(C2H5OH)
Development of biotechnology-based biofuels Prof. Carlo V. Bruschi
Senior Scientist & Group Leader Microbiology/Yeast Molecular Genetics group
ICGEB Ğ Areas Science Park, Trieste
Seminar on The Role of Agricultural Biotechnologies for Production of Bioenergy in Developing Countries
FAO Headquarters, Iran Room
12 October 2007
"Broadly defined, biotechnology is the manipulation of living organisms to produce goods and services useful to human beings." (From: "Modifying Africa" of F. Wambugu).
Microbial agro-industrial biotechnology stems from the traditional
practices and products developed by farmers and their families for use
on the farm or in the homestead. These practices can be improved
greately by the correct implementation of genetic engineering
Ethical concerns: Modern biotechnology is often seen as unnatural,
but in fact it relies on most of the same spontaneous processes occuring
in nature and leading to improvement through selction
THE ICGEB, AT ITS LOCATION OF TRIESTE PROMOTES BASIC AND
ADVANCED SCIENTIFIC TRAINING IN THE AREA OF MICROBIAL
BIOTECHNOLOGY FOR ITS APPLICATIONS IN AGRO-INDUSTRY.
AMONG THE ICGEB MEMBER COUNTRIES SEVERAL AFRICAN
COUNTRIES ARE ALREADY TAKING ADVANTAGE OF THE ICGEB
PROGRAMMES (http://www.icgeb.org)
AREAS OF RESEARCH AND TRAINING UNDERGOING AT ICGEB:
Utilization of genetically selected yeast strains enriched for particular
aminoacids (lysine, methionine) for animal feed, and for cellulose and
hemicellulosa digestion. (Microbiology, Trieste)
Study of plant growth-promoting bacteria (Pseudomonads).
Development of insect and pesticide-resistant crops (N.D.)
Studies towards the production of stress (drought)-resistant plants (N.D.)
• Areas of Primary concern for Developing Countries
• Epidemiology of food-related diseases and
genetic susceptibilities
• Impact of new technologies on food
production
• Chemical contaminants and pathogens
• Safer production and healthier foodstuffs
from agriculture
• Animal feed and impact on human health
• Environmental health risks
ROLE OF TECHNOLOGY PARKS AND INCUBATORS
IN TECHNOLOGY TRANSFER
Successful experiences in creating technology parks/ incubators
providing a basic infrastructure to transform ideas into products and
services can serve as model for developing Countries.
For example, given the comparative advantage of diversified
ethanol production in the world, particular emphasis could be
focussed upon research and transformation of agricultural products
in such technology parks.
It would also be advisable to set up technology parks near existing
institutions to attract foreign contract research funds to perform
applied research in situ.
Food Safety and Health Risks
Background and Aims:
• Assuring health and well-being of citizens
• Food intake and environmental factors
• Safer and health promoting foods
• Controlled and integrated production systems
• From farm to fork – consumer protection as the driver
• Epidemiology of food-related diseases and genetic susceptibility
- Diet, lifestyle and health- Measuring dietary intake and risk
assessment- Influence of genetic variability
• Traceability
• Chemical contaminants and pathogens- Analysis and detection- Improved prevention and measurement control- Prion detection, mapping, transfer mechanisms
• Safer production and healthier foodstuffs- Conventional vs. organic vs. GMOs- Improved animal welfare, husbandry and waste
management
• Animal feed and impact on human health
• Environmental health risks
Respiration (O2 + dispensable mitochondria, ρ+ , ρρ+ , ρρ+ , ρρ+ , ρ−−−−, ρ, ρ, ρ, ρ0000) and Fermentation (anaerobic) convert sugars (hexoses): sucrose>fructose>glucose>maltose = CO2 + ethanol
THE ICGEB MANDATE
To provide a Centre of excellence for research and training in genetic engineering and biotechnology
addressed to developing countries
THE STRUCTURE
TRIESTE COMPONENT(ITALY)
NEW DELHI COMPONENT(INDIA)
THEICGEB
+
A NETWORK OF AFFILIATED CENTRES
ICGEB IS ONE CENTRE, MADE OF TWO COMPONENTS AND A NETWORK OF
AFFILIATED CENTRES
67 Signatory States, 51 Member States, 2 Components: Trieste (Italy) - New Delhi (India) and a network of 35 Affiliated Centres
ICGEB: an intergovernmental organisation
INSTRUMENTS OF ACTION
• RESEARCH PROJECTS
• LONG TERM TRAINING
• SHORT TERM TRAINING
• COLLABORATIVE RESEARCH PROGRAMME
• COOPERATION WITH INDUSTRIAL SECTOR
• SCIENTIFIC SERVICES
• INSTITUTIONAL SERVICES
SUMMARY OF THE ACTIVITYOF THE ICGEB (1988-2004)
• INTERNATIONAL PUBLICATIONS: 1,220
• LONG TERM FELLOWSHIPS: 481 awarded; 797 MAN/YEARS
• SHORT TERM TRAINING: 5,826 persons trained
• RESEARCH GRANTS: 232 awardedfor a total of US$ 12,163,781.00
• PATENTS: 30 filed
• TECHNOLOGY TRANSFER
AGREEMENTS: 65 signed
INSTITUTIONAL ACTIVITIES
COOPERATION AGREEMENT WITH THE UNITED NATIONS SECRETARIAT. UN AND ICGEB COOPERATE IN ACTIVITIES RELATED TO
• SAFE AND SUSTAINABLE USE OF GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
• PROTECTION OF BIODIVERSITY
• BIOSAFETY AND RISK ASSESSMENT
• IMPLEMENTATION OF ARTICLE X OF THE CONVENTION ON BIOLOGICAL DISARMAMENT
“THE MILLENNIUM DEVELOPMENT GOALS MAY BE MORE EASILY MET WITH THE EXTENSIVE APPLICATION OF MODERN BIOTECHNOLOGY
IN AGRICULTURE AND HEALTH”
(Report of the Secretary-General on “Impact of new biotechnologies, with particular attention to sustainable development, including food security, health and economic productivity”- 2003)
MILLENIUM DEVELOPMENT GOALS
TAKES NOTE OF THE PROPOSAL OF THE SECRETARY GENERAL FOR AN INTEGRATED
FRAMEWORK FOR BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT WITHIN THE UN SYSTEM AND
THE NEED FOR STRENGTHENING CO-ORDINATION BETWEEN THESE RELEVANT
ORGANISATIONS AND BODIES IN THE AREA OF
BIOTECHNOLOGY
GENERAL ASSEMBLYRESOLUTION 58/200 -
DECEMBER 2003
THE IANCB HAS BEEN ESTABLISHED IN MAY 2004 BY A CLUSTER OF INTERNATIONAL ORGANISATIONS IN
ORDER TO:
• ELABORATE JOINT STUDIES• STRENGTHEN THE ADVISORY ROLE IN BIOTECHNOLOGY OF THE UN• ASSESS THE IMPACT OF BIOTECHNOLOGY, IN DEVELOPING COUNTRIES• ESTABLISH A COMMON PORTAL FOCUSED ON BIOTECH-RELATED ACTIVITIES LINKED TO THE EXISTING SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT NETWORK• ASSIST UNCTAD IN THE PREPARATION OF THE
REPORT TO THE UNITED NATIONS GENERAL ASSEMBLY
INTER-AGENCY NETWORK FOR CO-OPERATION IN BIOTECHNOLOGY
“THE UNITED NATIONS AND THE INTERNATIONAL CENTRE FOR GENETIC ENGINEERING AND
BIOTECHNOLOGY …CO-OPERATE IN ACTIVITIES RELATED TO THE SUSTAINABLE AND SAFE USE OF GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY”
ACCORDINGLY, ICGEB IS PRESENTLY CHAIRING THE INTER-AGENCY NETWORK FOR CO-OPERATION IN BIOTECHNOLOGY AND IS TO PLAY A KEY ROLE IN ASSISTING UNCSTD IN THE PREPARATION OF THE
REPORT TO THE GENERAL ASSEMBLY.
UN - ICGEB Co-operation Agreement
April, 2001
SCHEMA DEL PROCESSO PILOTA
Distillazione di etanolo
Fermentazione per inoculo
Produzione di etanolo
Vasca con B. pumilus
Decanter per separazione lignina/cellulosa
Macinazione criogenica
CRISCAT
Trasferimento calore al metano
Omogeneizzazione meccanica
Vasca di idratazione
ACCUMULO
MALIC
+Microbi ruminali
BioEthosBioEthosProject plan : 3 FASIProject plan : 3 FASI
FaseFase 1: 1: RicercaRicerca ScientificaScientifica -- ICGEBICGEBIngegnerizzazione dei ceppi di lievito1.1 produzione ceppi transgenici per digerire la cellulosa in collaborazione con la PiattaformaNazionale ITSusChem1.2 ottimizzazione genomica per� incrementare la percentuale di etanolo prodotto ad usoindustriale; l’ottimizzazione verra’ realizzata tramite l’impiego di tecniche di miglioramentogenomico in collaborazione con l’Universita’ di Oxford e grazie ad un sistema sviluppato e brevettato dal laboratorio YMG dell’ICGEB
FaseFase 2: 2: SviluppoSviluppo -- AREA/Talent AREA/Talent SrlSrl/ICGEB/ICGEB
2.1 Verifica in laboratorio di digestione della cellulosa da materiale criomacerato (ICGEB), sviluppo di sistemi di controllo (Talent Srl)2.2 sviluppo di impianto pilota con utilizzo di locali dell’AREA di ricerca per lo smaltimento dirifiuti chimici; come ricaduta vi sara’ la creazione di un Centro di Fermentazione (AREA)
Fermentazioni pilota
FaseFase 3: 3: ImplementazioneImplementazione industrialeindustriale --CartiereCartiere Burgo/Endesa/GasNaturalBurgo/Endesa/GasNatural
Trasferimento di frigorie3.1 Utilizzo del freddo prodotto dai rigassificatori (Endesa/GasNatural) per la criomacerazione con conseguente digestione di cellulosa di scarto (Cartiere Burgo) e produzione industriale di BioEtanolo. In questa fase e’ presente il coinvolgimento didistributori petrolchimici.
TempisticaTempistica didi attuazioneattuazione del del progettoprogetto
0 1 2 3 t(anni)
ICGEBITSusChem
ICGEB(Oxford)
Talent/ICGEB/
Reg. FVG?
AREA/NuoviPartners
Burgo/Endesa/
GasNatural/Db.Petrolchimici
Fasi
Ricerca
Sviluppo
Produzione(Implementazioneindustriale)
1.1 Nuovi lieviti 1.2 Ottimizzazione
2.1 Verifiche 2.2 Imp. Pilota
3.1 Trasferimento frigorie
DIAGRAMMA DI PROCESSO
MALIC
cippatoFASE 1Pre-trattamento interno
Macinazionemeccanica
Macinazionebiogenica
PAD
Batteri & Lieviti
AcidoVanillico
Proposta di Progetto:
Produzione di bioetanolo con lieviti ingegnerizzati,
via fermentazione di derivati vegetali criomacerati
nella regione Friuli Venezia-Giulia
Responsabile: Prof. Carlo V. BruschiHead, Yeast Molecular Genetics Group ICGEB
AREA Science Park, Trieste
Department of Genetics and Developmental Biology
University of Salzburg, Austria
Collaboratori:
Dr. Sergio StibelliTalent S.r.l, Trieste
Paolo ManderSister - Liaison Office
AREA Science Park, Trieste
Dr. Valentina Tosato
La linea pilota sarˆ basata sulle apparecchiature per la macinazione criogenica, la separazione della lignina, il s istema di fermentazione per la preparazione dellÕ inoculo, la produzione e distillazione dellÕ etanolo. Il processo che si sperimenterˆ sarˆ del tipo SSCF ( Simultaneous Saccharification and Co- Fermentation) con la variante di: i) non avere enzimi in soluzione, ii) avere un unico agente microbico, il lievito S. cerevisiae ingegnerizzato con enzimi cellulasi ed emicellulasi espressi sulla superficie cellulare e iii) in grado di trasformare zuccheri in una pi� alta percentuale di alcol. Questo processo innovativo, derivante dallÕevoluzione del precedente SSCF, verrˆ indicato con la nuova sigla CEDY (Cellulose to Ethanol Directly by Yeast). La fermentazione � un processo complesso ma noto nelle sue variabili e caratteristiche mentre pi� necessaria � la comprensione dei meccanismi di adesione e catalisi degli enzimi endo- ed eso-glucanasi, cellobioidrolasi ed i corrispondenti per lÕ emicellulosa, ai siti di legame e di catalisi sulla cellulosa ed emicellulosa . Questa dinamica regola i tempi e lÕ efficacia del processo. Il glucosio e lo xilosio saranno metabolizzati dal lievito nello stesso momento della sua produzione per cui mancherˆ lÕ inibizione da metaboliti. La concentrazione del lievito aumenterˆ fino a livelli stazionari in cui sarˆ rimosso dal bioreattore per mantenere il processo nella fase esponenziale. Il tasso alcolico massimo attuale � del 13 %, nella fase di ingegneria genetica si cercherˆ di portarlo al 20 Ğ 26% con un notevole guadagno economico nel processo.
Il sistema BIT per la bioenergia
3.4 Ingegnerizzazione genetica del lievito
3.4.1 Identificazione dei geni eterologhi degli enzimi necessari Il lievito Saccharomyces cerevisiae, oggi universalmente riconosciuto come il pi� importante microrganismo per le biotecnologie, e di grado GRAS (Generally Recognized As Safe), non possiede la capacitˆ enzimatica per metabolizzare la cellulosa, ma bens“ � estremamente efficiente nella produzione di etanolo partendo da zuccheri semplici quali il glucosio. Di c onseguenza, occorre introdurre nel lievito i g eni codificanti per gli enzimi che degradano la s truttura fibrillare della celulosa fino a ridurla a l ivello del monosaccaride glucosio che la cellula pu˜ assimilare. Di tali geni esistono diversi esempi, alcuni dei quali giˆ studiati ed isolati da laboratori di r icerca, in particolare in Giappone e Finlandia. Verranno quindi isolati i geni codificanti per i seguenti enzimi: i) endoglucanasi II (EGII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414, in grado di digerire le catene di cellulosa in modo casuale; ii) cellobioidrolasi II (CBHII) dal fungo Trichoderma reesei, ceppo QM9414, in grado di staccare cellobiosio, cio� molecole dimeriche di gl ucosio dallÕestremitˆ della catena di cellulosa; iii) §-glucosidasi I (BGL1) dal fungo Aspergillus aculeatus, ceppo F50, in grado di scindere una molecola dimerica di cellobiosio in due molecole di glucosio. Come miglioramento innovativo dellÕattuale stato dellÕarte, i ceppi transgenici di l ievito cos“ costruiti verranno sottoposti ad u n nuovo sistema di mutagenesi globale per traslocazione cromosomica. In pratica, il ba ckground genetico di questi ceppi verrˆ riarrangiato casualmente su l arga scala sfruttando una rivoluzionaria tecnologia genetica messa a p unto nei laboratori dellÕICGEB dellÕ AREA di Ricerca di Trieste.
3.4.5 Ottimizzazione / Fermentazione La ricerca di condizioni ottimali per la produzione di etanolo verrˆ effettuata sia su piastra, misurando la diminuzione della fluorescenza emessa dalla cellulosa presente. Successivamente i ceppi che daranno i valori pi� alti saranno oggetto di mutagenesi globale tramite induzione di traslocazioni cromosomiche per mezzo del sistema BIT (Bridge-Induced Translocation). La selezione avverrˆ per rivelazione automatica di concentrazione di etanolo per mezzo di appositi sensori enzimatici. I ceppi selezionati verranno testati in mini-fermentatori con diverse composizioni di MALIC ed eventualmente riassoggettati a ulteriori cicli di mutagenesi globale fino a dare risultati soddisfacenti, da testare su scale pilota. Per ultimo, utilizzando le recentissime scoperte del gruppo di Gerald Fink negli USA, sul Òquorum sensingÓ del lievito, si utilizzeranno le due molecole-segnale individuate, il feniletanolo e triptofolo, per aumentare la densitˆ massima delle cellule in terreno liquido nonch� il g rado alcolico prodotto dai ceppi transgenici.
3.1.1.1 Struttura chimica della lignina La lignina � u n polimero amorfo, eterogeneo e c himicamente complesso. LÕeterogeneitaÔ della lignina � dovuta al suo elevato peso molecolare derivante dallÕunione di differenti acidi ed alcoli fenilpropilici (cumarilico, coniferilico e sinapilico). LÕaccoppiamento casuale di questi alcoli dˆ luogo alla struttura tridimensionale complessa della lignina. Nelle figure seguenti sono riportate le strutture chimiche degli alcooli (A) e acidi cinnamici (B), noncheÔ la formula strutturale della lignina (C) proposta da Adler.
A
2
OCH
R R
R R
R R
1
1
1 2
2
OCH
3
3
=
=
=
=
=
=
,
H
H
alcool p-cumarilico
alcool coniferilico
alcool sinapilico
CHCH CH2
OH
R
1
2222
R
B
OCH
R R
R R
R R
1
1
1
2
2
2
OCH
3
3
=
=
=
=
=
=
,
H
H
acido p-cumarico
acido ferulico
acido sinapico
R
COOHCH CH
1R
OH
2222