Sánchez por su constante apoyo e invaluable guía en el transcurso
de la Maestría y la dirección de la tesis para el desarrollo y la culminación de la
misma.
Al Dr. Carlos A. Huertas por su por su aporte como Codirector de la tesis.
Al Dr. Mario Augusto García y a la Sra. Marzory Andrade de la Sala de Biometría de
Posgrados por sus aportes en el análisis estadístico e interpretación del mismo.
A la Universidad Nacional de Colombia - Facultad de Ingeniería y Administración de
la Sede Palmira por contribuir a mi crecimiento y fortalecimiento personal y
profesional tanto en el Pregrado como en la Maestría.
Al Dr. Eyder Daniel Gómez y a la Dra. Liliana Serna por sus aportes como Jurados
en este trabajo.
A Colciencias y el programa Jóvenes Investigadores, por patrocinar parte de esta
investigación a través del grupo de investigación “Recursos Genéticos de Plantas
Medicinales, Aromáticas.
A todas aquellas personas que de alguna manera aportaron en el desarrollo y
finalización de este trabajo.
vi
DEDICATORIA
A Jehová Dios por bendecirme cada momento de mi vida.
A Marzory por ser padre y madre a la vez entregándome su inmenso amor
incondicional,por su ejemplo, sus valores y por hacer de mí un hombre de
bien. A ti Madre Gracias.
A mis abuelos Omar y Doraly por su apoyo espiritual.
vii
CONTENIDO
RESUMEN ................................................................................................................................ xvi
ABSTRACT ............................................................................................................................... xvii
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................................ 1
1.1. PREGUNTA PROBLEMA ............................................................................................. 2
2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 6
3.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................ 6
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................................. 6
4. REVISION DE LITERATURA ..................................................................................................... 7
4.1. OPERACIONES BÁSICAS DE SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS QUÍMICAS DE PLANTAS
MEDICINALES Y AROMÁTICAS. ............................................................................................. 7
4.1.1. Método de extracción con solvente ...................................................................... 7
4.1.2. Método de hidrodestilación para obtención de aceites esenciales. ..................... 8
4.2. Lippia orIganoides HBK. ............................................................................................... 11
4.3. Thymus vulgaris. .......................................................................................................... 12
4.4. Botrytis cinerea. ........................................................................................................... 12
4.5. Colletotrichum spp. ................................................................................................... 13
4.6. ACTIVIDAD FUNGISTÁTICA ........................................................................................... 14
5. ESTADO DEL ARTE ............................................................................................................... 15
6. METODOLOGIA ................................................................................................................... 22
6.1. OBJETIVO ESPECÍFICO 1: .............................................................................................. 22
6.1.1. Recolección material vegetal ................................................................................ 22
6.1.2. Obtención de extractos etanólicos ....................................................................... 22
6.1.3. Aislamiento de B. cinerea y C. musae ................................................................... 23
viii
6.1.4. Evaluación in vitro del potencial biofungistático de EE de L. origanoides y T.
vulgaris como alternativa de manejo de B. cinerea y C. musae. .................................... 24
6.1.4.1. Preparación de la solución inicial del extracto etanólico (SI) ........................ 24
6.1.4.2. Preparación de las Soluciones Diluidas (SD) de los extractos etanólicos ...... 25
6.1.4.3. Preparación e inoculación de las cajas de petri ............................................. 25
6.1.4.4 Determinación del porcentaje de inhibición. ................................................. 26
6.1.5. Evaluación in vivo del potencial biofungistático de EE de L. origanoides HBK y T.
vulgaris L. como alternativa de manejo de B. cinérea y C. musae ................................. 27
6.1.5.1. Acondicionamiento de los frutos ................................................................... 28
6.1.5.2. Preparación de la suspensión de esporas y prueba de Patogenicidad .......... 28
6.1.5.3. Preparación de los tratamientos de inoculación. .......................................... 29
6.1.5.4. Aplicación de los tratamientos ...................................................................... 30
6.1.5.5. Almacenamiento de los frutos ....................................................................... 31
6.1.5.6. Evaluación de índice de severidad y porcentaje de control. ......................... 32
6.2. OBJETIVO ESPECIFICO 2: .............................................................................................. 33
6.2.1. Recolección material vegetal ................................................................................ 33
6.2.2. Obtención de aceites esenciales ........................................................................... 33
6.2.3. Aislamiento de B.cinerea y C. musae .................................................................... 34
6.2.4. Evaluación in vitro el potencial biofungistático de AE de L. origanoides y T.
vulgaris sobre B. cinérea y C. musae .............................................................................. 34
6.2.5. Evaluación in vivo el potencial biofungistático de AE de L. origanoides y T.
vulgaris sobre B. cinérea y C. musae .............................................................................. 34
6.3. DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................................................................... 34
6.3.1. Bioensayo in vitro .................................................................................................. 34
6.3.2. Bioensayo in vivo ................................................................................................... 37
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................. 40
7.1 OBTENCIÓN DE ACEITES ESENCIALES ........................................................................... 40
7.2. EVALUACIÓN in vitro .................................................................................................... 41
7.2.1. Prueba de patogenicidad ...................................................................................... 41
7.2.2. Botrytis cinerea .................................................................................................... 42
7.2.3. Colletotrichum musae ........................................................................................... 47
ix
7.3. EVALUACIÓN in vivo ..................................................................................................... 51
7.3.1. Escala diagramática para índice de severidad y porcentaje de infección. ............ 51
7.3.2. Botrytis cinerea en fresa ...................................................................................... 53
7.3.3. Colletotrichum musae en banano ......................................................................... 56
8. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 60
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 62
ANEXOS ................................................................................................................................... 67
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Área cultivada y participación por departamento en el total del área
cultivada (unidad hectáreas) de banano en Colombia en 2010. ........................ 3
Figura 2. a) Material vegetal troceado. b) Montaje hidrodestilación. c) Montaje
extracción etanólica. d) Concentración del extracto vegetal utilizando rotovapor.
Fuente: fotos del autor, 2012 ........................................................................... 9
Figura 3. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno.
Fuente: (Avalos y Pérez, 2011). ..................................................................... 10
Figura 4. Observación en microscopio (40x) de a) Botrytis cinerea y b)
Colletotrichum spp .......................................................................................... 14
Figura 5. a) Percolación del etanol en los materiales vegetales. b) y c)
rotaevaporación y secado en la campana de vacío. d) Extracto de L.
origanoides y e) Extracto de T. vulgaris. Fuente: Fotos del autor, 2012. ...... 23
Figura 6. a) Soluciones iniciales de extractos de Thymus vulgaris y Lippia
origanoides; b) Discos y crecimiento micelial con las diferentes concentraciones
del extracto. Fuente fotos: Autor, 2012. ........................................................ 26
Figura 7. Esquema del proceso de la evaluación in vivo de la capacidad fungistática
de EE de L. origanoides y T. vulgaris sobre B. cinerea y C. musae. ............... 27
Figura 8. Escala de madurez de: a) fresa (NTC 4130) y b) banano Piña et al.,
2006. Fuente: fotos del autor, 2012. .............................................................. 28
Figura 9. Esporas en la cámara de Neubawer en microscopio. a) Esporas de
Botrytis cinerea. b) Esporas de Colletotrichum musae. Fuente de fotos: Autor,
2012. ............................................................................................................... 29
Figura 10. Soluciones diluidas con a) aceites esenciales y b) extractos etanólicos
empleados en ensayo in vivo .......................................................................... 30
Figura 11. Sistemas de almacenamiento empleado en el bioensayo a)
Contenedores plásticos estibables b) recipientes plásticos herméticos con
cama de polipapel absorbente. Fuente: Fotos del Autor, 2012. .................... 31
xi
Figura 12. Esquema del bioensayo in vitro donde se evaluaron los factores: especie
vegetal (con dos niveles L. origanoides y T. vulgaris), tipos de extractos (con
dos niveles AE y EE) y patógeno (con dos niveles C. musae y B. cinerea). Para
cada tratamiento se evaluaron tres concentraciones (500, 256 y 128 mg/l) y un
solo testigo: el negativo. .................................................................................. 36
Figura 13. Esquema del bioensayo in vivo para el control de moho gris en fresa
donde se evaluaron los factores: especie vegetal (niveles L. origanoides y T.
vulgaris), y tipos de extractos (niveles AE y EE). Se evaluaron dos
concentraciones (500 y 256 mg/l) en cada tratamiento, y dos testigos: Negativo
y Etanol. .......................................................................................................... 38
Figura 14. Esquema del bioensayo in vivo para el control de antracnosis en banano,
donde se evaluaron los factores: especie vegetal (niveles L. origanoides y T.
vulgaris), y tipos de extractos (niveles AE y EE). Se evaluaron dos
concentraciones (500 y 256 mg/l) en cada tratamiento, y dos testigos: Negativo
y Etanol. .......................................................................................................... 39
Figura 15. Curvas de extracción de AE durante 90 minutos de proceso según el
modelo obtenido en el programa CurveExpert de tipo exponencial tal que
� = �(� − ��(−�) siendo � = �, �� para a) Thymus vulgaris y b) Lippia
origanoides. .................................................................................................... 41
Figura 16. Pruebas de patogenicidad. a) Banano asperjado con esporas de
Colletotrichum musae al cabo de 72 horas. b) Muestra testigo de bananos. c)
fresa asperjadas con esporas de Botrytis cinerea al cabo de 72 horas. d)
Muestra testigo de fresas. ............................................................................... 42
Figura 17. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial dado por Lippia
origanoides y Thymus vulgaris en el control de Botrytis cinerea. Letras
diferentes indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05). .................... 43
Figura 18. Promedio porcentaje de Inhibición de Botrytis cinerea de las
concentraciones 500, 256 y 128 mg/l de los extractos y aceites esenciales
evaluados. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel de
(p< 0,05). ........................................................................................................ 44
Figura 19. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de Botrytis cinerea por
los aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies vegetales
evaluadas. Letras diferentes diferencias significativas al nivel de (p< 0,05). .. 45
xii
Figura 20. Inhibición del crecimiento del micelio de Botrytis cinerea en
concentraciones del extracto etanólico de Lippia origanoides a, b, c, d
respectivamente y la Inhibición del crecimiento del micelio de Botrytis cinerea
por las concentraciones de aceites esenciales de Tymus vulgaris e,f,g,h
respectivamente. Fuente: fotos del autor, 2012. ......................................... 46
Figura 21. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de Colletotrichum
musae por los aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies
vegetales evaluadas. Letras diferentes indican diferencias significativas al
nivel de (p< 0,05). ........................................................................................... 48
Figura 22. Efecto de las concentraciones de los extractos y aceites esenciales (500,
256 y 128 mg/L), sobre el porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de
Colletotrichum musae. Promedios de diferentes letras indican diferencias
significativas al nivel de (p< 0,05). .................................................................. 49
Figura 23. Efecto de los tipos de extracto de Lippia origanoides y Thymus vulgaris
en el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial de Colletotrichum musae.
Promedios con diferente letra indican diferencias significativas al nivel de (p<
0,05). .............................................................................................................. 50
Figura 24. Diagrama pictográfico que exhibe la escala de porcentaje de infección de
a) Botrytis cinerea en fresa. b) Coletotrichum musae en el banano. Fuente:
fotos del autor, 2012. ..................................................................................... 53
Figura 25. Porcentaje de control in vivo de EE y AE en concentraciones de 500 y
256 mg/l, de Lippia origanoides y Thymus vulgaris y los testigos etanol,
negativo y etanol evaluados sobre Botrytis cinerea en fresa. .......................... 54
Figura 26. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control in
vivo de Botrytis cinerea por las especies vegetales L. origanoides y T. vulgaris y
tres testigos: negativo, etanol y Benomil. ........................................................ 55
Figura 27. Efecto de control de los tratamientos de AE y EE de L.origanoides sobre
la infección de Botrytis cinerea en fresa.Fuente: fotos del autor, 2012. .......... 56
Figura 28. Porcentaje de control in vivo de EE y AE de Lippia origanoides y Thymus
vulgaris en concentraciones de 500 y 256 mg/l y los testigos etanol, negativo y
etanol evaluados sobre Colletotrichum musae en Banano. ............................. 57
xiii
Figura 29. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control in
vivo de Colletotrichum musae por las especies vegetales L. origanoides y T.
vulgaris y tres testigos: negativo, etanol y Benomil. ........................................ 59
Figura 30. Efecto de control de los tratamientos de AE y EE de L.origanoides sobre
la infección de Colletotrichum musae en banano al cabo de 48 horas. Fuente:
fotos del autor, 2012. ...................................................................................... 59
xiv
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Control de Botrytis sp y Colletotrichum sp usando AE y EE de Lippia spp y
Thymus vulgaris. ............................................................................................. 15
Tabla 2. Extractos de algunas especies de plantas aromáticas y medicinales que
fueron evaluados por diferentes autores contra Botrytis cinerea. (Jacometti et
al., 2010) ......................................................................................................... 17
Tabla 3. Aceites Esenciales de algunas especies de plantas aromáticas y
medicinales que fueron evaluados por diferentes autores contra B. cinerea.
(Jacometti et al., 2010). ................................................................................... 19
Tabla 4.Valores reportados por (Combrinck et al., 2011) de concentración mínima
en µL/L de los aceites esenciales evaluados para causar el 100% de inhibición
de Colletotrichum y Botrytis. ............................................................................ 21
Tabla 5. Preparación de concentraciones para el método de dilución en agar. ....... 25
Tabla 6. Efecto de las concentraciones (128, 256 y 500 mg/L) y los dos tipos de
extractos (aceite esencial y extracto de etanol) sobre la porcentaje de inhibición
de Botrytis cinerea. ......................................................................................... 46
Tabla 7. Efecto de las concentraciones (128, 256 y 500 mg/L) y los dos tipos de
extractos (aceite esencial y extracto de etanol) sobre la porcentaje de inhibición
de Colletotrichum musae................................................................................. 51
xv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Variables evaluadas in vitro con Botrytis cinerea. .................................... 68
Anexo 2. Porcentaje de control de B. cinerea en fresa en la interacción tiempo a
las 48, 96 y 120 horas, por cada producto evaluado. ...................................... 69
Anexo 3. Porcentaje de control de C. musae en banano en la interacción tiempo a
las 48, 96 y 120 horas, por cada producto evaluado. ...................................... 70
xvi
RESUMEN
La antracnosis del banano (Colletotrichummusae) y la cenicilla de la fresa
(Botrytiscinerea) son dos enfermedades que producen importantes pérdidas
poscosecha. En el presente estudio se evaluó el efecto fungistático de extractos y
aceites esenciales de Lippiaoriganoides y Thymusvulgaris (a concentraciones de
500, 256 y 128 mg/l) sobre ColletotrichummusaeyBotrytiscinerea in vitroe in vivo. En
el ensayo in vitro se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial.
Se observó que los tratamientos: tipo de extracto aceite esencial (AE) yla especie
vegetal Lippiaoriganoides tuvieron los porcentajes de inhibición más altos (41,91 y
37,12% de control sobre Botrytis cinérea, respectivamente; y 60,23 y 53,72% de
control sobre Colletotrichummusae, respectivamente). En la evaluación in vivo se
determinó el porcentaje de control de la incidencia de daño de los hongos
patógenos (por escala valor de incidencia de 0 a 7 según características específicas
de deterioro de los frutos) sobre bananos y fresas inoculados con
Colletotrichummusae y Botrytis cinérea, respectivamente. Después de 120 horas de
seguimiento, se observó que los aceites esenciales controlaron más eficientemente
la incidencia de daño causado por los hongos patógenos estudiados.
Palabras clave: Evaluación in vivo, evaluación in vitro, inhibición de crecimiento
micelial, control de incidencia de daños en frutos.
xvii
ABSTRACT
Thebananaanthracnose(Colletotrichummusae) andstrawberrypowdery mildew(Botrytis cinerea) are two diseases thatcause significantpost-harvest losses(15 and 20% respectively), which affects the economyof producers, traders and consumers. In this studywas evaluatedfungicidaleffectof extracts andessentialoilsofLippiaoriganoidesandThymusvulgaris (at concentrations of 500, 256 and 128mg/l) onMusaecolletotrichumandBotrytiscinereain vitro andin vivo. There was determinedmycelialgrowth rateas a controlof thesefungi invitro assay.It was observed that the treatmentsLippiaoriganoidesplant´s speciesand essential oil(AE) type ofextract had thehighestpercentage of inhibition(41.91 and37.12%ofcontrol overBotrytis cinerea,respectively, and60.23and53.72% control over Colletotrichummusae,respectively). The invivoevaluation was determined by thelevel ofdamage incidenceof fungalpathogens using a value scaleincidence of0-7according to specific characteristicsof fruits deterioration. After120 hours ofmonitoring,it was found thatessential oilshad a higheraveragecontrol percentages(69.2%)thanthe ethanol extracts(52.83%) in the controlofColletotrichummusae. Meanwhile,AEconcentration500mg/lshowed higherpercentage of Botrytiscinerea´s control: 94.3and 93.6% for ThymusvulgarisandLippiaoriganoidesrespectively.These results demonstratethe potential ofLippiaoriganoidesandThymus vulgaris, which can provide awide variety of compoundsas an alternative tochemical fungicides.
Keywords:Lippiaoriganoides, Thymusvulgaris, Colletotrichummusae, Botrytis cinérea,essentialoils, ethanol extracts, potentialbiofungicide.
1
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La antracnosis del banano (Colletotrichummusae) y la cenicilla de la fresa
(Botrytiscinerea) constituyen dos enfermedades que producen importantes
pérdidas poscosecha (15 y 20%, respectivamente), lo que afecta la
economía de los productores, comercializadores y consumidores (López et
al., 2006).
En los bananos de exportación, la pudrición de la corona es la principal
causa de pérdida de estos frutos. La sintomatología característica es el
ennegrecimiento de la corona, debilitación de pedicelos y subsiguiente caída
de los dedos. La pudrición de la corona es causada por un complejo de
patógenos fungosos de los cuales Colletotrichummusae es uno de los
principales (Su et al., 2011). Este patógeno también causa manchas en el
pericarpio de la fruta madura, esta sintomatología se le conoce como
antracnosis (Nuangmek et al., 2008).
Por otro lado, la fresa es un producto con un potencial importante en la
economía regional y nacional (Cano Sanz, 2012). Sin embargo, este fruto es
altamente perecedero y susceptible a daños mecánicos, pérdidas de agua y
deterioro fisiológico y microbiológico causados por hongos como
Botrytiscinerea generando el pudrimiento del fruto y consecuente pérdida de
valor económico (Cruz et al., 2008).
Los fungicidas químicos tradicionalmente han sido los medios primarios para
el control de estos patógenos, pero su utilización continua, ha generado
importante interés público por los diversos problemas generados como la
2
toxicidad, detención de exportaciones por residuos en producto de consumo
y daños al medio ambiente (Arturo, 2008; Montoro et al., 2009). Otro aspecto
importante es que los microorganismos fitopatógenos han generado
resistencia al ingrediente activo de algunos fungicidas sintéticos, como
respuesta a la presión de selección a las altas dosis y aplicaciones continuas
sin previo estudio y cronograma de control, ocasionando grandes pérdidas
económicas (Leroch et al., 2010; Wilson et al., 1997).
Sin embargo, el principal problema generado por el uso indiscriminado de
plaguicidas de síntesis química, además de los altos costos de los mismos,
es el efecto colateral sobre el medio ambiente y la salud del operario y el
consumidor final que están expuestos al contacto directo y/o a los residuos
en los alimentos (Arturo, 2008).
Por todo lo anterior, investigaciones recientes se han enfocado en la
evaluación de varias alternativas de control para reducir la dependencia a
fungicidas sintéticos, tales como microorganismos antagonistas, tratamientos
físicos, sustancias naturales como extractos o aceites esenciales, entre otros.
1.1. PREGUNTA PROBLEMA
¿Son los extractos etanólicos y/o aceites esenciales potenciales
biocontroladoresposcosecha de los hongos patógenos de fresa y banano in
vitro e in vivo?
3
2. JUSTIFICACIÓN
Los frutales en Colombia alcanzaron un máximo de producción agrícola de
45.000.000 de toneladas y 4.500.000 hectáreas cultivadas, donde el banano
representa el 4% de toda la producción con 2.000.000 de toneladas reportadas en el
2010; El Valle del Cauca, donde se ejecutó esta investigación, es el tercer
departamento más importante en producción y áreas cultivadas de banano, después
de Antioquia y Magdalena (Figura 1).
Figura 1. Área cultivada y participación por departamento en el total del área cultivada (unidad hectáreas) de banano en Colombia en 2010.
Fuente www.agronet.gov.co. Consultado Noviembre de 2011.
Por otra parte, la fresa es uno de los cultivos con mayor potencial económico en
Colombia. Se reportó en 2009 un máximo de producción de 48709 Toneladas de las
4
1166 hectáreas cultivadas. En el mismo año, el Valle del Cauca fue el noveno
departamento más importante en rendimiento, área cultivada y producción de este
cultivar (Ministerio de Agricultura, agronet.gov.co.).
Es evidente por tanto, que en el departamento del Valle del Cauca, se reconozca el
potencial y la importancia de la producción de banano, fresa, así como otros
frutales. Coherente con este panorama regional, el Plan Hortofrutícola Del Valle Del
Cauca para el trienio 2013-2015 incluyó 13 frutales entre los cuales se encuentra la
fresa y el banano. Estas iniciativas departamentales jugarán un papel importante en
la cometida propuesta en el Plan Frutícola Nacional del Ministerio de Agricultura
(Tafur et al., 2006), donde se pretende para el 2025, que Colombia sea un país líder
en producción y exportación de frutales; esto demandará mayor dinamismo y
competitividad en el sector, alcanzando nuevos máximos de producción, áreas
sembradas y rendimientos así como participación de nuevos actores y asociaciones.
Esto constituye un reto importante para los productores colombianos que, por un
lado, deben competir en los mercados internacionales con tolerancias máximas de
residuos de plaguicidas cada vez más exigentes (Alonso, 2004; Pacheco, 2012), y al
tiempo, minimizar y controlar el umbral de daño causado por patógenos como
Colletotrichummusaeen banano y Botrytiscinereaen fresa (López et al., 2006).
Por lo anterior, es necesario generar alternativas viables y eficientes en el control de
estos problemas fitosanitarios y que, por otro lado, sean amigables con el medio
ambiente, y con la salud de operarios agrícolas y consumidores finales (Montoro et
al., 2009). Estas alternativas contribuirán al desarrollo de producciones limpias y
sostenibles (Jacometti et al., 2010).
5
Existen suficientes elementos justificatorios para comprobar y evaluar, por medio de
la investigación, el efecto fungistático in vitro e in vivo de los aceites esenciales y
extractos de plantas medicinales y aromáticas como una alternativa para inhibir el
crecimiento micelial de Botrytiscinereaen fresay Colletotrichummusae en banano
(Alzate et al., 2009; López et al., 2006).Esta es una de las promisorias aplicaciones
de estos productos de origen biológico en Colombia.
6
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar los posibles efectos biofungicidas de extractos y aceites esenciales de
Lippiaoriganoides HBK y Thymusvulgaris para el control de Colletotrichummusae
causante de antracnosis del banano y Botrytiscinereacausante del moho gris en
fresa.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Evaluar el potencial fungistático de los extractos etanólicos de Lippiaoriganoides
y Thymusvulgaris como alternativa de manejo de Colletotrichummusae
yBotrytiscinereain vitro e in vivo.
• Evaluar el potencial fungistático de los aceites esenciales Lippiaoriganoides y
Thymusvulgaris como alternativa de manejo de Colletotrichummusae
yBotrytiscinereain vitro e in vivo.
7
4. REVISION DE LITERATURA
4.1.OPERACIONES BÁSICAS DE SEPARACIÓN DE SUSTANCIAS
QUÍMICAS DE PLANTAS MEDICINALES Y AROMÁTICAS.
Desde la Edad Media, la obtención de productos naturales derivados de las plantas
medicinales y aromáticas reviste gran importancia por su comprobado uso como
agentes medicinales y plaguicidas (Canigueral et al., 2003).
Con el tiempo se desarrollaron y perfeccionaron diversos métodos de extracción de
sustancias químicas (también denominadas Técnicas de Extracción de Aceites
Esenciales) de plantas medicinales y aromáticas a las que se les atribuye actividad
biológica. Dentro de la gran cantidad de técnicas desarrolladas la extracción con
solventes, y la hidrodestilación son métodos de amplio uso y reconocimiento (Munir
y Hensel, 2010).
4.1.1. Método de extracción con solvente
Para la aplicación de esta técnica, el material vegetal debe ser previamente
desecado, molido, macerado o picado (Figuras 2a y 2b), para permitir mayor área
de contacto entre la muestra y el solvente (Figura 2c), Los solventes más
empleados son: Etanol, metanol, isopropanol, hexano, ciclohexano, tolueno, entre
otros. Esta técnica se utiliza a escala de laboratorio pues a nivel industrial resulta
costoso por el valor comercial de los solventes. De este método de extracción
resultan generalmente altos rendimientos de extracción (Peso/Volumen). El extracto
resultante se concentra recuperando el solvente mediante rotovapor (Figura 2d)
(Sharapin, 2000).
Los extractos vegetales son concentraciones liquidas de numerosos metabolitos
secundarios, así como de otros compuestos. El olor del extracto, aun después de
8
ser concentrado, es característico del solvente utilizado. Por esta razón, este tipo de
extracto se considera una esencia impura debido al contenido variable de partículas
vegetales, tales como pigmentos, clorofila, entre otros microcomponentes de la
planta (Martínez, 1996).
4.1.2. Método de hidrodestilación para obtención d e aceites esenciales.
La obtención de aceites esenciales constituye un sector industrial de gran
importancia. Su desarrollo se ha basado en el conocimiento de la composición,
aislamiento y estructura de sus componentes principales (Yúfera, 1995).
En la obtención y aislamiento de estos componentes principales, el método
hidrodestilación ha tenido amplio uso y aceptación, este método consiste en la
obtención de aceites esenciales mediante el uso de vapor de agua. No obstante el
vapor no se genera en el mismo contenedor de la materia prima; la generación de
vapor es externa y suministra un flujo constante que pasa a través de la muestra
vegetal (Chávez, 2007).
El diseño en escala piloto y tipo laboratorio (Figura 2b) tienen similar
funcionamiento, pues operan bajo los mismos principios: El agua que se encuentra
del sistema es calentada, el vapor generado arrastra los componentes de la muestra
los cuales son posteriormente condensados y separados por una trampa tipo
Clevenger(Chávez, 2007).
Figura 2. a) Material vegetal troceado. b) Montaje hidrodestilación. c) Montaje extracción etanólica. d) Concentración del extracto vegetal utilizando rotovapor.del autor, 2012
Los aceites esenciales (AE) resultantes son fracciones líquidas volátiles constituidas
por una mezcla homogénea de compuestos químicos orgánicos, provenientes de
una misma familia química (terpenoides). A estos se les atribuye el aroma de las
plantas y se consideran importantes por sus aplicaciones en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes),
farmacéutica (saborizantes) y agrícola (Biocontroladores y bioplaguicidas)
2007; Martínez, 1996).
Dichos terpenoides son denominados metabolitos secundarios de las plantas,
biosintetizados en el citoplasma y cloroplasto de la célula vegetal, producto de la
rutas metabólicas del ácido mevalónico y metileritritol fosfato (
Pérez, 2011) Un terpeno al que se le a
(Acevedo et al., 2007)
a
b
9
. a) Material vegetal troceado. b) Montaje hidrodestilación. c) Montaje extracción etanólica. d) Concentración del extracto vegetal utilizando rotovapor.
Los aceites esenciales (AE) resultantes son fracciones líquidas volátiles constituidas
por una mezcla homogénea de compuestos químicos orgánicos, provenientes de
una misma familia química (terpenoides). A estos se les atribuye el aroma de las
consideran importantes por sus aplicaciones en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes),
farmacéutica (saborizantes) y agrícola (Biocontroladores y bioplaguicidas)
Dichos terpenoides son denominados metabolitos secundarios de las plantas,
en el citoplasma y cloroplasto de la célula vegetal, producto de la
rutas metabólicas del ácido mevalónico y metileritritol fosfato (Figura
Un terpeno al que se le atribuye el potencial plaguicida es el timol,
Hay un número importante de plantas que contienen timol,
b c
d
. a) Material vegetal troceado. b) Montaje hidrodestilación. c) Montaje extracción etanólica. d) Concentración del extracto vegetal utilizando rotovapor.Fuente: fotos
Los aceites esenciales (AE) resultantes son fracciones líquidas volátiles constituidas
por una mezcla homogénea de compuestos químicos orgánicos, provenientes de
una misma familia química (terpenoides). A estos se les atribuye el aroma de las
consideran importantes por sus aplicaciones en la industria cosmética
(perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes),
farmacéutica (saborizantes) y agrícola (Biocontroladores y bioplaguicidas) (Chávez,
Dichos terpenoides son denominados metabolitos secundarios de las plantas,
en el citoplasma y cloroplasto de la célula vegetal, producto de la
Figura 3(Avalos y
tribuye el potencial plaguicida es el timol,
Hay un número importante de plantas que contienen timol,
10
dos especies con promisorias concentraciones de este metabolito son
Thymusvulgaris L. yLippiaoriganoidesHBK(Acevedo et al., 2007; Ruiz et al., 2007).
Figura 3. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de
isopreno. Fuente: (Avalos y Pérez, 2011).
11
4.2. LippiaorIganoides HBK.
El género Lippiacomprende más de 200 especies de plantas pertenecientes a la
familia de las verbenáceas. Estas se pueden encontrar en Centro y Sur América, así
como algunos territorios de África tropical (Pascual et al., 2001; Ruiz, 2008). Muchas
de estas especies son empleadas comúnmente en la medicina tradicional, como
condimentos, entre otros usos. Por otro lado, se ha demostrado la actividad
biológica que tienen los principios activos de las especies del genero Lippia(Dos
Santos et al., 2004; Pascual et al., 2001).
Una de las especies del género Lippia que ha recibido especial atención, y la cual
es objeto de estudio en el presente trabajo es la LippiaOriganoides. Esta es una
planta arbustiva que se encuentra en Colombia, Brasil y Venezuela (Pascual et al.,
2001) En Colombia, Lippiaoriganoidesse conoce popularmente como “Orégano
cimarrón” y “Orégano de monte” y se localiza en ambientes secos o semidesérticos.
Es usada tradicionalmente para combatir desórdenes gastrointestinales,
enfermedades respiratorias y también como condimento (Ruiz, 2008).
En la composición química de los aceites esenciales de L. Origanoides HBK
predominan: Monoterpenos∝-terpinenos, γ-terpinenos, 1,8-cineoleno, p-cimeneno,
timol, y timil acetato y los sesquiterpenos β-cariofileno, umbeluloneno (Pascual et
al., 2001). Estos compuestos activos, especialmente el timol, se han evaluado y
demostrando promisoria actividad fungicida en hongos poscosecha(Stashenko et
al., 2004).
12
4.3. Thymusvulgaris.
El géneroThymuspertenece a la familia de las labiadas (Lamiaceae del orden
Lamiales) Consta de 350 especies. Se le conoce popularmente como tomillo, y es
una planta de tallo leñoso, de porte bajo (10-30 cm). Esta planta es nativa de la
región del Mediterráneo (Hajimehdipoor et al., 2010). Son tradicionalmente usadas
para curar enfermedades respiratorias y digestivas (Ruiz, 2008).
La especie más popular y distintiva del genero Thymuses T. vulgaris, o tomillo
común, como se le conoce popularmente. Su uso más difundido a nivel mundial es
como condimento alimentario, y también es utilizado en la medicina tradicional
(Hajimehdipoor et al., 2010). Numerosos estudios han reportado actividad biológica
de T. vulgaris, insecticida y fungicida (Gumus, 2010; Reddy et al., 1998), y más
recientemente, se ha investigado y reportado actividad anticonceptiva (Mikaili et al.,
2010).
Según reportaron (Goodner et al., 2006)la composición química del AE del tomillo
es, de mayor a menor concentración:Timol con 72,900–482,600 ppm, Carvacrol con
10,000–63,800 ppm y 1,8- cineol con 2500 ppm–26,200 ppm respectivamente.
4.4. Botrytiscinerea.
El género Botrytis lo constituyen veintidós especies. La clasificación Botrytis en
gran medida se construye sobre la base de características morfológicas.
Botrytis cinerea(Figura 4a) es la especie más representativa. Este hongo tiene
estructura similar a un árbol o arbusto y su reproducción en las hojas, tallos y frutos
de la planta es asexual (Mirzaei et al., 2007).
13
Botrytis cinereaes el causante de la cenicilla o moho gris, como se le conoce
comúnmente la enfermedad causada por estehongo patógeno, y puede ser
devastador en algunos cultivos, las pérdidas en productos hortofrutícolas, causados
por B. cinerea durante la poscosecha, oscilan entre el 20 y el 50% (López et al.,
2006). No es de extrañar entonces que el tamaño del mercado para los
productos anti-Botrytis alcanzó los 15-25 millones dólares EE.UU. (Elad et al.,
2004).
Esta enfermedad aparece de forma primaria como una plaga de las flores y
pudrición de los frutos además de manchas en las hojas y bulbos podridos en el
campo y en productos almacenados. El hongo induce muerte celular del hospedante
y un decaimiento progresivo del tejido infectado de la planta, de dónde el hongo
toma sus nutrientes(Elad et al., 2004).
4.5. Colletotrichumspp.
Las especies de Colletotrichum (Figura 4b), son las causantes de la
enfermedad antracnosis que afecta en una amplia gama de huéspedes,
afectandotallos, hojas y fruto (Rodriguez-Tudela et al., 2008). La Antracnosis es uno
de los problemas fitopatológicos de mayor importancia económica en cultivos como
aguacate, banano, guayaba, papaya, mango entre otros. Siendo responsable de
una reducción que oscila entre el 10% y 80% de la producción y rendimiento
comercial, en países como Tailandia, Pakistán, Turquía y México y Colombia.
(Alzate et al., 2009);(López et al., 2006).
14
Figura 4. Observación en microscopio (40x) de a) Botrytiscinerea y b) Colletotrichumspp
Fuente: Fotos del Autor, 2012.
En banano,la pudrición de la corona y las manchas en el pericarpio características
de la fruta madura, son causadas por un complejo de patógenos fungosos en los
que Colletotrichummusae, es uno de los principales (López et al., 2006). La
infección de C. musaepuede ocurrir incluso, desde el periodo en que la fruta aún
está en el racimo de la planta; en este periodo el patógeno puede permanecer
inactivo hasta que la fruta se acerque a la maduración. (Dadzie y Orchard, 1997).
4.6. ACTIVIDAD FUNGISTÁTICA
Según lo define en el diccionario de la real academia española, fungistático se
refiere a una sustancia que impide o inhibe la actividad vital de los hongos,
tratándose de su crecimiento y reproducción. Sin embargo, algunos autores incluyen
el efecto de esta capacidad que tienen numerosas sustancias sobre otros
microorganismos como bacterias (Cantón y Pemán, 1999).
Un fungistático actúa inhibiendo la síntesis de varias enzimas a nivel de la célula
fúngica, estas enzimas son determinantes en el desarrollo metabólico del hongo, por
lo tanto al inhibir su metabolismo se está inhibiendo su crecimiento y proliferación,
(Vives y Medvedovsky 2004).
a b
15
5. ESTADO DEL ARTE
Los Aceites Esenciales (AE) y Extractos Etanólicos (EE) de las plantas aromáticas y
medicinales de los géneros Thymus, y Lippia presentan notables propiedades
antifúngicas, como se ha demostrado por numerosos estudios científicos
(Combrinck et al., 2011). La Tabla 1 muestra un resumen de los resultados
obtenidos por diferentes autores que evaluaron in vitro los mismos materiales
vegetales, métodos de extracción y hongos patógenos del mismo orden, que el
presente proyecto de investigación.
Tabla 1. Control de Botrytissp y Colletotrichumspusando AE y EE de
LippiasppyThymusvulgaris.
TIPO DE
EXTRACTOS
MATERIAL
VEGETAL
EVALUADO
HONGO
PATOGENO
EVALUADO
RESULTADOS OBTENIDOS AUTOR
ESTRACTOS
ETANOLICOS
(EE)
T. vulgaris Botrytis spp
Se evaluó in vitro el EE a tres
diferentes diluciones: 150, 250 y
500 g/l, el tratamiento de 500 mg/l
fue el que obtuvo mejores
resultados inhibición del crecimiento
del micelio sobre Botrytiscinerea
Lizcano, 2007
Colletotrichum No se encuentran registros
L. origanoides
Botrytis spp
El EE disminuyó en 68% el
crecimiento de B. cinerea
comparado con 67% obtenido con
el testigo químico.
López et al.,
2006
Colletotrichum
spp
Los resultados obtenidos mostraron
que las variables: peso, grados brix,
y acidez de los frutos evaluados no
se vieron afectadas
significativamente por la presencia
Bolívar et al.,
2009
16
del hongo patógeno en presencia
del extracto.
ACEITES
ESENCIALES
(AE)
T. vulgaris
Botrytis spp
La inhibición del crecimiento de B.
cinerea oscilo entre 26,5 y 63,5% a
concentraciones de 50 y 200 ppm
del AE
Reddy et al.,
1998
Colletotrichum
spp
Los resultados demuestran que la
germinación de las esporas se evita
en un 100%. Adicionalmente, el
timol a 125 mg/L y el citral a 300
mg/L inhiben completamente la
esporulación y el AE de tomillo a
350 mg/L
Alzate et al.,
2009
L. origanoides Botrytis No se encuentran registros
Colletotrichum No se encuentran registros
La Tabla 2 presenta algunos de los extractos de algunas especies de plantas
aromáticas y medicinales que fueron evaluados para el control de Botrytiscinerea.
Se expone cuatro diferentes niveles de actividad medidas como la inhibición de
crecimiento del micelio y/o germinación: Muy alto (>90%), Alto (60< x < 90%),
Moderado (30< x < 60%) y bajo (<30%). El medio de crecimiento de los autores fue
el medio convencional agar de dextrosa de papa (PDA) que también fue utilizado en
este trabajo.
17
Tabla 2. Extractos de algunas especies de plantas aromáticas y medicinales que
fueron evaluados por diferentes autores contra Botrytiscinerea. (Jacometti
et al., 2010)
ESPECIES NIVEL DE ACTIVIDAD REFERENCIA
Adenocalymaalleaceum Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Aglaiaodorata Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumampeloprasum Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumfistolops Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumramosum Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumsativum Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumschoenoprasum Alto (Wilson et al., 1997)
Alliumtuberosum Alto (Wilson et al., 1997)
Calaminthaoriganifolia Moderado (Abou-Jawdah et al., 2004)
Capsicumannuum Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Capsicumannuum Alto (Wilson et al., 1997)
Capsicumchinense Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Capsicumfrutescens Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Chloranthusjaponicus Alto (Gyung et al., 2004)
Clematispaniculata Alto (Wilson et al., 1997)
Clematistrichotoma Bajo (Gyung et al., 2004)
Corchoropsispsilocarpa Moderado (Gyung et al., 2004)
Corydalisochotensis Bajo (Gyung et al., 2004)
Dolichoskilimandscharicus Moderado (Tegegne and Pretorius, 2007)
Helianthustuberosus Bajo (Gyung et al., 2004)
Hesperismatronalis Alto (Wilson et al., 1997)
Inula viscosa Moderado (Abou-Jawdah et al., 2004)
Isatis tinctoria Alto (Wilson et al., 1997)
Isodoninflexus Moderado (Gyung et al., 2004)
Juglansnigra Alto (Wilson et al., 1997)
Liquidambarstyraciflua Alto (Wilson et al., 1997)
Lysimachiaclethroides Bajo Gyung et al., 2004)
Maeruasubcordata Bajo (Tegegne and Pretorius, 2007)
Matricaria sp. Alto (Wilson et al., 1997)
Micromeria juliana Bajo (Abou-Jawdah et al., 2004)
Micromeria nervosa Muy Alto (Abou-Jawdah et al., 2004)
18
Origanumsyriacum Muy Alto (Abou-Jawdah et al., 2004)
Oxaliseuropaea Alto (Wilson et al., 1997)
Patriniascabiosaefolia Alto (Gyung et al., 2004)
Patriniavillosa Moderado (Gyung et al., 2004)
Paulownia coreana Alto (Gyung et al., 2004)
Phytolaccadodecandra Bajo (Tegegne and Pretorius, 2007)
Plumbago maritima Muy Alto (Abou-Jawdah et al., 2004)
Prunuspersica Alto (Wilson et al., 1997)
Pyruscommunis Alto (Wilson et al., 1997)
Ruta sp. Bajo (Abou-Jawdah et al., 2004)
Saturejaacinos Alto (Wilson et al., 1997)
Sideritispullulans Moderato (Abou-Jawdah et al., 2004)
Taxuscanadensis Alto (Wilson et al., 1997)
Taxus media ALto (Wilson et al., 1997)
Tulbaghiaviolacea Muy Alto (Wilson et al., 1997)
Urgineamaritima Bajo (Abou-Jawdah et al., 2004)
La Tabla 3 presenta algunos de los AE de especies de plantas aromáticas y
medicinales evaluados por diferentes autores contra Botrytiscinerea. Se expone
cuatro diferentes niveles de actividad medida como la inhibición de crecimiento del
micelio y/o germinación: Muy alto (>90%), Alto (60< x < 90%), Moderado (30< x <
60%) y bajo (<30%). El medio de crecimiento PDA.
19
Tabla 3. Aceites Esenciales de algunas especies de plantas aromáticas y
medicinales que fueron evaluados por diferentes autores contra B.
cinerea. (Jacometti et al., 2010).
ESPECIES NIVEL DE ACTIVIDAD REFERENCIA
Aeglemarmelos L. Alto (Tripathi et al., 2008)
Ageratumconyzoides L. Moderado (Tripathi et al., 2008)
AmmomumsubulatumRoxb. Moderado (Bouchra et al., 2003)
Anethumgraveolens L. Alto (Chebli et al., 2004)(Plotto et al.,
2002)
Azadirachta indica A. Moderado (Tripathi et al., 2008)
CaesuliaaxillariesRoxb. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Callistemonlanceolatus DC. Bajo (Tripathi et al., 2008)
Chenopodiumambrosioides L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Cinnamomumzeylanicum L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Citrus medica L. Citron Bajo (Tripathi et al., 2008)
Citrus reticulata L. Bajo (Tripathi et al., 2008)
Coriandrumsativum L. Alto (Plotto et al., 2002)
Cryptocaryamassoia L. Muy Alto (Antonov et al., 1997; Walter et al.,
2001)
Cuminumcyminum L. Alto (Chebli et al., 2004)
Cymbopogoncitrates DC. Muy Alto
(Tripathi et al., 2008)(Plotto et al.,
2002; Tzortzakis and Economakis,
2007)
Cymbopogonmartini Muy Alto (Wilson et al., 1997)
ElettariacardamomumMaton. Alto (Tripathi et al., 2008)
Eucalyptuscitriodora Hook. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Eupatoriumcannabinum L. Muy Alto
(Tripathi et al., 2008)
FoeniculumvulgareMill. Muy Alto (Tanović et al., 2005)
HeteranthemisviscidehirtaSchott. Muy Alto (Chebli et al., 2004)
Hyptissuaveolens L. Bajo (Tripathi et al., 2008)
Jasminumgrandiflorum L. Moderado (Antonov et al., 1997)
Laurusnobilis L. Alto (Chebli et al., 2004)
Lavandula angustifolia L. Moderado (Antonov et al., 1997)(Daferera et al.,
2003)
Lawsoniainermis L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Leptospermiumscoparium Moderado (Antonov et al., 1997)
Lippia alba Bajo (Tripathi et al., 2008)
20
Melaleucaalternifolia L. Moderado (Antonov et al., 1997)
Melaleucaleucodendron L. Bajo (Tripathi et al., 2008)
Mentha cardiaca L. Muy Alto (Plotto et al., 2002)
Menthapoperita L. Alto (Wilson et al., 1997)
Menthapulegium L. Moderado (Bouchra et al., 2003)Daferera et al.,
2003)
Menthaspp. Muy Alto (Tanović et al., 2005)
Murrayakoenigii L. Alto (Tripathi et al., 2008)
Nepetahindostana Moderado (Tripathi et al., 2008)
Ocimumbasilicum L. Alto (Plotto et al., 2002)
Ocimumbasilicum L. Alto (Tripathi et al., 2008)(Plotto et al.,
2002)(Tanović et al., 2005)
Ocimumcanum Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Ocimumgratissimum L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Ocimumsanctum L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Origanumdictamnus L. Muy Alto Daferera et al., 2003)
Origanummajorana L. Alto Daferera et al., 2003)
Origanumvulgare L. Muy Alto (Wilson et al., 1997); Bouchraet al.
(2003) Daferera et al., 2003)
PelargoniumroseumWilld. Muy Alto (Tanović et al., 2005)
Pimpinellaanisum L. Muy Alto (Tanović et al., 2005)
Prostantherarotundifolia Alto (Antonov et al., 1997)
Prunuspersica L. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
Rosa spp. Moderado (Antonov et al., 1997)
Rosmarinusofficinalis L. Bajo (Daferera et al., 2003)
Salvia fruticosa L. Moderado (Daferera et al., 2003)
Syzygiumaromaticum L. Alto (Wilson et al., 1997)(Antonov et al.,
1997)
Thymbraspicata L. Alto (Chebli et al., 2004)
Thymuscapitatus L. Muy Alto (Daferera et al., 2003)
ThymusglandulosusLag. Muy Alto (Bouchra et al., 2003)
ThymuszygisLoefl. Muy Alto (Wilson et al., 1997)
ZingibercassumunarRoxb. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
ZingiberofficinaleRosc. Muy Alto (Tripathi et al., 2008)
21
La Tabla 4 presenta los valores reportados por (Combrinck et al., 2011) de
concentración mínima en µL/L de los aceites esenciales evaluados para causar el
100% de inhibición de Colletotrichumy Botrytis, donde se destaca la concentración
mínima de T. vulgaris.
Tabla 4.Valores reportados por (Combrincket al., 2011) de concentración mínima en µL/L de los aceites esenciales evaluados para causar el 100% de inhibición de Colletotrichum y Botrytis.
ACEITE ESENCIAL C. gloeosporioides C. gloeosporioides B. cinerea
(aguacate) (mango) (grape)
Anethumgraveolens >3000 >3000 3000
Carum carvi (caraway) 3000 >3000 2000
Cinnamonumzeylanicum (cinnamon) 500 1000 500
Citrus sinensis (orange) >3000 3000 2000
Cymbopogoncitratus (lemongrass) 3000 3000 2000
Eucalyptus radiata >3000 >3000 >3000
Eucalyptusglobulus >3000 >3000 >3000
Eucalyptusdive >3000 >3000 >3000
Eucalyptuscitriodora >3000 >3000 2000
Jatropha curcas (jatropha) >3000 >3000 >3000
Simmondsiachinensis (jojoba) >3000 >3000 >3000
Lippiarehmannii 3000 3000 >3000
Lippiajavanica (fever tea) 3000 3000 >3000
Lippiacitriodora (lemon verbena) 2000 2000 2000
Lippiascaberrima (beukesbos) 2000 3000 2000
Menthapiperita (peppermint) 3000 >3000 3000
Menthaspicata (spearmint) 3000 3000 2000
Origanummajorana (origanum) 3000 2000 1000
Syzygiumaromaticum (clove) 3000 2000 1000
Thymusvulgaris (thyme) 500 500 500
1,8-Cineole (99%) 2000 2000 2000
Citral (97%) 2000 3000 3000
R-carvone (98% pure) 1000 1000 1000
S-carvone (96% pure) 1000 2000 1000
Eugenol (99%) 1000 500 500
Limonene (98%) 3000 3000 2000
Thymol (97%) 1000 200 500
22
6. METODOLOGIA
6.1. OBJETIVO ESPECÍFICO 1: Evaluar el potencial biofungistático de
los extractos etanólicos de LippiaoriganoidesHBK y Thymusvulgaris L como
alternativas de manejo de Colletotrichummusae y Botrytiscinereain vitro e in
vivo.
6.1.1. Recolección material vegetal
El material vegetal de LippiaOriganoides y Thymusvulgaris se obtuvo de parcelas
establecidas de la colección de trabajo de plantas medicinales y aromáticas del
Centro Experimental (CEUNP) de la Universidad Nacional de Colombia Sede
Palmira, donde predominan suelos vertisoles, y se registran temperaturas promedio
de 25°C y una humedad relativa de 83%.
6.1.2. Obtención de extractos etanólicos
Para la obtención extractos etanólicos (EE), el follaje de ambas especies, se
cosechó manualmente y se colocó en bandejas durante tres días a la sombra a
condiciones ambientales del laboratorio de Fitoquímica de la Universidad Nacional
de Colombia Sede Palmira, donde se registran temperaturas promedio de 25°C y
una humedad relativa de 83%.
Posteriormente se molieron 50 gramos de material vegetaldesecado de cada
especie que contenía 42% de humedad, y se dispusieron en dos reservorios porta
muestras cada uno de 10 cms de diámetro al cual se le adicionó 180 ml etanol al
98% de pureza (Figura 5a). Los dos reservorios se sellaron para evitar la
volatilización de los fitocompuestos y se almacenaron durante 3 días a una
temperatura promedio de 25 °C. Al cabo de este tiem po, se extrajeron los
percolados o concentraciones etanólicos los cuales fueron rotoevaporados con un
23
equipo modelo R-114 marca Buchi (Figuras 5b, 5c); en este proceso se recuperó
176 ml de etanol de los reservorios que contenían el material deLippiaoriganoides y
Thymusvulgaris respectivamente, y se obtuvieron 10 gramos de materia seca de
extracto final (con 0% de humedad relativa) en cada caso (Figuras 5d, 5e).
Figura 5. a) Percolación del etanol en los materiales vegetales. b) y c) rotaevaporación y secado en la campana de vacío. d) Extracto de L. origanoides y e) Extracto de T. vulgaris. Fuente: Fotos del autor, 2012.
6.1.3. Aislamiento de B. cinerea y C. musae
Los hongos patógenos estudiados se aislaron de muestras de fresas (Fragaria sp)
afectadas por Botrytis cinérea, y bananos (Musa acuminata) de la variedad
GrossMitchel afectados por Colletotrichummusae. Las muestras de ambos frutos
fueron colectados en una finca productora de frutales de la vereda El Castillo, del
municipio de Palmira Valle. Las muestras se guardaron en cámaras húmedas
(humedad relativa 98%) a fin de estimular el crecimiento de los patógenos.
b
d
c
e
a
24
El reconocimiento de las colonias fungosas se realizó mediante el método de
impronta (Lopezet al., 2006); donde se montaron placas con azul de algodón
y se observaron al microscopio a 40x; para hacer la identificación de
estructuras fungosas se utilizaron las claves de Barnett (1972) y Pardo
(1995). Una muestra de los cultivos puros se sembró en PDA inclinado y se
refrigeraron a 8 °C.
6.1.4. Evaluación in vitro del potencial biofungistático de EE de L.
origanoides y T. vulgaris como alternativa de manejo de B. cinerea y C.
musae.
Para la evaluación in vitro, se realizó la Determinación de la Concentración Mínima
Inhibitoria mediante el método de dilución en caldo de los extractos a los cuales se
les atribuye actividad fungistática (CMI), según lo establecido en el documento
EUCAST, ED 7.1 (Rodriguez-Tudela et al., 2008) como se documenta a
continuación.
6.1.4.1. Preparación de la solución inicial del ext racto etanólico (SI)
La solución inicial (o solución madre) del EE, (de donde se sacaron posteriormente
las soluciones diluidas para los ensayos in vitro) se realizó en un matraz volumétrico
de 10 ml, al cual se le adicionó 1,5 ml del disolvente dimetilsulfóxido (DMSO), 75 mg
del extracto etanólico y se completó el volumen de 10 ml del matraz con agua
destilada esterilizada. Esta solución de concentración 7500 mg/l, se rotuló y refrigeró
hasta su uso en los bioensayos (Santacoloma, F. 2004).
25
6.1.4.2. Preparación de las Soluciones Diluidas (SD ) de los extractos etanólicos(EE).
Se prepararon tres diluciones de 500, 256, 128m g/L. El volumen de 15 ml de cada
una de las cajas Petri, se obtuvo mezclando 14 ml de PDA con 1 ml de la SD. Las
soluciones se prepararon mezclando cantidades determinadas de la SI previamente
filtradas a través de unidades de filtración Millipore de 0,22 µm con volúmenes
variables de agua esterilizada para completar en todos los casos, 1 ml de la SD
(Tabla 5).
Tabla 5. Preparación de concentraciones para el método de dilución en agar.
Concentració
n de la SI
(mg/L)
Volumen
de la SI
(µL)
Volumen de
agua
destilada
(µL)
Concentración
de las SD
(mg/L)
Concentración final
del extracto después
de la adición de 14 mL
de PDA (mg/L)
7500 1000 0 7500 500
7500 512 488 3840 256
7500 256 744 1920 128
6.1.4.3. Preparación e inoculación de las cajas de petri
La preparación se realizó colocando 14 mL de agar fundido en cada uno de los
matraces que contenían adicionalmente 1 mL de SD, se mezcló y se adicionó el
contenido del matraz en una caja Petri esterilizada, y se dejó que se solidificara
(Figura 6).
26
Los esclerocios aislados previamente de las muestras infestadas, se desinfectaron
con hipoclorito de sodio al 1% durante un minuto, luego con etanol al 70% durante
un minuto y posteriormente se sumergieron en agua destilada estéril, luego se
sembraron en cajas de Petri (cinco esclerocios por caja) con papa-dextrosa-agar
(PDA) como medio de cultivo, y se incubaron a 25 oC hasta obtener micelio. Con el
micelio obtenido se realizó tres siembras para obtener cultivo puro el cual se
conservó en PDA inclinado refrigerado a 8 °C. Para la inoculación del hongo
patógeno se colocó un disco de 5 mm de diámetro de micelio en el centro de cada
caja de Petri, se taparon, se sellaron con cinta parafilm, se rotularon y se incubaron
a 25 oC por cinco días.
Figura 6. a) Soluciones iniciales de extractos de Thymusvulgaris y Lippiaoriganoides; b) Discos y crecimiento micelial con las diferentes concentraciones del extracto.Fuente fotos: Autor, 2012.
6.1.4.4 Determinación del porcentaje de inhibición.
La inhibición del crecimiento se evaluó haciendo medición del diámetro del micelio
cada 24 horas durante cuatro días, en todas las repeticiones del experimento.
Se determinó el porcentaje de inhibición a partir de la siguiente ecuación propuesta
por Sztejnberg (1987) (Alzate et al., 2009):
a b
27
% �������ó� = �� − � �� ��!� �"# � !! $ % "��"�!� �"#�� ��!� �"# � !! $ % " &"�'# � ( � ����)* � ���
6.1.5. Evaluación in vivo del potencial biofungistá tico de EE de L. origanoides HBK y T. vulgaris L. como alternativa de manejo de B. cinérea y C. musae
La Figura 7 presenta el diagrama de flujo del proceso de Evaluación in vivo de la capacidad fungistática de EE de L. origanoides HBKy T. vulgaris L. sobre B. cinerea y C. musae.
Figura 7. Esquema del proceso de la evaluación in vivo de la capacidad fungistática de EE de L. origanoides y T. vulgaris sobre B. cinerea y C. musae.
28
6.1.5.1. Acondicionamiento de los frutos
Se seleccionaron frutos en escala de madurez No 4 según establece las (Normas
NTC 4130 1997) para fresa variedad Chandler y escala de madurez No 4 según lo
establece (Piña et al., 2006) para el banano. Ambos índices se representan en la
Figura 8.
Figura 8. Escala de madurez de: a) fresa (NTC 4130) y b) banano Piña et al., 2006. Fuente: fotos del autor, 2012.
Posteriormente se lavaron con agua esterilizada y una solución de hipoclorito
al 1%. Los frutos lavados se pesaron, y se les aplicó los tratamientos.
6.1.5.2. Preparación de la suspensión de esporas y prueba de
Patogenicidad
Un importante requisito, previo a la experimentación, es evaluar la patogenicidad de
los hogos estudiados. En este paso se comprobó la eficacia de infección de las
esporas que se emplearon en la experimentación.
Para ello, inicialmente se preparó una suspensión del micelio del hongo agregando
agua destilada esterilizada en una caja de Petri que contenía micelio recién
a b
29
sembrado, luego se raspó la superficie de la caja y se filtró la solución a través de
una capa de gasa esterilizada; la suspensión filtrada se diluyó con agua destilada
esterilizada hasta obtener la concentración de 1x 105 esporas.(Figura 9).
Figura 9. Esporas en la cámara de Neubawer en microscopio. a) Esporas de Botrytiscinerea. b) Esporas de Colletotrichummusae.Fuente de fotos: Autor, 2012.
Posteriormente se preparó la suspensión de esporas de 1.x105 esporas * ml-1; La
solución se dispuso en un atomizador y se mantuvo en agitación hasta la
inoculación de los frutos. Para esta prueba previa al ensayo in vitro e in vivo, se
emplearon 2 frutos, los cuales se asperjaron con la solución de esporas y se
almacenaron en cámaras húmedas durante 72 horas, al cabo de este tiempo se
determinó el porcentaje de infección. Se utilizaron 4 frutos sanos como testigos.
6.1.5.3. Preparación de los tratamientos de inocula ción.
Se empleó la misma metodología descrita en el numeral 6.1.4.3 para realizar las
diluciones, y solo se utilizaron las concentraciones de 500 y 256 mg/l, que fueron las
que previamente presentaron un porcentaje de inhibición de crecimiento superior al
30
50% en la prueba in vitro. Las diluciones se llevaron a un volumen final de 300ml
(Figura 10).
Figura 10. Soluciones diluidas con a) aceites esenciales y b) extractos etanólicos empleados en ensayo in vivo Fuente:fotos del Autor, 2012.
6.1.5.4. Aplicación de los tratamientos
Siguiendo la metodología propuesta por (Alvarado et al., 2011), se hirieron los cinco
frutos de cada tratamiento con una aguja de disección en condiciones de esterilidad;
la lesión fue de 2 mm de profundidad por 2mm de ancho en la parte superior del
fruto cerca al pedúnculo. Posteriormente se colocaron en los vasos de precipitado
que contenían la solución del tratamiento a evaluar, de manera que quedaron
totalmente cubiertos durante 5 segundos para posteriormente colocarlos en una
superficie lisa dentro de la campana de flujo laminar, donde se secaron durante 5
minutos a una temperatura de 25°C y HR de 69%. Fina lmente se asperjaron con la
solución de esporas de 1.x105 esporas * ml-1.
Este mismo procedimiento se realizó para los tratamientos testigos; salvo que se
dispuso etanol al 98% de pureza en el vaso de precipitado, y en otro, una solución
del fungicida de síntesis química Benomil con una concentración de 100 µg/ml; en
estos se sumergieron los frutos.
a b
31
Los testigos negativos fueron los frutos que fueron inoculados sin previa aplicación
de ningún tratamiento o solución anti-fúngica.
6.1.5.5. Almacenamiento de los frutos
El bioensayo in vivo se realizó en un sistema de almacenamiento donde los
tratamientos tuvieron las condiciones más homogéneas posibles de iluminación,
temperatura (25°C promedio monitoreada con un termó metro de mercurio) y
humedad (usando un atomizador con agua destilada se humedecía el polipapel
absorbente cada 48 horas).
El sistema de almacenamiento consistió en contenedores plásticos individuales que
se estibaron para el bioensayo con bananos (Figura 11a), y recipientes plásticos
herméticos para las fresas (Figura 11b). El modelo fue óptimo para el periódico
seguimiento y registro de las mediciones. Los cinco bananos de cada tratamiento se
colocaron dentro de cada uno de los contenedores plásticos, y 10 fresas se
introdujeron en cada recipiente hermético (2 tratamientos: similar tipo de extracto y
dos concentraciones cada uno). Los frutos fueron separados a una distancia
aproximada de 2 a 3 cm.
Figura 11. Sistemas de almacenamiento empleado en el bioensayo a) Contenedores plásticos estibables b) recipientes plásticos herméticos con cama de polipapel absorbente.Fuente: Fotos del Autor, 2012.
a b
32
6.1.5.6. Evaluación de índice de severidad y porcen taje de control.
Siguiendo la metodología propuesta por (Alvarado et al., 2011) se aplicó una
escala de infección para evaluar el índice de severidad de los frutos del
bioensayo. Se emplearon 5 frutos los cuales fueron desinfectados, heridos y
asperjados según lo descrito en los numerales 6.1.5.1 y 6.1.5.4. Se
realizaron observaciones de los frutos cada 12 horas durante 5 días; se midió
el diámetro de las lesiones, en cada periodo de seguimiento se verificó la
relación de la infección presentada con respecto a la infección total del fruto
en el tiempo. A partir de estos datos se elaboró un diagrama pictográfico que
se utilizó en el experimento de fresa y banano respectivamente. (Figura 24).
Esta escala presenta las siguientes categorías siendo el porcentaje de
infección del fruto correspondiente hasta el siguiente indicador porcentual: 0=
0%, 1= 5%, 2= 15%, 3= 45%, 4= 75% y 5= 100% de infección por fruto.
Esta escala diagramática se utilizó para seguir el progreso de la infección de
los frutos a las 48, 96 y 120 horas; adicionalmente se determinó el porcentaje
de control de cada tratamiento sobre los hongos patógenos evaluados, en
función del porcentaje de infección presentado por el testigo negativo tal
como se evidencia en la siguiente ecuación. Con los datos resultantes se
ejecutó un análisis de varianza.
% �#�"�#% �� +�+# = �� − � % ��( ���ó� (�,"#& "��"�$#& − ��� �% ��( ���ó� " &"�'# � '�"�+# − ��� �)* � ���
33
6.2. OBJETIVO ESPECIFICO 2: Evaluar el potencial biofungistáticode los
aceites esenciales de LippiaoriganoidesHBK. yThymusvulgaris L. sobre
Colletotrichummusaey Botrytiscinereain vitro e in vivo.
6.2.1. Recolección material vegetal
Simultánea con el mismo procedimiento descrito en el numeral 6.1.1.
6.2.2. Obtención de aceites esenciales
Para la obtención AE, el follaje de Lippiaoriganoidesy Thymusvulgaris se expuso en
bandejas durante tres días a la sombra a condiciones ambientales del laboratorio de
Fitoquímica de la Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira: temperatura
promedio de 25 °C y 83% de humedad relativa.
Los AE se obtuvieron mediante el método hidrodestilación, empleando un equipo
de destilación tipo Clevenger, para lo cual se troceó (en pedazos de 1 a 3 cm) las
hojas de las especies desecado (45% de humedad); seguidamente se dispuso 100
gr de dichos trozos de hojas en el reservorio de vidrio del montaje piloto de
hidrodestilación (Figura 2b). En todas las corridas de destilación se empleó 200 ml
de agua destilada la cual se dispuso en un matraz redondo y se calentó con una
estufa eléctrica marca Haceb, a una temperatura constante de 80°C. Se empleó una
trampa Clevenger para la separación de fases (hidrolato- aceite esencial) una vez
condensado el vapor del proceso. Pasó seguido, se retiró el aceite y se le agregó 5
gr de sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) por cada mililitro del mismo, con el fin de
secar los residuos de humedad y evitar la oxidación del mismo. El AE se rotuló y
conservó a temperatura de 10°C.
El proceso se detuvo a los 90 minutos, a partir del momento de ebullición del agua
destilada.
34
Se midió el volumen del AE extraído cada 15 min a fin de determinar el modelo de
rendimiento de obtención de AE en el tiempo. Este análisis del rendimiento de
extracción en el tiempo, pretendió evaluar la viabilidad del escalonamiento del
proceso una vez demostrado su potencial biofungistático.
6.2.3. Aislamiento de B.cinerea y C. musae
Se realizaron simultáneamente los procedimientos descritos en el numeral 6.1.3.
6.2.4. Evaluación in vitro el potencial biofungistá ticode AE de L.
origanoides y T. vulgaris sobre B. cinérea y C. musae
Se realizaron simultáneamente los procedimientos descritos en el numeral 6.1.4.
6.2.5. Evaluación in vivo el potencial biofungistát icode AE de L.
origanoides y T. vulgaris sobre B. cinérea y C. musae
Se realizaron simultáneamente los procedimientos descritos en el numeral 6.1.5.
6.3. DISEÑO EXPERIMENTAL
6.3.1. Bioensayo in vitro
Los tratamientos usados en el ensayo in vitro, se organizaron en la estructura
factorial aumentada 23 x 3 + 1 testigo, para un total de 25 tratamientos, cada uno
con tres repeticiones. El esquema del bioensayo in vitro se representa en la Figura
35
12 donde se muestran los factores: especie vegetal (niveles L. origanoidesy T.
vulgaris), tipos de extractos (niveles AE y EE) y patógeno (niveles C. musaey B.
cinerea), en cada tratamiento se evaluaron por tres concentraciones (500, 256 y 128
mg/l) y se tomó como referencia un solo testigo: el negativo.
La variable de respuesta estudiada fue el porcentaje de inhibición. Se realizó un
análisis de varianza utilizando el software estadístico SAS
(StatisticalAnalysisSystem) Versión 9.3.1, 2012.
36
Figura 12. Esquema del bioensayo in vitro donde se evaluaron los factores: especie vegetal (con dos niveles L. origanoidesy T. vulgaris), tipos de extractos (con dos niveles AE y EE) y patógeno (con dos niveles C. musaey B. cinerea). Para cada tratamiento se evaluaron tres concentraciones (500, 256 y 128 mg/l) y un solo testigo: el negativo.
37
6.3.2. Bioensayo in vivo
Se utilizó el mismo modelo estadístico para los dos patógenos estudiados, se
analizaron independientemente. Los tratamientos usados en el ensayo in vivo de la
antracnosis del banano y el moho gris de la fresa, se organizaron en la estructura
factorial aumentada 22 + 3 testigos, para un total de 7 tratamientos, cada uno con
cinco repeticiones, dispuestos en un diseño completamente al azar.
La variable de respuesta en este ensayo fue el porcentaje de control de los
diferentes tratamientos aplicados en las muestras de frutos inoculados y se midió a
las 48,96 y 120 horas. A los datos porcentuales resultantes se les realizó un análisis
estadístico de varianza con el software estadístico SAS
(StatisticalAnalysisSystemVersión 9.3.1, 2012).
Los factores estudiados en el ensayo in vivo para moho gris en fresa y antracnosis
en banano, se describen en las Figura 13 y 14 respectivamente.
38
Figura 13.Esquema del bioensayo in vivo para el control de moho gris en fresa donde se evaluaron los factores: especie vegetal (niveles L. origanoidesy T. vulgaris), y tipos de extractos (niveles AE y EE). Se evaluaron dos concentraciones (500 y 256 mg/l) en cada tratamiento, y dos testigos: Negativo y Etanol.
39
Figura 14. Esquema del bioensayo in vivo para el control de antracnosis en banano,
donde se evaluaron los factores: especie vegetal (niveles L. origanoidesy T. vulgaris), y tipos de extractos (niveles AE y EE). Se evaluaron dos concentraciones (500 y 256 mg/l) en cada tratamiento, y dos testigos: Negativo y Etanol.
40
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 OBTENCIÓN DE ACEITES ESENCIALES
Se elaboró una curva de rendimiento de aceites esenciales para cada especie
evaluada durante el tiempo de proceso (Figuras 15a y 15b). En ambos casos el
modelo de la curva de extracción es exponencial siendo� = �(� − ��(−�))( � =�, ��). Es relevante el análisis de este resultado considerando la naturaleza de la
demanda energética del proceso de extracción, y coincide con la particular
necesidad de optimizar el proceso.
Lo anterior es pertinente debido a que, a mediano y largo plazo, una vez
demostrada el potencial biofungistático de los aceites esenciales, el prospectivo
objetivo de la investigación en estos productos naturales debería ser la
estandarización y desarrollo farmacéuticos del producto biológico a partir de estos
ingredientes naturales. El comportamiento exponencial del proceso muestra que se
obtiene la mayor cantidad de aceite esencial resultante (1,5 y 1,1 ml de AE de T.
Vulgarisy L. Origanoides, respectivamente) en los primeros 45 minutos de proceso,
a partir de este tiempo, la línea de proceso se comporta asintóticamente y los
rendimientos de obtención disminuyen considerablemente obteniendo solo 0,3 ml de
AE en los últimos 45 minutos (Figura 15).
El consumo de energía es una de las principales variables a controlar, las pérdidas
de energía deben ser reducidas al máximo y procurar recuperar calor siempre que el
proceso lo permita, y de esta manera propendiendo a que sea un proceso
económicamente viable (Cerpa et al., 2007; Cuadros y Martinez, 2007). Si bien este
modelo se obtuvo de un proceso en laboratorio, en escala piloto e industrial, la
demanda energética también permanecerá constante durante todo el proceso junto
con la temperatura de extracción (80°C). Lo que har ía completamente ineficiente
continuar el proceso de extracción una vez los rendimientos de extracción tengan un
comportamiento asintótico, (a partir de los 50 minutos).
Figura 15. Curvas de extracción de AE durante 90 minutos de proceso según el modelo obtenido en el programa CurveExpert de tipo exponencial tal que ��(−�) siendo
7.2. EVALUACIÓN in vitro
7.2.1. Prueba de patogenicidad
Para Colletotrichummusae
patogenicidad del 90% en frutos infestados con esporas (
Botrytiscinerea en fresa, el porcentaje de daño fue de 80% después de 72 horas de
incubado (Figuras 16c y 16d). En ambos casos resultó positiva la prueba de
patogenicidad.
a
41
continuar el proceso de extracción una vez los rendimientos de extracción tengan un
comportamiento asintótico, (a partir de los 50 minutos).
Curvas de extracción de AE durante 90 minutos de proceso según el modelo obtenido en el programa CurveExpert de tipo exponencial tal que
siendo � = �, �� para a) Thymusvulgarisy b) Lippiaoriganoides.
in vitro
7.2.1. Prueba de patogenicidad
Colletotrichummusaeen banano, a las 96 horas se obtuvo un nivel de
patogenicidad del 90% en frutos infestados con esporas (Figuras 16a y 1
en fresa, el porcentaje de daño fue de 80% después de 72 horas de
incubado (Figuras 16c y 16d). En ambos casos resultó positiva la prueba de
Tiempo (min)A
E(m
l)
0.0 15.0 30.0 45.00.00
0.33
0.66
0.99
1.32
1.65
1.98
b
continuar el proceso de extracción una vez los rendimientos de extracción tengan un
Curvas de extracción de AE durante 90 minutos de proceso según el modelo obtenido en el programa CurveExpert de tipo exponencial tal que � = �(� −
origanoides.
en banano, a las 96 horas se obtuvo un nivel de
a y 16b). Para
en fresa, el porcentaje de daño fue de 80% después de 72 horas de
incubado (Figuras 16c y 16d). En ambos casos resultó positiva la prueba de
Tiempo (min)
60.0 75.0
42
Figura 16. Pruebas de patogenicidad. a) Banano asperjado con esporas de
Colletotrichummusae al cabo de 72 horas. b) Muestra testigo de bananos. c) fresa asperjadas con esporas de Botrytiscinerea al cabo de 72 horas. d) Muestra testigo de fresas. Fuente fotos: Autor, 2012
7.2.2. Botrytiscinerea
El análisis estadistico permitió detectar diferencias estadisticas significativas entre
las dos especies vegetales evaluadas para el control in vitro de Botrytiscinerea(p<
0,05). Los extractos de LippiaoriganoidesHBKpresentaron mayor porcentaje de
inhibición de crecimiento micelial (37,12%) (Figura 17).
La razón de este resultado es la concentración de metabolitos secundarios a los que
se le atribuye actividad bilógica inhibitoria; según reporta la literatura el metabolito
timol, se encuentra en una concentración de 68% en la especie vegetal
LippiaoriganoidesHBK (Ruiz, 2008), por su parte ThymusvulgarisL contiene una
concentración de timol de 54% (Maher et al., 2011).
a b
c d
Figura 17. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial dado por
LippiaoriganoidesBotrytiscinerea.nivel de (p< 0,05).
Igualmente se evidenciaron diferencias significativas entre
evaluadas (500, 256 y 128 mg/L). La concentración más
mayor porcentaje de porcentaje de inhibición (58,31%); las concentraciones 256 y
128 mg/l tuvieron 40.9 y 40% de inhibición del crecimiento miceliar respectivamente
(Figura 18).
Estos resultados son comparables a los obtenidos por
extractos etanólicos de
mg/l; y el tratamiento de 500 mg/l también presentó mayor inhibición del crecimiento
micelial de Botrytiscinereain vitro,
complementarios con actividad biológica está más concentrado.
Lippia origanoides
Por
ce
nta
je
de
inh
ibi
ció
n
43
. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial dado por LippiaoriganoidesyThymusvulgarisen el control de Botrytiscinerea.Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
Igualmente se evidenciaron diferencias significativas entre las concentraciones
evaluadas (500, 256 y 128 mg/L). La concentración más alta (500mg/L) presentó
mayor porcentaje de porcentaje de inhibición (58,31%); las concentraciones 256 y
128 mg/l tuvieron 40.9 y 40% de inhibición del crecimiento miceliar respectivamente
Estos resultados son comparables a los obtenidos por (Lizcano, 2007)
extractos etanólicos de Thymusvulgarisa tres diferentes diluciones: 150, 250 y 500
mg/l; y el tratamiento de 500 mg/l también presentó mayor inhibición del crecimiento
Botrytiscinereain vitro, lo que se debe a que el metabolito
tarios con actividad biológica está más concentrado.
Lippia origanoides HBK Thymus vulgarisL
a b
. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial dado por en el control de
Letras diferentes indican diferencias significativas al
las concentraciones
alta (500mg/L) presentó
mayor porcentaje de porcentaje de inhibición (58,31%); las concentraciones 256 y
128 mg/l tuvieron 40.9 y 40% de inhibición del crecimiento miceliar respectivamente
) quien evaluó
a tres diferentes diluciones: 150, 250 y 500
mg/l; y el tratamiento de 500 mg/l también presentó mayor inhibición del crecimiento
lo que se debe a que el metabolito
Figura 18. Promedio porcentaje de Inhibición de concentraciones 500, 256 y 128 mg/l de los extractos y aceites esenciales evaluados. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
Se detectaron diferencias estadísticas significativas entre
evaluados. Los aceites esenciales presentaron una media superior de porcentaje de
inhibición de crecimiento de micelio (41,91%) comparado con 27,77% obtenido con
los extractos etanólicos (Figura 1
Por
ce
nta
je
de
inh
ibi
ció
n
44
. Promedio porcentaje de Inhibición de Botrytiscinereaconcentraciones 500, 256 y 128 mg/l de los extractos y aceites esenciales evaluados. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
Se detectaron diferencias estadísticas significativas entre los dos tipos de extractos
evaluados. Los aceites esenciales presentaron una media superior de porcentaje de
inhibición de crecimiento de micelio (41,91%) comparado con 27,77% obtenido con
los extractos etanólicos (Figura 19).
Concentración mg/ L
a
b
b
Botrytiscinerea de las concentraciones 500, 256 y 128 mg/l de los extractos y aceites esenciales evaluados. Letras diferentes indican diferencias
los dos tipos de extractos
evaluados. Los aceites esenciales presentaron una media superior de porcentaje de
inhibición de crecimiento de micelio (41,91%) comparado con 27,77% obtenido con
Figura 19. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de los aceites esenciales y extractos etanólicosevaluadas. Letras diferentes diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
La interacción concentración y
significancia (p< 0,0002). El
mg/L), presentó la mayor media de porcentaje de inhibición (66,1%), y el extracto
etanólicocon una concentración de
Estos resultados son comparables con l
quienes evaluaron el potencial biocontrolador de aceites esenciales y extractos
etanólicos de Viola odorata
esencial presentó una mayor actividad inhibitoria que el extracto etanólico
al., 2011).
Por
ce
nta
je
de
inh
ibi
ció
n
45
. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de Botrytiscinerealos aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies vegetales evaluadas. Letras diferentes diferencias significativas al nivel de (p<
La interacción concentración y tipo de extracto mostraron altos niveles de
(p< 0,0002). El aceite esencial con la concentración más alta (
mg/L), presentó la mayor media de porcentaje de inhibición (66,1%), y el extracto
con una concentración de 128 mg/L, la menor (24,1%) (Tabla 6;
Estos resultados son comparables con lo reportado por (Hammami
l potencial biocontrolador de aceites esenciales y extractos
Viola odorata sobre B. cinerea, in vitro, encontrando, que el aceite
esencial presentó una mayor actividad inhibitoria que el extracto etanólico
Método de extracción
b
a
Botrytiscinerea por de las especies vegetales
evaluadas. Letras diferentes diferencias significativas al nivel de (p<
mostraron altos niveles de
aceite esencial con la concentración más alta (500
mg/L), presentó la mayor media de porcentaje de inhibición (66,1%), y el extracto
Tabla 6; Figura 20).
Hammami et al., 2011)
l potencial biocontrolador de aceites esenciales y extractos
encontrando, que el aceite
esencial presentó una mayor actividad inhibitoria que el extracto etanólico(Fang et
46
Tabla 6. Efecto de las concentraciones (128, 256 y 500 mg/L) y los dos tipos de extractos (aceite esencial y extracto de etanol) sobre la porcentaje de inhibición de Botrytiscinerea.
CONCENTRACIÓN mg/L
TIPO DE EXTRACTO
PROMEDIO 1
EE AE
Inhibición (%)
128 24.16 56.01 40.08 b
256 36.48 45.46 40.97 b
500 50.46 66.16 58.31 a
PROMEDIO 2 37.03 b 55.88 a 1y2 Promedios en la fila y la columna con diferente letra difieren significativamente
Figura 20. Inhibición del crecimiento del micelio de Botrytiscinerea en concentraciones
del extracto etanólico de Lippiaoriganoides a, b, c, d respectivamente y la Inhibición del crecimiento del micelio de Botrytiscinerea por las concentraciones de aceites esenciales de Tymusvulgarise,f,g,h respectivamente. Fuente: fotos del autor, 2012.
a b c d
e f g h
47
La Anexo 1 presenta los resultados de los análisis de varianza realizados con el
software estadístico SAS que, de acuerdo a la comparación de media Duncan (p<
0,05), indican diferencias significativas para la evaluación in vitro de las especies y
métodos de extracción sobre el control del hongo patógeno Botrytiscinerea.
7.2.3. Colletotrichummusae
El análisis estadístico detectó diferencias estadisticas significativas entre los dos
tipos de extractos evaluados (p< 0,05). (Figura 21). Los aceites esenciales
presentaron una media superior de porcentaje de inhibición de Colletotrichummusae
(53,72%).
Este resultado coincide con lo reportado por (Tellez et al., 2001), quienes utilizaron
ambos tipos de extractos para el control de Colletotrichumspp reportaron un
promedio de inhibición del patógeno más alto con el aceite esencial.
Figura 21. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de por los aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies vegetales evaluadas. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel d(p< 0,05).
De igual forma, se detectaron diferencias entre
256 y 128 mg/L). La concentración más alta (500
de inhibición (65,25%). Las concentraciones 256 y 128 mg/L tuvieron 54.28 y
48.09% de inhibición de
(Alzate et al., 2009)evaluaron
resultados obtenidos (21.2 y 28.0% respectivamente), corroboran que entre mayor
sea la concentración utilizada mayor será la respectiva inhibición de crecimiento.
Por
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inh
ibi
ció
n
48
. Porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de Colletotrichummusaepor los aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies vegetales evaluadas. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel d
De igual forma, se detectaron diferencias entre las concentraciones evaluadas (500,
256 y 128 mg/L). La concentración más alta (500mg/L) presentó el mayor porcentaje
de inhibición (65,25%). Las concentraciones 256 y 128 mg/L tuvieron 54.28 y
48.09% de inhibición de Colletotrichummusae respectivamente (Figura 2
evaluaron concentraciones de AE de tomillo a 350 y 400 mg/l los
resultados obtenidos (21.2 y 28.0% respectivamente), corroboran que entre mayor
sea la concentración utilizada mayor será la respectiva inhibición de crecimiento.
Tipo de extracto
a
b
Colletotrichummusae por los aceites esenciales y extractos etanólicos de las especies vegetales evaluadas. Letras diferentes indican diferencias significativas al nivel de
las concentraciones evaluadas (500,
mg/L) presentó el mayor porcentaje
de inhibición (65,25%). Las concentraciones 256 y 128 mg/L tuvieron 54.28 y
respectivamente (Figura 22).
concentraciones de AE de tomillo a 350 y 400 mg/l los
resultados obtenidos (21.2 y 28.0% respectivamente), corroboran que entre mayor
sea la concentración utilizada mayor será la respectiva inhibición de crecimiento.
Figura 22. Efecto de las concentraciones de los extractos y aceites esenciales (500,
256 y 128 mg/L), sobre el porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial de Colletotrichummusae. diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
La interacción entre las variables especie y tipo de extracto mostraron niveles de
significancia (p< 0,005). El
media del porcentaje del crecimiento micelial (60,23%) seguida del aceite esencial
de Thymusvulgaris con una media de porcentaje de inhibición igual a 47,22%
(Figura 23).
Estos resultados son comparables a los reportados por
quienes evaluaron la actividad antifúngica de los extractos de
yThymusvulgaris sobre
esenciales de Lippiaobtuvier
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. Efecto de las concentraciones de los extractos y aceites esenciales (500, 256 y 128 mg/L), sobre el porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial
Colletotrichummusae. Promedios de diferentes letras indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
La interacción entre las variables especie y tipo de extracto mostraron niveles de
(p< 0,005). El aceite esencial de Lippiaoriganoides presentó la mayor
del porcentaje del crecimiento micelial (60,23%) seguida del aceite esencial
con una media de porcentaje de inhibición igual a 47,22%
Estos resultados son comparables a los reportados por (Anaruma
quienes evaluaron la actividad antifúngica de los extractos de
sobre Colletotrichum en maracuyá, encontrando que los aceites
obtuvieron un mayor rendimiento de porcentaje de inhibición.
Concentración mg/L
. Efecto de las concentraciones de los extractos y aceites esenciales (500, 256 y 128 mg/L), sobre el porcentaje de Inhibición del crecimiento micelial
diferentes letras indican
La interacción entre las variables especie y tipo de extracto mostraron niveles de
presentó la mayor
del porcentaje del crecimiento micelial (60,23%) seguida del aceite esencial
con una media de porcentaje de inhibición igual a 47,22%
Anaruma et al., 2010),
quienes evaluaron la actividad antifúngica de los extractos de Lippiaspp.
en maracuyá, encontrando que los aceites
on un mayor rendimiento de porcentaje de inhibición.
Figura 23. Efecto de los tipos de extracto de el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial de Colletotrichummusae.significativas al nivel de (p< 0,05).
La interacción entre las variables concentración y tipo de extracto mostraron
significancia alta (p< 0,0001). Los aceites esenciales con una concentración de 256
y 500 mg/L presentaron las medias de porcentaje de inhibición más altas (81,94 y
74,72%), por otra parte, los
mg/L, presentaron las medias de porcentaje de inhibición
más bajas (81,94 y 74,72%), (
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AE EE
L. origanoides
50
. Efecto de los tipos de extracto de Lippiaoriganoides y Thymusvulgarisel porcentaje de inhibición de crecimiento micelial de Colletotrichummusae. Promedios con diferente letra indican diferencias significativas al nivel de (p< 0,05).
entre las variables concentración y tipo de extracto mostraron
(p< 0,0001). Los aceites esenciales con una concentración de 256
y 500 mg/L presentaron las medias de porcentaje de inhibición más altas (81,94 y
74,72%), por otra parte, los extracto etanólicoscon concentraciones de
mg/L, presentaron las medias de porcentaje de inhibición de Colletotrichummusae
más bajas (81,94 y 74,72%), (Tabla 7).
AE EE
L. origanoides HBK
AE EE
T. vulgaris L
Thymusvulgaris en el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial de
Promedios con diferente letra indican diferencias
entre las variables concentración y tipo de extracto mostraron
(p< 0,0001). Los aceites esenciales con una concentración de 256
y 500 mg/L presentaron las medias de porcentaje de inhibición más altas (81,94 y
con concentraciones de 128 y 256
Colletotrichummusae
51
Tabla 7. Efecto de las concentraciones (128, 256 y 500 mg/L) y los dos tipos de extractos (aceite esencial y extracto de etanol) sobre la porcentaje de inhibición de Colletotrichummusae.
CONCENTRACIÓN mg/L TIPO DE EXTRACTO
PROMEDIO1 EE AE Inhibición (%)
128 31.94 58.24 45.09 c 256 33.85 74.72 54.28 b 500 48.56 81.94 65.25 a PROMEDIO2 38.11b 71.63 a
1y2 Promedios en la fila y la columna con diferente letra difieren significativamente
7.3. EVALUACIÓN in vivo
7.3.1. Escala diagramática para índice de severidad y porcentaje de infección.
Siguiendo el modelo propuesto por (Alvarado Hernández et al., 2011) se obtuvo un
diagrama pictográfico cuya escala presenta los valores y correspondientes
porcentajes de infección, a saber: 0= 0%, 1= 5%, 2= 15%, 3= 45%, 4= 75% y 5=
100% (Figura 24).
Escala a)
0= 0%
1= 5%
2= 15%
3= 45%
4= 75%
5= 100%
52
a) b)
53
Figura 24. Diagrama pictográfico que exhibe la escala de porcentaje de infección de a) Botrytiscinerea en fresa. b) Coletotrichummusae en el banano. Fuente: fotos del autor, 2012.
7.3.2. Botrytiscinerea en fresa
El análisis estadístico evidenció que el testigo etanol tuvo la media de porcentaje de
control más alta de 95,3%. Esto se debe a que el crecimiento del micelio en
presencia de etanol (98%) es bajo. Esto no necesariamente significa que el etanol
es la mejor alternativa de control del patógeno en estudio, puesto que el elevado
costo del reactivo hace que sea ineficiente su uso para este fin.
Los aceites esenciales con concentración de 500 mg/l presentaron estadísticamente
la media de porcentaje de control más alta, 94,3 y 93,6 comparado con lo obtenido
por la concentración 256 mg/l evaluada 92,2 y 88,8 para
LippiaoriganoidesyThymusvulgaris respectivamente (Figura 25). Este resultado es
comparable con lo obtenido por (Soylu et al., 2010) quien evaluó tres
concentraciones (35, 75 y 100 mg/l) de aceites esenciales de Origanumsyriacumen
el control in situ de Botrytiscinerea, obteniendo de igual forma una correlación entre
mayor concentración de los aceites esenciales mayor porcentaje de control del
patógeno.
54
Figura 25. Porcentaje de control in vivo de EE y AE en concentraciones de 500 y
256 mg/l, de LippiaoriganoidesyThymusvulgarisy los testigos etanol, negativo y etanol evaluados sobre Botrytiscinereaen fresa.
Los dos tipos de extractos evaluados presentaron diferencias significativas (Figuras
26 y 27), los aceites esenciales presentaron mayores porcentajes de control que los
extractos etanólicos, Los resultados coinciden con los obtenidos en las pruebas in
vitro; y ocurre debido a que los metabolitos secundarios volátiles con actividad
promisoria biocontroladora, se encuentran de forma concentrada en los aceites
esenciales por el mecanismo de volatilización-condensación empleado en su
obtención, mientras que la extracción con etanol, conlleva necesariamente el
arrastre de otros compuestos de la planta en elevadas concentraciones; dichas
impurezas pueden afectar el potencial biocontrolador(Hammami et al., 2011). Esto
coincide con lo reportado por (Fang et al., 2011) quienes evaluaron el potencial
biocontrolador de aceites esenciales y extractos etanólicos de Viola odorata en el
control de B. cinerea, in vitro e in vivo, en ambos casos, los aceites esenciales,
poseen una mayor actividad antifúngica que los extractos etanólicos.
Por
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Tratamientos
El porcentaje de control de
120 horas (Figura 26, Anexo 2), no presentó diferencias significativas con lo
obtenido por los tratamientos de
potencial de estas especies vegetales como alt
este patógeno, que mitigan los impactos ambientales y los daños a la salud de
operadores en cosecha
evitando por ejemplo los altos riesgos de cáncer por estar expuestos a fungicidas de
síntesis química (Wilson
Figura 26. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control vivo de Botrytisvulgarisy tres testigos: negativo, etanol y Benomil.
Por
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El porcentaje de control de 85%, del tratamiento de síntesis química Benomil a las
, Anexo 2), no presentó diferencias significativas con lo
obtenido por los tratamientos de Lippiaoriganoides(81,75%)lo que confirma el
potencial de estas especies vegetales como alternativas eficientes para el control de
este patógeno, que mitigan los impactos ambientales y los daños a la salud de
operadores en cosecha-poscosecha y al consumidor final (Jacometti
evitando por ejemplo los altos riesgos de cáncer por estar expuestos a fungicidas de
Wilson et al., 1997).
. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control Botrytiscinereapor las especies vegetales L. origanoides
y tres testigos: negativo, etanol y Benomil.
Tiempo (horas)
85%, del tratamiento de síntesis química Benomil a las
, Anexo 2), no presentó diferencias significativas con lo
(81,75%)lo que confirma el
ernativas eficientes para el control de
este patógeno, que mitigan los impactos ambientales y los daños a la salud de
Jacometti et al., 2010),
evitando por ejemplo los altos riesgos de cáncer por estar expuestos a fungicidas de
. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control in L. origanoidesy T.
56
Figura 27. Efecto de control de los tratamientos de AE y EE de L.origanoides sobre la infección de Botrytiscinerea en fresa.Fuente: fotos del autor, 2012.
7.3.3. Colletotrichummusaeen banano
El análisis estadístico evidenció que el testigo con etanol obtuvo mayor porcentaje
de control sobre el patógeno esto se debe a que el crecimiento del micelio en
presencia de etanol al 98% de pureza inviable (López et al., 2006) (Figura 28).
También se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de extracto Los
aceites esenciales presentaron una media de porcentaje de control de 69,2%,
mientras que los extractos etanólicos un promedio de 52,83%. Estos resultados
coinciden con lo obtenido por (Ranasinghe et al., 2002) quienes evaluaron extractos
y aceites esenciales de Cinnamomumzeylanicum obteniendo mayor control e
inhibición de crecimiento de Colletotrichummusaecon los aceites esenciales que con
los extractos etanólicos.
a b c
d e f
57
Figura 28. Porcentaje de control in vivo de EE y AE de LippiaoriganoidesyThymusvulgarisen concentraciones de 500 y 256 mg/l y los testigos etanol, negativo y etanol evaluados sobre Colletotrichummusaeen Banano.
En el caso de los aceites esenciales, se evidencian diferencias significativas entre
las dos concentraciones evaluadas de 256 y 500 mg/l, siendo la concentración de
500 mg/l la que presentó menor porcentaje de control equivalente a 75,7 y 68,3%
para Thymusvulgaris y Lippiaoriganoidesrespectivamente (Figura 29, 30).
En el Anexo 3 se exponen los de porcentaje de control y su correspondiente nivel
de significancia por prueba de Duncan, obtenidos por los diferentes tratamientos
evaluados en el bioensayo in vivo sobre C. musaeen banano a las 48, 96 y 120
horas. Lo tabulado se observa en la Figura 29 donde se evidencia que el testigo de
etanol presentó mayor porcentaje de control sobre C. musae. Este resultado
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so
bre
C.
mu
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Tratamientos
58
coincide con lo evaluado por (López et al., 2006) quienes reportaron en su ensayo
que el testigo etanol tuvo mejores resultados que los mismos tratamientos de
Lippiaoriganoides empleados en el control de Colletotrichummusae.
Entre las dos especies vegetales que fueron evaluadas en el bioensayo mostraron
diferencias significativas al cabo de 120 horas (Anexo 3).
Por otro lado, debe resaltarse que el porcentaje de control registrado por el testigo
de síntesis química Benomil al cabo de las 120 horas (56,4%;
Figura 2929, Anexo 3), no presentó diferencias significativas con lo obtenido por las
especies vegetales L. origanoidesy T. vulgaris, con base en esto se puede postular
las especies vegetales como alternativas eficientes para el control de este patógeno,
lo que resulta conveniente por dos razones: su origen natural significa mitigar
impactos sobre la salud de las personas y el medio ambiente por el uso
indiscriminado de productos antifúngicos de síntesis química, y que estos extractos
naturales pueden ser considerados de bajo riesgo para el desarrollo de resistencia
de hongos patógenos (Hernández-Albíter et al., 2007). Los derivados naturales de
plantas pueden proveer una amplia variedad de compuestos como alternativa de los
fungicidas de síntesis química (Jacometti et al., 2010).
Figura 29. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control vivo de ColletotrichummusaeT. vulgarisy tres testigos: negativo, etanol y Benomil.
Figura 30. Efecto de control de los tratamientos de AE y EE de
la infección de Fuente: fotos del autor, 2012.
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. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control Colletotrichummusaepor las especies vegetales L. origanoides
y tres testigos: negativo, etanol y Benomil.
Efecto de control de los tratamientos de AE y EE de L.origanoidesla infección de Colletotrichummusae en banano al cabo de 48 horas. Fuente: fotos del autor, 2012.
Tiempo (horas)
. Progreso en el tiempo (48, 96 y 120 horas) del porcentaje de control in L. origanoidesy
L.origanoides sobre en banano al cabo de 48 horas.
60
8. CONCLUSIONES
Las especies vegetales T. vulgarisy L. origanoidesson promisorias y eficientes
alternativas en el control de los hongos patógenos C. musaey B. cinérea, en vista de
los resultados obtenidos en los ensayos in vitro, y confirmados en el ensayo in vivo.
Cabe resaltar que hubo una marcada tendencia en la experimentación por parte de
la especie vegetal Lippiaoriganoides, la cual presentó los porcentajes más altos de
inhibición y control de los patógenos estudiados por encima de lo reportado por
Tymusvulgaris.
De igual forma, los resultados de la presente investigación permiten observar una
tendencia de directa proporcionalidad entre la concentración de los agentes anti-
fúngicos y la inhibición y porcentaje de control de los patógenos estudiados. Siendo
la concentración de 500 mg/l la que reportó mejores indicadores.
Por otra parte, de los dos tipos de extractos estudiados, el aceite esencial presentó
mayores porcentajes de inhibición y control en los dos componentes de la presente
investigación (in vivo e in vitro), esto lo convierte en el tipo de extracto con mayor
potencial biocontrolador. Por este motivo, los resultados del análisis del rendimiento
de obtención de aceite esencial en el transcurso de la hidrodestilación, son de
seria consideración, puesto que esta es una tecnología costosa en vista los de
elevados requerimientos energéticos del proceso y el alto consumo de agua
causado por el flujo constante que debe alimentar el condensador del sistema,
Mediante la modelación de extracción del aceite, se concluye que es importante
determinar el momento en el que el proceso debe detenerse aunque no se hayan
extraído todos los metabolitos activos de la muestra vegetal, ese momento es
61
cuando la curva de extracción empieza un comportamiento asintótico, y ya no es
rentable continuar el proceso de obtención aceites esenciales.
La investigación permitió confirmar la viabilidad del uso de estos productos naturales
para un posible uso comercial como agente biocontrolador de patógenos
poscosecha tales como C. musae en banano y B. cinérea en fresa; al comparar los
resultados obtenidos por estas especies vegetales con lo reportado por el fungicida
de síntesis química Benomil (tratamiento testigo en la presente investigación), no se
observaron diferencias significativas en el porcentaje de control de los patógenos.
Estos extractos naturales se postulan entonces, como una alternativa amigable con
el medio ambiente, con la salud de operarios y consumidores.
Al pensar en futuras investigaciones y exploraciones asociadas a la formulación y
desarrollo de una forma farmacéutica; sea esta un producto biocontrolador aplicado
por aspersión, una solución en donde se sumerjan las frutos, una película como
empaque (convencional o comestible) u otras; la presente investigación postulará al
aceite esencial de la especie nativa LippiaorIganoides, como una importante y
promisoria opción fuente de metabolitos complementarios bioncontroladores.
Adicionalmente esta provee una aproximación de la concentración (500 mg/l) que
debería empezar a probarse en dichas formas farmacéuticas.
62
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ANEXOS
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Anexo 1. Variables evaluadas in vitro con Botrytiscinerea.
Fuente Cuadrado de la media Pr>F Especie 248.53 0.033 * Concentración 7320.34 < 0,0001 *** Tipo de extracto 2397.32 < 0,0001 *** Concentración* Metodo de extracción
542.70 0.0002 **
Nivel de significancia tal que *= p< 0, 05; ** = p< 0, 01; *** = p< 0,001.
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Anexo 2. Porcentaje de control de B. cinerea en fresa en la interacción tiempo a las 48, 96 y 120 horas, por cada producto evaluado.
48 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 98 ab 2.513
TOMILLO 20 98.5 a 2.350 BENOMIL 5 95 bc 0 TE 5 99 a 2.236 TN 5 67 i 16.431 TT 5 95 bc 0
96 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 92 c 6.155 TOMILLO 20 90.25 cd 5.495 BENOMIL 5 89 cd 5.477 TE 5 98 ab 2.738 TN 5 31 j 13.416 TT 5 87 de 4.472
120 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 81.75 fg 16.56 TOMILLO 20 78.5 g 16.311 BENOMIL 5 85 ef 0 TE 5 89 cd 5.477 TN 5 5 k 11.180 TT 5 73 h 16.431
Letras diferentes en la columna (Media) difieren significativamente
70
Anexo 3.Porcentaje de control de C. musae en banano en la interacción tiempo a las 48, 96 y 120 horas, por cada producto evaluado.
48 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 82.5 bcd 14.823
TOMILLO 20 76.55 d 25.018 BENOMIL 5 77.20 cd 20.59 TE 5 99 a 2.23 TN 5 85 bc 0 TT 5 95 a 0
96 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 64 e 19.708 TOMILLO 20 56.5 g 20.589 BENOMIL 5 55 g 30 TE 5 97 a 2.738 TN 5 31.1 ij 13.416 TT 5 87 b 4.472
120 Horas
Nivel Producto N Media Dev.Tip
LIPPIA 20 46.5 h 23.116 TOMILLO 20 40 i 18.209 BENOMIL 5 37 j 16.431 TE 5 79 cd 13.416 TN 5 5 k 11.180 TT 5 61 eg 13.416
Letras diferentes en la columna (Media) difieren significativamente.
