Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae Journal of Bacteriology...

Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae Journal of Bacteriology (2009) Lybarger et al Bressuire Christelle

INTRODUCTION Le Systme de scrtion de type II - Mcanisme en 2 tapes -Translocation MI via Sec ou Tat - Machinerie complexe similaire machinerie dassemblage Pili type IV -Translocation ME de la conformation replie

-Bacille incurv Gram - Responsable du cholera - Scrtion de toxine et de facteurs de virulence par SST2 Vibrio cholerae INTRODUCTION

Modle du Systme de scrtion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

Comment sassemble le SST2 dans la paroi de Vibrio cholerae ? Modle du Systme de scrtion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

Interactions protine-protine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protine-protine

INTRODUCTION Interactions protine-protine du SST2 GspC GspD Assemblage du SST2 ? Etude interactions protine-protine C

INTRODUCTION Interactions protine-protine du SST2 GspC GspD Gsp C GspM et GspL Assemblage du SST2 ? Etude interactions protine-protine C

INTRODUCTION Interactions protine-protine du SST2 Assemblage du SST2 ? Etude interactions protine-protine GspC GspD Gsp C GspM et GspL EpsL EpsM C

INTRODUCTION Interactions protine-protine du SST2 Etude de lassemblage du SST2 de Vibrio cholerae Etude des interactions protine-protine de EpsC et EpsM Suivit des protines GFP-EpsC et GFP- EpsM in vivo C Protine GFP (Green Fluorescent Protein)

Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) Localisation polaire de GFP-EpsM GFP-EpsM localis aux ples de la bactrie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit nest pas localis aux ples de la bactrie Klebsiella Oxytoca

Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) Localisation polaire de GFP-EpsM GFP-EpsM localis aux ples de la bactrie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit nest pas localis aux ples de la bactrie Klebsiella Oxytoca La localisation polaire de GFP-EpsM est-elle due la surproduction de la protine?

Localisation de GFP-EpsM ? Souche Vibrio cholerae epsM + pGfp-EpsM

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope fluorescence Induction lIPTG Localisation des protines GFP-EpsM aux ples de la bactrie C

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope fluorescence Sans induction lIPTG Localisation des protines GFP-EpsM la priphrie de la membrane C

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope fluorescence + IPTG- IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due linduction lIPTG

Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope fluorescence + IPTG- IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due la surproduction de la protine. Artefact !!!

Surproduction des protines GFP-EpsM les protines GFP-EpsM sont localises aux ples de la bactrie Hypothse 1: la surproduction des protines GFP-EpsM Hypothse 2: les protines GFP-EpsM sont surproduites alors que les autres protines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protines?

Hypothse 1 ou 2? Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM

Souche Vibrio cholerae epsM + pGfp-EpsM Promoteur eps = Protine GFP-EpsM produite en adquation avec les autres protines Eps Promoteur Inductible = Protine GFP-EpsM peut tre produite un niveau diffrent de celui des autres protine Eps Hypothse 1 ou 2? CC

Localisation protines GFP-EpsC et GFP-EpsM Localisation protine native EpsC ou EpsM ? SST2 assure la scrtion des toxines de Vibrio cholerae ? C Protine GFP-Eps = Protine native Eps?

Vrification production protine de fusion par Western-Blot Dtection de protine GFP-EpsC Dtection protine GFP-EpsM Protine GFP EpsM instable ? Cross reactive band ?

Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? BOC Methylcoumarin fluorescent Induction IPTG protaseVC1200

Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? Linsertion de la fusion GFP nempche pas le fonctionnement du SST2

Localisation des protines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Protine de fusion localis dans la membrane de Vibrio cholerae et non aux ples Observation au microscope fluorescence

Surproduction des protines GFP-EpsM les protines GFP-EpsM sont localiss aux ples de la bactrie Hypothse 1: la surproduction des protines GFP-EpsM Hypothse 2: les protines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protines?

Surproduction des protines GFP-EpsM les protines GFP-EpsM sont localiss aux ples de la bactrie Hypothse 1: la surproduction des protines GFP-EpsM Hypothse 2: les protines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protines? La stchiomtrie des protines de fusion et des autre Eps est ncessaire la localisation des protines de fusions

Localisation des protines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Points de fluorescence= SST2 assembl ? Observation au microscope fluorescence

Point de fluorescence = SST2 assembl? Dispersion de la fluorescence Comptition Protine native Eps / Protine GFP-Eps Point de fluorescence = SST2 assembl C Observation au microscope fluorescence

Vrification de limportance du maintien de la stchiomtrie des Eps pour la localisation des protines Souche Vibrio cholerae PBAD Remplacement epsC et epsM par leur version fusionne gfp-epsM et gfp-epsC sous le contrle du promoteur pbad inductible larabinose. Maintien quilibre des lments Eps du T2SS C

Vrification de limportance du maintien de la stchiomtrie des Eps pour la localisation des protines

Maintien de la stchiomtrie naturelle de chacun des composants du SST2 = Pr requis pour dtermination de la localisation cellulaire

Observation au microscope fluorescence

Le nombre de point de fluorescence augmente avec le niveau dinduction larabinose Observation au microscope fluorescence

Corrlation Points de fluorescence/Scrtion protase du SST2?

Les points de fluorescence reprsentent un SST2 fonctionnelle

Localisation protine EpsG par immunofluorescence Localisation protine GFP-EpsC et Eps= Localisation protine native EpsC et EpsM ?

Auto- fluorescence Points de fluorescence

Localisation protine GFP-EpsC et Eps= Localisation protine native EpsC et EpsM ? Points de fluorescence la localisation des protines de fusion est reprsentatif des protines natives Auto- fluorescence

Assemblage du Systme de scrtion de type II

Ancrage du systme de scrtion de type II de Vibrio cholerae Rle filaments cytosquelette MreB ? MreB nest pas ncessaire lapparition des points de fluorescence

Ancrage du systme de scrtion de type II de Vibrio cholerae Rle filaments cytosquelette MreB ? MreB nest pas ncessaire lapparition des points de fluorescence Lactivit du SST2 ne dpend pas de MreB MreB nintervient pas dans larrimage du SST2

Interactions protine-protine entre GFP-Eps et les autres Eps Rle des autres protines Eps dans la localisation de EpsC et EpsM? Dltions des autres gnes Eps Observation de leffet de la dltion: -Sur lexpression des gnes gfp-EpsC et gfp-EpsM - Sur lactivit du SST2 - Sur la localisation des protines de fusion GFP- EpsC et GfP-EpsM C

Effet de la dltion des gnes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau dexpression?

La dltion depsD espL et epsM entraine une surproduction des autres protines Eps Effet de la dltion des gnes epsD, espL et epsM ?

Sur le niveau dexpression? Augmentation de la production des protines Eps non due la fusion GFP Hypothse: Absence Eps D, EpsL ou EpsM SST2 non fonctionnelle Suractivation du promoteur eps (facteur E ) Augmentation de la production des autres protines Eps Effet de la dltion des gnes epsD, espL et epsM ? C

Sur lactivit du SST2?

Effet de la dltion des gnes epsD, espL et epsM ? Sur lactivit du SST2? La Dltion des gnes epsD, espL et epsM empche la scrtion de protase par le SST2

Effet de la dltion des gnes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence

Effet de la dltion des gnes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence La localisation de EpsC semblerait dpendre dEpsD

Souche Vibrio cholerae PBAD::gfp-espC Dltion epsD gfp-epsC sous le contrle du promoteur eps inductible larabinose Empche la surproduction des protines EpsC due la dltion depsD C Dispersion de fluorescence= Surproduction protine GFP-EpsC suite la dltion depsD?

Dispersion de la fluorescence Dispersion de fluorescence= Surproduction protine GFP-EpsC suite la dltion depsD?

Dispersion de la fluorescence EpsD un rle crucial dans la localisation de EpsC Dispersion de fluorescence= Surproduction protine GFP-EpsC suite la dltion depsD?

Effet de la dltion des gnes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Plus de points de fluorescence aux ples des cellules Dltions nempchent pas la formation des points de fluorescence

Effet de la dltion des gnes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Dltions nempchent pas la formation des points de fluorescence Plus de points de fluorescence aux ples des cellules EpsM et EpsC sembleraient maintenir EpsC au niveau de la membrane latrale

Interactions EpsL et EpsM Moins de protine EpsL en absence d EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protases

Interactions EpsL et EpsM Moins de protine EpsL en absence d EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protases Effet de protection mutuelle dans linteraction EpsL/EpsM

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Cellules plus courtes mais mme points de fluorescence Localisation de GFP- EpsC aux ples de la cellules et dans le cytoplasme

Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Restauration des points de fluorescence aprs complmentions des gnes epsL et epsM dlts Hypothse: EpsC est sujet la protolyse en labsence dEpsM et EpsL EpsL-EpsM stabilisent EpsC dans une conformation ncessaire sa localisation dans la membrane latrale

Effet de la dltion des gnes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence

Effet de la dltion des gnes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence EpsD est ncessaire la localisation dEpsM

Effet de la dltion des gnes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complmentation

Effet de la dltion des gnes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complmentation EpsC et EpsL sont ncessaire la localisation dEpsM

Co-localisation de mCherry-EpsC and GFP-EpsM? mCherry-EpsC GFP-EpsM mCherry-EpsC + GFP-EpsM Points jaunes = SST2 assembl ?

Conclusion Localisation non polaire du SST2 mais tout au long de la membrane = artefact due la surproduction des protines Eps. Importance du respect de la stchiomtrie naturelle des lments du SST2 pour lobservation de leur localisation. Technique de fusion des protines Eps au GFP permet ltude des interactions directement au sein du SST2. Relations entre les Eps mise en vidence: -EpsD est ncessaire la localisation dEpsC -EpsM/EpsL assurent le maintien dEpsC la membrane latrale -EpsD, EpsC et EpsL permettent la localisation dEpsM Modle de lassemblage du Systme de scrtion de type II de Vibrio cholerae

Modle de lassemblage du SST2

Merci pour votre attention

Date post:	03-Apr-2015
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