Dissertation

submitted to the

Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics

of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany

for the degree of

Doctor of Natural Sciences

presented by

Diplom-Biologist Ruben Strecker

born in Heilbronn, Germany

Oral examination: .....................................................

Toxicity and teratogenesis in zebrafish embryos (Danio rerio)

Referees: Prof. Dr. Thomas Braunbeck

Centre for Organismal Studies, Heidelberg

Prof. Dr. Henner Hollert

Institut für Umweltforschung, RWTH Aachen

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbst verfasst und mich dabei kei-

ner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe. Des

Weiteren erkläre ich, dass ich an keiner Stelle ein Prüfungsverfahren beantragt oder die Dis-

sertation in dieser oder einer anderen Form bereits anderweitig als Prüfungsarbeit verwendet

oder einer anderen Fakultät als Dissertation vorgelegt habe.

Heidelberg, 24.01.2013 ____________________________

Ruben Strecker

"That which can be asserted without evidence, can be dismissed without evidence."

Christopher Eric Hitchens (1949-2011)

Danksagung

Verschiedene Institutionen und Personen haben zum Gelingen meiner Doktorarbeit beigetra-

gen, denen ich herzlichst danken möchte.

Mein besonderer Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. Thomas Braunbeck, für die Möglichkeit meine Doktorarbeit in seiner Ar-

beitsgruppe anzufertigen und für seine Unterstützung über all die Jahre hinweg. Insbesondere

unsere „Dienstreisen“ werde ich nicht vergessen.

Herrn Prof. Dr. Henner Hollert für die unkomplizierte Übernahme des Korreferats.

Christopher „Da Hansel“ Faßbender, meinem Kalauerkumpanen, ohne den das Leben für

mich deutlich langweiliger gewesen wäre (inwiefern das die lieben Kollegen im selben Zim-

mer ebenso genossen haben, sei dahingestellt). Irgendwann einmal werden wir noch unseren

Film drehen …

Patrick „Chuck Gyver/Mac Norris“ Heinrich, das Juniormitglied im Range eines Kalauer-

meisters. Dein Holzlaster sowie auch dein Jägermeistervorrat haben uns wertvolle Dienste

geleistet …

Erik Leist, für die viele Arbeit im Fischkeller und die vielen Fachsimpeleien.

Den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Braunbeck und Prof. Dr. Frings für die entspannte Arbeits-

atmosphäre, den Sekt, das Bier und die vielen Süßigkeiten:

Britta Kais, Stefan Weigt, Daniel Stengel, Katharina „Käthe“ Schneider, Federica „Fede“

Genovese, Kerstin Vocke, Kristin Dauner, Eva Lammer, Weiping Zhang, Svenja Böhler, Se-

mir Jeridi, Philipp Daiber, Florian Schmitt, Franziska „Franzi“ Förster, Kirsten Henn, Sina

Volz, Leon Kreuter, Kristina „Krisi“ Rehberger, Frank Möhrlen, Chrisztina Vincze, Markus

Lutz, Jens Otte, Lisa Baumann, Nadja „Naddl“ Schweitzer, Kerstin Ullrich, Paula Suares-

Rocha, Philipp Kremer, Shoui, Pluto, Cleo, Emma, Natalya „Natascha“ Demir, Melanie

„Mel“ Böttcher, Markus „Maggus“ Braun, Raoul Wolf, Sarah Schnurr, Ann-Marie Oppold,

Annika Batel, Franziska Scheller, Thomas-Benjamin Seiler, Gabriele „Gabi“ Günther, Steffi

Grund, Aennes Abbas, Uta Jürgens, Sebastian „Seba“ Lungu, Susanne Keiter, Susanne „Su-

se“ Knörr, Ulrike „Uli“ Diehl, Malte Posselt, Werner Greulich, Frank Böttger, Frau Marek,

Christina Godel, Gisela Adam (unserem Photoshopgenius) und Herrn Schade.

Meinen Eltern, für den Rückhalt und ihre Unterstützung.

Abbreviations

AAF 2-Acetylaminofluorene

AFB1 Aflatoxin B1

BaP Benzo[a]pyrene

CBZ Carbamazepine

CPA Cyclophosphamide

CSG Chemical Selection Group

CV Coefficient of Variation

CYP Cytochrome Enzymes

DMSO Dimethylsulfoxide

EC Effect Concentration

ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods

ECHA European Chemical Agency

hpf hours post fertilization

IFO Ifosfamide

IUCLID International Uniform Chemical Information Database

LC Lethal Concentration

LOX Lysyl oxidase

MSDS Material Safety Data Sheet

NC Negative Control

OECD Organisation for Economic Co-operation and Development

PAH Polycyclic Aromatic Hydrocarbon

PC Positive Control

PHE Phenytoin

QSAR Quantitative structure–activity relationship

REACH Regulation, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals

RT-PCR Real Time-Polymerase Chain Reaction

SC Solvent Control

SOP Standard Operation Procedure

TCDD Tetrachlordibenzodioxine

TEG Tegafur

TI Teratogenic Index

TG Test Guideline

TMO Trimethadione

TT Thio-TEPA (N,N,N-triethylenethiophosphoramide)

UBA Umweltbundesamt (German EPA)

VMG Validation Management Group

WHO World Health Oranisation

ZFET Zebrafish Embryo Toxicity Test

I

Contents

Summary ................................................................................................................................... 1

Zusammenfassung .................................................................................................................... 3

Introduction ............................................................................................................................ 5

Alternatives to animal testing....................................................................................... 5

Zebrafish as a test organism ......................................................................................... 8

General aspects and outline of this thesis .................................................................... 8

Chapter I

1 The Zebrafish (Danio rerio) Embryos Toxicity Test (ZFET) OECD .....................

validation study ........................................................................................................ 12

1.1 Abstract ...................................................................................................................... 12

1.2 Introduction ................................................................................................................ 13

1.3 Materials & Methods.................................................................................................. 14

1.3.1 Test chemicals ............................................................................................................ 14

1.3.2 Zebrafish maintenance and spawning ........................................................................ 16

1.3.3 Zebrafish Embryo Toxicity Test (ZFET) - Principles ................................................ 17

1.3.4 Determination of toxicity - Lethal endpoints ............................................................. 18

1.3.5 Acceptance criteria ..................................................................................................... 19

1.3.6 Chemical analysis....................................................................................................... 20

1.3.7 Statistics ..................................................................................................................... 20

1.4 Results ........................................................................................................................ 21

1.4.1 Phase 1a ...................................................................................................................... 21

1.4.2 Phase 1b ..................................................................................................................... 23

1.4.3 Phase 2 ....................................................................................................................... 28

1.5 Discussion .................................................................................................................. 40

1.6 Conclusions ................................................................................................................ 43

Chapter II

2 Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens .............. 46

2.1 Abstract ...................................................................................................................... 46

2.2 Introduction ................................................................................................................ 47

2.3 Materials and Methods ............................................................................................... 50

II

2.3.1 Materials ...........