Detecção por imunocitoquímica de
VEGF no pénis do rato
Cristina Resende
Diana Cruz T6
Objectivo
Mapear a localização preferencial do VEGF (vascular endothelial growth factor) no pénis do rato
Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo mapear e comparar a localização do factor de crescimento no pénis em diversos grupos de risco.
Histologia do pénisComponentes principais: Uretra 3 corpos cilíndricos de
tecido eréctil
2 Corpos cavernosos - na parte dorsal
Corpo esponjoso – anteriormente; a revestir a uretra
Fig. 1: Corte transversal de pénis humano
Os corpos cavernosos são envolvidos por uma camada resistente de tecido conjuntivo denso - a túnica albugínea.
O tecido eréctil que compõe os corpos cavernosos e o corpo esponjoso tem uma grande quantidade de espaços cavernosos separados por trabéculas de fibras de tecido conjuntivo e células musculares lisas.
Fig. 2: Corte transversal de pénis humano (maior ampliação)
Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção
• Molécula sinalizadora parácrina
• Sintetizado a partir do aminoácido arginina
• Difunde-se directamente através da membrana plasmática das células alvo
• Molécula extremamente instável, com um tempo de semi-vida curto (alguns segundos)
Fisiologia da erecção (I)
Fisiologia da erecção (II)
Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso
Epidemiologia da disfunção eréctil
estudos epidemiológicos demonstram uma associação entre o envelhecimento e a disfunção eréctil
declínio da actividade sexual e da função eréctil com o envelhecimento
Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de idade.
Disfunção eréctil não é necessariamente
uma consequência inevitável da idade
associada a patologias concomitantes
principal causa da disfunção eréctil
relacionada com a idade
doença aterosclerótica
das artérias penianas
Factores de risco vascular como hipertensão, hipercolesterolemia, tabaco e diabetes associados a maior probabilidade de disfunção eréctil
Outros factores de risco:
declínio da produção hormonal, nomeadamente de androgénios
Factores psicológicos
Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica de patologias concomitantes
Importância do estudo
Última década grande preocupação nesta área
Crescimento populacionalAumento da esperança média de vida
Acréscimo importante na prevalência de diversas patologias, incluindo a disfunção eréctil
Compreensão mais aprofundada dos mecanismos fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à orientação de novas linhas terapêuticas
Alterações estruturais e ultrastruturais nos componentes fibroelásticos das:
trabéculas penianas,
músculo liso cavernoso
endotélio
inadequada expansão sinusoidal
rigidez do pénis erecto
Farmacologia para melhorar a erecção peniana
Medicamentos de acção periférica de actuação predominantemente vasoactiva como os inibidores da fosfodiesterase tipo 5
Viagra
Angiogénese terapêutica
desordens do fluxo arterial relaxamento do músculo liso cavernoso disfunção venooclusiva
Disfunção endotelial1 dos factores responsáveis pela disfunção eréctil
Traduz-se em:
Alvo farmacológico válido na prevenção da disfunção eréctil
Neovascularização cavernosa é controlada por factores de crescimento angiogénicos que promovem a proliferação e migração de células endoteliais e musculares lisas
VEGF um dos factores mais importantes, que ainda estimula a produção de óxido nítrico
VEGF
Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais, estimulando a angiogénese
Parente distante do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)
Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D
e factor de crescimento da placenta (codificados por genes distintos)
Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais, musculares lisas e fibroblastos)
A administração intracavernosa de VEGF em modelo animal estimula a expressão da síntase de óxido nítrico endotelial, sendo a presença deste necessária para a angiogénese
regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas
Melhoramento da erecção peniana(numa situação de oclusão arterial aguda)
Utilização de modelos animais O estudo da expressão de VEGF no animal experimental
parece fundamental na regulação destes mecanismos
Possibilidade de manipulação biológica, química e genética, simulando nestes animais os factores de risco para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in vivo
Extrapolações têm que ser cuidadosas
Célula com antigénio
Anticorpo primário
Anticorpo secundário conjugado com uma enzima
Produto da reacção
Imunocitoquímica
Protocolo Imunocitoquímica:
1º Dia Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água
Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA).
Recuperação antigénica em tampão de citrato
Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen.
Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS)
Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC
Protocolo Imunocitoquímica:
2º DiaAdicionar Ab secundário (1/100) a TA
Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA.
Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes.
Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina
Desidratar e montar com Entellan
Resultados
Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)
Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)
Discussão dos resultados
Os corpos cavernosos apresentam marcação preferencial no tecido conjuntivo (sem definição específica). Este tecido apresenta as condições necessárias para a formação de vasos.
O tecido muscular liso não apresenta marcação acentuada
O endotélio apresenta alguma marcação.
Uretra com marcação, mas no lúmen contaminação (deficiência de lavagem)
Perspectivas futuras
Estudos experimentais Fisiopatologia da erecção Mecanismos de actuação terapêutica
Agradecimentos
Dr. Pedro Vendeira Dr. Jorge Ferreira Dra. Delminda Neves
Serviço de Biologia Celular e Molecular
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