dirección web del DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y BIOLOGIA MOLECULAR

http://www.us.es/dbiovege/

Web de la American Association of Plant Biology

http://www.aspb.org/http://www.aspb.org/publications/arabidopsis/

Base de datos de Arabidopsis

http://arabidopsis.org/

EL CLOROPLASTO

• Introducción• Tipos de plastidios• Diferenciación• División• Elgenoma

cloroplastídico– Estructura– genes

LA CÉLULA VEGETAL

LA PARED CELULAR, LA MEMBRANA PLASMÁTICAY LOS PLASMODESMOS

RETICULOENDOPLÁSMICO

NUCLEO Y NUCLEOLO

PEROXISOMA

Actividad carboxilasa

ribulosa-1,5-bi-P + CO2 2 3-P-glicerato

Actividad oxigenasa

ribulosa-1,5-bi-P + O2 3-P-glicerato + 2-P-glicolato

FOTORRESPIRACIÓN

EL CLOROPLASTO

• Introducción• Tipos de plastidios• Diferenciación• División• Elgenoma

cloroplastídico– Estructura– genes

PROPLASTIDIO

PROPLASTIDIO

amiloplasto cromoplasto

EL CLOROPLASTO

• Introducción• Tipos de plastidios• Diferenciación• División• Elgenoma cloroplastídico

– Expresión génica– Regulación

DIFERENCIACIÓN DE PLASTIDIOS

etioplasto

desarrollo de granascloroplasto maduro

PR: prolamellar body (75% lípidos) tilacoidesLUZ

protoclorofilida clorofila

ORIGEN ENDOSIMBIONTE DEL CLOROPLASTO

1 de cada 16000 gametos

algas rojasGlaucocystophytes (Cyanophora)algas verdesplantas

Otros grupos de algas:Chlorarachnion (con nucleomorfo)EuglenaGuillardia (con nucleomorfo)EmilianiaLaminaria

EL CLOROPLASTO

• Introducción• Tipos de plastidios• Diferenciación• División• Elgenoma cloroplastídico

– Expresión génica– Regulación

División de plastidios (etioplastos)

Figure 1. Dividing and Mature Plastids in Arabidopsis.(A) Dividing proplastid from a cell in the shoot apical meristem.(B) to (D) Division conformations of epidermal cell chloroplasts stained with silver nitrate from young expanding cotyledons.(E) Typical chloroplast in early division, from an expanding leaf mesophyll cell.(F) Confocal topographic view of dumbbell-shaped plastids in the base of petals in the Arabidopsis arc5 mutant.(G) A mature Arabidopsis mesophyll cell showing part of the monolayer of chloroplasts over the internal cell surface with a large hole in the monolayer representing where the cell was previously attached to a neighboring cell.(H) An electron micrograph of arc5 petal chloroplasts showing an electron-dense plastid dividing ring at the narrow isthmus of a chloroplast in division (photograph courtesy of K. Hagley).

DRP: dynamn related proteins

wtRNAi FtsZ1RNAi FtsZ2 RNAi MinD RNAi ARC5

FtsZ1 FtsZ2 ARC6 ARC5

Figure 4. Phenotypes of Transgenic Plants Expressing Antisense Constructs of AtFtsZ1-1 or AtFtsZ2-1.

Tissue from the first leaves of 23-day-old plants was prepared for visualization of individual mesophyll cells by using Nomarski interference contrast optics, as described by Pyke and Leech 1991 .

(A) and (B) Cells from transgenic plants expressing the AtFtsZ1-1 antisense gene.

(C) and (D) Cells from transgenic plants expressing the AtFtsZ2-1 antisense gene.

(E) and (F) Cells from wild-type Arabidopsis.

EL CLOROPLASTO

• Introducción• Tipos de plastidios• Diferenciación• División• Elgenoma

cloroplastídico– Estructura– genes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/euk_o.html

La replicación del DNA cloroplastídico no está acopladaa la replicación del genoma nuclear

EL CLOROPLASTO

• Fotosíntesis

- Introducción

- El aparato

fotosintético

- State transition

El aparato fotosintético

PSII

PSI

Interconexión entre granas y lumen tilacoidal

State transition

EL CLOROPLASTO

• Biotecnología

- Transformación

- Obtención de

mutantes

The elimination of marker genes using the CRE-lox site specific recombination system in plastids. In this example, the transplastome contains the marker gene aadA flanked by lox sites (arrowheads). The gene of interest (goi) that was introduced by selection for the marker gene is shown in blue. Introduction of cre (a) by Agrobacterium transformation or (b) by crossing results in expression of the CRE site-specific recombinase from the nuclear cre gene. The CRE is plastid targeted, and will simultaneously excise the marker gene from all the plastid genome copies. In the experiment described in [16], the gene to keep (i.e. the goi) was aadA and the gene to remove was codA, a negative selectable marker. In [30], the gene to be eliminated was aadA and the gene to keep was gfp (encoding GFP). Presence of cre and the linked kanamycin-resistance (neo) gene in the nuclear genome are indicated by c and n, respectively; their absence by a ‘+’. T0 refers to transgenic plants regenerated from tissue culture; T1 and T2 are the first and second generation progeny of T0 produced by self pollination.

Table 1 Foreign genes successfully expressed to date from higher plant plastid genomes

Gene(s) Gene product and gene source Function aadA Aminoglycoside 3''-adenylyltransferase from E. coli Positive selectable marker (spectinomycin and streptomycin resistance) nptII Neomycin phosphotransferase from Tn 5 Positive selectable marker (kanamycin) resistance

uidA Glucuronidase (GUS) from E. coli Reporter of gene expression gfp Green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria (Vital) reporter of gene expression cry1A Crystal toxin from Bacillus thuringiensis Insecticidal protein (protoxin

cry2A Crystal toxin from Bacillus thuringiensis Insecticidal protein (protoxin cry2Aa2 operon Crystal toxin, ORF1 and ORF2 (putative chaperonin) Insecticidal protein (protoxin) proteins from Bacillus thuringiensis codA Cytosine deaminase from E. coli Negative selectable marker (5-fluorocytosine sensitivity) EPSPS 5-Enol-pyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Herbicide tolerance (glyphosate) Petunia hybrida or from eubacterial species bar Phosphinothricin acetyltransferase from Streptomyces Herbicide resistance (glufosinate) hygroscopicus

hST Human somatotropin Therapeutic protein (human growth hormone)

EL CLOROPLASTO

• Expresión genica• Regulación

transcripcional• Regulación post-

transcripcional• Transformación

NEP(nuclear encoded RNA polymerase)

RpoZ

PEP(plastid encoded RNA polymerase)

rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2

plastídicasnucleares

Genes fotosintéticosGenes no fotosintéticos

rpoB rpoC1 rpoC2

NEP promotor

PEP promotores

PEPNEP

núcleo

cloroplasto

Genes plastídicos pueden tener múltiples promotores

atpB-atpE codifican dos subunidades de la ATP sintasa

Elevada regulación transcripcional de los promotores plastídicos:

- distintos promotores activos

- regulación de la intensidad de un promotor

Fuerte regulación transcripcional por factores ambientales (luz)

EL CLOROPLASTO

• Expresión genica• Regulación

transcripcional• Regulación post-

transcripcional

- splicing

- traducción

Estructura típica de un mRNA maduro del cloroplasto

Procesamiento de los rRNAs plastídicos

Trans-splicing

E1

E3

E2

E1E3

E2

E1 E3E2

psaA de Chlamydomonas

cromosoma cloroplasto

EL CLOROPLASTO

• Expresión genica• Regulación

transcripcional• Regulación post-

transcripcional

- splicing

- traducción

- El DNA del cloroplasto codifica ~ 50-100 proteínas, además de rRNAs y tRNAs

- La mayoría de las proteínas participan en la fotosíntesis o en transcripción y traducción

- Muchas de las proteínas codificadas en el cloroplasto funcionan en complejos oligoméricos que contienen subunidades que provienen tanto del genoma nuclear como del cloroplasto, como es el caso de la Rubisco

Rubisco

Diferencias entre la traducción citosólica y plastídica

bacterias

citoplasma

Inicio de traducción en Euglena gracilis

Translocación co-traduccional

Polisomas libres: producen proteínas en el estroma, que son dirigidas a sus destinos

Polisomas asociados a membrana: producen proteínas que son insertadasdirectamente en la membrana (proteínas del aparato fotosintético en lasmembranas tilacoidales)

Subunidad grandede la Rubisco

Ensamblaje de la Rubisco

Regulación del ensamblaje de la Rubisco

La luz como regulador principal del desarrollo del cloroplasto

Band-shift assay(retardo en gel)

La luz como regulador traduccional

psbA (D1 protein)

cPDI: chloroplast protein disulfide isomerase

cPABP: chloroplast polyadenylate-binding protein

Regulación de la síntesis de proteínas por la disponibilidad de cofactores

Modelo para la inserción co-traduccional de cofactores en la proteína D1

Regulación de la síntesisy ensamblaje del PSII

EL CLOROPLASTO

• Transporte de proteínas– Método de ensayo– Peptido de transito– Maquinaria– Envuelta externa– Sistema tilacoidal– Ensamble de complejos

thight binding: < 50 µMtranslocation: > 0.1 mM

Péptido de tránstito

20-150 aa

TOC159, TOC34: GTP-binding proteins

TOC75: translocation channel

TIC55: Rieske-type Fe-S centre

AtToc159, -132 y -120 interaccionan con el cloroplasto y con TOC34

etioplasto

wt ppi1

5 dias

cloroplasto5 dias

4 semanas

SRP (signal recognition particle)

Inserción de proteínas en la membrana tilacoidal

TOC75

TIC22TIC20

Bibliografía

- Biochemistry and Molecular Biology of Plants (2000) Eds. Buchanan, Gruissem, Jones.

American Society of Plant Physiologists

- Zerges W. Does complexity constrain organelle evolution? Trends Plant Sci. 2002 Apr;7(4):175-82.

- Bock and Khan. Taming plastids for a green future. Trends Biotechnol. 2004 Jun;22(6):311-8.

- Maliga P. Engineering the plastid genome of higher plants. Curr Opin Plant Biol. 2002 Apr;5(2):164-72.

- Bruce BD. Chloroplast transit peptides: structure, function and evolution. Trends Cell Biol.

2000 Oct;10(10):440-7.

- Soll and Schleiff. Protein import into chloroplasts. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Mar;5(3):198-208.

- Jarvis and Robinson. Mechanisms of protein import and routing in chloroplasts. Curr Biol. 2004

Dec 29;14(24):R1064-77.

- May and Soll. Chloroplast precursor protein translocon. FEBS Lett. 1999 Jun 4;452(1-2):52-6.

- Zerges W. Translation in chloroplasts. Biochimie. 2000 Jun-Jul;82(6-7):583-601.

- Rodermel S. Pathways of plastid-to-nucleus signaling. Trends Plant Sci. 2001 Oct;6(10):471-8.

- Maliga P. Plastid transformation in higher plants. Annu Rev Plant Biol. 2004;55:289-313.

- Osteryoung and Nunnari. The division of endosymbiotic organelles. Science. 2003 Dec 5;302(5651):1698-704.

- Osteryoung and Pyke. Plastid division: evidence for a prokaryotically derived mechanism. Curr Opin

Plant Biol. 1998 Dec;1(6):475-9.

- Timmis JN et al. Endosymbiotic gene transfer: organelle genomes forge eukaryotic chromosomes.

Nat Rev Genet. 2004 Feb;5(2):123-35.

- Archibald and Keeling. Recycled plastids: a 'green movement' in eukaryotic evolution.

Trends Genet. 2002 Nov;18(11):577-84.