8/2/2019 Detection of Oral Anaerobic Spirochetes in Dental Plaque By

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JOURNAL O F C L I N I C A L M I C R O B I O L O G Y , D e c . 1 9 7 9 , p . 9 3 4 - 9 3 60 0 9 5 - 1 1 3 7 / 7 9 / 1 2 - 0 9 3 4 / 0 3 $ 0 2 . 0 0 / 0 V o l . 1 0 , N o . 6

D e t e c t i o n o f O r a l A n a e r o b i c S p i r o c h e t e s i n D e n t a l P l a q u e b yt h e I n d i r e c t F l u o r e s c e n t - A n t i b o d y T e c h n i q u eE . J A C O B , ' A . L . ALLEN,2 AND R . K . N A UM A N`*

D e p a r t m e n t s o f M i c r o b i o l o g y ' and P e r i o d o n t i c s , 2 S c h o o l o f D e n t i s t r y , U n i v e r s i t y o f M a r y l a n d , B a l t i m o r e ,M a r y l a n d 2 1 2 0 1R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 1 J u l y 1 9 7 9

The i n d i r e c t f l u o r e s c e n t - a n t i b o d y t e c h n i q u e was f o u n d t o b e a r a p i d a n ds e n s i t i v e t o o l f o r t h e d e t e c t i o n o f o r a l a n a e r o b i c s p i r o c h e t e s i n d e n t a l p l a q u e .A n a e r o b i c s p i r o c h e t e s a r e i n d i g e n o u s mem-b e r s o f t h e o r a l f l o r a o f h u m a n s a s w e l l a s o t h e r

a n i m a l s p e c i e s ( 6 ) . C u l t u r a l s t u d i e s h a v e s h o w nt h a t t h e a p p e a r a n c e o f s p i r o c h e t e s i n t h e s u c c e s -s i o n o f m i c r o o r g a n i s m s w i t h i n d e n t a l p l a q u e i sc l o s e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e t i m e o f o n s e t o f e x -p e r i m e n t a l g i n g i v i t i s ( 9 ) . L i g h t m i c r o s c o p i c s t u d -i e s o n s u b g i n g i v a l p l a q u e h a v e r e v e a l e d t h a tt h e r e i s a d r a m a t i c i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o fs p i r o c h e t e s f r o m 0 . 6 % i n p a t i e n t s w i t h o u t p e r i -o d o n t a l d i s e a s e t o a s much a s 1 7 % o f t h e t o t a lm i c r o b i a l p o p u l a t i o n i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i cs e v e r e p e r i o d o n t i t i s ( 7 ) . A l t h o u g h a s p e c i f i c r o l ef o r s p i r o c h e t e s i n p e r i o d o n t a l d i s e a s e h a s n o t y e tb e e n e s t a b l i s h e d , b a s e d o n n u m e r i c a l e v i d e n c ea l o n e , t h e r e i s r e a s o n t o b e l i e v e t h a t t h e y c o n -t r i b u t e t o t h e p e r i o d o n t a l d i s e a s e s t a t e . Thep u r p o s e o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n w a s t o d e -t e r m i n e t h e a p p l i c a b i l i t y o f t h e i n d i r e c t f l u o r e s -c e n t - a n t i b o d y ( I F A ) t e c h n i q u e f o r t h e d e t e c t i o no f i m m u n o l o g i c a l l y d i s t i n c t s p i r o c h e t e s w i t h i ns u b g i n g i v a l d e n t a l p l a q u e .O u r l a b o r a t o r y h a s b e e n s u c c e s s f u l i n i s o l a t i n gs e v e r a l s t r a i n s o f o r a l a n a e r o b i c s p i r o c h e t e s f r o ms u b g i n g i v a l p l a q u e o b t a i n e d f r o m p a t i e n t s w i t hc h r o n i c p e r i o d o n t i t i s . T h r e e o f t h e s e s t r a i n sw e r e d e s i g n a t e d W , 1 1 , a n d 1 4 , r e s p e c t i v e l y . F o rt h e i n i t i a l i s o l a t i o n , t h e m e m b r a n e f i l t e r t e c h -n i q u e o f L o e s c h e a n d S o c r a n s k y ( 5 ) w a s u t i l i z e d ,e m p l o y i n g t h e m e d i a d e s c r i b e d b y S o c r a n s k y e ta l . ( 8 ) c o n s i s t i n g o f PPLO b r o t h (BBL M i c r o b i -o l o g y S y s t e m s ) p l u s 5 , i g o f c o c a r b o x y l a s e p e rm l , 1 0 % s t e r i l e p o o l e d r a b b i t s e r u m , a n d 0 . 7 %i o n a g a r . S u b g i n g i v a l p l a q u e w a s o b t a i n e d f r o mt h e a r e a o f p e r i o d o n t a l i n v o l v e m e n t a n d wasi m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d t o i n d i v i d u a l v i a l s c o n -t a i n i n g 0 . 2 ml o f PPLO b r o t h . The p l a q u e wasb l e n d e d v i g o r o u s l y i n a V o r t e x m i x e r f o r 1 m i nt o d i s p e r s e t h e o r g a n i s m s . One d r o p o f t h i sp l a q u e was c a r e f u l l y p l a c e d o n t o p o f a mem-b r a n e f i l t e r w i t h a d i a m e t e r o f 2 5 mm a n d a p o r es i z e o f 0 . 4 5 ym ( S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l , K e e n e ,N . H . ) w h i c h h a d b e e n l a y e r e d o n t h e s u r f a c e o ft h e P P L O - i o n a g a r m e d i u m . A l l m a n i p u l a t i o n sw e r e c a r r i e d o u t i n a C o y a n a e r o b i c c h a m b e r

s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d b y A r a n k i e t a l . ( 2 ) .A f t e r 4 t o 5 d a y s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 C , t h emembrane f i l t e r w as r e m o v e d a n d t y p i c a l s p i -r o c h e t a l g r o w t h w as o b s e r v e d w i t h i n t h e a g a ra n d t h e n c o n f i r m e d b y d a r k - f i e l d m i c r o s c o p y . As t e r i l e P a s t e u r p i p e t t e was u s e d t o r e m o v e ap l u g o f a g a r f r o m t h e l e a d i n g e d g e o f s p i r o c h e t a lg r o w t h a n d s t r e a k e d o n t o a s e p a r a t e p l a t e o f t h es a m e m e d i a c o m p o s i t i o n f o r s i n g l e c l o n e i s o l a -t i o n . O n c e i n d i v i d u a l c l o n e s were o b t a i n e d , t h e yw e r e t r a n s f e r r e d t o t h e m e d i u m , d e s c r i b e da b o v e , w h i c h l a c k e d i o n a g a r f o r l i q u i d c u l t i v a -t i o n . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s r e v e a l e d t h a tt h e t h r e e i s o l a t e s were i d e n t i c a l m o r p h o l o g i c a l l ya n d p o s s e s s e d t h e " 2 - 4 - 2 " a x i a l f i l a m e n t a r r a n g e -m e n t .S p e c i f i c immune serum was p r e p a r e d f o r e a c hs p i r o c h e t a l i s o l a t e i n N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t sb y i n o c u l a t i n g t h e m a r g i n a l i n n e r e a r v e i n w i t h2 . 5 m l o f a 6 - t o 7 - d a y - o l d b r o t h c u l t u r e . Thei m m u n i z a t i o n s c h e d u l e c o n s i s t e d o f a s i n g l e i n -o c u l a t i o n p e r w e e k f o r a t o t a l o f 4 w e e k s . Onew e e k a f t e r t h e f i n a l i n o c u l a t i o n , b l o o d was c o l -l e c t e d b y c a r d i a c p u n c t u r e a n d t h e s e r u m w ass e p a r a t e d . Q u a n t i t a t i o n o f s p e c i f i c s p i r o c h e t a la n t i b o d y was c a r r i e d o u t b y u s i n g t h e m i c r o -s c o p i c a g g l u t i n a t i o n t e s t a s o r d i n a r i l y u s e d f o rt h e q u a n t i t a t i o n o f l e p t o s p i r a l a n t i b o d y ( 4 ) . M i -c r o s c o p i c a g g l u t i n a t i o n t i t e r s o b t a i n e d w e r e t y p -i c a l l y 1 : 1 0 , 0 0 0 o r g r e a t e r . M i c r o s c o p i c a g g l u t i -n a t i o n s t u d i e s u s i n g h e t e r o l o g o u s r a b b i t a n t i s e -r u m r e v e a l e d t h a t s t r a i n s W a n d 1 4 s h o w e d somec r o s s - r e a c t i v i t y , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e s t r a i n smay s h a r e common s u r f a c e a n t i g e n i c d e t e r m i -n a n t s ; h o w e v e r , s t r a i n 1 1 a p p e a r s t o b e i m m u -n o l o g i c a l l y d i s t i n c t .The p a t i e n t s u t i l i z e d i n t h i s s t u d y c o n s i s t e d o fi n d i v i d u a l s w i t h c h r o n i c , s e v e r e p e r i o d o n t i t i s r e -c e i v i n g t r e a t m e n t a t t h e U n i v e r s i t y o f M a r y l a n dD e n t a l S c h o o l C l i n i c . A t o t a l o f 1 0 p a t i e n t s - 7m a l e s a n d 3 f e m a l e s - p a r t i c i p a t e d i n t h e s t u d y .S i x o f t h e p a t i e n t s w e r e d e s i g n a t e d c l a s s I I I , a n df o u r w e r e d e s i g n a t e d a s c l a s s I V w i t h r e s p e c t t ot h e s e v e r i t y o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e ( 1 ) .S u b g i n g i v a l p l a q u e w as c o l l e c t e d f r o m e a c h

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V O L . 1 0 , 1 9 7 9p a t i e n t f r o m b o t h t h e m a x i l l a r y a n d m a n d i b u l a rp o s t e r i o r t e e t h ; t h e a v e r a g e d e p t h o f t h e p e r i -o d o n t a l p o c k e t i n t h e s e r e g i o n s w a s 7 t o 9 mm.The p l a q u e w a s t r a n s f e r r e d t o 0 . 2 m l o f PPLOb r o t h a n d b l e n d e d f o r 1 m i n i n a V o r t e x m i x e rt o d i s p e r s e t h e o r g a n i s m s .The IFA t e s t w a s p e r f o r m e d b y t h e m e t h o do f C h e r r y e t a l . ( 3 ) a s f o l l o w s . O n e d r o p ( 0 . 0 5 m l )o f p l a q u e s u s p e n s i o n w a s p l a c e d i n e a c h w e l l o fm i c r o s c o p i c s l i d e s c o n t a i n i n g t w o r o w s o f 7 - m m -d i a m e t e r c i r c l e s c u t i n a T e f l o n c o a t i n g ( C e l lL i n e A s s o c i a t e s ) . The s a m p l e s w e r e d r i e d a t3 7 0 C f o r 1 h a n d f i x e d i n a c e t o n e f o r 5 m i n .S e r i a l d i l u t i o n s o f s p e c i f i c r a b b i t a n t i s e r u m ( 0 . 0 5m l ) t o o u r s p i r o c h e t a l i s o l a t e s w e r e a d d e d t os e p a r a t e p l a q u e s a m p l e s a n d i n c u b a t e d a t 3 7 Ci n a m o i s t c h a m b e r . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e s l i d e sw e r e r i n s e d w i t h t w o c h a n g e s o f p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( p H 7 . 2 ) f o r 3 0 m i n . A f t e r a i rd r y i n g w i t h a f a n , o n e d r o p ( 0 . 0 5 m l ) o f f l u o r e s -c e i n i s o t h i o c y a n a t e - l a b e l e d g o a t a n t i - r a b b i tgamma g l o b u l i n ( A n t i b o d i e s , I n c . ) w a s a p p l i e dt o t h e p l a q u e s a m p l e s a n d i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r3 0 m i n . A f t e r r i n s i n g w i t h p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e a s b e f o r e , t h e s a m p l e s w e r e c o u n t e r -s t a i n e d w i t h o n e d r o p o f a 0 . 1 % s o l u t i o n o f E v a n sb l u e f o r 5 m i n . T h e c o u n t e r s t a i n w a s r e m o v e dw i t h d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e s l i d e s w e r e a i r d r i e da n d c o v e r e d w i t h b u f f e r e d g l y c e r o l m o u n t i n gmedium a n d a c o v e r s l i p . The s a m p l e s w e r ev i e w e d w i t h t h e P h a c o 1 0 O x o b j e c t i v e o f a L e i t z -D i a l u x m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h P l o e m o p a k 2i n c i d e n t f l u o r e s c e n c e m o d u l e c o n t a i n i n g e x c i t a -t i o n c u b e H . The l i g h t s o u r c e w a s a n HBO-50m e r c u r y l i g h t w i t h a B G - 2 3 b a r r i e r f i l t e r . I m a g e sw e r e r e c o r d e d a t a n A SA r a t i n g o f 8 0 0 w i t h h i g h -s p e e d K o d a k E k t a c h r o m e 4 0 0 f i l m . T y p i c a l e x -p o s u r e t i m e s w e r e b e t w e e n 1 a n d 2 m i n . P o s i t i v ec o n t r o l s e m p l o y e d c o n s i s t e d o f o u r t h r e e s p i r o -c h e t a l i s o l a t e s r e a c t e d w i t h t h e s p e c i f i c h o m o l -o g o u s a n t i s e r u m . N e g a t i v e c o n t r o l s c o n s i s t e d o fo u r s p i r o c h e t a l i s o l a t e s r e a c t e d w i t h n o n i m m u n e( p r e b l e e d ) r a b b i t s e r u m a s w e l l a s d e n t a l p l a q u ea g a i n s t n o n i m m u n e r a b b i t s e r u m . I n a d d i t i o n ,p l a q u e w a s r e a c t e d w i t h t h e c o n j u g a t e a l o n e t od e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o m m e r c i a l l y p r e p a r e dc o n j u g a t e p o s s e s s e d s p i r o c h e t a l a n t i b o d i e s . Thef l u o r e s c e n c e o f t h e s p i r o c h e t e s w a s g r a d e d o n a+ 4 , + 3 , + 2 , +1 b a s i s , w i t h +4 i n d i c a t i n g t h eh i g h e s t i n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e .The r e s u l t s o b t a i n e d i n d i c a t e t h a t s p i r o c h e t e sw e r e d e t e c t e d i n t h e s u b g i n g i v a l p l a q u e s a m p l e so f a l l 1 0 p a t i e n t s w i t h a n t i s e r a W a n d 1 4 ( T a b l e1 ) . The a v e r a g e n u m b e r o f s p i r o c h e t e s p e r f i e l dw a s a p p r o x i m a t e l y 1 0 t o 2 0 , a n d t h e i n t e n s i t y o ft h e f l u o r e s c e n c e w a s +3 t o +4 ( F i g . 1 ) . Thei n t e n s i t y o f t h e f l u o r e s c e n c e r e m a i n e d c o n s t a n twhen t h e a n t i s e r u m w a s d i l u t e d u p t o a f a c t o ro f 1 : 4 0 , b u t b e y o n d t h i s r a n g e a l l f l u o r e s c e n c e

N O T E S 9 3 5 !TABLE 1 . I n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e o f s p i r o c h e t e so b s e r v e d i n s u b g i n g i v a l p l a q u e o f 1 0 p a t i e n t s w i t hp e r i o d o n t a l d i s e a s e

I n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e a t a n t i s e r u m d i l u t i o n " :P a t i e n t Anti-W A n t i - 1 4 A n t i - l ino .

1 : 1 0 1 : 2 0 1 : 4 0 1 : 1 0 1 : 2 0 1 : 4 0 1 : 1 0 1 : 2 0 1 : 4 01 + 3 +3 + 3 +3 +3 +3 - - -2 +3 +3 +3 +3 +3 +3 - - -3 + 4 +4 +3 +3 +3 +3 - - -4 +3 +3 +3 +3 +3 +3 - - -5 +3 +3 +3 + 3 +3 +3 - - -6 +4 + 4 +3 +4 +4 + 4 + 3 + 3 +37 +4 + 4 + 4 +4 +4 +4 - - -8 + 4 +4 + 4 +4 + 4 +3 + 4 +4 +49 +4 +4 +4 +4 +4 +4 - - -

1 0 + 4 + 4 + 3 +4 +4 +3 - - -+ 4 , O u t s t a n d i n g f l u o r e s c e n c e ; + 3 , s t r o n g f l u o r e s c e n c e ;

+ 2 , m o d e r a t e f l u o r e s c e n c e ; - , n o f l u o r e s c e n c e . N o f l u o r e s -c e n c e w a s o b s e r v e d w i t h a n y o f t h e a n t i s e r a a t 1 : 8 0 .

F I G . 1 . F l u o r e s c e n c e o f o r a l a n a e r o b i c s p i r o c h e t e si n s u b g i n g i v a l d e n t a l p l a q u e o f a p a t i e n t w i t h s e v e r e ,c h r o n i c p e r i o d o n t i t i s , u s i n g t h e IFA t e c h n i q u e . Barr e p r e s e n t s 1 0 , u m .w a s l o s t a n d n o s p i r o c h e t e s w e r e d e t e c t e d . W i t ha n t i s e r u m 1 1 , s p i r o c h e t e s w e r e d e t e c t e d i n t h ep l a q u e s a m p l e s o f o n l y t w o o f t h e p a t i e n t s . Ther e a s o n f o r t h i s may b e , a s p o i n t e d o u t p r e v i o u s l y ,t h a t b y m i c r o s c o p i c a g g l u t i n a t i o n , s t r a i n s Wa n d1 4 s h o w some d e g r e e o f c r o s s - r e a c t i v i t y ; h o w -e v e r , s t r a i n 1 1 a p p e a r s t o b e i m m u n o l o g i c a l l yd i s t i n c t . T h i s o b s e r v a t i o n was a l s o c o n f i r m e d b yp e r f o r m i n g t h e IFA t e s t w i t h o u r t h r e e s p i r o c h e -t a l i s o l a t e s u s i n g b o t h h o m o l o g o u s a s w e l l a sh e t e r o l o g o u s s p e c i f i c immune s e r u m . W i t h t h eh o m o l o g o u s a n t i s e r a , a l l t h r e e s t r a i n s s h o w e d a+ 4 f l u o r e s c e n c e ; h o w e v e r , w i t h t h e h e t e r o l o g o u ss y s t e m s t r a i n s W a n d 1 4 s h o w e d some c r o s s -r e a c t i v i t y a l t h o u g h t h e d e g r e e o f f l u o r e s c e n c ew a s n o t i c e a b l y d i m i n i s h e d ( + 2 ) , w h e r e a s w i t hs t r a i n 1 1 n o c r o s s - r e a c t i v i t y was o b s e r v e d ( T a b l e2 ) . The s t r i k i n g f e a t u r e o f t h i s t e s t i s i t s m a r k e d

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J . C L I N . M I C R O B I O L .T A B L E 2 . I m m u n o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p s b e t w e e no r a l s p i r o c h e t e s , u s i n g t h e IFA t e s t

I n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e w i t h t h e f o l l o w i n g a n -S t r a i n t i s e r a a :

A n t i - W A n t i - 1 4 A n t i - 1 1W +4 + 2 -1 4 +2 + 4 -1 1 - - +4

a A l l d i l u t i o n s o f a n t i s e r a w e r e 1 : 2 0 . + 4 , O u t s t a n d i n gf l u o r e s c e n c e ; + 3 , s t r o n g f l u o r e s c e n c e ; + 2 , m o d e r a t ef l u o r e s c e n c e ; + 1 , m i n i m a l f l u o r e s c e n c e ; - , n o f l u o r e s -c e n c e .s p e c i f i c i t y f o r d e t e c t i n g o n l y s p i r o c h e t e s a m o n gt h e m u l t i t u d e o f m i c r o o r g a n i s m s n o r m a l l y p r e s -e n t w i t h i n a s a m p l e o f s u b g i n g i v a l p l a q u e . A t n ot i m e w e r e o t h er o r g a n i s m s , b e s i d e s s p i r o c h e t e s ,d e t e c t e d b y t h e IFA t e s t , a l t h o u g h d a r k - f i e l dm i c r o s c o p y d i d r e v e a l a m u l t i t u d e o f m i c r o o r -g a n i s m s w i t h i n t h e p l a q u e . A t p r e s e n t , e f f o r t sa r e u n d e r way i n o u r l a b o r a t o r y t o i s o l a t e a w i d ev a r i e t y o f o r a l a n a e r o b i c s p i r o c h e t e s a n d , b yp r e p a r i n g s p e c i f i c i m m u n e s e r u m t o t h e s e i s o -l a t e s , t o t r y t o i d e n t i f y t h e i r p r o t o t y p e i n d e n t a lp l a q u e u s i n g i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e . Thee n c o u r a g i n g r e s u l t s o b t a i n e d s o f a r l e a d u s t ob e l i e v e t h a t t h e I F A t e s t w i l l p r o v e t o b e a r a p i da n d s e n s i t i v e t o o l f o r t h e d e t e c t i o n a n d e v e n t u a li d e n t i f i c a t i o n o f o r a l s p i r o c h e t e s .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e U n i v e r s i t y o fM a r y l a n d D e n t a l S c h o o l A l u m n i .L I T E R A T U R E CITED

1 . A n o n y m o u s . 1 9 7 7 . C u r r e n t p r o c e d u r a l t e r m i n o l o g y f o rp e r i o d o n t i c s , 4 t h e d . A m e r i c a n A c a d e m y o f P e r i o d o n -t o l o g y , C h i c a g o .2 . A r a n k i , A . , S . A . S y e d , E . B . K e n n y , and R . F r e t e r .1 9 6 9 . I s o l a t i o n o f a n a e r o b i c b a c t e r i a f r o m human g i n -g i v a a n d m o u s e s e r u m b y m e a n s o f a s i m p l i f i e d g l o v eb o x p r o c e d u r e . A p p l . M i c r o b i o l . 1 7 : 5 6 8 - 5 7 6 .3 . C h e r r y , W. B . , M . G o l d m a n , T . R . C a r s k i , a n d M . D .M o o d y . 1 9 6 1 . F l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e s i n t h ed i a g n o s i s o f c o m m u n i c a b l e d i s e a s e s . U . S . D e p t . o fH e a l t h , E d u c a t i o n a n d W e l f a r e , P u b l i c H e a l t h S e r v i c e ,W a s h i n g t o n , D . C.4 . G o c h e n o u r , W. S . , R . H . Y a g e r , P . W. W e t m o r e , a n dJ . A . H i g h t o w e r . 1 9 5 3 . L a b o r a t o r y d i a g n o s i s o f l e p t o -s p i r o s i s . Am. J . P u b l . H e a l t h . 4 3 : 4 0 5 - 4 1 0 .5 . L o e s c h e , W. J . , a n d S . S . S o c r a n s k y . 1 9 6 2 . D e f e c t i ns m a l l M i l l i p o r e f i l t e r s d i s c l o s e d b y n e w t e c h n i q u e s f o ri s o l a t i n g o r a l t r e p o n e m e s . S c i e n c e 1 3 8: 1 3 9- 1 4 0 .6 . Newman, H . N . , a n d D . G . F . P o o l e . 1 9 7 4 . S t r u c t u r a la n d e c o l o g i c a l a s p e c t s o f d e n t a l p l a q u e , p . 1 1 1 - 1 2 7 . I nF . A . S k i n n e r ( e d . ) , The n o r m a l m i c r o b i a l f l o r a o f m a n .A c a d e m i c P r e s s I n c . , N e w Y o r k .7 . S c h u l t z - H a u d t , S . , M . A . B r u c e , a n d B . G . B i b b y . 1 9 5 4 .B a c t e r i a l f a c t o r s i n n o n s p e c i f i c g i n g i v i t i s . J . D e n t . R e s .3 3 : 4 5 4 - 4 5 8 .8 . S o c r a n s k y , S . S . , M . A . L i s t g a r t e n , C . H u b e r s a k , a n dA . C l a r k . 1 9 6 6 . M o r p h o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l d i f f e r -e n t i a t i o n o f t h r e e t y p e s o f s m a l l o r a l s p i r o c h e t e s . J .B a c t e r i o l . 9 8 : 8 7 8 - 8 8 2 .9 . S y e d , S . A . , a n d W. J . L o e s c h e . 1 9 7 8 . B a c t e r i o l o g y o fhuman e x p e r i m e n t a l g i n g i v i t i s : e f f e c t o f p l a q u e a g e .I n f e c t . I m m u n . 2 1 : 8 2 1 - 8 2 7 .

9 3 6 NOTES