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Thèse soutenue le 16 décembre 2005 par

Anne-Cécile PETIT Ingénieur ENSCR

MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR

UNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDSUNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDS

Thèse réalisée sous la direction des Docteurs:Nicolas NOIRET

Laboratoire Synthèses et Activations de BiomoléculesSylvia COLLIEC-JOUAULT

Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines

Introduction

Techniques d’analyses

Dépolymérisation par les ultrasons

Dépolymérisation par catalyse métallique

Evaluation d’activités biologiques

Modifications chimiques de l’EPS

Conclusion

Plan de l’exposé

Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005






Conclusion

Plan de l’exposé


Introduction


L’environnement hydrothermal


Les exopolysaccharides

Criblage parmi les isolats

Production d’EPS


– Diversité des structures chimiques

– Relative facilité de récupération des polysaccharides exocellulaires

– Conditions contrôlées de leur biosynthèse

– Biosynthèse en fermenteur

– Propriétés de suspension, d’épaississement, de viscoélasticité

– Formation de gels

☺

Intérêts industriels des exopolysaccharides (EPS)

Manipulation de microorganismes

Métabolites secondaires formés pendant la fermentation

Haute viscosité en solution

Modifications

• Souche bactérienne:Sous-espèce d’Alteromonas macleodii subsp. fijiensis biovar deepsane

• EPS de masse molaire élevée:

M >106 g/mol

• Composition:40-50% d’oses neutres (Glu, Gal, Rha, Fuc, Man)30-40% acides uroniques (GlcUA, GalUA)

• Hypothèse de structure:Undécasaccharide avec 3 ramifications et la présence d’un acide glucuroniquesubstitué en position 3 par un lactate

L’EPS HYD 657

Objectifs de la thèse:élargissement du champ d’application de l’HYD

657Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

3.106 g/mol pour le lot de thèse

* Brevet EP 0987010A2, Lanatech

L’HYD 657 commercialisé sous le nom « Abyssine®» possède des propriétés apaisantes en application topique cutanée*

Analyses chimiques

• Analyses qualitatives et quantitatives des résidus osidiques

Chromatographie gazeuse

Dosage des acides uroniques

Dosage des oses par la méthode Orcinol Colorimétrie


• Dosage des métaux par spectrophotométrie de flamme

• HPSEC (High pressure steric exclusion chromatography)

Détermination des masses molaires

moyennes (Mw,Mn, Mp) et de l’indice de polydispersité

• Mesure de la viscosité par un viscosimètre rotatif

chimiquesenzymatiques

• Radiations gamma• Faisceau d’électrons• Irradiation UV• Micro-ondes• Irradiation ultrasonique

☺ Selon la littérature:• Bons rendements • Pas d’altération de la structure chimique• Peut être stoppée à tout instant• Pas de formation de produits secondaires• Distribution de masses relativement étroite

Différentes voies de dépolymérisation


physiquesenzymatiques chimiques

Introduction





Conclusion

Plan de l’exposé



Origine physique de la sonochimie

Dépolymérisation par irradiation ultrasonique


Sonificateur basse fréquence (20 kHz)

Microsonde conique ultra haute intensité (~100W) pour des volumes traités de 1-10 ml.

Sonde conique haute intensité (~300W) pour des volumes traités de 10-250 ml.

Microprocesseur

Cryostat

Les ultrasons au laboratoire


Liquide de refroidissement

Possibilité d’une circulation en continu de la solution d’EPS

Ajout

Viscosité du solvant

Température

Volume de la solution

Fréquence d’irradiation

Concentration en EPS

Détermination des facteurs influents

Pulse

Durée d’exposition

Dépolymérisation par irradiation ultrasonique


Cinétique de dépolymérisation


Cinétique pour 10 ml d'EPS ( 2,5 g/L) à 60°C

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 60 120 180 240

Durée d'exposition aux ultrasons (min)

Mw

(kg/

mol

)

Durée d’exposition

Mw~200 000 g/molIp~2

Composition chimique inchangée

Viscosité proche de l’eau

1,71,8% Man

1212,3% Glc

22,221,7% Gal

7,57,3% GalA

5,56,1% GlcA

1,91,8% Fuc

3,23,4% Rha

Après 10 h d’exposition

aux ultrasonsNatifEPS

Importance de la concentration



100000

150000

200000

250000

300000

1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

[C]=3g/l[C]=2g/l

Mw

(g/m

ol)

Durée d'exposition aux ultrasons (h)

Cinétique pour 10 ml d'EPS à 60°C

Moins bonne efficacité :

Plus de liaisons à cliver

Viscosité plus importante

Importance de la viscosité



0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1 2 3 4 5

1

2

Évolution de la viscosité en fonction de la [C]pour T1= 30°C et T2= 60°C

Visc

osité

(mPa

s)

Concentration (g/L)

Moins bonne efficacité:

de la viscosité avec la [C]

Cavitation plus difficile à obtenir

Température importante

Pas d’amélioration proportionnelle à la

quantité d’H2O2

Combinaison H2O2/USaméliore l’efficacité

2,1214 680112 140239 1403h ultrasons

3,3118 16043 530145 6503h ultrasons,0,48% H2O2

2,991 86041 220118 7703h ultrasons,0,24% H2O2

3,952 355 590762 1503 010 020HYD 657 natif

IpMp (g/mol)Mn (g/mol)Mw (g/mol)EPS

H2O2 +))))→ 2 OH •

Influence de l’ajout de H2O2


Ajout

400 mg d’une solution à 2g/L soumise à 3h d ’exposition aux ultrasons à 60°C:

Pas de modifications de la composition osidique

Pas d’amélioration à température ambiante

Barrière technique:puissance des transducteurs

Transmission d’énergie

Viscosité du produit

Échauffement de l’échantillon

Les Ultrasons dans l’industrie


Semi-Batch

LEPMI UMR 5631 GRENOBLE FRANCE

Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces

Montage retenu pour le premier changement d’échelle

Réacteur à double

enveloppeRéacteur

Sonochimique

Générateur

Pompe


Possibilité d’enrichir le

milieu en EPS

Possibilité de contrôler la température Possibilité de

régler le débit

La reproductibilité à plus grande échelle doit être vérifiéeD’autres modes de fonctionnements pourraient être envisagés

Passage à un petit pilote


Essai réalisé avec un dispositif BF en mode pseudo batch (sans optimisation)18 g dissous dans 9 litre soumis à 15h d’ultrasons

200 000

250 000

300 000

350 000

400 000

450 000

500 000

3 6 9 12 15

Mp

(kg/

mol

)


Cinétique de dépolymérisation du petit pilote en BF

EPS NatifAprès 15 h d’exposition

aux ultrasons

% Rha 3,4 3,1

% Fuc 1,8 1,8

% GlcA 6,1 5,3

% GalA 7,3 7,7

% Gal 21,7 24,5

% Glc 12,3 12,8

% Man 1,8 1,8

Mw< 300 000 g/molIp~2,5

Composition inchangée

Faisabilité vérifiée

• Détermination des facteurs les plus influents

Bilan de la dépolymérisation par les ultrasons



PulseTempérature


Volume de la solution

Ajout

Fréquence d’irradiationDurée d’exposition

– Durée d’exposition aux ultrasons

– Concentration en EPS

– Volume

– Ajout (H2O2, métal)

Facteurs les plus influents

• Bonne reproductibilité (Ecart type < 10 000)

• Rendement élevé (> 95%)

• Sans altération de la composition chimique

• Stabilité dans le temps

• Échantillons variés obtenus (20mg 18g)

chimiques


physiquesenzymatiques

• Par hydrolyse acideDépolymérisation destructrice, mauvais rendements obtenus

• Par ajout d’acide nitreuxNécessite la présence de groupements aminés

• Par ozonolyseRéactions secondaires

• Par oxydation par le periodatePossibilité de former des formaldéhydes

• Par électrolyse

• Par catalyse métallique


Introduction





Conclusion

Plan de l’exposé




Brevet Ifremer n°WO9708206

- Concerne la dépolymérisation de fucanes

- Obtention de faibles poids moléculaires de composition constante

- Elimination possible du métal par l’utilisation d’une résine Chélex

- Ultrafiltration utilisée pour purifier les fractions dépolymérisées


Conditions doucesBon rendement Peut être stoppée à tout instant

☺

Réduction par NaBH4 après dépolymérisation


1) Formation de radicaux libres très réactifs par réaction de type Fenton :

HOOH + Fe2+ → OH • + OH- + Fe3+


3) Scission des liaisons glycosidiques par différents mécanismes :

Hydrolyses Éliminations Réarrangements

OH + H C OH H2O + C OH

2) Abstraction d’un H du polysaccharide :

Mécanismes radicalaires envisagés

STOP1.00

H O9 %

débit 1 ml/min

2 2

BAINCHAUFFANT

AGITATEUR MAGNETIQUE

POMPE

pH STAT

REACTEUR

BURETTE

NaOH 2N

FTCuEau

2 +

Pompe péristaltique

H2O2 EPS

eau

Métal

cryostat

agitation

NaOH

0,1 NpH stat


Au laboratoire dans un réacteur de 5 L

Montage utilisé en catalyse métallique


pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu ou

initial

Mélange de métaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température

Détermination des facteurs influents et des synergies



Influence de la températurepH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2 O

Débit d’ajout

R(H O 2/EPS)

Température

Température de 50°C retenue


0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

0 20 40 60 80 100 120

T=50°CT=35°CT=20°C

Mp

(g/m

ol)

Durée de la réaction (min)

Cinétique de dépolymérisation pour différentes

températures

Conditions: pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, débit de 0,5 ml/min, R=0,2

Influence du ratio H2O2/EPS

Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, débit de 0,5 ml/min

l’augmentation du ratio en

H2O2/EPS , diminue la Mw

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0,025 0,05 0,075 0,1 0,15 0,175 0,20

1

2

3

4

5

6

7

8

MwIp

Évolution de la masse molaire moyenne en masse en fonction du ratio H2O2/EPS

Ratio massique en H2O2 ajouté à un temps t

Mw

(g/m

ol)

Ip

Influence du débit d’ajout du H2O2

Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O

R(H2O2/EPS) Duréed’ajout Mw (g/mol) Reproductibilité Rendement

0,1 1h2h

40-130 00040 000

MauvaiseBonne

--

0,2 1h2h

20-50 00020 000

MauvaiseBonne

82%75%

0,4 1h2h

10-20 00010 000

BonneBonne

65%65%

l’efficacité et la reproductibilité de la

dépolymérisation

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


Influence de la quantité de métal

Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O (22g/L), t = 2h


pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température

0

25

50

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Mw

en

kg/m

ol

a

b

Nombre de ml de CuSO4, 5 H2O aqueux (22g/L) ajoutés

a) R=0,2b) R=0,4

Évolution de la masse molaire moyenne en masse en fonction de la concentration en cuivre

Système saturé pour un ratio massique de 22% / à l ’EPS

Ajout de métaux et phénomènes de chélation

Principales fonctions responsables de la chélation:

- Les fonctions carboxyliques

- Les fonctions alcools

La chélation dépend également de la nature des cations

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


OHO

OH

OHMn+

O

OH

OH

Mn+

OH

OH

O

O OH

OCOO

O

OHO

C OO Mn+

Dépolymérisation possible pour les 3 métaux

Conditions à optimiser pour chaque métal

Influence du choix du métal sur le mécanisme à vérifier

Influence de la nature du métal ajouté

Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux


pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température

Métal Mw(g/mol) Ecart type Reproductibilité

CuSO4, 5 H2O 10 000 1 100 Oui

ZnSO4, 7 H2O7 500-322 000

wM = 85 700 18 800 Non

MnSO4, H2O5 000-540 000

wM = 198 500 62 700 Non

Influence de la nature du métal ajoutépH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


Métal Natif Cu Zn Mn

% Rha 3,4 2,7 2,8 2,3

% Glc 12,3 9,5 9,8 9,0

% Man 1,8 2,1 1,3 1,8

% Fuc 1,8 1,9 1,5 1,3

% GalA 7,3 7,1 7,3 7,4

% Gal 21,7 15,5 17,7 18,0

% GlcA 6,1 2,6 4,8 4,5

)sédépolyméri(Glc%)natif(Glc%

)sédépolyméri(Rha%)natif(Rha%

≈

)sédépolyméri(GlcA%)natif(GlcA%

)sédépolyméri(Gal%)natif(Gal%

≈

Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux, Mw~ 20 000 g/mol

Influence de la nature du métal ajouté

Pas de sélectivité de clivage de liaisons osidiques

en fonction du métal utilisé

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


Conditions: T= 50°C, pH neutre, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles de différents métaux, Mw~ 20 000 g/mol

→3)-L-Rhap-(1→3)-D-Galp-(1→4)-D-GalpA-(1→4)-D-GlcpA-(1→4)-D-Galp-(1→3)-D-Manp-(1→4)-D-Glcp-(14 4 2↑ ↑ ↑1 1 1

L-Fucp D-Galp L-Rhap3↑1

Lac-3-O-D-GlcpA

)sédépolyméri(Glc%)natif(Glc%

)sédépolyméri(Rha%)natif(Rha%

≈

)sédépolyméri(GlcA%)natif(GlcA%

)sédépolyméri(Gal%)natif(Gal%

≈

Importance de la régulation du pH

Conditions: T= 50°C, t=2h, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles des différents métaux, pH non régulé

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


Profils de courbes semblables obtenus

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 20 40 60 80 100 120 140Durée de la réaction (min)

Mw (g

/mol

)

Zinc

Cuivre

Cinétique de dépolymérisation en présence de cuivre ou de zinc

Importance de la régulation du pH

Conditions: T= 50°C, t=2h, R = 0,4, t =2h, ajout de la même quantité en moles des différents métaux, pH

pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température


Synergie Cu-Zn mise en évidence

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

0 20 40 60 80 100 120 140


Mw

(g/m

ol)

ZnSO4

CuSO4

CuSO4 + ZnSO4

Cinétique de dépolymérisation en présence de cuivre, zinc et Cu-Zn

Première extension d’échelle


Conditions: T= 50°C, pH neutre, ajout de CuSO4,5 H2O, R=0,4, t=2h

Première extension à 2g d’EPS

Echelle Mp Mw Mn Ip

200 mg 8 800 10 500 4 000 2,6

2g 13 300 40 400 12 700 3,2

Réadaptation des facteurs influents

Influence de l’agitation et de la géométrie du réacteur à vérifier

Reproductibilité– débit d’ajout du H2O2

– nature du métal– régulation du pH

Efficacité– R(H2O2/EPS)

– nature du métal

– régulation du pH

Bilan de la dépolymérisation par catalyse métallique

Des échantillons variés ont ainsi pu être obtenus en jouant sur les différents facteurs (200mg 2g)


pH

Régulation ou non

pH acide pH neutre

METALContre-ion

Quantités

Biosorption

NatureAjout continu

ou initial

Mélange demétaux

H2O2

Débit d’ajout

R(H2O2/EPS)

Température

Détermination des facteurs les plus influents

Echantillons de plus faibles masses molaires☺Réduction nécessaireEtapes de purifications

Comparaison avec les ultrasons

Introduction





Conclusion

Plan de l’exposé



Evaluations de différentes activités biologiques

La recherche in vitro d’activités biologiques sur les fractions dépolymérisées s’est

concentrée sur 3 effets possibles :

Effet amincissant Effet anti-radicalaire

Activité immunostimulante



Effet anti-radicalaire

Détermination de l ’effet amincissant


Recherche d’un effet inhibiteur de l’activité de la lipoprotéine lipase

LDL

Intestin

lymphe

chylomicrons

chylomicrons

sang LPL

Cellule adipeuseAG

FOIE

Chylomicronsrestants

VLDL

IDL

LDL

LPL

LPL

Ajout d’héparine



LPL Lipoprotéine lipaseAG Acide GrasVLDL Lipoprotéine de très faible densitéLDL Lipoprotéine de basse densitéIDL Lipoprotéine de densité intermédiaire

Détermination de l ’effet amincissantEffet amincissant Effet anti-radicalaire


fractions dépolymérisées testées


Méthodologie utilisée

1) Détermination de la cytotoxicité in vitro :Viabilité des cellules déterminées par un test au MTT

3) Effet des fractions dépolymérisées sur l’activité LPL

[C] de 0,01 et 0,002 mg/ml

retenues

Quantification par dosage des acides

gras

N NS

NCH3

CH3

NN

Br

MTT

2) Induction de l’activité LPL-Contrôles :

0

50000

100000

Act

ivité

LP

L (c

pm)

Témoin d +

Contrôle nd +

Contrôle d -

Effet de fractions dépolymérisées sous ultrasonsEffet amincissant Effet anti-radicalaire


2 fractions actives

Effet dose-dépendant


0

50000

100000

Témoin

US 48 0,01 mg/mlUS 48 0,002 mg/ml

US 34 0,01 mg/mlUS 34 0,002 mg/ml

US BF 0,01 mg/mlUS BF 0,002 mg/ml

Effet des fractions dépolymérisées sous ultrasons sur l’activité LPL des adipocytes

51 %

38 %

10h d'expositionaux US (laboratoire)

Mw~ 100 000 g/mol Ip~ 2,5

15h d'expositionaux US (petit pilote)

Mw~ 300 000 g/mol Ip~ 2,5

4h d'exposition aux US avec ajout de Cu

Mw ~ 100 000 g/mol Ip~ 3

Act

ivité

LPL

(cpm

)

Effet de fractions dépolymérisées en catalyse métalliqueEffet amincissant Effet anti-radicalaire


Pas de modifications significatives


0

50000

100000

Témoin

CM 63(1) 0,01 mg/mlCM 63(1) 0,002 mg/ml

CM 52(4) 0,01 mg/mlCM 52(4) 0,002 mg/ml

CM 56(6) 0,01 mg/mlCM 56(6) 0,002 mg/ml

Effet des fractions dépolymérisées par catalyse métallique en présence de CuSO4 sur l’activité LPL des adipocytes

Cu, pH non régulé,R=0,4

Mw ~ 25 500 g/mol

Cu, pH régulé,R=0,1

Mw ~ 37 500 g/mol

Cu, pH régulé,R=0,2

Mw ~ 37 500 g/molAct

ivité

LPL

(cpm

)

Effet de fractions dépolymérisées en catalyse métalliqueEffet amincissant Effet anti-radicalaire


Fractions dépolymérisées avec un mélange

Cu-Zn actives Effet dose-dépendant


0

50000

100000

Témoin

CM 45(3) 0,01 mg/mlCM 45(3) 0,002 mg/ml

CM 65(3) 0,01 mg/mlCM 65(3) 0,002 mg/ml

CM 57(3) 0,01 mg/mlCM 57(3) 0,002 mg/ml

Effet des fractions dépolymérisées par catalyse métallique en présence de mélanges de métaux

sur l’activité LPL des adipocytes

Cu/Zn, pH régulé,R=0,1

Mw~ 44 400 g/mol Ip~ 3

Cu/Zn, pH régulé,R=0,4

Mw~ 11 600 g/mol Ip~ 2,7

Cu/Mn, pH non régulé,R=0,2

Mw~ 10 000 g/mol Ip~ 2,2

33 %

60 %

43 %

Act

ivité

LPL

(cpm

)

Bilan sur les effets de fractions dépolymériséesEffet amincissant Effet anti-radicalaire



Les produits peuvent être classés en 3 groupes:– les produits avec effet dosedépolymérisation par ultrasons ou par catalyse métallique en présence d’un mélange Cu-Zn

– les produits inhibiteurs à une concentrationdépolymérisation par catalyse métallique en présence d’un mélange Cu-Zn

– Les produits sans effetdépolymérisation, par catalyse métallique ou ultrasons, en présence de Cu

L ’activité in vitro à faibles concentrations permet d’espérer une activité in vivo

Evaluations de différentes activités biologiques

- Premiers résultats de criblages encourageants

- Produits actifs à de faibles concentrations

- Applications possibles dans le domaine visé des cosmétiques


La recherche in vitro d’activités biologiques sur les fractions dépolymérisées s’est

concentrée sur 3 effets possibles :



Introduction





Conclusion

Plan de l’exposé





Ajout de groupements chargés négativement

Ajout de groupements chargés positivement

Oxydation

Estérification

Modifications chimiques envisagées


Oxydation

Nombre de positions OH par motif pouvant être substituées:- OH primaires: 5- OH secondaires: 22

D’où:


→3)-L-Rhap-(1→3)-D-Galp-(1→4)-D-GalpA-(1→4)-D-GlcpA-(1→4)-D-Galp-(1→3)-D-Manp-(1→4)-D-Glcp-(14 4 2↑ ↑ ↑1 1 1

L-Fucp D-Galp L-Rhap3↑1

Lac-3-O-D-GlcpA


Dans notre hypothèse de structure:

DS maximum théorique ~ 2,45



OxydationEstérification

Degré de substitution (DS)

Mécanisme de sulfatation de l’EPS


Sulfatation réalisée avec de l’acide chlorosulfonique et de la pyridine ou directement avec un complexe Pyr.SO3 ou DMF.SO3

Mécanisme probable:

HOR

N S

O

O

O

L. H: ↑ électrophilie de S et nucléophilie de OH

N S

O

O

O N + R O S

O

O

OH

R O H

N2 + Cl SO3H N S

O

O

O + N HCl

Toute trace d’eau doit être évitée




Techniques d’analyse de la sulfatation

Réf.: Lijour Y., Gentric E., Deslandes E. et Guezennec J. (1994). Anal. Biochem. ,220, 244-248.Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005

- Analyses infrarouges (IR)

- Analyses élémentaires

% SO3Na = % S x 3,22Ajout de groupements chargés négativement



1.35

1.40

1.45

1.50

1.55

1.60

1.65

1.70

1.75

1.80

1.85

1.90

1.95

2.00

2.05

800 1000 1200 1400 1600

Absorbance à1250 cm-1

Absorbance à1050 cm-1

Ligne de base

Abs

orba

nce

Nombre d’onde (cm-1)

Techniques d’analyse de la sulfatation

Réf.: Lijour Y., Gentric E., Deslandes E. et Guezennec J. (1994). Anal. Biochem. ,220, 244-248.Soutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005



% SO3Na = % S x 3,22

Détermination du taux de sulfates par IR avec précision de ± 5%




0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 5 10 15 20 25 30 35 40

% Sulfates

Abs

(125

0)/A

bs(1

050)

Résultats obtenus en Sulfatation





Sulfatation possible avec DMF-SO3Plus grande réactivitéMoins grande toxicité

Conditions: 60 mg d’EPS mis sous forme de sel de pyridinium ensolution dans le DMF, m(complexe-SO3) = 5 x m(EPS), 45°C, sous azote, 24h

Agent desulfatation EPS %SO3Na DS

Pyr-SO3

NatifDépolymérisé sous USDépolymérisé sous CM

25-302530

0,6-0,90,60,9

Pyr + ClSO3H Natif Non reproductible -

DMF-SO3 Natif 25 0,6

N° Sel Température(°C) Solvant SO3Na

(%) DS Mw (g/mol) Rendement(%)

HYD 657 natif Ca - - 5 - 3 000 000 -

1 Pyr 45 DMF 34 1,1 18 000 48

2 Pyr Ambiante DMF 21 0,5 43 000 70

3 Pyr 45 DMF + 2 mlpyridine 34 1,1 670 000 90

4 Na 45 DMF 8 nd 15 000 25

5 Pyr 45 DMSO 5 - < 10 000 < 10%

6 Pyr 45 Sulfolane 5 - < 10 000 < 10%

Sulfatation en présence de DMF-SO3





Conditions à optimiser

Conditions: 60 mg d’EPS natif mis sous forme de sel ensolution, m(DMF-SO3) = 5 x m(EPS), 45°C, sous azote, 24h

Cinétiques de Sulfatation en présence de DMF-SO3





5

10

15

20

25

30

35

40

0 2 4 6 8 10

Durée de la réaction (h)

% S

ulfa

tes

DMF,45°C

DMF + Pyr, 45°C

DMF, TA

DMSO, 45°C

Evolution du taux de sulfate pendant les premières heures de sulfatation

Conditions:60 mg d’EPS natif mis sous forme de sel de pyridinium, m(complexe-SO3) = 5 x m(EPS)

Cinétiques de Sulfatation en présence de DMF-SO3





Sulfatation la plus efficace:

- 2h de réaction- présence de

Pyr DSmax de 1,1

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 2 4 6 8 10

Durée de la réaction (h)

Mw

(g/m

ol)

DMF,45°C

DMF + Pyr, 45°C

DMF, TA

DMSO, 45°C

Evolution de la masse molaire Mw pendant les premières heures de sulfatation

Mécanisme d’acétylation de l’EPS


Ac2O + N NCCH3

O

+ CH3 COO

R O

H

NCCH3

O

+ C

O

OR CH3 + HN




Conditions: EPS mis sous forme de sel en solution dans le DMF, ajout de n équivalent d’anhydride acétique en présence de pyridine, 45°C, sous azote, 48h

Réf.: Na et al (1999). Drug developpement and industrial pharmacy, 25(8), 917-927.

Techniques d’analyse de l’acétylation






EPS natif

%T

EPS acétylé

%T

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000Nombre d'onde (cm-1)

1750 cm-1

C=O 1375 cm-1

CH3

1240 cm-1

C-O-C





OxydationEstérification- Analyses RMN

Intégration des acétates et quantification par rapport à l’intégration des :

CH3 des Rha, Fuc et Lac Protons du squelette

Squelette du polysaccharide

2CH3

Rha, Fuc, Lac0,8-1,5 ppm

1

Acétates1,6-2,4 ppm

Irradiation du pic d ’eau





OxydationEstérification- Analyses RMN

Intégration des acétates et quantification par rapport à l’intégration des :

CH3 des Rha, Fuc et Lac Protons du squelette

Acétates1,6-2,4 ppm

D2O4,7 ppm

3

Squelette du polysaccharide

1

Déconvolution DAdéterminé par 3

méthodes

CH3Rha, Fuc, Lac0,8-1,5 ppm

Résultats obtenus en acétylation


Nombre d’équivalents d’anhydride à revoir pour l’EPS natif




DAEPS

Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3Mw (g/mol) Rendement

(%)

HYD 657 CMMw~40 000g/mol 2,5 2,2 2,1 23 300 50

HYD 657 USMw~300 000g/mol 2,5 2,5 2 233 000 90

HYD 657 NatifMw~3 000 000g/mol 1,1 0,8 1,1 > 1 000 000 100

Conditions: 85 mg d’EPS mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97%-3%), néq(Anhydride acétique)~20, 45°C, 48h

Faible dépolymérisation

observée

Acétylation quasi-totale pour les échantillons

dépolymérisés

Résultats obtenus en acétylation


DAEPS Anhydride acétique

(équiv) Méthode 1 Méthode 2 Méthode 3Mw (g/mol) Rendement

(%)

20 1,1 0,8 1,1 > 1 000 000 100HYD 657natif 40 2,2 2,4 2,2 275 140 90




Conditions: 85 mg d’EPS natif mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97-3), néq(Anhydride acétique)~40, 45°C, 48h

Nombre d’équivalents d’anhydride acétique nécessaire supérieur

Dépolymérisation importante observée

Etude de la cinétique de réaction nécessaire

Cinétique d’acétylation de l’EPS

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

2 4 6 8Durée de la réaction (h)

DA

400

500

600

700

800

900

1000

Mw (kg/m

ol)

DA

Masse molaire





Evolution de la masse molaire Mw et du DA pendant les premières heures d’acétylation

Après 2h, DA de 2 et dépolymérisation moins importante

Conditions: 85 mg d’EPS natif mis sous forme de sels de pyridinium ensolution dans DMF-Pyr (97-3), néq(Anhydride acétique)~40, 45°C, 48h

Mécanisme d’estérification de l’EPS

N

+

R'

O

Cl

N

CO

R'

Cl

N

CR'O

+

R OH

Cl

N

C O

O HR

R'

ClN

HCl

R'C

O

OR





Ion acyl pyridinium Neutralisation des protons

Conditions: EPS mis sous forme de sel en solution dans le DMF, ajout de n équivalents de chlorure d’acide en présence de pyridine, 45°C, sous azote, 48h

Ajout de chlorure de décanoyle et stéaroyletesté


Techniques d’analyse de l’estérification

EPS estérifié avec une chaîne en C10


EPS natif




3022 cm-1

CH3

2850-2950 cm-1

CH21750 cm-1

C=O

10

12

14

16

18

20

%T

20

30

40

50

60

%T

1000 1500 2000 2500 3000 3500 Nombre d'onde (cm-1)



- Analyses RMN MASAjout de groupements chargés négativement



Rotation à l’angle magique (54,7°)

Elimination des contributions anisotropesRéduit la largeur des raies☺

Technique Etat Elémentobservé Procédé Avantages

UMR CNRS 6026 «RMN structurale des protéines et des interactions lipides-protéines »

HR-MAS Gel 1HAction combinée

d’une forte rotation etde l’angle magique

Elimination descontributions

anisotropes élargissantles raies

SPE-MAS

CP-MAS Solide 13CMagnétisation des spins abondants (1H) transféréeaux spins rares (13C)

Augmentation de lasensibilité et de la

résolution du signal en13C

Solidepartiellement

hydraté

13C Analogue à CP-MAS Détection des fractionsles plus mobiles

Laboratoire « Biopolymères, Interactions, Assemblages » (INRA-Nantes)

UMR CNRS 6026

«RMN structurale des protéines et des interactions lipides-

protéines »



- Analyses RMN HR-MASAjout de groupements chargés négativement



4,7 ppmeau

1,5 ppmCH3 Rha, Fuc, Lac

2,2 ppmCH2 en α des C=O

0,85 ppmCH3 des esters

1,3 ppmCH2 des esters

Chaîne en C10

DS~ 1,2

Chaîne en C18

DS~1,7

1

2



180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

SPE MAS EPS + chaine C10 hydrate

CP-MAS

solide

SPE-MAS

solide partiellement hydraté

- Analyses RMN 13C CP-MAS et SPE-MASAjout de groupements chargés négativement



Mise en évidence de la rigidificationdu système




Formule moléculaire théorique d’une unité répétitive : C69H107O57

Calcul du pourcentage théorique attendu en chacun des éléments en fonction du DS




DS voisins et supérieurs à 1,1 pour l’ajout de chaînes

grassesen C10 et C18

Résultatsthéoriques

Analysesélémentaires

EPS Chaîneajoutée

%C %H %N %C %H %N

Formulemoléculaire DS

En C10 65,23 9,18 0,86 65,35 9,15 0,79 C264H446O75N3 1,6Dépolymérisésous US En C18 69,93 10,40 0,69 69,82 10,61 0,52 C354H632O72N3 1,4

En C10 62,25 8,59 1,07 62,10 8,72 0,87 C204H338O69N3 1,1Natif

En C18 70,41 10,50 0,66 70,71 10,73 0,63 C372H666O73N3 1,45

Bilan des modifications chimiques de l’EPS





Mise en place de caractérisations et de quantifications par des techniques d’analyses adaptées

Etudes plus poussées à envisager en fonction de l’intérêt

Faisabilité de modulations chimiques de l’EPS, natif ou dépolymérisé, par groupements classiques

Optimisations en cours

Obtention de façon reproductible de fractions sulfatées, acétylées ou estérifiées par des chaînes grasses pouvant être criblées

Introduction






Plan de l’exposé


Conclusions

Bilan général et perspectives

– En dépolymérisation par les ultrasons:


• Faisabilité de cette voie confirmée ;

• Obtention d’échantillons de masses molaires inférieures à 300 000 g/mol en mode semi-batch avec recirculation de la solution ;

• Mise en évidence d’une nouvelle voie combinant dépolymérisation physique et chimique ;

• Possibilité d’activités dans le domaine visé des cosmétiques mise en évidence.

– En dépolymérisation par catalyse métallique :



• Utilisation des métaux n’ayant pas fait l’objet d’études dans la littérature ;

• Obtention de façon reproductible des échantillons de masses molaires comprises entre 5000 et 100 000 g/mol ;

• Possibilité d’activités dans le domaine visé des cosmétiques mise en évidence.

• Détermination des facteurs influents sur la reproductibilité et l’efficacité de la dépolymérisation ;


– En fonctionnalisation chimique:


• Obtentions de nouvelles molécules d’EPS natif et dépolymérisé ;

• Obtention d’échantillons sulfatés, acétylés ou estérifiés par des chaînes grasses de façon reproductible ;

• Mise en place de techniques d’analyses adaptées ;

• Possibilité de nouveaux criblages d’activités biologiques

Remerciements


Laboratoire « RMN structurale des protéines et des interactions lipides-protéines »

M. le Docteur Arnaud Bondon

Laboratoire « Organométalliques et catalyse, Chimie et électrochimie moléculaire »

M. le Docteur Jean-Pierre Hurvois

Laboratoire « Biopolymères,

Interactions, Assemblages » (INRA)

Mme le Docteur Corinne Rondeau

Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-Chimie des Matériaux et des Interfaces

M. le Professeur Nicolas Gondrexon

Norbert VölkelStephanie Röper

Guillaume Hersant

Mes directeurs de thèse et l’ensemble du personnel des

deux laboratoires

Thèse soutenue le 16 décembre 2005 par

Anne-Cécile PETIT Ingénieur ENSCR

MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR MODIFICATION D’UN EXOPOLYSACCHARIDE BIOSYNTHÉTISÉ PAR

UNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDSUNE BACTÉRIE ISSUE DES FONDS HYDROTHERMAUX PROFONDS

Thèse réalisée sous la direction des Docteurs:Nicolas NOIRET

Laboratoire Synthèses et Activations de BiomoléculesSylvia COLLIEC-JOUAULT

Laboratoire Biotechnologies et Molécules Marines

Formation des exopolysaccharides

chimiquesphysiquesenzymatiques


• Les endopolymérases• Les exopolymérases

Avantages:Absence de produits secondairesMenée en conditions douces

Inconvénients: haute sélectivitéNécessite une connaissance exacte des structuresNe peut être généralisée


physiques chimiques

LEPMI UMR 5631 GRENOBLE FRANCE

Laboratoire d'Electrochimie et de Physico-chimie des Matériaux et des Interfaces

Essai réalisé avec un dispositif HF en mode batch pur2g dissous dans 1 litre soumis à 15h d’ultrasons

Dépolymérisation possible

Modification chimique observée en CPG au niveau

du galactose

Influence de la fréquence d’irradiation


100

150

200

250

300

350

3 6 9 12 159,6

9,8

10

10,2

10,4

10,6

10,8

11

MpViscosité

Mp

(kg/

mol

) Viscosité


Cinétique de dépolymérisation en HF

Fréquence d’irradiation

Durée d’exposition aux ultrasons à ajuster en fonction du volume de

solution

• Ultrasons les plus efficaces au voisinage de la sonde

• Difficulté d’homogénéiser un volume trop important

Volume de la solutionInfluence du volume

Solution d’EPS à 2g/L soumise à 3h d ’exposition aux ultrasons:


Problème du changement d’échelle posé

M p M w M n Ip

10 m L 146 000 145 900 56 400 2,6

100 m L 182 800 184 500 86 800 2,1



EPS Natif

Catalyse métallique Ultrasons

1aModifications

chimiques2a

Modifications chimiques

Modifications chimiques

Applications potentielles

2b

1b

5 voies sont envisageables:

3

Mécanisme de phosphatation de l’EPS

Différents mécanismes peuvent être envisagés:

- formation d’un carbamate phosphate:

- phosphatation de l’EPS:

NH2

C

O

NH2 H3PO4

R OHC

O

NH2 H3PO4OR

NH3+ +

H2NC

O

NH2

+ HO P

O

OHOH NH2 C

O

O P

O

OH

OH+

R OH

O P

O

OH

OH

R + O P

O

O

OH

R P OH

OH

O

+ O P

O

O

OH

R P

OH

O

O R + O P

O

O

OH

R R

Réf: M.I. Khalil et al. Carbohydr. Polym. 48 (2002) 255-261

Réf: D.Sacco et al. Carbohydr. Res. 184 (1988) 193-202

Ajout de groupements cationiques

O

ON(CH3)3

Exemple de la glycine bétaïne:

Réf: R. Auzély-Velty et al, International Journal of biological macromolecules, 31 (2003) 123-129




(CH3)3NO

OH

DCC

+Cl

(CH3)3NO

O N

NH

Cl

N C N

+

DMAP

N

NMe2

DCU

N

NMe2

CO

N(CH3)3Cl

+

N

NMe2

+ ROC

O

N(CH3)3

ClC

NH

NHO+

R OH


Techniques d’analyse de l’ajout de groupements cationiques



OxydationEstérification- Analyses infrarouges (IR)

HYD 657 natif

13

14

15

16

17

18

19

20

21

%T

11

12

13

14

15

16

17

18

%T

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Nombre d'onde (cm-1)

Après ajout de bétaïne

1756 cm-1

C=O


Techniques d’analyse de l’ajout de groupements cationiques




- Analyses RMN CP-MAS


Présence de bétaïnates sur

l’EPS confirmée mais pas quantifiée

CP-MASEPS natif

CP-MASEPS natif avec ajout de bétaïne

180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm180 160 140 120 100 80 60 40 20 (ppm)

165 ppmC=O bétaine

57 ppmCH3 bétainate

Oxydation de l’EPS

Radical organique nitroxyle: le TEMPO




N

O


N

O

1

Oxydant actif : le cation nitrosonium

N

O

2

Formes mésomères et encombrement expliquent sa

stabilité

Oxydation sélective des alcools I

Système TEMPO-hypochlorite de sodium-

bromure de sodium étudié

Mécanisme d’oxydation de l’EPS

N

O

N

OH

N

O

Br

BrO

ClO

Cl

RCH2OH

RCHO

N

O

N

OH

N

O

Br

BrO

ClO

Cl

RCOONaSoutenance de Thèse- Anne-Cécile PETIT- 16 décembre 2005




Conditions retenues pour l’oxydation de l’EPS

Conditions retenues à partir de l’étude bibliographique :





pH9,2-9,7

Températurebasse 0-5°C

Arrêt de la réactionajustement pH faible

Quantités de réactifs0,02 éq en TEMPO

0,2 éq en NaBr2,2 éq en NaOCl

Réduction en fin de réaction

Techniques d’analyses de l’oxydation


• augmentation de la bande de vibration des carboxylates à 1612 cm-1

• absence de bande d’absorption à 1730cm-1

- Dosage colorimétrique des acides uroniques

EPS % d’acidesuroniques

% de fonctions alcoolsprimaires oxydées Mw(g/mol) Ip

Rendement%


Natif oxydé (1) 52% 50 620 000 2,3 87

Natif oxydé (2) 45% 36 783 000 2 87Dépolymérisépar US oxydé 43% 32 246 500 2,5 89




Sélectivité de la réaction

Dépolymérisation de l’EPS natifOxydation partielle

Résultats d’oxydation de l’EPS


0

50

100

150

200

250

300

0 50 100 150 200 250 300


NaO

H a

jout

é (µ

mol

)

Facteurs pouvant expliquer les résultats observés

- la cinétique de la réaction

- notre EPS est un polysaccharide chargé




Les quantités de réactifs devront être adaptées à l’EPSHYD 657

Réaction plus lente

Disponibilité différente de l’oxydant réel

Électrode de référence ECS

Solution d’EPS à 2g/L

dans tampon phosphate pH ~ 7,2 + H2O2

Électrode de travail: graphite

Verre fritté

Carbone vitreux (anode)

Dépolymérisation par Électrolyse

– Étude préliminaire réalisée en voltamètrie où différents systèmes ont été étudiés: tampon phosphate, EPS, ajout d’H2O2, ajout de métal...

– Première étude en électrolyse:

Après 2000 C, Mw= 620 000 g/mol avec Ip=2,8Après 4000 C, Mw= 275 000 g/mol avec Ip=2,7Après 6000 C, Mw= 100 000 g/mol

En noireCourbe déconvoluée (a)

En bleueCourbe non déconvoluée (b)

Différence entre (a) et (b)

Exemple de déconvolution

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