+ All Categories
Home > Documents > Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers,...

Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers,...

Date post: 26-Aug-2016
Category:
Upload: keith
View: 213 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
15
ORIGINAL ARTICLE Patrick Frank á Hayley C. Angove á Barbara K. Burgess Keith O. Hodgson Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior Received: 4 August 2000 / Accepted: 30 March 2001 / Published online: 16 June 2001 Ó SBIC 2001 Abstract Equilibrium titrations in N-methylformamide NMF) of G-25 gel ®ltered ox)-state FeMo cofactor [FeMocoox)] from Azotobacter vinelandii nitrogenase were carried out using sodium ethanethiolate and fol- lowed using UV/Vis absorption spectroscopy. For Fe- Mocoox), a non-linear least squares NLLSQ) ®t to the data indicated a strong equilibrium thiolate-binding step with K eq =1.30.2´10 6 M ±1 . With 245 molar excess imidazole, cooperative binding of three ethanethiolates was observed. The best NLLSQ ®t gave K eq =2.0 0.1´10 5 M ±2 and a Hill coecient n=2.00.3. A Scat- chard plot of these data was concave upward, indicating positive cooperativity. The ®t to previously published data involving benzenethiol titration of the one-electron reduced semi-reduced) cofactor, FeMocosr), as fol- lowed by EPR required a model that included both a sub-stoichiometric ratio of thiol to FeMocosr) and about ®ve cooperative ligand binding sites. These con- straints were met by modeling FeMocosr) as an aggre- gate, with fewer thiol binding sites than FeMocosr) units. The best ®t model was that of FeMocosr) as a dodecamer with ®ve cooperative benzenethiol binding sites, yielding a thiol binding constant of 3.32 0.09´10 4 M ±4.8 and a Hill coecient n=4.80.6. The results of all the other published ligand titrations of FeMocosr) were similarly analyzed successfully in terms of equilibrium models that include both cooperative ligand binding and dimer-level aggregation. A possible structural model for FeMoco aggregation in NMF solution is proposed. Keywords FeMoco á Nitrogenase á Cofactor á Iron á Molybdenum Introduction Ever since the iron-molybdenum cofactor FeMoco) of Azotobacter vinelandii and Klebsiella pneumoniae nitro- genase was isolated [1], interest in the chemistry [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16], electronic structure [17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25], and rational synthesis [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34] of this heterometal cluster has been intense. After publication of the solu- tion to the crystal structure of the nitrogenase enzyme [35, 36], this interest became structurally more explicit [13, 37, 38, 39, 40]. Within the holo-enzyme, FeMoco is now known [41] to consist of an O 2 NMoFe 7 S 9 core that is unique in metallo-biochemistry. This core structure is shown in Fig. 1 as both a ball-and-stick model and a space-®lling model. When bound within the nitrogenase active site, FeMoco is connected to the protein back- bone only by a single cysteine Cysa275) sulfur ligand to the terminal iron, and by a single histidine Hisa442) imidazole ligand to the antipodal molybdenum ion. The coordination sphere of the molybdenum is completed by chelation to the 2-carboxyl and 2-hydroxyl groups of an R-homocitrate ligand. The two remaining carbo- xyl groups of homocitrate are hydrogen-bonded to the protein backbone at Glna191 and Ilea425. The six internal iron ions of FeMoco are each bound to only three sul®do sulfurs and so are coordinatively unsatu- rated. FeMoco can be extruded from nitrogenase into N- methylformamide NMF) solvent without loss of activ- ity [1, 42]. Following extrusion, cysteine coordination to the terminal iron and histidine coordination to the an- tipodal molybdenum are lost, and the continued chela- tion of molybdenum by homocitrate appears to be J Biol Inorg Chem 2001) 6: 683±697 DOI 10.1007/s007750100247 P. Frank á K.O. Hodgson &) Department of Chemistry, Stanford University, Stanford, CA 94305, USA P. Frank á K.O. Hodgson Stanford Synchrotron Radiation Laboratory, SLAC, Stanford University, Stanford, CA 94309, USA H.C. Angove á B.K. Burgess Department of Molecular Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, University of California, Irvine, CA 92697, USA
Transcript
Page 1: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

�������� �����

������� ���� � ��� � �� ���� � ������� �� ���� ��� ��� �� �����

������������ ����� ��� ��� �������� � ��� �������� ��������� ����������� ������� ������������ ��������� �������

���� ���� � ������ ���� ���������� �� ����� ���� � �!" ���� #$" $�� �% &�$� ����� '(� ����

�������� )� " !� �* � ���� #$� $ �+*���,"-#�*�* ��.��/0 #- �+�1 ��" 2"����� .#30+����� /��# �#-���#�4/��#�#.#305 -�#* ��������� �� �� ��� $ ��#��$���6��� ���� �� #�� �� $� �#� �* ����$��� #"��� �$� -#"+"#6�� �� $� 78�8 � �!�#��� #$ ������#��#�,9 /#� /�+�#�#.#30: � $#$+" $��� "���� �)����� .���';0 2� �# ������� $� ����� � ���#$� �)� " !� �* �� #"���+! $� $� ����6 �� ��)<�9�=�9����% �>�9 ? �� ��1 *#"�� �3���� * ��@#"�: �##����� �� ! $� $� #- ����� ����$��� #"����6�� #!������9 ��� !��� ���'; 2� ���� ��)<�9�=�9����1 �>� �$� � A "" �#�B� �$� <�9�=�9�9 � '���+����� �"#� #- ����� ���� 6�� �#$���� ��6���: $� ��� $��#� � �� �##����� � �,9 ��� 2� �# ���� #��", ��!" �������� $�#"� $� !�$@�$��� #" � ���� #$ #- ��� #$�+�"����#$������� .��* +�������0 �#-���#�: /��#�#.��0: �� -#"+"#6�� !, � ��)� ��� � *#��" ���� $�"���� !#�� ���!+��# �� #*��� � ��� # #- �� #" �# /��#�#.��0 �$��!#�� 2�� �##����� �� " ��$� ! $� $� � ���9 ����� �#$+���� $�� 6��� *�� !, *#��" $� /��#�#.��0 �� �$ �����+����: 6 �� -�6�� �� #" ! $� $� � ��� ���$ /��#�#.��0�$ ��9 ��� !��� 2� *#��" 6�� ���� #- /��#�#.��0 �� ��#����*�� 6 �� 2�� �##����� �� !�$@�$��� #" ! $� $�� ���: , �"� $� � �� #" ! $� $� �#$���$� #- �9��=�9�C���� �>�9D �$� � A "" �#�B� �$� <�9D=�9%9 �������"�� #- �"" ��� #���� ��!" ���� " ��$� � ���� #$� #-/��#�#.��0 6��� � * "��", �$�",@�� �������-�"", $ ���*�#- �)� " !� �* *#��"� ���� $�"��� !#�� �##����� ��" ��$� ! $� $� �$� � *��+"���" �������� #$9 � �#�� !"�

���������" *#��" -#� /��#�# �������� #$ $ ��/�#"�� #$ � ��#�#���9

� ������ /��#�# � � ��#��$��� �#-���#� � ��#$ � �#",!��$�*

���� �����

��� � $�� ��� �#$+*#",!��$�* �#-���#� ./��#�#0 #-��������� �� �� ��� �$� �������� � ��� �� $ ��#+��$��� 6�� �#"���� 4�5: $������ $ ��� ���* ���, 4�: �: �:1: %: E: D: C: ��: ��: ��: ��: ��: �1: �%5: �"����#$ � ���������4�E: �D: �C: ��: ��: ��: ��: ��: �15: �$� ��� #$�" �,$���� �4�%: �E: �D: �C: ��: ��: ��: ��: ��5 #- �� � �����#*���"�"����� ��� !��$ $��$��9 �-��� ��!" ��� #$ #- ��� �#"�+� #$ �# ��� ��,���" ��������� #- ��� $ ��#��$��� �$@,*�4�1: �%5: �� � $������ !���*� ���������"", *#�� �3�" � �4��: �E: �D: �C: ��59 ? �� $ ��� �#"#+�$@,*�: /��#�# �$#6 F$#6$ 4��5 �# �#$� �� #- �$ ����#/�E'C �#�� ���� � �$ )�� $ *���""#+! #���* ���,9 �� � �#�� ��������� ���#6$ $ / �9 � �� !#�� � !�""+�$�+�� �F *#��" �$� ������+2"" $� *#��"9 ?��$ !#�$� 6 �� $ ��� $ ��#��$������ �� � ��: /��#�# � �#$$����� �# ��� ��#�� $ !��F+!#$� #$", !, � � $�"� �,��� $� .,���E10 ��"-�� " ��$� �#��� ���* $�" �#$: �$� !, � � $�"� � �� � $� .A �����0 * ��@#"� " ��$� �# ��� �$� �#��" *#",!��$�* #$9 ����##�� $�� #$ ������ #- ��� *#",!��$�* � �#*�"����!, ���"�� #$ �# ��� �+���!#3," �$� �+�,��#3," ��#���#- �$ �+�#*#� ����� " ��$�9 ��� �6# ��*� $ $� ���!#+3," ��#��� #- �#*#� ����� ��� �,��#��$+!#$��� �#��� ��#�� $ !��F!#$� �� �"$��C� �$� �"����19 ��� � 3 $���$�" �#$ #$� #- /��#�# ��� ���� !#�$� �# #$",����� ��"2�# ��"-��� �$� �# ��� �##�� $�� ��", �$����+�����9

/��#�# ��$ !� �3������ -�#* $ ��#��$��� $�# �+*���,"-#�*�* �� .��/0 �#"��$� 6 ��#�� "#�� #- ��� �+ �, 4�: ��59 /#""#6 $� �3���� #$: �,��� $� �##�� $�� #$ �#��� ���* $�" �#$ �$� � �� � $� �##�� $�� #$ �# ��� �$+� �#��" *#",!��$�* ��� "#��: �$� ��� �#$� $��� ���"�+� #$ #- *#",!��$�* !, �#*#� ����� ������� �# !�

& ( #" �$#�� ��* .����0 %� %D�>%CEG�� ��9���E����EE1������E

9 /��$F � H9�9 A#���#$ .�0G�����*�$� #- ��* ���,: '��$-#�� 7$ ���� �,:'��$-#��: � C���1: 7'�

9 /��$F � H9�9 A#���#$'��$-#�� ',$���#��#$ ��� �� #$ ��!#���#�,: '��:'��$-#�� 7$ ���� �,: '��$-#��:� C���C: 7'�

A99 �$�#�� � (9H9 (������G�����*�$� #- �#"���"�� ( #"#�, �$� ( #���* ���,:'��##" #- ( #"#� ��" '� �$���: 7$ ���� �, #- �" -#�$ �:��� $�: � C�%CE: 7'�

Page 2: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

��� �!"� 4��: ��59 �$ ��/ �#"�� #$: /��#�# �3� ! ���6# ������ !"� � $�"�+�"����#$ ���#3 ���$� � #$� 4E: C: �%:�159 ����� ��� /��#�#.#30I��>�/��#�#.��0 .���<>�9�� 80 �$� /��#�#.��0I��>�/��#�#.�0 .����>� 804�%: �1: �%59 /��#�#.#30 � � � "�$� �$� � $#���#���� �# ��J��� � ! #"#� ��"", ��"���$� #3 ��� #$ �����9A#6����: /��#�#.��0 �3� ! �� �$ �<��� � �������*6� �� � �$�"#�#�� �# �$ � � �$�" �� � $� -�#* �� ��"����� $ ��� � �� #$ ��+������� �#"#+�$@,*�9 ��� ! #+"#� ��" ��"���$�� #- /��#�#.�0: - �$,: ��*� $� �$+��2$��9 ��� ���* ���, #- �#"���� /��#�# $ ��/�#"�� #$ ��� ����$�", !��$ ��� �6�� 4�E59

�� ��� !��$ F$#6$ � $�� �CED 4�5 ���� /��#�#.��0 $��/ �#"�� #$ ��� � �� #" ! $� $� � ��9 ��� �<��� ��������* #- /��#�#.��0 $ ��/ �#"�� #$ � ������ 6 ����# �� #*��� � �� #" 4D: �1: �D5: 6� �� � F$#6$ �# ! $� ���$ �#$ � �� 4�1: �C: 1�5 #$ �� � �"�����9 �� #" ! $� $� ���*#�� ����$�", !��$ ���� �� � F $�� � ��#!� $�#/��#�#.��0 ����� � �, 4��: ��59 A#6����: �# �� � ������� �)� " !� �* �#$���$� �#���$ $� ��� ����� #$ #-/��#�#.��0 6 �� �� #" ��� ��*� $�� �$ �"�� �� )��$� �,:���� �� �3��$� �� �3��� *�$��� #$ 4�: ��: ��: �1: ��: �D:1�59

?� ���#�� ���� $�6 ������#��#� � � ���� #$� #- /�+�#�#.#30 $ ��/ �#"��$� 6 �� ����$��� #"���: !#��

�"#$� �$� $ ��� �����$�� #- * ��@#"�: -�#* 6� ���� #"��� ! $� $� �#$���$�� ��$ !� ��� ���9 ?� �"�# ��#6���� � ����*#�,$�* � ! $� $� �#$���$� ��$ !� ��� ���-�#* ����, �3��$� " ��$� � ���� #$ #- /��#�#.��09/ $�"",: �"" ��� " ��$� � ���� #$� #- /��#�#.��0 ������ #$�" @�� $ ���*� #- � �#$� ���$� *#��"9 '��������" $-���$��� ��"�� $� �# /��#�# $ ��/ �#"�� #$ ������ ��� -�#* ��� ����"��9

��������� �� ���� �

�9 �� �� ��� /��#�# 6�� �#"���� �$� ��� 2��: �$� �� ��� � �,*������� �� $� *���#�� �$� ��#�#�#"� ����� !�� ���� #��", 4��:1�59 ��� � � �� 6��� � ����", ��� 2�� !, ������ #$ #- /��#�#.#30� ���� #$ ��*�"�� 6 �� �3���� �#� �* � �� #$ �� $ ��� �����$�� #- ���+-#"� �3���� #- !�$@�$��� #" �$� *������*�$� #- � ��������$� ��!��)��$�", #- ����,"�$� ������ #$ ��� � �,9 �"" � ���� #$��*�"�� 6��� #!������ �# ��#���� ����#�� ��� �<��� � ������� $ ��� � �� #$ ��+������� �����9 /��#�# �#$��$���� #$� 6��� $#�+*�" @�� �# *#",!��$�* �#$��$�: 6� �� 6�� �����* $�� !, ��"+!�� �� ��!#���#� �� .H$#3� ""�: ��$$909 7$"��� #����6 �� ���� 2��:�$���#! � 6#�F 6�� ���� �� #�� �$��� � $ ��#��$ $ � 8����*��*#������� .A�6��#�$�: �" -90 $��� ��*#������ �"#�� !#3#����� $� �� � � ��* #- � #3,��$9

'#� �* ����$��� #"��� 6�� �������� �$��� �$ ���#$ ��*#+������ �� $� '��"�$F ����$ )��� !, ��#�6 �� ����� #$ #- �D� �.%9�% *#"0 #- �#"� ����$��� #" .�"�� ��0 6 �� �#"� �#� �* *���+#3 �� �#"�� #$9 '#� �* *���#3 �� 6�� �������� !, �"#6", ��� $����9E � .%9�E *#"0 #- �#� �* *���" �# ���� *� #- �!�#"��� *���+�$#" �##"�� $ � ��,+ �� !���9 �-��� ����� #$ 6 �� ����$��� #": ����3���� *����$#" 6�� � �� ""�� #K9 ��� �#" � �#� �* ����$��� #"���6�� �� �� �$��� �����* �� ��� � �# � *� $�� $�� �������� #-1� �!��9 ��� 6� �� �#6���, �#� �* ����$��� #"��� ��"� 6�� ��#����$��� � $ ��#��$ $ �$ $��� ��*#������ �"#�� !#39

'#"�� #$� #- �#� �* ����$��� #"��� #� #- �9� � * ��@#"� 6����������� �$��� � $ ��#��$ !, 6� �� $� #�� ����#�� ��� �*#�$�� #-�#" �: 6� �� 6��� � ��#"��� $ ��/9 '#"�� #$� #- /�"� .�"-�+8�$��#$0 #� /�"� ./ �����0 6��� " F�6 �� �������� !, � ��#"� $���� �$�,��#�� �#" �� $ ��/ �$��� � � $ ��#��$ ��*#������9 ���/�"� �#"�� #$ 6�� ������ ���#��� � �9�1 �* 2"��� �# ��*#�����! � �,9 ��� �#"�� #$ #- /�"� $ ��/ 6�� $#� ���!"� �$����#� ��� � " ��� #��$�� �#" � �-��� ������" 6��F�9

'#"�� #$� #- �#� �* ����$��� #"��� $ ��/ 6��� ���$���� @�����#��� ������#��#� � � ���� #$ �� $� ""*�$L� �����$� 41�5 .�"�+� ��0: �$� �� $� �.���0<��:%�� �>� �*>�9 ��/ �#"�� #$� #-�#� �* ����$��� #"��� 6��� ��������", ���$���� @�� �$� 6���-#�$� �# !� ���!"� -#� *#$��� �$��� � $ ��#��$9 ��/ .�"�� ��06�� ��� 2�� !, �� �� $� #���$ ��� #��� �#� �* ! ���!#$���: -#"+"#6�� !, �����* � �� ""�� #$ -�#* !�� �* #3 ��9 ��� 2��� ��M #-��� � �� ""��� 6�� ��N�����9 �"" #���� �����$�� 6��� ���� �� ���� ���9

� ���� #$� #- /��#�#.#30 6 �� ����$��� #"��� $ ��/ �#"�� #$6 ��#�� #� 6 �� ����� * ��@#"� 6��� ���� �� #�� �$��� � �,$�* ����#$ #���+�������� �� $� �$ �$���#! � ����*+��#������ )����@����� #$ �����9 ��� ��/ ���� $ ����� � ���� #$� 6�� �"F�" $�:��#��� $� � �#"�� #$ �A #- ���9� #$ ��+-#"� � "�� #$ $ 6����9/��#�#.#30 �#$��$���� #$� 6��� �!#�� �� �� $ ��/9 �$���#+! � ����$��� #"��� � ���$� 6�� ��" ����� �� $� �$ ���#$+J�����A�* "�#$ ���+� ��� * ��#+�,� $��9 � ���� #$� 6��� *#$ �#��� ��78�8 � ������� �� $� � A�6"���+ ��F��� D�1� � #�� ����, ����+��#��#�#*����9 / $�" ������� 6��� ���#���� �!#�� �1 * $ �-������� ��� � #$: 6��$ ��)��$� �"", ���#���� ������� ��� �� !, "������$ �9��� �!�#�!�$�� �$ ��9 G K���$�� �!�#��� #$ ������� ��� ���-�#* � ���� #$� #- /��#�# ��$��� $ $��$� �, -�#* ��9��� �9�9 �#� �9��>�9�D �9�9 �����-#��: $����*�$��" ���#� ��� ����* ��$���-�#* �!#�� =��M ���", $ � � ���� #$ �# =�91M>�9�1M �� ��� �$�#- � � ���� #$9 G � � @�� � ���� #$ ���� 6��� �#������� -#� � "�� #$�$� 6��� 2���� �� $� ��� �$�",� ��" �3����� #$� -#� �)� " !� �*����� #$� 41�: 115 6 �� $ ��� ��$���" 2�� $� �#�� $� $ ��� H�"� ��+

���� � ���� !�""+�$�+�� �F *#��" #- /��#�#9 ������� ��� ��*�� �6 #- /��#�# ��#6$ �� � �����+2"" $� *#��"9 ��� � ���$��� �$��$�"�� ��� ��#�� #- ��� ��,���" ��������� 4�1: �%59 ��� ��#* �,��� ���*��F��9 �$", ��� " ��� $� ��#*� ��� ��#6$ #$ ��� ���* $�" *���"���� �#$ ��� ��"-�� -�#* ,��E1: �$� �� *#",!��$�* ��� $ ��#��$-�#* A ���� �$� ��� #3,��$� #- ��� �#*#� ����� *#"���"�

%D�

Page 3: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

����� �����+2�� $� ���F��� .',$���, '#-�6���: ���� $�: �90:6� �� �� " @�� ��� ����$!���+���)����� *���#� 41%59 /#� ��� 2��:��� ����" �)� " !� �* �3����� #$ 6�� ������$��� $ ���*� #- ���#!�����!"��� .-���� #$ #- /��#�# !#�$�0 #!�� $�� -�#* ��� � ���+� #$ �!�#��� #$ �������: �$� 4-��� " ��$�5 ��"��"���� �� .O.*#"�+�)� ��"�$�� #- �� #"��� �����0>.��-���� #$ #- /��#�# ��!������!#�$�0P�4�#��" /��#�# ��!������50: 6���� QQ*#"�+�)� ��"�$�� #-�� #"��� �����LL � O.*#"�+�)� ��"�$�� #- �� #"��� �������#0�*�"+� *�� $�*!��P: � � ��� $�*!�� #- " ��$�� !#�$� ��� ����� $���!������ �$ �: �$� QQ4�#��" /��#�# ��!������5LL � ��� �#$��$���� #$#- /��#�# *#$#*�� #� *�"� *��9 ���� ���� ������ *#��" �3+�" � �", $�"���� ��� $�*!�� #- " ��$�� !#�$� ��� /��#�# �$ � �$���� �������� #$ ����� #- /��#�#9 ��� ��$���" �3����� #$ 2���� -#�� � $�"� � ���� #$ 6�� QQ� � .-���� #$ #- /��#�# !#�$�0 � .�4-���" ��$�5� � ���)������ �-��� " ��$��� � ���)�����LL9 /#� � � *�"��)� " !� �*: <�: �$� ��� #$", 2���� ��� �!"� � ��)R -#� � �#+#����� �� 2�: <��� A "" �#�B� �$� �$� 6�� � 2���� ��� �!"�9 ������#�� $ ����� 2�� 6��� ��� ��� -�#* ��� �� �)���� ���� �$� ��"����# ��� $#$+ $����*�$��" ������� $ ��� ���� �# $��9 �� � ���#� �*��� "����� ���$ ��� $����*�$��" ���#� $ ��� �3��� *�$� �$� �� ��$ �"#$� 6 �� ��� ����"�� #- ���� 2�9

G��� -�#* ��!" ���� " ��$� � ���� #$� #- /��#�#.��0 �$�",@�� $ ��� ��3� 6��� �3������� -�#* ��� ��"���$� 2����� $ ��� " ��������41: ��: �D59 ��� ��!" ���� 2����� -�#* 6� �� ���� 6��� ��F�$ ���$#��� $ ��� "���$�� �# / ��9 E: C: �$� ��9 ��� �"#�� #- QQ-���� #$!#�$�LL ������ QQ*#"�+�)� ��"�$�� #- " ��$� �����LL �"#$� 6 �� ���� ��$ �#��" �#$��$���� #$ #- /��#�# 6��� ���� �# ���#$������ �����!�"�� � ���� #$ ���� $ ���*� #- ��� �����" �#$��$���� #$� ����9����� ���#$�������� � ���� #$ ���� 6��� ���$ �$�",@�� $ ����)� ��"�$� -��� #$ �� $#��� �!#�� -#� ���� ��� ��� -�#* �� �6#�F9

�������

/#� �"" ��� 2�� ����� !�� !�"#6: ���� � ���� #$ ���� ���6�� ��#������ �# ��J��� ��� " ��$� ! $� $� ��# �� #*���,�$��� ����9 ��� ��#������ ���� 6��� ���$ 2� �� $� �$�)� " !� �* ����*#�,$�* � *#��" 4115 ���� �3�" � �", $�"���� ���� ���� ��"�� ! $� $� ��# �� #*���,9 ����#�����#$��$�� !��6��$ ��� ���� �$� ��� *#��" 6�����$ ���"����� �$� � ��J����� $ ��� �##�$���+#-+2� QQLL9�$ ��� � #$: �$ �������!"� *#��" 6�� ��)� ��� �#����#���� � '�������� �"#� #- ��� � ���� #$ ���� �$�:6���� ����#�� ���: �# ����#���� � A "" �"#� #- ��� ����41E59 �$ �"" �����: ��� � *�"��� *#��" ���� �������-�"", *������� �� ��� � 6�� ��#��$ �# �������$� ��� ����9 /#�� *�"� �)� " !� �: ��� �)� " !� �* �#$���$�: �: 6�� ����#"� 2���� ����*����9 �$ ���� $� � �##����� �� " ��$�! $� $� *#��": ��� A "" �#�B� �$� 6�� � ���#$� 2��������*����9 �� � ����#��� � ����� !�� $ ���� " $ �������� �"� �$� *���#�� ���� #$9

#$��#" �3��� *�$��

#$��#" �3��� *�$�� � ���� $� �#"�� #$� #- /�.��0 �$�/�.���0 $ ��/ 6 �� �#� �* ����$��� #"��� 6��� $+ � �"", ���� �� #�� !������ �������� #$� #- /��#�# *�,�#$�� $ ��� �!"� �*#�$�� #- ����$� � #�� �#$ 4D: 1�59���$��� #"��� 6�� ���� ���#���#�� !������: �$" F�!�$@�$��� #": � � ���$�����$� �� 6���"�$���� �!#���1� $*9 � ���� #$ #- /�.��0 $ ��/ ./ �9 �0 ��#�����$�6 �!�#��� #$ !�$�� 6 �� *�3 *� �� �1% $* �$�

�D% $*: 6� �� ��� ��* $ ���$� #- ��� � ���� �$���,!�$�� #- 4/�.��0.'�+�+3,","0�5

�> 41D59 � �#��� �$�� �"#�.$#� ��#6$0 #- ��� $��$� �, #- ����� !�$�� ��#����� ����� ��� " $�: $� ��� $� ���� ���, ���� ��J��� ��� ��*���#����9 ��� � � � @�� � ���� #$ ���� ./ �9 �: $���0 �#�"�$#� !� 2� 6 �� � � *�"� �)� " !� �* *#��" �������$� $� ���� /�.��0��� #"��� ! $� $� ��# �� #*���,9 � '���������"#� #- ��� ���� .$#� ��#6$0 6�� �#$���� ��6���: $+� ��� $� � �##����� �� ! $� $� �)� " !� �* 41E59 �$ ����##����� �� ! $� $� #- *�"� �"� " ��$��: ��� �)� " !� �*�#$���$� #- ���� ��!��)��$� " ��$� ! $� $� ���� �������� ���$ ���� #- ��� ���� #�� ����9 �� � *��$� ����-#� ��� �##����� �� ����� #$ $ ��/ �#"��$� #- /�.��0�"�� �6# ��)��$� �" ����$��� #"��� *#"���"��: -#� �3+�*�"�: �#"����� 4/�.'�05I ��� ������� �B$ �, -#� ������'> ���$ �#�� �#"����� /�.��09 �$ �� � �3�*�"�: �� �������� ��� $� � � ���� #$ 6 �� ����$��� #"���: ��� �)� " +!� �* �#"�� #$ 6 �� " * � $� ����$��� #"��� �#$�� $� -����'>: �#"����� /�.��0: �$� �#"����� 4/�.'�0�5: �"*#���3�"�� ��",9 ��� ���� "�� *#"���"�� #� � $� -#� �#+#����� �� !���� #� ��$ !� �#*�"�3 41C: %�5: �$� *�, $�"��� �$ #����"" ������ #$ $ ��� �##�� $�� #$ $�*!��#- �#$: ���#��� "#�� #- ��/ " ��$��: �� �� #"��� " ��+� #$ ��#�����9 �$ ��� $��� �# / �9 � ��� � ���� #$ �����3� ! � � � �*# ��" ����� ��������� �� � #- ��� �#+#����� �� ! $� $� #- *�"� �"� " ��$�� 41E59 ��� �����#�"� #$", !� 6�"" 2� 6 �� � �##����� �� ! $� $� *#��"���� $�"���� ����� ����$��� #"��� ! $� $� � ���9 ���������$� ! $� $� �#$���$� 6�� D91�=�9�1���� �>�9�

6 �� � 2� A "" �#�B� �$� #- �9�C=�9�D .<�9CCC09 (�+����� ��� A "" �#�B� �$� � �"6�,� "��� ���$ ��� $�*!��#- ! $� $� � ��� 41�: 1E5: ����� ����"�� ��� �#$� ���$� 6 ������� �##����� �� ! $� $� � ��� -#� �� #"��� #$ /�.��0 $��/9

/#� /�.���0 � � * "�� 2$� $� #!�� $�� .���� $#���#6$0: �$� ��� � ���� #$ ����� ��� $ �#�"� $#� !� 2�6 �� � � *�"� ��� /�.���0��� #"��� �)� " !� �* ! $� $�

���� � 78�� � !"� �!�#��� #$ ������� #- CD9C �� /�.��0 � ������ $��/ 6 �� �9�: �9�: �9�: �9�: �9�: 19�: %9�: E9�: C9�: �$� ��9� *#"+�)� � #- ����$��� #"���9 � ��� � � � @�� � ���� #$ ���� ��F�$ -�#*��� ������� �� �1% $* �$� ��� 2� �# ��� ����9 ��� 2� *#��" $�"�����##����� �� ! $� $� #- ����$��� #"��� !, /�.��0

%D1

Page 4: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

*#��"9 �$�����: �� -#� /�.��0: �##����� �� ! $� $� #-����� ����$��� #"���� 6�� $� ����� �$� �$ ������$�! $� $� �#$���$� #- E9�D=�9������ �>�9� .<�9CC%0 6��-#�$�9 ��� A "" �#�B� �$� #- �9��=�9�D 6�� �#$� ���$��� � *#��"9

����: -#� !#�� /�.��0 �$� /�.���0 $ ��/ ��� � ���+� #$ �3��� *�$�� , �"��� ��� �$�3������ ����"� *�", $�� * $ *�* �##����� �� ����� � �, 6� �� $�"���� �����! $� $� � ��� ��� *���" #$: �� $ ����� #$ ��

/����:���� ��'� /��'������� ����� � ���* ���, 6�� $#� ������� -������9 ��� ����"��-�#* � ���� $� /�.��:���0 6 �� ����$��� #"��� 6��� ���� �#���� ��� � �! " �, #- ��� �$�"#�#�� �3��� *�$�� $�"�� $�/��#�#.#309 ����� ����"�� ��� � ������� $�3�9

��� ������#��#� � ����#$�� #- /��#�#.#30 $ ��/�# �$ $����� $� �#$��$���� #$ #- ����$��� #"���

��� ����"�� ��� ��#6$ $ / �9 �9 ��� �� #"��� ��� � #$6�� *#$ �#��� !, *��$� #- ��� -�"" �"����#$ � �������*9/�"" �!�#��� #$ ������� 6��� ��F�$ -#""#6 $� ���� ��+� � #$ #- �� #"��� " ��$� �-��� ��� ���$�� $ �!�#��� #$ $��$� �, ������ ���#���#��: $� ��� $� ���� ��� �,���*��� ��� ���� �)� " !� �*9 ��� ���� �# $�� ���� ��J������ �,���* �� �)� " !� �* �� ���� ����9 ��� $��$� �,#- ��� ����#$�� 6�� $��� �!", �*�""9 �����-#��4./��#�#.#30I�� #"���0 * $�� /��#�#.#305 � K���$���!�#��� #$ ������� 6��� �#$�������� �$� ����� ���� �����#6$ $ ��� $��� �# / �9 �9 ��� ���� �# $� �������$�� �-�"" �!�#��� #$ �������* ��F�$ -#""#6 $� ��� �#*�"�� #$.=�9��� �9�90 #- ��� ������#��#� � ����#$�� #- /��#�#.#30 �# ����� ����$��� #"���9 �$ � �"",: � ���� #$

�"#�� 6��� �#$�������� -�#* ���� �� ���� 6���"�$���:�������$� $� � � K���$�� *�3 *�* #� * $ *�*.�-9 / �9 �: $���09 �- �����: #$", ��� ���� �#�����#$� $��# ��� �!�#��� #$ !�$� ��$����� ��#�$� �C� $* ./ �9 �0��#����� !#�� ���-�" �$� ����#��� !"� � ���� #$ �"#��9�� � ��� #$ #- ��� �!�#��� #$ �������* � �#*�"���",#!������ $ ��+�������� /��#�# �#"�� #$� 4�D: 1�5#6 $� �# ��� �����$�� #- � �� #$ �� #$9

��� ���� �� � ���� 6���"�$���� �,� ��"", ��#6���#*�"�3 � ���� #$ !���� #�9 ����: ��� �!�#��� #$ $+��$� �, #- � ���� 6���"�$��� � K���$�� �!�#��� #$ !�$��6#�"� $���� ��� $� � ���� #$: 9�9: 2��� $������ 6 ������� �� #"��� �$� ���$ �������� .#� � �� �����0: ����#��� � ��#���� ��!��)��$� �# �� #"��� ! $� $���#����� �$ $������ *���� �� ��� ��*� 6���"�$���9'��� ��#������ * ��� !�: -#� �3�*�"�: � ���������"������$��*�$� -#""#6 $� �� #"��� ! $� $�9 �$ #$� ����:� ���� #$ ���� � * "�� �# ���� #!������ $��� �C� $* 6���#!�� $�� �� �1� $*: !�� ����� ���� � � $#� ������ $ ����" ���� � ���� #$9 /��#�#.#30 � F$#6$ �# ���� �!����+ �$� � ��#�,+����$��$� 78�8 � �������* 41�5:6� �� *��� ��J��� *������!"� ���������" ��� �� #$� $ ���*#"���"�: #� ��� �� #$� $ ��� #!������ �������� #$ �����4��: %�5: #� !#��9 ��� �$���, "�$������ #���� �� !,/��#�# ���������� *�, ���� ���� � $�*!�� #- ����+�� !"� * $ *� ���� ��$ !� ��� #��", �#��"����: ����$�+ $� #$ ��� �����*�$� � ��#�, #- ��� ��*�"�9 ',$���� � �#�$� /� �"������ �#$�� $ $� ��"2�� �$� �� #"��� " ��$������ �"����#$ � ���$� � #$� $ ��� ��� #$ ��#�$� �C� $*:6���� �+"#��" @�� ������+���$�-�� .�0 !�$�� �#* $���4%�: %�: %�59 �� *�, !� ���� ��� �+��� ��� � -������ #-��� $�6 /�+'� !#$� � "��� ������!�� !, ��N���*�$�� #-��������� ���$ �+��� ��� ��"2���/�:�# � �!�#��� #$-�������: 6� �� *�, !� *#�� ��$� � �� �# ���$��� $ � +�����" �$�"��9 ?� ������� ���� ��� �!�#��� #$ ���$�� ���C� $* ��J���� ��� $�6 /�+'� !#$�: �$� �# � ��"�� ��", $��$� � �� �# *#�� �"#!�" ���������" ��N���*�$��9 ���"#$��� 6���"�$��� -������� ���� ��� *#�� ��$� � �� �#�$��"�� ��#*���, *�, ���$ ���, $ ��� � ����#$�� �#����� �� #"���: ����$� $� #$ ��� � ��#�,+����$��$��"#!�" ���������" �����.�0 #���� �� !, ��� /��#�# *#+"���"��9 �$ �"" �����: �!�#�!�$�� ���� 6��� ��F�$ #$",6��$ ��� �$� �� �!�#��� #$ �������* ��� ���! " @�� �-������� ��� � #$ #- �� #"���9 ����: $ ��� �3��� *�$�����#���� ����: ��� ��#���� *#$ �#��� !, ��� �!�#��� #$���$�� $��� �C� $* � ������ ����#��� !", #�� �# �!#��% *#"+�)� � #- ����$��� #"��� �����: �� ��#6$ $ / �9 �9����� ���� 6��� ���� $ ��!��)��$� �$�",� �9 ��� � �� +*��� � ����#$�� �� �C� $* #- /��#�#.#30 �-���SE *#"+�)� � #- ����$��� #"��� � � $#� ���� ��� " * �+ $� ������ #- � � ���� #$ �����: �$� �� � ��� � #$�"� ���� #$ ���* ���, 6�� $#� -������ $���� �����9

�$ / �9 �: � � � @�� ���� ��F�$ �� �C� $* -�#* ��+�" ���� � ���� #$� ��� ��#6$ �"#���� �� � � ���� #$ �����9����� ���� ��� 6�"" !������9 � �##� 2� 6�� #!�� $�� -#������ ���� ./ �9 �0: *#��"�� �� ��� � $�"� �)� " !� �* #-����� #$ ��

/��#�#�#3� �'� /��#�#�#3� � '� ���

���� � 78�� � !"� �!�#��� #$ ������� #- D ��/��#�#.#30 � ������6 �� .-�"" " $�0 �9�: ."#$� ������0 �9�: .��#�� ������0 �9�: .�#������" $�0 �9�: .������ ��������� !, ����� �#��0 �91: �$� .�#���� " $�0�9� *#"+�)� � #- ����$��� #"���9 � ��� 78�� � !"� � K���$���!�#��� #$ ������� #- ��� ��*� ����

%D%

Page 5: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

��� 2�+��� ��� �)� " !� �* �#$���$� -#� ����� #$ � 6����)<�9�=�9����% �>� .<�9CE�09 �� � ���#$� ����+$��� #"��� ! $� $� � �� � ��#!�!", �$�"#�#�� �# ���F$#6$ ���#$� !�$@�$��� #" ! $� $� � �� $ /��#�#.��04D: �1: �D59 �"��#��� ��� #$ � ����$��� 6�� $#� F����#$���$� ��� $� �� � � ���� #$: 6� �#$� ��� ���� ����)� " !� �* �#$���$� �$� �!�#��� #$ �������* #-/��#�#.#30 6��� $#� �K����� !, ��� ���$�� $ ����#$��$���� #$ #- �#� �* ����$��� #"���9 '#� �* #$ ����" � F$#6$ �# !� ���#$�", �#"����� $ ��/ �� �#� �� �#$��$���� #$� 4%1: %%: %E5: �$� �# #$ �� � $� 6 ��/��#�#.#30 #� ����$��� #"��� � �$" F�", �# �K��� ���������"��9

��� � #$ #- * ��@#"� �# ��/ �#"�� #$�#- /��#�#.#30

�� � ��� � #$ ��#����� �*�"" ���$��� ���#���#�� ���78�8 � �!�#��� #$ �������* ./ �9 1: $���0: �����*�!",-#""#6 $� ! $� $� #- * ��@#"� �� *#",!��$�* $ �$�+"#�, �# ��� F$#6$ � �� � $� ! $� $� � �� 4��: �1: �%: ��59��� $J��$�� #- * ��@#"� #$ ��� ����� #$ #-/��#�#.#30 6 �� �� #"��� 6�� $���� ����� !, � ���� #$#- /��#�#.#30 6 �� ����$��� #"��� $ ��� �����$�� #-�3���� * ��@#"�9 ��� � ���� #$ � K���$�� ������� ��#6$ $ / �9 1 $� ���� ���� ��� ������#��#� � ����#$�� #-/��#�#.#30 �# ����$��� #"��� ��� ���$��� $ ��� ���+��$�� #- ����� * ��@#"� .�-9 / �9 �09 ��� ���� �������$����� � � ���� #$ �"#� �$� ��� 2� �# ����� ���� ��� ��#6$ $/ �9 %9 ����� ���� �#�"� $#� !� 2� 6 �� � � $�"� �)� " +!� �* ����� #$ *#��": #� 6 �� � *#��" ���� $�"���� �6#�#$�����$� � *�"� �)� " !� �* �� #"��� ! $� $� �����9/ �� �� $� *#��"� ���� $�"���� ����� #� *#�� � *�"��� #"��� ! $� $� �)� " !� � �"6�,� ��#����� �� "���� #$�$���� �� �)� " !� �* �#$���$�: #!� �� $� ��� � ��" � �,9 �'�������� �"#� #- ����� ���� 6�� �#$���� ��6��� �$� �

A "" �"#� �3� ! ��� � �"#�� #- �!#�� � .��� !�"#609 �����2$� $�� ��� �#$� ���$� 6 �� � �##����� �� ��#����9�����-#��: 2� *#��"� ���� $�"���� �##����� �� �� #"���! $� $� 6��� ������9 �$ �$ �$�3������ 2$� $�: ��� !��� 2��# ��� ���� 6�� #!�� $�� 6 �� � *#��" $ 6� �� ������� #"���� ! $� �# /��#�#.#30 $ � �##����� �� -��� #$9�� � *#��" � ����#���� !, � '�������� �"#� #- ���� ���� #$ ����: 6� �� � ���#$�", �#$���� ��6��� ./ �9 %:

���� 78�� � !"� � K���$�� �!�#��� #$ ������� #- /��#�#.#306 �� ��1� *#"�� �3���� #- * ��@#"� $ ��/ � ������ 6 ��� � .-�""" $�0 �9�: � ."#$� ������0 �9�: � .6 ��", ������ �#���� " $�0 �9%: �."#$����#�� ������0 �9�: � .�#������ " $�0 �9D: �$� .�"#��", �������#���� " $�0 �9� *#"+�)� � #- ����$��� #"���9 #*���� ����� ����6 �� ��#�� #- / �9 � $���9 � ��� O/��#�#.#30 * $�� ./��#�#.#30�"�� �3���� * ��@#"�0P � K���$�� �!�#��� #$ �������*

���� ! "#� #- /��#�#.#30 � ������ 6 �� �#� �* ����$��� #"��� $$#�*�" @�� � K���$�� �!�#�!�$�� �$ �� ��F�$ -�#* ��� ������� #-/ �9 �: $��� �� �C� $*9 ��� ����� �� � ��� 2� *#��" $� ��� ����� #$�� � � $�"� �)� " !� �* 6 �� ��)<�9�=�9����% �>�

���� " G��� ��F�$ �� �E% $* -�#* ��� ������� #- / �9 1�������$� $� � ���� #$ #- /��#�#.#30 6 �� ����$��� #"��� $ ��������$�� #- �3���� * ��@#"�9 ��� !��� �� �������$�� ��� 2� *#��" $�"�� $� �##����� �� ! $� $� #- ����$��� #"��� !, /��#�#.#30.��� ��3� -#� ���� "�09 � �� � �������$�� ��� ���� �� � '�������� �"#�R� �� � �������$�� ��� ���� �� � A "" �"#�9 ��� �� ���#��� ��� �# $�� $ ���� ���� � ��"��"���� -�#* ��� *#��"9 QQ/9(9LL � QQ-���� #$ #-/��#�#.#30 !#�$�LL !, ����$��� #"���

%DE

Page 6: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

$��� �09 � �##� 2� �# ��� ���� 6�� #!�� $�� .<�9CD�0:, �"� $� �$ ������$� ����$��� #"��� ! $� $� �#$���$� #-�9�=�9����1 �>�9 ��� A "" �#�B� �$� #- �9�=�9� ��#$� ���$� 6 �� ��� �����$�� #- ����� �� #"��� ! $� $�� ���9 � A "" �"#� #- ��� ���� � ��#6$ $ / �9 %: $��� !9 ��##� 2� 6�� �"�# #!�� $�� �� $� � *#��" ���� $�"����#$", �6# �##����� �� ! $� $� � ���9 A#6����: ��� ��� ���A "" �#�B� �$� #- �9��=�9�% 6�� $�#$� ���$� 6 �� ���*#��" ��# �� #*���, !������ � �3������ ��� $�*!�� #-! $� $� � ���9 ����: 6 �� * ��@#"� �����$�: /��#�#.#30$�6", *�$ -����� ����� �� #"��� ! $� $� � ��� ���� �"�#$�6", �3� ! ��� �#� � �� �##����� � �,9

�$ ��� -#""#6 $� ���� #$�: 6� ��#6 ���� � � * "������#��� ��$ !� ��F�$ �# ��� #$�" @� �3��$� " ��������� ���� #$ ����9 ���� ��� ���� #�� �� ,����: /��#�#.��0��� !��$ � ������ 6 �� !�$@�$��� #": 6 �� !�$@�$���"�$#":6 �� �,�$ ��: �$� 6 �� *���," �#�,�$ �� �$��� � ��� ��,#- �3��� *�$��" �#$� � #$� �$� �,� ��"", -#""#6�� �� $� � ������#��#�,9 A#6����: ���� �� ����� �3��� *�$��:�# �� � ���� �$ �)� " !� �* �#$���$� -#� ��� ����� #$ #-/��#�#.��0 6 �� !�$@�$��� #": #� 6 �� �$, #���� #-����� " ��$��: ��� $#� !��$ -#����#* $�9

� ���� #$ #- /��#�#.��0 6 �� !�$@�$��� #"

�� � � ���� #$: ���� #��", ��!" ���� !, (������ �� �"9 4D:�D5: � � ������� 2���: �$� ��� #� � $�" ���� ��� ��#6$ $/ �9 E�9 �� � 6�""+F$#6$ �3��� *�$� 6�� -#""#6�� �� $� � ������#��#�,: �$� ����!" ���� ��� ��� ��# �� #*���,#- ��� ����� #$9 ��� ����� #$ ��� !��$ -������ $���� ����� �� $� �C/ ��� 6 �� �+�� J�#�#*���,"+!�$@�$��� #" �� ��� ���#���� *#"���"� 4�: 1�5: �$� !,� ���� #$ 6 �� !�$@�$���"�$#" �� $� !#�� H+���� T�/'������#��#�, 4�1: �C: 1�5 �$� � 4�159 ��������"���: �$�$�",� � #- ��� � � ���� #$ ���� �� � � *�"� �)� " +!� �* ! $� $� ����� #$: $ �$�"#�, �# ����� #$ � �!#��:

��� $#� !��$ �������-�"9 ��� ����#$ � ����: #$ 6#�F+��#- ��� � ���� #$ ���� ���#�� $� �# � ��� " ��� #$ ��# �� +#*���,: ��� �"#� #- QQ-���� #$ !#�$�LL ������ 4-��� �� #"5�3� ! �� � ������� #- �# $�� ���� ��$$#� !� 2� �# �$,�)� " !� �* *#��"9

A#6����: $ �� � 6#�F: �#����$� ����� ��" ���� 6���-#�$� �# ��+�*���� - ��� � � ���� #$ 6�� �$�",@��6 �� � *#��" ����* $� � " ��$��/��#�#.��0 ��� # #- "������$ ���9 ��� ���� �"#���� ���#�� $� �# ����� *#��"�.�9�9: / �9 E!0 $��� �!", �3� ! ��� ��� � �*# ��" ��#2"�#!�����!"� $ ��� #� � $�" ���� .�-9 / �9 E�0: 6� �� ��#$� ���$� #$", 6 �� �##����� �� ! $� $� #- !�$@�$��� #"" ��$� !, /��#�#.��09 '�!��)��$� 2�� �� $� ��� #�������� �##����� �� *#��"� �$ -#�*", ��#����� A ""�#�B� �$�� $� ��� $� �!#�� 2�� �##����� �� �� #"! $� $� � ���9 ��� #$", 6�, �# �#$������ � *#��" �#$+� ���$� 6 �� ��� N# $� �#$���� $�� #- � ��!+��# �� #*��� �" ��� #$ ��� # �$� *�"� �"� .�10 " ��$� ! $� $� � ��� � �#����*� ���� /��#�#.��0 6�� ���������� �$��� ����#$� � #$� #- ��� �3��� *�$� �$� ���� -�6�� �� #"� !#�$����$ ��� $�*!�� #- /��#�#.��0 *#$#*�� �$ �� $ ���*�"� *��9 ��� �#$� � #$� �#���$ $� �� � � �3��� +*�$� 6��� � K���$� -�#* ��#�� #- ��� ������#��#� �� ���� #$� ����� !�� �!#��: $ ���� ��� /��#�# 6�����+-#"� *#�� �#$��$������: 6�� $ ��� .��0 �����: 6�� $� "��� �"F�" $� ��/ *�� �*: �$� 6�� -�#@�$ �� �� H4�D59 �� � �����-#�� $#� �#*�"���", ����� � $� ����� K���$� � ���� #$ !���� #� 6�� *�$ -���9

*� � ��" ��#�$�� -�#* !#�� T+��, ������� $� 4%�5�$� ���#*��#����� � 4��5 �3��� *�$�� �3 �� -#� *#��"+ $� !#�� /��#�#.#30 �$� /��#�#.��0 �� *�"� *��� ���#$��$���� #$� ��9� *� $ ��/9 ��� T+��, ������� $�����"�� $ ���� ��"�� ��#6�� ���� /��#�#.#30 ����������.�� ��91 *� $ �#0 � � $#� � ���������� -#""#6 $� ��+���� #$ 6 �� � �� #$ �� #$: #� -#""#6 $� �����*�$� 6 ��!�$@�$��� #": #� !#��9 � $�*!�� #- *�"� *�� � *#��"�6��� ������ $ 2�� �# ��� � ����: ��J��� $� � ���� #$ #-/��#�#.��0 6 �� !�$@�$��� #"9 ��� �*�""��� /��#�#.��0*�"� *�� *#��" ���� ��#����� � ����#$�!"� 2� �# ������� �#$� ���$� 6 �� ��� �!#�� �#$���� $�� $�"���������*�� � /��#�#.��0 6 �� 2�� !�$@�$��� #" ! $� $�� ���9 A#6����: ��� 2� ���� �� �� 6 �� $ �� � *#��" 6����##� .<�9C��0 �$� ��� ���#�� $ ��� ��� ��� �#$���$��6��� ��"�� ��", � ��9 �$ ��� � #$: 6��$ ��� ���� �$� ��������*�� � *#��" 2� 6��� ���� ���� �� � '�������� �"#�:��� " $� -�#* ��� *#��" � � $#� ���� ���#��� ��� �����# $��9

� "���� $�*!�� #- *#��"� 6��� ������9 ��� !��� 2��6��� ��#����� !, *#��"� $ 6� �� ����� 6��� �� #� ��/��#�# �$ �� ��� ��������� �$� 2�� #� � 3 �� #"� �#+#����� ��", !#�$� ��� ���������9 �# �� �*#$� �����*#��"� ������ ��#$ �#$� ����� #$ #- � $�*!�� #- �� +��� �9 ����� $�"���� ��� *��$ ���� #- ��� �##�$���+#-+2� : ��� ��#�#�� #$��� ���#� $ 2� ! $� $� �#$���$�:6������ ��� $#* $�" ��"�� #- ��� A "" �#�B� �$� �3+������ ��� ���#��� ��" " * �: ��� �#*����� �� *��$ �����#- ��� 2�� $� ���#�� $ ��� A "" ��"���: �$� � � ���"������*�$� #- �#6 6�"" ��� 2� ������ ���#��� ��� �����# $�� 6��$ �"#���� $ ��� '�������� -#�*�" �*9

���� #�$ � � ���� #$ �"#� #- ��� ���$�� $ ��� � �������* #-/��#�#.��0 6 �� ����� !�$@�$��� #"9 ��� � �������$�� ��� ���� ��� ��$ $ 2�9 � $ 4�D5 ��#6 $� � �� ��� �� $� � ��� ����� #$ 6 �� �$ $2$ �� ! $� $� �#$���$�9 ��� � ��#6� ��� ��*� ���� ���� �� ��#���/��#�#.��0 6�� �#����*�� � $ �� � �3��� *�$�9 ��� �� ���#������ �# $�� $ � � ��� 2� �# ����� ���� 6 �� � *#��" $�"�� $��##����� �� �� #" ! $� $�9 '�� ��3� -#� ���� "�

%DD

Page 7: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

(, ����� �� ��� �: ��� !��� 2� *#��"�� /��#�#.��0 �� ��#����*�� $ �� � �3��� *�$�: 6 �� 2�� �##����� ��!�$@�$��� #" ! $� $� � ���9 ��� *#��" �������$� $�/��#�#.��0 �� �$ ��+*�� 6 �� 2�� �� #" ! $� $� � �����#����� $���", �� �##� � 2�9 ��� ����#$� -#� �3�"�� #$#- ��� ��+*�� *#��" $ -��#� #- ��� �#����*�� *#��" 2� $�"���� � �" ���", �##��� ��"��: � "����� ���#� $ ��� 2�! $� $� �#$���$�: �$� � A "" �#�B� �$� #- 19�=�9E:6� �� � $#* $�"", "����� ���$ ��� ���#��� ��" *�3 *�*�$� 6� �� $�"���� � �#*����� ��", "����� ���#�9 �$��� � #$: �� � ������� !�"#6: ����� � � ���������" ����#$�# ���-�� � �#����*�� *#��" ������ ���$ �$ ��+*��9

��� ����"�� #- ��� �#����*�� *#��" 2� �# ��� ����6��� ��)<�9��=�9�C���� �>�9D .<�9CC�0 �$� A "" <�9D=�9%9 '���$���$ �"���$�� �� *#��"� $�#��#��� $�*�"� *�� $�*!��� �$� ! $� $� ��� #� � K���$� -�#* ���16��� ������9 �"" #- ���* ��#����� 2�� 6 �� �##����##�$���+#-+2� ���� �� �� �$� "����� ���#�� $ !#�� ��)

�$� A "" ��"��9��� ���� �� #� � $�"", ��!" ���� �$� ���� �� � /�+

�#�#.��0 �#����*��: 9�9: �� -#� 4/��#�#.��05��: �����#6$ $ / �9 E �"#$� 6 �� ��� �#����*�� *#��" 2� �#��� ����9 �$ / �9 E� ��� � �*# ��" ����� #- ��� � ���� #$����� ��$ !� � ����$��9 �� � ����� � $#� �#$� ���$� 6 ���$, � ���� #$ ���� -#� � � *�"� ��� �)� " !� �* " ��$�! $� $� ����� #$: �$� � $����� ��������� �� � #-�##����� �� ! $� $� !���� #�9 �$ / �9 E! ��� � �*# ��"����� #- ��� ���� � #!� #�� �$� ��� 2� �# ��� ���� ��##�9 �� $#��� �!#��: $ � �##����� �� ! $� $� *#��"���� ��!��)��$� !�$@�$��� #" " ��$� ! $�� *#�����#$�", ���$ ��� ���� #�� " ��$�9 ��� � *�"��� $���+������ #$ #- ��� *#��" � ������� ���� � ���� ��� 2-��" ��$� ! $� $� ���� �#������� ��� � ����� �B$ �,9 �"" ���� � ���$ #!������ $ ��� �)� " !� �* � ���� #$ #- ���� ��,���* � ����� #$ �: �$� #$", ��� $�� ������$� ! $� $��#$���$�: ����: � #!�� $�� $ � A "" -#�*�" �* 2�9 �����

/��#�#���� ���1 �'A� �����

/��#�#���� ����' ��1� �

���

6���� �'A � !�$@�$��� #": �$� �' $ ��� ��#���� $�"���� ��� ����*�� #$ ���� ��� �� #" � ����#�#$����#$ ! $� $� �# /��#�#.��09 / ���� D� ��#6� � '���������"#� #- ��� ���� ���� �� � /��#�#.��0 �#����*��: �$���� �3��""�$� �#�����#$��$�� �# ��� ���� #- ��� " $���"��"���� -�#* ��� ����� #$ � *#��"9 ��� $��$��",�#$���� ��6��� ����� #- ��� �"#� � �#$� ���$� #$", 6 ���##����� �� ! $� $�9 / ���� D! ��#6� ��� ���� �"#�������#�� $� �# ��� A "" �)��� #$ �$� ��� " $� ��"��"����-�#* ��� �#����*�� *#��" .A "" �"#�� <�9D09

� ���� #$ #- /��#�#.��0 6 �� �,�$ ��

�$ / �9 C � � ��"�,�� ��� ���� #��", ��!" ���� ����#- #$����#$ �� �"9 415 ��#6 $� �,�$ �� ! $� $��# /��#�#.��0 $ ��� �����$�� #- � �6#+-#"� �3���� #-�+�� J�#�#*���,"!�$@�$��� #"9 �$ �� � �3��� *�$� ���J�#� $���� �� #" 6�� ���� �� � ���#���� " ��$� �$� ���� ���� #$ 6�� -#""#6�� �� $� �C/ ���9 ��� �3��� *�$���#6�� �$�*! ��#��", ���� /��#�#.��0 6�� �#*�"�3��!, �,�$ �� 6 ��#�� � ��#� �� #$ #- ��� �� #" " ��$�9A#6����: $# ! $� $� �#$���$� �#���$ $� ��� $������ #$#- �,�$ �� 6 �� �� #"+" ��$��� /��#�#.��0 6�� ���#����9

����� ���� 6��� ������ 6 �� ������" *#��"�9 �$ $#���� 6�� � �##� 2� #!�� $�� �� $� � *#��" $�#��#��� $�� � *�"� �)� " !� �* ����� #$ #� *�"� �"� ��)��$� �"�)� " !� �9 �� � �#$�"�� #$ 6�� �� $-#���� $ ���� ������� ��#����� � �#$���� ��6��� '�������� �"#� .���!�"#609 ����: � �##� 2� -#""#6�� -�#* � *#��" $+�#��#��� $� ��� �##����� �� " ��� #$ #- �6# �,�$ �� #$�.<�9CD109 A#6����: ��� A "" �#�B� �$� ����$� $� �� �2� 6�� �9��=�9�E: 6� �� � ��""#6�� ��� *#��" ��# +�� #*���,9 � � ���� #$ *#��" $�"�� $� ��� �##����� ��! $� $� #- ����� �,�$ �� #$� ��� /��#�#.��0 ��#������ �##� 2� .<�9DD109 ��� !��� 2� 6 �� $ ��� �#$���� $��#- ��� A "" �#�B� �$� $�"���� � ��� �>�/��#�#.��0��# �� #*���, �$� � /��#�#.��0 � *��9 �$ �� � ����: ��#��" #- -#�� �,�$ ��� ��� �##����� ��", !#�$� ���/��#�#.��0 � *��9 ��� �##����� �� � *�� *#��" 2�

���� % ��� ���� #- / �9 E!�������$��� � �� � '���������"#� �$� � �� � A "" �"#�9 ����� $ ���� ���� 6�� ��"��+"���� -�#* ��� �##����� ��*#��"9 /��#�# � �����+��$��� �� � �#����*��9QQ/9(9LL � QQ-���� #$ #-/��#�#.��0 !#�$�LL !,!�$@�$��� #"

%DC

Page 8: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

.<�9CDE0: ��#6$ $ / �9 C: , �"��� � ! $� $� �#$���$�#- �E��=��� �>�9C �$� � A "" �#�B� �$� #- �9C=�919���� ��� *#��" *�" �� ����� #$ ��

/��#�#������ ��/�%A�'A /��#�#�����'%A�/������

���

/��#�#�����'%A�/�������������

6���� �+/�%A�'A � �+�� J�#�#*���,"!�$@�$��� #"9��� / �9 C $��� ��#6� ��� �#$���� ��6��� '���������"#� #- ��� ����9 ��� " $� ��"��"���� -�#* ��� � *��*#��" 6�"" ����#����� ��� '�������� �"#� #- ��� ����9��� ��*� �#$� ����� #$� 6��� -#�$� �# ���", �# ����-�#* ��� �$�"#�#�� � ���� #$ �3��� *�$� 415 �� $����: 6� �� 6�� ��� $ �������-�"", 2� 6 �� � �#+#����� �� *#��" $�#��#��� $� ����� #$ � ��# �� #*���,.��)<�E�=�� �>�9�: A "" <�9�=�9�: <�9CDE09 ��6 �� �,�$ ��: ��� ��� ���� �#�"� $#� !� 2� �� $� �� *�"� �)� " !� �* *#��": �$� 6��� #$", �##�", 2� 6 ��� �##����� �� *#��" ����* $� ����� ��� ! $� $� � ���#$ *#$#*�� � /��#�#.��09

/ �� �# ��� � ���� #$ #- /��#�#.��0 6 �� �,�$ �� $ ��� �!��$�� #- �� #"

����� �����"�� � K���$� " ��� #$ !���� #�9 / ���� ����#6� �,�$ ��+! $� $� � ���� #$ ���� -#� /��#�#.��0��F�$ -�#* ��� ���� #��", ��!" ���� 6#�F #- � �������� �"9 4��59 �$ �� � �3��� *�$� ��� � �������* #- � *�/��#�#.��0 6�� *#$ �#��� ��� $� � ���� #$ 6 �� �����

�����!��,"�**#$ �* �,�$ ��9 /�#* � &#!L� �"#� �$�+",� �: ����� 6#�F��� ������� ���� /��#�#.��0 ����9��=�9�� ! $� $� � ��� -#� �>9

?� ������ ������" *#��"� $ 2�� �# ����� ����: �$� �����#$�!"� 2� 6�� #!�� $�� �� $� � � $�"�+� �� �,�$ ��+! $� $� *#��" .<�9C�C09 A#6����: �� � 2� #$", �##�",����#����� � '�������� �"#� #- ��� ����9 � 2� $�"�� $��6# $����$��$� ! $� $� � ��� ��#����� � $���� ���)� " !� �* �#$���$� -#� �� �$� �# 6�� ��N�����9##����� �� *#��"� $ 6� �� *#�� ���$ #$� �> #$!#�$� ��� /��#�#.��0 �"�# ���� $���� �� ����"��9 ���!��� 2� ����"��� 6��$ ��� ���� 6��� ��� $ ���� �� ��#���/��#�#.��0 6��� � *�� �: !�� 6 �� �##����� �� ! $� $�#- #$", #$� �> #$ ��� /��#�#.��0 �$ �: �� $ ����+� #$ 1�

/��#�#������ ��� /��#�#��������� �1�

�� � 2� � ��#6$ $ / �9 ��: �$� , �"�����)<�9%=�9����� �>�9� �$� � A "" ��"�� #- �9�=�9�.<�9C%C09 ��� / �9 �� $��� ��#6� ��� '�������� �"#� #-��� ���� �$� ��� " $� ��"��"���� -�#* ��� � *�� *#��"9�"��#��� ��� �# $� ������� � "����: ��� �#�����#$��$��!��6��$ ��� ���� �$� ��� " $� ��"��"���� -�#* ��� *#��" � ������$�9 �$�",� � #- ��� ���#$� � � ���� #$ #-/��#�#.��0 6 �� �> 4��5: !�� 6 �� /��#�#.��0<%C ��: ��#����� ��� ��*� ���-����� 2� ��# �� #*���,��#6$ $ ����� #$ 1 .��)<19D=�9D���� �>�9�: A "" <�9�=�9�: <�9CD�09 ��� � K���$�� $ ! $� $��#$���$�� #!�� $�� -#� ����� �6# � ���� #$� *�, !� ����# ��� )� �� � K���$� �#"��$� *�� � �$� ����� #$ �#$� +� #$� $�#"���: �� 6�"" �� ��� � K���$� /��#�#.��0�#$��$���� #$�9

���� �& � ���� #$ �"#� #- ��� ����� #$ #- /��#�#.��0 6 �������!��,"�**#$ �* �,�$ �� �� -#""#6�� !, �9 ����� ������� ��F�$ -�#* / �9 � $ 4��59 ��� �� � ��� 2� �# ��� ���� �� $� �*#��" ���� ���� /��#�#.��0 �� � � *�� �$� 6� �� $�"�����##����� �� �,�$ �� ! $� $�9 � ��� ��� ���� �������$��� �� �'�������� �"#�9 ��� �� 6�� ��"��"���� -�#* ��� *#��"9 '�� ��3� -#����� "�

���� ' � ���� #$ �"#� #- ��� ����� #$ #- /��#�#.��0 6 ����������,"�**#$ �* �,�$ �� $ ��� �����$�� #- � �6#+-#"� �3����#- �+�� J�#�#*���,"!�$@�$��� #": �$� �� -#""#6�� �� $� �C/ ���9����� ���� ��� ��F�$ -�#* / �9 �� $ 4159 ��� �� � ��� 2� �# ������� �� $� � *#��" 6� �� $�"���� � *�� � /��#�#.��0 �$��##����� �� �,�$ �� ! $� $�9 � ��� ��� ���� �������$��� �� �'�������� �"#�9 ��� �� 6�� ��"��"���� -�#* ��� *#��"9 '�� ��3� -#����� "�9 QQ/9(9LL � QQ-���� #$ #- �� #"���� /��#�#.��0 !#�$�LL !,�,�$ ��

%C�

Page 9: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

?� ���� ���" �� �� � ����#��� �# �"" #- ��� � ���� #$�#- /��#�#.��0 �3��$� $ ��� " ��������: �$� ���� #!+�� $�� � ����*#�,$�* ��"", ��" � *#��" -#� ���� #-���*9 ��� ����"�� #- �"" ����� 2�� ��� �������� $ ��!"� ��"#$� 6 �� ��� $�6 ����"�� 6 �� /��#�#.#30 ���#��������9 �� � $#��6#���, ���� ����� � � �$ -#�* �, #- !���+2� *#��" ���� ����F� ��� �$ -#�* �, #- " ��� #$ �����9����: $ ��� �!��$�� #- �� #": �6# 2�� ��#6 ���� � *�� �/��#�#.��0 ! $�� #$� �> ��� *#$#*�� � �$ � 6 �� ��$ -#�* "���" #- A "" �##����� � �,9 �$ ��� �����$�� #-�� #": �6# 2�� ��#6 ���� � *�� � /��#�#.��0 ! $�� �6#�+�,�� " ��$�� ��� *#$#*�� � �$ �9 ��� �#����*�� �*#��" 2� �# ��� � � ���� #$ #- /��#�#.��0 6 �� !�$+@�$��� #" � �$ )�� �$� � � ������� ��������", !�"#693�"���� 6�� ��� ����$� � ���� #$ #- ��� /��#�#.��0 � � �$�" �� $� !�$@�$���"�$#" 4�15 !������ ����� �����3� ! ��� �## *��� ������� �# �""#6 � ��2$ � �� ��# ���*#$� *#��"�9 ��� � *�"��� *#$#*�� � /��#�#.��0��"�$#" ! $� $� *#��" ������ ��#����� � 2� .$#� ��#6$:<�9DE�0 $� ��� $� � ��"�$#" ! $� $� �#$���$� #- �!#���9�=�9����� �>�9

���������

��� �3��� *�$�� ���#���� ���� ��*#$������ � $�6 �$��#$��$ �$� ����#��� �# ��� ����, #- ��� �#"�� #$���* ���, #- /��#�#9 ? �� ����� " ��$�: /��#�# �3+� ! �� � ����#��� !"� 78�8 � ������#��#� � ����#$�� ������$ !� *#$ �#��� $��� �C� $*9 �� � ����#$�� ��$ #$",!� #!������ - � �� #$ �� #$ �$� #���� ��"-��#��� �� #$ �� ���#*�#� � #$ ��#����� ��� ��*#��� -�#*�#"�� #$9 ������� #$� #- /��#�#.#30 ��$ $�"�������$� � #�� �#$ 4D: 1�5: 6� �� *�, $���-��� 6 �� �������#��#� � �3��� *�$� 41�59 �����-#��: �"" �������+� #$� #- /��#�# 6��� ��� 2�� �� $� �+�1 ��" 2"���� #$�# ��*#�� � �� #$ �� #$ �$� ����$� � #�� �#$ �� 6�"" ���$, #���� "#6+�? *��� � ��9 ��� �#$��#" �3��� *�$��6 �� /�.��:���0 6��� ���$ ���� �� #�� �# �����" ��� ����+��#��#� � � �$������ �$� ! $� $� �#$���$�� #- �����*���" #$� #$ � ���� #$ 6 �� ����$��� #"��� $ ��/9����� ���� 6��� ���� �# ���� 6������ �$, ��� ���"*#$#*�� � �#$ �#*�#$�$� �#$��* $���� ��� ������#+��#� � ����"� 6��$ /��#�#.#30 6�� � ������ 6 �� ����+

$��� #"���9 (������ ��� ������#��#� � !���� #� #-/�.��:���0 6 �� ����$��� #"��� $ ��/ 6�� ��*#$+����!", � K���$� -�#* ���� #- /��#�#.#30: ��� ������#+��#� � ����#$�� #- ��/ �#"�� #$� #- /��#�#.#30 �#����� ����$��� #"��� 6�� ��" ����� �� $#� ��� �# �3+���$�#�� �#$9 ��� �#*����� ��", "#6 ! $� $� �#$���$��#- /�.��0 �$� /�.���0 -#� ����$��� #"��� �"�# $� ���� ��������� #$�: ���$ - �����$� �� �#$��$���� #$� �)��" �#/��#�#: �# $#� � �$ 2��$�", �#*���� -#� ����� " * � $��� #"9

�"��#��� ��� �"����#$ � �!�#��� #$ �������* #- /�+�#�#.#30 ����#$�� �# ����� " ��$�� ���#���#�� ����$��: �� � ����#$�� ��� $#� ��#��� �# !� ����#��� !"� $#�� ��$�� �3���� �� ��� �!�#��� #$ !�$� $��� �C� $*9��� ����#$� -#� �� � ��� �����$�", �$�"���: !�� *�, $�"��� ���� ��� ����� #$ #- /��#�#.#30 6 �� ����+$��� #"��� � ���#*��$ �� !, #���� ���������" ���$���6� �� ���� ������#��#� � �#$��)��$��� �� 6���"�$����������� ���$ ��� $*9 ��� 78�8 � �������* #- /��#+�#.#30 ��$ ���, -�#* �������� #$ �# �������� #$ �$����$ -#""#6 $� -���@ $� �$� ���6 $� 41�59 ����� � B+��"� �� ���� !��$ ����", � ���*��$��� !, ���#�� �# F +$�� �� -#� ��� ����, #- /��#�# " ��� #$ ���* ���, 4��59��� 2$� $� ���� ����#��� !"� !���� #� � ��� "�!"� $ ���78 ��� #$ *�, ���$�� �� � � ���� #$9 ��� � �� *��� �����#��� �# ����, $� " ��� #$ ����� #$� #- /��#�# ������ ����$���� ���� #$", �*�"" �#$��$���� #$� #- /��#�#: #$ ��� #���� #- �� ��: $��� !� ����9 �$ ��� � #$:!������ ��� �3��� *�$�� ��$ !� �#$� $ �#"�� #$ ���*! �$� ��*��������: ��� -���� #- -���@ $�: ���� ���#$��$���� #$ #- �#"���� #� ��*��������+����$��$�*#� 2��� #$ #- �)� " !� �* �#$���$��: ��� ��# ���9

��� !����+����$��$� ������#��#�, #- /��#�# 4E: 1�5*�, $� ���� ���� ��� �������� #$ ����� #- /��#�# ���� �!"�: �� � ������� �$��� ����"��9 A#6����: $ �""����� ���� -�� ������: 78�8 � ������� #- ��/ �#"�� #$�#- /��#�# 6� �� ���� !��$ ��� 2�� -�#* � �� #$ �� #$ $��� �!", ��#6 ��� �!�#��� #$ -������ $��� �C� $* 41�59��� ������#��#� � ����#$�� #- /��#�#.#30 �# � �� *��� ���� � #$ #- ����$��� #"��� �#$� $��� �� �"" 6���"�$�����# ���, � �� ����$��� #"��� ��# �� #*���,: $� ��� $��#$� $� $� ���* ���, !�� �# $# #!� #�� �$�+�# $�9 �������#������ 6��� $#� -������ �������9 �� $#��� �!#��: �$,�K���� ��� �# ���$��� $ ��� �#$��$���� #$ #- �#� �* #$

(��� � � ��� #$ #- /��#�#

�3 ��� #$ ����� � ���$� #$� � #$� ��) .�> 0 A "" ��"�� �#��" � ��$�� ��� �# / �

/��#�#.#30 �'> D �� �9�=�9����% �9� �#$#*�� � �9CE�/��#�#.#30 �'> 3� �*AR D �� �9�=�9����1 �9�=�9� �#$#*�� � �9CD�/��#�#.��0� �'A �� HR C� �� �9�=�9����� �9D=�9% ��+*�� �9��� �9CC�/��#�#.��0! ��� ���� #"�R � *� �9E=�9����� �9�=�9� G *�� � �9CDE/��#�#.��0! ,�$ �� ���� #"�R � *� �9E=�9����� �9�=�91 G *�� � �9CDE/��#�#.��0� ,�$ �� 1 HR � *� �9%=�9����� �9�=�9� G *�� � �9C%C/��#�#.��0� ,�$ �� 1 HR %C �� 19D=�9D���� �9�=�9� G *�� � �9CD�

�G��� ��F�$ -�#* 4�D5!G��� ��F�$ -�#* 415�G��� ��F�$ -�#* 4��5��+�� J�#�#*���,"!�$@�$��� #": ���� �� � ���#���� " ��$� $ ��� �C/ ��� �3��� *�$��/ �� !�$@�$��� #" " ��$�� ��� !#�$� ��� �#����*�� #- /��#�#.��0

%C�

Page 10: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

��� $� � ���� #$ ��� " F�", �# !� �*�"" !������ �� � ��� #$ � ���#$�", �#"����� $ ��/ �# � �� �#$��$���� #$ 4%%:%E59 /#� �3�*�"�: $ ��/ �#"��$� �� �1 �: ��� �#$+���� � �, #- ��" � " $��� �# �9��% � �$� #- ��� �#�9�% � 4%159

'�����" �$�3������ ����"�� �*����� -�#* �� � 6#�F:�$� 6� � ����� ����� $ ���$9 '���� $� 6 �� /��#�#.#30:��� ���#$�: ��)<�9����% �>�: �� #"��� ! $� $� ����� #$ � ��* $ ���$� #- ��� 6�""+F$#6$ � ��+�B$ �, ! $� $�#!������ 6 �� /��#�#.��0 �� $� � ������#��#�,9�� � "����� � �� ��� !��$ " $F�� �# ��� ���* $�" �#$ #-/��#�# 6���� ,���E1 �������� -�#* ��� ��#�� $!��F!#$� .�-9 / �9 �09 ��� *��$ ���� #- ��� �)� " !� �*�#$���$� �$� ��� $����� #- ��� ������#��#� � ����#$��!#�� $� ���� ���� ��� #!������ ����� #$ � $#� ��� �#����$� � #�� �#$9

��� � #$ #- * ��@#"� ��#����� �*�"" ���$��� $ ���78�8 � �������* #- /��#�#.#30 .�-9 / �9 1: �!#��09 �! $� $� $������ #$ 6 �� /��#�#.��0 � �"�# $� ����� !,*#� 2��� #$ #- ��� � �������* 4��5 �$� !, �� $+"�,��/��� ������#�"����#���* ��" ���� �� #- � ! $� $�:6� �� � ������!�� !, * ��@#"� 4�%59 � ���� #$ #- /�+�#�#.#30 6 �� ����$��� #"��� $ ��� �����$�� #- �3���� * ��@#"� � ������#��#� ��"", � K���$� -�#* ��� � ���� #$ $ ��� �!��$�� #- �� � *#"���"�: "��� $� �# ��� ��*� $-���$�� #- � ���� 2� /��#�#+ * ��@#"� $������ #$9

��� � ���� #$ #- /��#�#.#30 6 �� ����$��� #"��� $��� �����$�� #- * ��@#"� "�� �# ��� �$�3������ ����"������ * ��@#"� ! $� $� $#� #$", $������� ��� $�*!��#- !#�$� ����$��� #"���� -�#* #$� �# ����� !���"�# $����� �##����� � �, $ �� #"��� ! $� $�9 �� ��##����� � �, *��� !� � ��+�"�����9 �$� #- ��� ������� #"��� ! $� $� � ��� � *#�� " F�", ��� �,��� $� ��"-��! $� $� � �� #- ��� ���* $�" �#$ ./ �9 �09 �- * ��@#"� ���� �$�� �# ��� *#",!��$�* #$ ��� !�� � #- ��� F$#6$A ����� ! $� $� � �� $ $ ��#��$���: ���$ ��� $J��$�� #-�� � " ��$� *��� !� ���$�* ���� ���#�� ��� �$� �� *���"�"����� �# �K��� �� #"��� ! $� $� �� ��� �$� �#��" �#$9��� � �� #- ! $� $� -#� ��� ��*� $ $� �6# �� #"���� ���#!"�*�� �9 �� � � B��"� �# ��� #$�"", � ��� !��� �6#�� #"���� �*#$� ��� � 3 �#�� �#$� #- ��� /��#�# �"�����9��� *#�� ����#$�!"� �#�� ! " �, ���*� �# !� �6# �� #+"���� �"#$� 6 �� * ��@#"� �#*�"�� $� ��� �##�� $�� #$#- *#",!��$�*9 (������ *#",!��$�* ��$ �3��$� ���##�� $�� #$ $�*!�� �# � ��� 4%�: %D5: ��� �#�� !"� ���+��$�� #- � �#*#� ����� " ��$� *�, $#� �����$� -������" ��� #$ #- �� � #$9 �� � ��#�#��" �#�"� ���� ", !� �������� $� *#",!��$�* H+���� T�' 4%: �1: �C: %C: E�59

��� �������-�" 2�� #!�� $�� #$ � ���� #$ ���� ��F�$-�#* ���� #��", ��!" ���� ���� �� #- /��#�#.��0 ����!#�� *�"� *�� � /��#�#.��0 �$� �##����� �� " ��$�! $� $� $ �#**#$9 �$ ���� ����: $�"�� $� ����� ����+� #$ ��������� �� �� $ ��� ������ *#��" ��#����� ���#!� #��", ����� #� 2�9 ����� 2$� $�� �#$�� ���� �$#�������", $#��" ����"� �# �*���� -�#* �� � ����,9 � �#$$��+� #$ ��$ !� *��� 6 �� ����"�� -�#* *#",!��$�* H+����T�/' ���� $� ����� "#$�+��$�� #���� � $������� $/��#�#.��0 -#""#6 $� �� #" ! $� $� 4�1: E�59 ' * "�� $+��������� #$� ���� ����$��� �#"��**��� � �3�* $�� #$

#- /��#�#: 6� �� �3 ��� $ *�"� �"� �"����#��� �� -#�*� $ ��� �!��$�� #- !�$@�$��� #" �$� �#�"����� �# � � $�"�-#�* $ �� �����$�� 4E: �1: �%: E�59 ��� $-���$�� � ����" ��� #$ #- /��#�# !, �� #" � ���#*��$ �� !, �����+����" �#*#��$ @�� #$: �$� �� � ��#���� � $#� $�#$+� ���$� 6 �� � �##����� �� �""#���� �*9

��� �#����*�� � *#��" -#� /��#�#.��0 �� � $� -�#*��� 2�� �# ��� ���" ��� � � ���� #$ #- /��#�#.��0 ��"���", �$�������$���9 � "���� � ���� #$ �3��� *�$� ���+-#�*�� $��� �*! �$� ��*�������� �$� -#""#6�� �� $��C/ ��� ��#6�� ���� ��� ����� #$ #- !�$@�$��� #"�6 �� !#�� /��#�#.��0 �$� /��#�#.#30 � �$ �)� " +!� �* ��#���� 4�: 1�59 ����� ��� �3��� *�$�� $� ��������� ��� �*! �$� ��*�������� �B$ �, -#� !�$@�$��� #" !,/��#�#.��0 6�� *��� "��� ���$ ��������� !, ��� ����"����** $� -�#* ��� -�#@�$ �#"�� #$ � �3��� *�$�� ������� ����9 '��� ��� �� #$� $ #���#*� *�", ������� " ��� #$ !���� #� #- /��#�#.��0 � ��*����������$� � ��9 �� $#��� �!#��: �� ��$�� -#� �������� #$#- /��#�#.��0 $ ��/ �#"�� #$ ��� !��$ ��� ��� -�#*� $�*!�� #- �3��� *�$��9 ��� ��� �� #- �,��� #$���E91 �U ����"� $� -�#* �#"�� #$ T+��, ������� $� �3+��� *�$�� 4%�5 � ����#3 *���", �#$� ���$� 6 �� /��#�#�� *���9 A#6����: ��� �����$�� #- "����� ���������� 6����"�# *�" �� !, ��� ����9 A#6 /��#�# *�, ��������� $�#"�� #$ 6 "" !� � ������� !�"#6: �$� � ����#$�!"� *�+���$ �* -#� ��� -#�*�� #$ #- /��#�# �#����*��� 6 ""!� ��� ��� -�#* �� � *#��"9 �� � �"���: �#6����: ���� $�� � ���� ��� �##����� �� ! $� $� #- !�$@�$��� #" *���!� � �+�"����� �$� �# � � K���$� -�#* ��� $���+�"������##����� �� ! $� $� #- ����$��� #"��� !, /��#�#.#30 $��� �����$�� #- * ��@#"�: � ������� �!#��9 �� � *�" ������: 6������� ��� ��������� #- ��� �#����*��: �#**�+$ ��� #$ �*#$� ��� !�$@�$��� #" ! $� $� � ��� � �B� �$�9�$, �����$�� #- �#����*�� � /��#�#.��0 � �"���", ��+��$��$� #$ �#"�� #$ �#$� � #$� !������ $#$� #- ���#���� �3��� *�$�� �3�* $�� ��#����� �� ��$�� #- �� �"���" #- �������� #$9

�"" ��� *#��"� ���� �# 2� ��� ��*� $ $� /��#�#.��0� ���� #$ ���� ���� *�" �� � � *�� � ��������� $ �#"�+� #$9 ��� !���+2� *#��" �$ -#�*", -#""#6� ��� � K���$��#$� � #$� #- ��� ���#���� �3��� *�$��9 ? �� ������� �#��� ! $� $� #- �,�$ �� #� *���," �#�,�$ ��: ��� *#��"��$ -#�*", *�", ���� 6��$ �� #" � �����$� ��� $�*!�� #-�+�,�� ! $� $� � ��� #$ /��#�#.��0 $������� !, #$�.��!"� �09 ����� �C/ ��� �3��� *�$�� ���� �� #�� !,#$����#$ �� �"9 415 ��#6�� ���� ! $� $� #- �> #���� 6�� $#� ���#*��$ �� !, � ���$�� $ ��� #���+��$�, #- !#�$� �� #"9 �- ��� ���+ #� �+!#�$� /�+�#�#.��0 $�"���� #$� �� #" ��� /��#�#.��0 �$ �: ���$��� 2�� $� ���� ���� ��� �#��" $�*!�� #- " ��$� ! $� $�� ��� ��� /��#�#.��0 �3��$��� �# ������ #$� �� #" �$��6# �,�$ ���� �#�,�$ ���9 �� � ����"� ������� � * "�� �#��� ���#�� #- �!��� * �� �"9 4�%5: 6�# #!������ �$ ��+� � #$�" � !�$� $ ��� /��� #- /��#�#.��0 �$��� ���*#������ $ ��� �#""�����" �����$�� #- !�$@�$��� #"�$� * ��@#"�9 ��� �#**#$ -���#� -#� �3��$��� " ��+� #$ #- /��#�#.��0 ���*� �# !� ��� �����$�� #- !#���� #" �$� � *#",!��$�*+! $� $� " ��$�9 ���� $ ���

%C�

Page 11: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

�> � ���� #$ #- /��#�#.��0 �"#$�: �� ���� �� #�� !,� ������ �� �"9 4��5 $ ��� �!��$�� #- �� #": #$", #$��,�$ �� � !#�$� ��� /��#�#.��0 �$ �9 ��� $���� #$ #-��� � #$�" " ��$� ! $� $� � ��� 6��$ !#�� � ����� ��",*#",!��$�*+! $� $� " ��$� �$� � �� #" ��� �����$� *�,!� �$ �*��� $� ���$� $ /��#�# ���* ���,9

/�#* T�/' �3��� *�$��: �,�$ �� �� � "#$� " ��$� � F$#6$ �# ! $� �� ��� *#",!��$�* � �� #- �#"����/��#�#.��0 4E�59 �- � �# ! $� $� � �� � � �#$���$� -���#� $ ��� �6# ���� #- �,�$ ��+! $� $� �3��� *�$��: ���)���� #$ !��#*�� 6���� ��� ���#$� �,�$ �� � !#�$� $��� �C/ ��� �3��� *�$� ���� $�"���� �� #"9

(������ ��� ��� ! $� $� ���� -#""#6�� ��� ��*�*#��" �� ���� #- �> ! $� $� $ ��� �C/ ��� �3��� +*�$��: �$ �$�"#�, ���6$ -#* ��� ���* ���, #- �#+�,�$ �� " ��$�� *�, !� ��"�-�"9 �#",!��$�*.�80��$���� ��� F$#6$ �# ! $� !#�� � �$� (��� 4E�: E�:E�: E159 ��#�,�$ ��� �"�# ! $� �# ��� �#$ ��$���� #- /�+'��!�$�� �$� � * "�� �"������ 4E%: EE59 A#6����: ���, $+������ $� ���������" �$� *����$ �� � ����"�� ��"���$� �#$ ��#��$ 23�� #$ $�#"� $� ��� ����� #$ #- �#�,�$ ���6 �� �,�"#��$��� �$,"+������ � +*#",!��$�*.�80 ��"+2�#+!� ���� �"������: �� ���� �� #�� !, G�(# � �$� ����#""�!#���#�� 4ED: EC5: ��$ !� ���" �� �# �� � )���� #$97$��� �,��#��$: ����� �"������ ��$ ������ A� �$� �#�,�$ ��� �# �**#$ �: ���� �#$�� ��� $� � ��" � ���+* ��" *#��" -#� ! #"#� ��" � $ ��#��$ ������ #$9 ��� +��"��", ��"���$� �# ��� � ����� #$ ���� � ���� �$�)� " !� �* ����� #$ !��6��$ �#.�80+��"2�# �"�������$� �#�,�$ �� � #!������ $ 6� �� ��� �#�,�$ �� ������� !", !#�$� �# � !� �� $� ��"2�# ��"-��9 /#� �������� #$ #- O��#.�+'0P�'�A� .�<�,�"#��$��� �+$,"0 6 �� �+!��," �#�,�$ �� $ ��"#�#-#�* �#"�� #$: ����)� " !� �* �#$���$� � ��� �>� 4EC59 � F� �<���/��#�# $ ��� �#"#+��#�� $ 4��5: O��#.�+'0P�'�A�

$�"���� ���* $�" �#.�80+��"2�# � ���9 �$ -�������$�"#�, 6 �� �#"#+$ ��#��$���: �� � �"����� ������ 6 ��A�: �#�,�$ ���: �$� �,�$ ��� �# ��#���� �A� $ �-��� $�� $� �$� 6�""+6#�F��+#�� *����$ �*9 ?� ���������� �#�� ! " �, ���� ���* ���, �$�"#�#�� �# ���� #-O��#.�+'0P�'�A� �$� � * "�� �# ���� ��#6$ $ ��+��� #$ % *�, ��������� @� ��� $������ #$ #- /��#�#.��06 �� *���," �#�,�$ �� $ ��� �����$�� #- �+/�+!�$@�+$��� #"�

�� � �,�#���� � �#�"� !� ������ !, �$ /��� �3��� +*�$�: $ ���� ��� ��#�#��� <� !#$� *�, � ��"�, ���������� �� � !�$� $��� �%��>�%1� �*>� 4ED59 �� ����* ���, ������$�", �#�� $#� �����$ 6 �� � 6��$��� ����� $� ���� �� � ��� �� #"��# �#*�"�3O��#.�80.'�A�A�0P� 4ED59 A#6����: �$ �!�#��+� #$ �� �D�D �*>� �#�� !", �#$� ���$� 6 �� � S<�-�$�� #$�" �, 6�� �������� !, /��� $ ��� ����� #$ #-

� 6 �� /��#�#.��0 4�%59 (������ ��� ����� #$ #- !#���> �$� ��� 6 �� /��#�#.��0 $ ��� �����$�� #-�+/�+!�$@�$��� #" -#""#6�� ��� ��*� *#��" ��# �� #+*���, $ ��� 2��: �� $#��� �!#��: ��� ��*���� #$ � �#�3��$� ��� �,�#���� � #- ����� #$ % �# $�"��� ��� ����+� #$ #- /��#�#.��0 6 �� �,�$ �� " ��$� �� 6�""9 �$ �� �����: ��� ���� �� ����� $� 6 �� /��#�#.��0 *�, !� A������� ���$ ��� �$ #$: $ �$�"#�, 6 �� ��� ����� #$ #-A� 6 �� O��#.�+'0P�'�A� 4EC5: -�� " ����� !, ���#�#$ ����" �� !, �+/�+!�$@�$��� #"9 �$����� #$ #-/ �9 � ��#6� ���� #$ ��� /��'� -���� #- /��#�# ���#��$ � ��� #- ��� �#�� �#$� ��� �����$��� �#6���� �����$��� #- ��� �"����� �$� $#� �#6���� �3���$�" �#"��$�9� ��� #$ #- � �#�� �#$ 6#�"� " F�", $����� ���� � ���$�� $ �� � ����$��*�$�9 A#6����: ��� �#�� ��"2�# ��#������ ��#* $�$�", �3�#���9 �- �� � ��"2�#+!���� ���* ���,��$ !� ��#6$ �# #���� 6 �� /��#�#.��0: ���$ ��� �#�+� !"� *�" ��� #$� 6 �� ������� �# ��� *����$ �* #- $ +��#��$ 23�� #$ ��� �"���9 �� � ��"���$� ���� �# $#�� ����! $� $� #- �#�,�$ ��� �� ��"-�� �#�� �� #���� $ �$�+"#�#�� �+������ �#.�80 �#*�"�3�� $ 6� �� ���!� �� $� " ��$�� ��� �� #"��� ������ ���$ ��"2�� 4E�: E�:E159

� ��� #�� �$#*�", ��*� $ $� � ��� �#$����� !��6��$��� T+��, ������� $� ����"�� ��-���$��� �!#��: *�", $� ��#",� ������ �#"�� #$+����� /��#�#: �$� ��� ����"������ $ 6� �� �$ -#�*", � $�"�+����� /��#�# *#��"�. 9�9: �"" *#$#*��: �"" � *��: #� �"" �#����*��0 6����������-�" $ 2�� $� ��� � ���� #$ ����9 ?� ���� $#��2$ � �� �3�"�$�� #$ -#� �� � �#$�����9 ��� T+��, ����+��� $� ����"�� $� ����� ���� /��#�# ���������� $ ��/�#"�� #$ 6��� �� *�� ", ��#��� $#� �3�"�� ��", �*�"":�#$��$���� $� ����#3 *���", ��#�$� �� *��� #�: �)� �+�"�$�",: * 3����� #- � *��� �$� �����*���9 ��� ����"������� !�� ���� *�F� �"��� ���� ��� *#$#� ������ *#��"��������-�"", ����#����� ��� � ���� #$ ����9 �# ����*���6��� *��� �# 2� ��� � ���� #$ ���� �� $� -���� #$�"�#��"�� #$� #- �*�"" /��#�# *�"� *���: !������ ���� �*#��" ����$��� � "���" #- �#*�"�3 �, $#� ��)� ��� �##!�� $ � �##� 2� �# ����9 ��� � *�"��� �#�� ! " �, � ����#$� *�*!�� #- ��� ��� #- �)� " !��� $� /��#�# �����+����� $ ��/ �#"�� #$ � �#$������ $�# ��� �#*�"�3������ �� ��� $� � ���� #$9 ��� ��*� $ $� �$�#*�"�3����/+�#"����� /��#�# ���������� ���$ ��+�)� " !����9��� " ��� #$+��+�)� " !��� #$ ��#���� � �������� �$� " �""��� ��/+�#"����� /��#�# ���������� ��� �#$������ $�# #$� " ��$�+!#�$� ���� ��: ��� ��$� �, #- 6� �� ������* $�� !, ��� �3��� *�$��" �#$� � #$�9

��� )���� #$ ��*� $� �� �# �#6 /��#�# * �����"-+��������� $ ��/ �#"�� #$9 A��$� �� �"9 4��5 ���� $-����� � ������ #- �> -#� ��� /��#�#.#30 �#"�� #$� *��9 �� � ������ � $#� �3���� �� 6��$ �#*����� �#F$#6$ �3��$��� �#$+��"-�� �"����� �$ #$�: ���� ��4/��.' �0�"%5

�> 4D�5: 6� �� ����, � � ���� ������ ��$+� �, ��� ����, �#�� �"�*�$� ���$ 4/��#�#.#305�

�>9 �����"����� �"������ ��� ��#�#��� �# -#�* !, ��� ���#� �� ���)� " !��� #$ #- �*�""�� �$ #$ � �$ ��9 /��#�# �����+��� #$ *�, ��#���� �$�"#�#��",9 � 6�""+��������� @���$�"#�, �# ��� ���#� �� �� ����� ��#�#��� !�"#6 -#�

%C�

Page 12: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

/��#�# �������� #$ ��� ��� $ ��� ��"-+����*!", #- ���� ��+$��"��� �, �#",�$ #$ � /�+' �"����� 4���/��D'��5

D>

-�#* �*�""�� �$ #$ � /�+' ��#*!� 4D�59 ' * "��",: � ��",�$ #$ � �#",#3#*���""��� �#*�"�3�� #- ���, � ��$��"��� �, �$� �$ #$ � ������: ���� �� 4 �?��V$�.A��0�����5

�%> 4D�5: ��� �,$���� @�� !, ���#� �� #$ #- �*�""���$ #$ � �$ ��9 �$ �#*� �����: �"����� ��"-+����*!", �������$�", ��� ���� !, ��#�#$� #� �#�$��� #$� 4D�: D�:D�: D�5: !�� $ #����� *�, $#� !� �# ��� ���� 4D�: D159 ��*�, !� ���� ��� � �� $#* $�" ������ #- � � ��$ � ������/��#�# ��������� $ ��/ � ���� �"", $�����" @�� !, #$ �� � $�: ���#��� ��#�#$�� #$ !, �$, �3#��$#�� �� #"�����$�: #� ��#�#$�� #$ !, ��/ ���"-9 �� � "��� � �$��* �� !"� �#�� ! " �,: � ��$ ��� "���� ���#��#�#",� ��#$���$� #- ��/ 4D%: DE59

/��#�# $�"���� ����� �)� ��"�$� !�#F�$+!#��*���""#+�,�"##���$� -���� � ��#��� ���� �����: ���� 6 ���"���$�� $� �#$� �$� ��"2���9 �$ / �9 �� 6� ��#�#�� �)��" ��� �� *#��": ������� $� ���� �$ $������ $� �$��"��� !"� � *�� ��������� �*����� 6��$ �6# ���� -����:#$� -�#* ���� /��#�# *#"���"�: ��� N�3���#���9 �$ �� �����: ��� /��#�# �"������ ��� �#����� �1� ��"�� �� �# #$��$#���� �# �� �# !� $� ��� -#�� �#$� #$ ��� -��� #- #$�/��#�# �"����� #��#� �� ��� -#�� ��"2�� ��"-��� #$ ���-��� #- ��� #����9 �$ �# �# $�: � 6��F �3#��$#�� $���+��� #$ #- -#�� #- ��� � 3 �#�� �#$� 6 �� -#�� #��#� $���"2��� !��#*�� -��� !"�9 ��� �� � $� -#��� -#� ���#� �+� #$ � ��������� �# !� ��� �##�� $�� �� ������� #$ #- ����#�� �#$�9 �- ���� #- ��� � ��� $�6 $���+�"����� /�+' $������ #$� � 6#��� N��� ��� #- � �,��#��$ !#$�: ���$ �����9 >1 F& *#">� �#��" -��� �$���, ���$�� 6#�"� �$�����#*�"��� � *�� @�� #$9 /#""#6 $� � *�� @�� #$: ��� ���+���� �� /��'� -���� !��#*� $������ !"� �# ����� " ��$��9

��� -#�� ��*� $ $� #��$ /��'� -���� #- ��� � *��.�6# ��� /��#�# ��!�$ �0 ��� $ � ��������� �6#+����+#-+�6# ����$��*�$� ./ �9 ��09 ��� �6# ��#3 *��� #��$ $����"����� -���� ��� �1� �����: �$� ��� ���#$� ��� #- �6#��� �D�� �6�, -�#* ��� 2���9 ��� �##�� $���� ���� -#��� � *#��" ��� ��#�� #- ��� ��!" ���� ��,���" ���������:�$� �# ��J��� � � � � �, ���� �#"�� #$+����� /��#�# ��+����$�", �#�� $#� ����9 �����-#��: ��� "#$� $���+�"�����/�+' � ���$��� ./ �9 ��0 ��� �$ ����� " * � ��� *���9 ?��#$� ��� ���� � *#�� ��"�3�� *#��" -#� �#"�� #$+�����/��#�#: �#$� ���$� 6 �� T�/' *��� �� $� ��� $� �$�3��$��� �"����� 4E�5: 6#�"� ��#���� � � *�� 6 �� $���+�"����� /�+' � ���$��� �#$� ���$� 6 �� � 6��F !#$� $� $������ #$9 �� � ��������� � ��#�#��� �� � *#��" -#� ���� *�� � /��#�#.��0 *�" �� !, ��� 2�� ����� !�� �!#��9

���� �� '��������" *#��" -#� � /��#�# � *��9 �6# /��#�#*#"���"�� ��� �#����� �1� ��"�� �� �# #$� �$#���� �!#�� � �#**#$�3 � �# $� ���#��� ��� ��$���� #- �$ /��'� -���9 �� � ��#���� " $��-#�� �#�� �#$� #- #$� /��#�# 6 �� -#�� ��"2��� #- ��� #����: �$�� �� �����9 ����� -���� ��� ���$ !�#���� �#������9 "!�� � �����+2"" $� *#��" #- ��� � *�� ��� ��� -�#* ��� �##�� $���� #- �����,���" ���������9 �#�� ��� �6# #��$ �/�+�' -���� #� �$��� �1������9 ����� ��� �6# *#�� ���� -���� �D�� �6�,9 '�"-��� ��� ��#$�: �#$� ��� �����+��%: �$� #3,��$� ��� ��%9 ��� *#",!��$�*���� !�$���� ��� #3,��$� �$� �"*#�� �#*�"���", #!������ $ �� �� �69 ��#$�� � ����##$ ��#6 $� ��� ! -�� �" ���� #- �#$���� 6 �� ���/�+' � ���$��� � ��$ !�"#69 ��� !��� ������ �� �� �# ��� -�#$� .�>�0��� $�*!���� �# ��� � "#6�� � ��� �$� ��� ���$� ������ �� �� �#��� ���� .�>&0 ��� $�*!���� �# ��� � ����� "�-�9 ��� $���+/��#�#� ���$�� 6�� ��N����� �# ���� ��� * $ *�* $���-�� �" '+'������� #$ 6�� �9�% �U 9 �� � � ���$�� 6�� ��� ��� !, ���" $� ��� ��" $� #$ � ��� �� -#� '�> !, ��� ��� # #- ��� ������� ��,���"��������� /��#�# /�+' � ���$�� �# ��� ��" $� #$ � ��� �� -#� ���/�+' � ���$��

%C�

Page 13: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

� �#*���� /��#�# ��3�*�� ��$ -������ !� �$� +� #$�� ./ �9 ��09 ��� ����� �/�+�' -���� #- *#$#*�� �/��#�# ��� ���� �����9 �� � ����$��*�$� ��$ !� ���+����$��� �� �$ �)� "�����" �� �$�"�: ""�������� $ / �9 ��9�$ � � *�� ��� �6#+����+#-+�6# #��$ -���� ��#���� ���-#�� ��������� ������ !"� -���� ����� !�� $ / �9 ��9 ����#6$ $ / �9 ��: �� � ��������� *�" �� ���� � ��3�*����$ -#�* !, ��� ���#� �� #$ #- ����� � *�� �$ ��9 �����3�*�� -#�*� � �#*���� �6 ���� �#���9 '��� � ���������$#6 ��#� ��� �##�� $�� �� ������� #$: �$� ��)������� #$-�#* �#"��$�: �# �"" �% �#�� �#$�9 �� � ��������� � $#� $�#$� ���$� 6 �� ��� E91 �U ������� �� �� *������� !,�*�""+�$�"� T+��, ������� $� *�$� #$�� �!#�� -#�/��#�# $ ��/ �#"�� #$: !������ �"#$� $# �3 � ���� ��3�*�� 6 ��� ���$ �6# *#$#*��� �"�� ��� $���+/��#�# /�+' � ���$��9 �$ $#$� #- ����� �$� � #$��/��#�# *�"� *��� ��� ��� �$� �#��" *#",!��$�* �$� �#$ � ��� ��)�������� �6�, -�#* ����#��� !, �3#��$#��" ��$��9

��� �!#�� ��3�*�� *#��" $#6 ���* �� � ��� #$�"�#"�� #$ �# ��� ��#!"�* ������� !, ��� 2� �# ��� !�$@�+$��� #" � ���� #$ #- /��#�#.��0 �������$��� !, / ��9 E

�$� D9 ?� $#�� ��� $ ���� ��� !��� 2� ���� �� �� ����$������ �#����*�� *#��" $ �� � �3��� *�$�9 � ��"�� ��",�#*���� �#����*�� ��$ �� �� - �6# #- ��� ��3�*��� #-/ �9 �� 6��� �# ����F -���+�#+-���9 �- ��� �" �$*�$� #- ���/��#�# *#$#*��� �"���$���� ��#�$� ���� #- ��� ��3�+*�� �$ �� �� ��#6$ $ / �9 ��: ���$ ��� ����"� $��#����*�� 6#�"� �����$� � 3 �$� �#��" �#$ -���� #��$ �#�� #" " ��� #$9 ��� ��*� $ $� � 3 �#$ -���� 6#�"� !���)�������� �6�, -�#* ����#��� !, " ��$� 6 �� $ ��� $��� #� #- ��� ����F9 ���� ��� ����"�� -�#* ��� �� ���� #$ #- (������ �� �"9 4�D5 ��$ !� ��� #$�" @�� $���*� #- �� � ���������: 6 �� ��� ��#� �# ���� #$", ���2��� 2�� !�$@�$��� #" " ��$�� ! $� �##����� ��",9 ���! $� $� !, �$, � 3�� " ��$� 6#�"� ���$ $�#"�� � � *�"��)� " !� �* ����� #$ 6 �� ��� ��*� $ $� �#$ � �� #- ���$���", ��������� �#����*��9

�"" #- ����� ����� ��� ��������� �# !� ������ !"� �#���#�� !#�� 6 �� ��� ����F� #- *#$#*�� � /��#�# !,��#+$ ��#��$���: 6� �� � ���#*�" ���� !, � "�� $�/��#�# $�# �)��#�� �#"�� #$: �$� 6 �� ��� � ���� #$����"�� *�", $� *#$#*�� � !���� #� �� "#6 �#$��$���+� #$� �$� *#$#� ������ !���� #� �� � ���� �#$��$���+� #$�9

/ $�"",: ��� ����#��� ��F�$ ���� ��� �$ 2�� ���" ��� #$ ���* ���, #- /��#�# �$��� � *#��" #- � *�"�#� �##����� �� " ��$� ! $� $�: *�"� �"� /��#�# " ��$�! $� $� � ���: �$� �#����$� /��#�# �������� #$9 ����� 2� ���������" *#��" -#� /��#�# ���������� ���!��$ ��#�#���9 ��� "����� ��� ��2$ �� ��* 2��� #$� $�$, ����#��� �# ��� #$�" �,$���� � #- /��#�#9 )� +" !� �* ���#� �� #$ #- /��#�# $�# ���������� #- ��� +#�� F $�� �$� � @�� *�, �3�"� $ ��� �#$� $� $� "��F #-������� $ ��,���"" @ $� �� � �"�����9 '��� �3��� *�$���,� ��"", $�#"�� �#$��$���� $� /��#�# �#"�� #$�:�#$� � #$� ���� *�, ��#���� /��#�# #" �#*���: ����#- 6� �� *�, !� �� � ��"�� ��", "#6 �#$��$���� #$9

���� �� '���*� -#� ��� #" �#*�� @�� #$ #- /��#�# $ ��/9 ' ��� �6 .��� �#$�0 �$� -�#$� � �6 .��� �!�0 #- ��� /��#�# ���������:6� �� ��� !��$ $��� !�� 6 �� � �� �$��"�� �� �* #$ �� -���: ����" $����� !, ��� � 3 �#�� �#$�9 ��� �����$��"�� -��� #- ��� �� �*.��� �#$�0 � !#�$��� !, � *���""#+�,�"##���$� �#$� �� $� #- -#���"���$�� $� �#$� �$� ��"2���9 /��#�# ��� ����� ���� *���""#+�,�"##���$� -���� � ��#��� ���� �����9 ���' �!�� ��� ����������$��"�� -���� ��� �������$��� $ �6# � *�$� #$� !, ��� � ���#- �$ �)� "�����" �� �$�"�9 ��� � *�� #- / �9 �� � *��� 6��$ �6#/��'� -���� -�#* �6# �� �$�"�� ��� N�3���#��� .���' �����09 ��#*���� ��3�*�� ��$ !� �$� � #$�� !, �#*! $ $� ����� � *���.���' �#$�09 �$ �� � ���������: �6# #- ��� ����� -���� #- �"" ���/��#�# �"������ ��� ��)�������� -�#* �#$���� 6 �� �#"�� #$: �� #-��� �% �#�� �#$� ��� $#* $�"", -#��+�##�� $���: �$� �� ��� 2��+�##�� $���9 � �#����*�� � -#�*�� 6��$ �6# ���� ��3�*��� ����F-���+�#+-���9 ���$+��� $ #" �#*��� ��� �"�# �"���", �#�� !"�

%C1

Page 14: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

�$�#*#��$�#�� * 3����� ��� �,� ��"", ��� ���$� �# ��,�+��"" @�� #$9 �$�",� � #- � ���� #$ �$� #���� ����"�� *�" ������ " ��$� ������� #$ #- ��� ���* $�" *���" � ��� *�, !�� �#��� �# ������� $ ���� �#�"����$�� #- /��#�# $�# �� $�"� -#�* *�, ����"�9

������ �� ) �� �� � 6#�F 6�� ����#���� !, �'/ A+C�+��1E% �$� ��A ��+����C .�# H9�9A0 �$� !, ��A ��+�����.�# (9H9(09 ?� �"�# ���$F ��� �$#$,*#�� ��� �6���: 6�#���� � ��" �#**�$�� ��"��� #�� �3�#� � #$ #- ��� ����"�� ���#�������� $9

���������

�9 '��� 8H: (� "" ?& .�CEE0 �#� ���" ���� '� 7'� E�����C>��1�

�9 ��6" $�� &: '��� 8H: � �$�"" &�: (� "" ?&: V **��*�$$ �:��W $�F : ��*�+&#�$�#$ ?A .�CED0 & ( #" ��* �1������>����

�9 ��$�F� H: �#� ,� �: 7�@�* ': ��$�F� � .�CDE0 �$#�� ��*�E���E>���

�9 #$����#$ 'G: (������ (H: A#"* �A .�CDD0 & ( #" ��*�%����E��>��E�C

19 #$����#$ 'G: (������ (H: 8����$ '�: �#� ��: A��*�$ (:A#���#$ H�: A#"* �A .�CDC0 & ( #" ��* �%���1C%E>�1CE�

%9 A��*�$ (: /��$F : ���""�� '/: �#� ��: ��6�#$ ?:A#���#$ H� .�CDD0 & �* ��* '#� �����ECD>�D�1

E9 ��6�#$ ?: ���""�� '/: /�"�*�$ (&: G�$��* ?�: '���"�@/� .�CDC0 & ( #" ��* �%���C��>�C�E

D9 (������ (H .�CC�0 ��* ��� C����EE>���%C9 '���"�@ /�: /�"�*�$ (&: ���""�� '/: ��6�#$ ? .�CC�0 �$#��� * ���� �E����1>���

��9 � ������ �&�: �#6� G&: � ������ ��: ��#*�#$ �&: '* ��( .�CC�0 ( #���* & �CE��E�>�ED

��9 �����" $ �&: #��#���$ � G .�CC10 & �* ��* '#� ��E����D>���1

��9 ��" $�F '�: ' *�#$#� ��: �#� �� : ��H�$$� :#��#���$ � G .�CCE0 & �* ��* '#� ��C��%%�>�%%E

��9 ��#W $!��� H�: �#�*�" �: '* �� (: A�$����#$ �� .�CCE0��* #**�$ E��>E��

��9 (�@��$#�� ��: (�@��$#�� ��: � �#$#�� '�: ���#�� ��:'� "#�� �H: '����"#�� ��: '� "#� � .�CCD0 �$#�� � * �����E�����>��%

�19 A����, �: '���$�� �?: '��$� ��� �: �#�*�" �: ���$�� G:A��$� $ '': � ������ ��: '* �� ( .�CCD0 �$#�� � * �����E%��1�>�1D

�%9 �� ��"" �: �!��� * 'H: �#�*�" �: '* �� (: �F��� &.�CCC0 ��* #**�$ EE�>EE�

�E9 �� ��#� �: ���$�� G: � ""�� ��: &#�$�#$ : ���� &G.�CD�0 & ��* '#� G�"�#$ ���$� ��%�>��%D

�D9 �� ��#� �: ��������F H: ��*���#$� ?A: ����-��,* #��: /��$F�" �(: A#"* �A .�CD�0 & �* ��* '#� �����D��>�D��

�C9 ##F �: H���"�� � .�CD10 & ��* �,� D��%���>%�%%��9 ��6�#$ ?: ���""�� '/: '�$�� �A: G�$��* ?� .�CDC0

( #���* ( #��,� ��� #**�$ �%��DD�>DC���9 G�$� A: A#K*�$ � .�CC�0 �$��6 ��* �$� � $�" �����%�>

��%1��9 G�$�� � .�CCE0 ��* #**�$ �%1>�%%��9 '������ HH: V��$�� � .�CCE0 ���#� ��* ��� C%����>��1��9 ��� A+�: A�"�� (&: A#K*�$ (� .�CCE0 & �* ��* '#�

��C����C1>������19 G�$�� � .�CCD0 ��* #**�$ 1��>1���%9 ?#"K �: (��� &�: ?�� �F : A#���#$ H�: A#"* �A:

/��$F�" �( .�CED0 & �* ��* '#� �����%��>�%���E9 �� ��#� �: ���$�� G: ��!!� / .�CED0 �$#�� � * ����

�C���DC>��C�

�D9 H#���� &�: (���F $ &H: A#"* �A .�CDE0 #",����#$ %����1>��1%

�C9 V��$� V: /�$ X: X� �: '��,�$ �: '��) $ � .�CDE0 H�3���#$�!�# ������1>���C

��9 #��#���$ � G .�CC�0 ��� ��* ��� ����>D��9 "�� ��� �: (#�� H': (��!�� G: (�,�$ �/: ' $$ :

��� $�#"� �: ���� "" (� .�CC�0 �$#�� ��* �����%1>��E1��9 �$ ?: ���G#$$�"" /�: '�#�� �&: A#"* �A .�CC�0 �$#��

��* ���1D�C>1D�D��9 �,�#$ ��: #��#���$ � G .�CCE0 �$#�� ��* �%��D�D>�D�C��9 A#"* �A .�CCD0 ��� ���" ��* E��C��>C�D�19 H * &: ���� G .�CC�0 '� �$�� �1E��%EE>�%D��%9 H * &: ?## G: ���� G .�CC�0 ( #���* ���, ���E���>E��1�E9 '�""*�$$ G .�CC�0 �$��6 ��* �$� � $�" ���%�>%E�D9 ��, ��: �� �� �& .�CC�0 & ��* '#� G�"�#$ ���$� �E�C>

�E�E�C9 A#6��� &(: ���� G .�CC%0 ��* ��� C%��C%1>�CD���9 (� $��� A: A#"* �A: ��$�F .�CCE0 '� �$�� �EE�%1�>%1C��9 ��$ �H: H * &: ���� G .�CC�0 '� �$�� �%��EC�>EC���9 (������ (H: &��#!� G(: '� �-�" � .�CD�0 ( #�� * ( #��,�

���� %����C%>��C��9 A��$� A;: H#K#�� �: ' *��#$ /(: ?��� �G .�CC�0 & �$#��

( #���* 1��1C>E1��9 ��#W $!��� H�: �#�*�" �: G����$� �: '* �� (: A�$���+

�#$ �� .�CCD0 & �* ��* '#� ������%��>��%���19 '���"�@ /�: ���""�� '/: (������ (H: �#��� ': ��6�#$ ?

.�CD10 & �* ��* '#� ��E�1�%�>1�%D�%9 �!��� * 'H: 8 $��$� H: �#�*�" �: '* �� (�: (��� ' :

�F��� & .�CCC0 ��* #**�$ ���C>�����E9 '* �� (: G����$� �: /� ������ '�: �#�*�" �: ��#W $!���

H�: A�$����#$ ��: �!��� * 'H: �� ��"" �: �F��� &.�CCC0 ##�� ��* ��� �D1>�D%�%%C>%DE

�D9 (������ (H: '� �-�" �: ��6�#$ ? .�CD�0 & ( #" ��*�11��1�>�1%

�C9 #$����#$ 'G: (������ (H: ��6�#$ ?: �#���$�#$ �:A#���#$ H� .�CDE0 & �* ��* '#� ��C�E1�E>E1�1

1�9 #$����#$ 'G: (������ (H: ��6�#$ ?: G ��# �:/ " ��#$ �: ?� VX: ���#" �: A��*�$ (: A#���#$ H�.�CC�0 �#� ���" ���� '� 7'� C����C�>��C�

1�9 ��������F H: '* �� �: ��*���#$� ?A: (������ (H:A#"* �A .�CD�0 �#� ���" ���� '� 7'� EC�E�1%>E�%�

1�9 /��$F : ���""�� '/: ��6�#$ ?: A#���#$ H� .�CDC0 ( #+���* ( #��,� ��� #**�$ �%��E�%>E1�

1�9 ""*�$ �� .�C1C0 ���� ( #���* ( #��,� D��E�>EE1�9 �$�#� �: '�� **�" � .�CD�0 ( #��,� ��" ���* ���,: �#" �9

/���*�$: '�$ /��$� ��#119 H"#�@ ��: A�$��#$ G� .�CD�0 & ( #" ��* �1C����%�>���%�1%9 ���� ?A: /"�$$��, ( : ���F#"�F, '�: 8�����" $� ?� .�CDC0

��*�� ��" ��� ���9 �*!� ��� 7$ ���� �, ����: �*!� ���1E9 G��")� �� /? .�CED0 ����#�� $@,*#" �D��E�>�CC1D9 ��$� �?: �!��� &�: /��$F�" �(: ����-��,* #� �: A#"*

�A .�CEE0 & �* ��* '#� CC�D�>CD1C9 ���� $ �( .�CC%0 #**�$�� �$#�� ��* �D���C>�D�%�9 '��F��� G�: '��#K A� .�CC%0 /(' ���� �CE��>%%�9 " �@�� G: /��$F : � "" � �: ��6�#$ ?: G#$ ��� ': A#��+

�#$ H� .�CC�0 & ( #" ��* �%D���C1�>��C1E%�9 '� �-�" � .�CE%0 �#� �$#�� ��* ����>���%�9 ?#"K �: (��� &�: A#���#$ H�: /��$F�" �(: A#"* �A

.�CEC0 & �* ��* '#� ��������>��1�%�9 �##�"�*�$ �: �#�*�$ &�: ��!#�$� &A: � @*�$ �: ��� G�

.�CD10 & �* ��* '#� ��E����D>���%%19 /��$�� �: �"#��� HA .�C110 ���$� /�����, '#� ������D>

���E%%9 (�����" &: (���$�� �: (�����!�� H: A��@�$���� A: H"��!����

�: ���*� �� A .�CC�0 ��� ���" ��* %����DE>��C%%E9 (�����" &: (�����!�� H: (���$�� � .�CC10 V �����-#���� �

1��%1>E�%D9 '* �� G�: ��G#$�"� &?: / $F"�� A�: ��� 8�: '���"�@ /�

.�CD�0 �$#�� ��* ����D�1>�D��%C9 #$����#$ 'G: (������ (H: ��6�#$ ?: A#���#$ H�:

��G#$�"� &?: ��! $�#$ &/: ���""�� '/: �#���$�#$ �:

%C%

Page 15: Determination of ligand binding constants for the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase: monomers, multimers, and cooperative behavior

���*� �??: ��������F H: ��*���#$� ?�: A#"* �A.�CD10 & �* ��* '#� ��E�EC�1>EC��

E�9 � � A�: / "" ��#$ �: ��� $ �: (������ (H: A��*�$ (:G ��# �: ���#" �: A#���#$ H� .�CC�0 & �* ��*'#� ��%����D>����

E�9 '���"�@ /�: ���""�� '/: /�"�*�$ (&: ��6�#$ ? .�CDD0 �$�(#��� A: �� (�� N$ /&: ��6�#$ ? .���0 � ��#��$ 23�� #$���$���� ,���� �-���9 / �����: '��������: �� ���>��%

E�9 / " ��#� �: ���W $"� �$�� ?: A����6��F .�CDC0 & ����$#*����* �E����1>���

E�9 ���F�� G': G ��@ ': ��F�� H�: �����#� 8: ��!�, &: �#"" (:G�!# � ��: �*��$� / .�CC10 ����$#*���"" �� ������1>����

E�9 �� ""#$ /X: #���� "" #� ': '��#""��**�� : ��"��* $ &.�CCE0 ��6 & ��* ����EE>�C�

E19 (��� ��� /: ������ X: �� ""#$ /X: #���� "" #� ': '��#""+��**�� : ��"��* $ & .�CC%0 & ��* '#� G�"�#$ ���$� �C%E>�CE%

E%9 A��*N�$@ �: '��F ?: A���� G: #�" ' .�CCE0 ��* #**�$C1�>C1�

EE9 �#� : � �#�#@�F $ �: X## '&: (#* $��� �: ��W $�F :A#"* �A .�CCD0 �$#�� ��* �E��C�%>�C��

ED9 � ""�� G&: G�(# � �� .�CD�0 & �* ��* '#� �����C�1>�C�DEC9 (��$�� � : ���� � &8: G�(# � �� .�CC�0 ����$#*���"" ��

C��%�E>�%�ED�9 ?� ��$�� ��: (���F $ &H: A���$ H': � ���� &+&: ��*� :

��"��� $ �: A#"* �A .�CD%0 & �* ��* '#� ��D�1%�E>1%��D�9 X#� &+/: '$,��� (': ����-��,* #� �: A#"* �A .�CC�0

& �* ��* '#� ������%E>��E%D�9 / $F� ��: G�#��� �?: G#*� ""� & .�CDE0 �$#�� ��*

�%��DD%>�DC%D�9 H��$ ��: V�! ��� & .�CC�0 & �* ��* '#� �������1D>���1CD�9 (������ : '�� *�- �: �#��$� �: �#��$� � .�CD�0 & �*

��* '#� ��1�E�1C>E�%�D19 ?� ;: ?�$� : � � & .�CC�0 #",����#$ ����1%�>�1%DD%9 �$����� �: ��$��� �+�: G� ���,�� � .�CD�0 & �,� ��*

D����C�>��C�DE9 �$����� �: ��$��� �+�: G� ���,�� � .�CD�0 & �,� ��*

DE��1C�>�1CC

%CE


Recommended