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Dissertation - Dissertation.pdf · PDF filePAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon PC...

Date post:12-Aug-2019
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  • Dissertation

    submitted to the

    Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics

    of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany

    for the degree of

    Doctor of Natural Sciences

    presented by

    Diplom-Biologist Ruben Strecker

    born in Heilbronn, Germany

    Oral examination: .....................................................

  • Toxicity and teratogenesis in zebrafish embryos (Danio rerio)

    Referees: Prof. Dr. Thomas Braunbeck

    Centre for Organismal Studies, Heidelberg

    Prof. Dr. Henner Hollert

    Institut für Umweltforschung, RWTH Aachen

  • Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbst verfasst und mich dabei kei-

    ner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe. Des

    Weiteren erkläre ich, dass ich an keiner Stelle ein Prüfungsverfahren beantragt oder die Dis-

    sertation in dieser oder einer anderen Form bereits anderweitig als Prüfungsarbeit verwendet

    oder einer anderen Fakultät als Dissertation vorgelegt habe.

    Heidelberg, 24.01.2013 ____________________________

    Ruben Strecker

  • "That which can be asserted without evidence, can be dismissed without evidence."

    Christopher Eric Hitchens (1949-2011)

  • Danksagung

    Verschiedene Institutionen und Personen haben zum Gelingen meiner Doktorarbeit beigetra-

    gen, denen ich herzlichst danken möchte.

    Mein besonderer Dank gilt:

    Herrn Prof. Dr. Thomas Braunbeck, für die Möglichkeit meine Doktorarbeit in seiner Ar-

    beitsgruppe anzufertigen und für seine Unterstützung über all die Jahre hinweg. Insbesondere

    unsere „Dienstreisen“ werde ich nicht vergessen.

    Herrn Prof. Dr. Henner Hollert für die unkomplizierte Übernahme des Korreferats.

    Christopher „Da Hansel“ Faßbender, meinem Kalauerkumpanen, ohne den das Leben für

    mich deutlich langweiliger gewesen wäre (inwiefern das die lieben Kollegen im selben Zim-

    mer ebenso genossen haben, sei dahingestellt). Irgendwann einmal werden wir noch unseren

    Film drehen …

    Patrick „Chuck Gyver/Mac Norris“ Heinrich, das Juniormitglied im Range eines Kalauer-

    meisters. Dein Holzlaster sowie auch dein Jägermeistervorrat haben uns wertvolle Dienste

    geleistet …

    Erik Leist, für die viele Arbeit im Fischkeller und die vielen Fachsimpeleien.

    Den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Braunbeck und Prof. Dr. Frings für die entspannte Arbeits-

    atmosphäre, den Sekt, das Bier und die vielen Süßigkeiten:

    Britta Kais, Stefan Weigt, Daniel Stengel, Katharina „Käthe“ Schneider, Federica „Fede“

    Genovese, Kerstin Vocke, Kristin Dauner, Eva Lammer, Weiping Zhang, Svenja Böhler, Se-

    mir Jeridi, Philipp Daiber, Florian Schmitt, Franziska „Franzi“ Förster, Kirsten Henn, Sina

    Volz, Leon Kreuter, Kristina „Krisi“ Rehberger, Frank Möhrlen, Chrisztina Vincze, Markus

    Lutz, Jens Otte, Lisa Baumann, Nadja „Naddl“ Schweitzer, Kerstin Ullrich, Paula Suares-

    Rocha, Philipp Kremer, Shoui, Pluto, Cleo, Emma, Natalya „Natascha“ Demir, Melanie

    „Mel“ Böttcher, Markus „Maggus“ Braun, Raoul Wolf, Sarah Schnurr, Ann-Marie Oppold,

    Annika Batel, Franziska Scheller, Thomas-Benjamin Seiler, Gabriele „Gabi“ Günther, Steffi

    Grund, Aennes Abbas, Uta Jürgens, Sebastian „Seba“ Lungu, Susanne Keiter, Susanne „Su-

    se“ Knörr, Ulrike „Uli“ Diehl, Malte Posselt, Werner Greulich, Frank Böttger, Frau Marek,

    Christina Godel, Gisela Adam (unserem Photoshopgenius) und Herrn Schade.

    Meinen Eltern, für den Rückhalt und ihre Unterstützung.

  • Abbreviations

    AAF 2-Acetylaminofluorene

    AFB1 Aflatoxin B1

    BaP Benzo[a]pyrene

    CBZ Carbamazepine

    CPA Cyclophosphamide

    CSG Chemical Selection Group

    CV Coefficient of Variation

    CYP Cytochrome Enzymes

    DMSO Dimethylsulfoxide

    EC Effect Concentration

    ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods

    ECHA European Chemical Agency

    hpf hours post fertilization

    IFO Ifosfamide

    IUCLID International Uniform Chemical Information Database

    LC Lethal Concentration

    LOX Lysyl oxidase

    MSDS Material Safety Data Sheet

    NC Negative Control

    OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

    PAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

    PC Positive Control

    PHE Phenytoin

    QSAR Quantitative structure–activity relationship

    REACH Regulation, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals

    RT-PCR Real Time-Polymerase Chain Reaction

    SC Solvent Control

    SOP Standard Operation Procedure

    TCDD Tetrachlordibenzodioxine

    TEG Tegafur

    TI Teratogenic Index

    TG Test Guideline

    TMO Trimethadione

    TT Thio-TEPA (N,N,N-triethylenethiophosphoramide)

    UBA Umweltbundesamt (German EPA)

    VMG Validation Management Group

    WHO World Health Oranisation

    ZFET Zebrafish Embryo Toxicity Test

  • I

    Contents

    Summary ................................................................................................................................... 1

    Zusammenfassung .................................................................................................................... 3

    Introduction ............................................................................................................................ 5

    Alternatives to animal testing....................................................................................... 5

    Zebrafish as a test organism ......................................................................................... 8

    General aspects and outline of this thesis .................................................................... 8

    Chapter I

    1 The Zebrafish (Danio rerio) Embryos Toxicity Test (ZFET) OECD .....................

    validation study ........................................................................................................ 12

    1.1 Abstract ...................................................................................................................... 12

    1.2 Introduction ................................................................................................................ 13

    1.3 Materials & Methods.................................................................................................. 14

    1.3.1 Test chemicals ............................................................................................................ 14

    1.3.2 Zebrafish maintenance and spawning ........................................................................ 16

    1.3.3 Zebrafish Embryo Toxicity Test (ZFET) - Principles ................................................ 17

    1.3.4 Determination of toxicity - Lethal endpoints ............................................................. 18

    1.3.5 Acceptance criteria ..................................................................................................... 19

    1.3.6 Chemical analysis....................................................................................................... 20

    1.3.7 Statistics ..................................................................................................................... 20

    1.4 Results ........................................................................................................................ 21

    1.4.1 Phase 1a ...................................................................................................................... 21

    1.4.2 Phase 1b ..................................................................................................................... 23

    1.4.3 Phase 2 ....................................................................................................................... 28

    1.5 Discussion .................................................................................................................. 40

    1.6 Conclusions ................................................................................................................ 43

    Chapter II

    2 Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens .............. 46

    2.1 Abstract ...................................................................................................................... 46

    2.2 Introduction ................................................................................................................ 47

    2.3 Materials and Methods ............................................................................................... 50

  • II

    2.3.1 Materials ...........