Androgenes anabolisants de synthese dans les matieres

fecales des bovins : dosage radio-immunologique apres

purification par Chromatographie liquide a haute

performance

P Delahaut, M Dubois, G Maghuin-Rogister

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P Delahaut, M Dubois, G Maghuin-Rogister. Androgenes anabolisants de synthese dans lesmatieres fecales des bovins : dosage radio-immunologique apres purification par Chromatogra-phie liquide a haute performance. Annales de Recherches Veterinaires, INRA Editions, 1990,21 (1), pp.13-22. <hal-00901917>

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Submitted on 1 Jan 1990

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Article original

Androgènes anabolisants de synthèsedans les matières fécales des bovins :

dosage radio-immunologique après purificationpar Chromatographie liquide à haute performance

P Delahaut M Dubois G Maghuin-Rogister1 Laboratoire d’hormonologie animale, Centre d’économie rurale,

1 rue du Carmel, 5406, Marloie2 Laboratoire d’analyse des denrées alimentaires d ôrigine animale,

Faculté de médecine vétérinaire, Université de Liège,Bât B-41 Sart-Tilman, 4000 Liège, Belgique

(Reçu le 31 août 1988; accepté le 18 avril 1989)

Résumé &horbar; Dans le but de répondre à l’obligation imposée par la CEE de contrôler l’usage des ana-bolisants dans les fermes, une méthode de dosage radio-immunologique dans les matières fécalesdes principaux androgènes synthétiques utilisés frauduleusement en engraissement du bétail estdécrite. Elle comporte une séparation préalable par chromatographie liquide à haute performance(CLHP) de la trenbolone 17 p- et 17 a-, collectées dans une même fraction, de la nortestostérone17p- et 17 a- et enfin de la 17 a-méthyltestostérone. Ces 4 fractions sont ensuite soumises au do-sage radio-immunologique correspondant. Le rendement d’extraction moyen et de purification, ap-précié par la méthyltestostérone tritiée utilisée comme standard interne, est de 44 t 7%. Une bonnecorrespondance est obtenue entre les quantités d’hormones ajoutées aux fèces d’animaux non trai-tés et les concentrations moyennes d’hormones trouvées après purification et dosage. Les quantitésde métabolites trouvées sont légèrement sous-estimées du fait du manque de spécificité des anti-sérums utilisés vis-à vis de ces métabolites.

Les limites de détection de la nortestostérone, de la trenbolone et de la méthyltestostérone sontrespectivement de 0,25, 0,23 et 0,32 ng/g de fèces. Une cinquantaine d’échantillons peuvent êtreexaminés par semaine.

résidu / fèces / hormone anabolisante / androgène synthétique / chromatographie liquide àhaute performance / dosage radio-immunologique

Summary &horbar; Synthetic androgen anabolizing agents in cattle faeces: radioimmunoassay afterpurification by high performance liquid chromatography. In answer to the mandatory control ofthe illegal use of anabolizing agents in meat-producing animals imposed by the EEC in farms, amethod of analysis of faeces involving high performance liquid chromatography (HPLC) and radioim-munoassay (RIA) has been described. Four HPLC fractions were collected and submitted to corre-sponding RIA: 17(3- and 17a-trenbolone, 17fJ-nortestosterone. 17a-nortestosterone and 17a-methyltestosterone. The mean extraction and purification yield was estimated at 44 ± 7% using tri-tiated 17a-methyltestosterone as internal standard. Detection limits of the 3 hormones were estimat-ed at 0,2-0,3 nglg of faeces. About 50 samples can be analysed per week by this method.

residue / faeces / anabolic hormone / synthetic androgen / high performance liquid chroma-tography / radioimmunoassay

INTRODUCTION

L’usage illicite d’hormones anabolisantes

chez les animaux producteurs de viandedemeure un problème important. Les

contrôles effectués dans les abattoirs et

dans les exploitations agricoles ont montrél’usage répandu des anabolisants à desfins d’engraissement en dépit de l’interdic-tion légale.

Les récentes directives de la CEE d’une

part interdisent l’utilisation d’hormones àdes fins non thérapeutiques (88/146/CEE)et imposent d’autre part le contrôle de tou-te une série de substances chez les ani-maux de boucherie (86/469/CEE, 87/410/CEE). La directive 86/469/CEE prévoit, àcôté des prélèvements effectués dans lesabattoirs, l’obligation pour le départementde l’Agriculture de réaliser les prélève-ments en ferme. Les matières fécales re-

présentent l’échantillon de choix pourl’examen des animaux vivants. En effet,les anabolisants deviennent rapidement in-détectables dans le sang après l’arrêt del’administration et le prélèvement d’urineest difficile sans administration de diuréti-

ques surtout chez les mâles. De plus, lesteneurs en résidus restent élevées pluslongtemps dans les fèces que dans les

urines chez les animaux implantés à la

trenbolone (Von Schopper, 1981; Rapp etMeyer, 1985), à l’hexestrol (Heitzman et

al, 1984) et au zéranol (Dixon et al, 1986).A notre connaissance, aucune méthode

de détermination concernant plusieursagents anabolisants dans les fèces n’a été

publiée jusqu’à présent. Les techniquesd’analyse physico-chimique (chromatogra-phie en couche mince, spectrométrie demasse) sont généralement lourdes à

mettre en oeuvre. Nous avons donc choisi

de développer une méthode de dosageimmunologique qui permet l’examen d’ungrand nombre d’échantillons. Afin d’éviterle risque de faux positifs en raison des in-

terférences de la matrice biologique del’échantillon, les extraits ont été purifiés parchromatographie liquide à haute perfor-mance (CLHP) avant leur dosage.

Nous décrivons ici une méthode de dé-termination des résidus de la trenbolone,de la méthyltestostérone et de la nandro-lone (nortestostérone) dans les matièresfécales.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Produits chimiques

Les solvants organiques utilisés pour les extrac-tions et les purifications (acétate d’éthyle, mé-thanol, éther de pétrole (40-60 °C), hexane)étaient tous au moins de grade «pour analyse&dquo;.L’eau et l’acétonitrile utilisés en CLHP ont été

spécialement purifiés pour correspondre au

grade CLHP. Tous les stéroïdes utilisés commesubstances de référence proviennent de chezSteraloids (Wilton, USA). L’a-nortestostéronenous a été offerte par Organon (Dr Kuys, Orga-non, Oss, Netherlands) tandis que les 13- et a-trenbolone sont des dons de Roussel-Uclaf (Ro-mainville, France). La nortestostérone tritiée pro-venait de chez Amersham (Little Clalfond, UK)tandis que la méthyltestostérone et la 17 p-trenbolone tritiées nous ont été fournies par le

Dr Winand (IRE, Fleurus, Belgique) et par le la-boratoire Roussel-Uclaf (Romainville, France)respectivement.

Traitements des échantillons

Préparation

L’échantillon servant à la détermination des va-

leurs témoins a été préparé par mélange desfèces provenant d’une dizaine d’animaux nontraités. Les échantillons enrichis en résidus ont

été obtenus en ajoutant des quantités crois-

santes (0,5, 1, 2, 5 et 10 ng/g fèces) de [3- et a-nortestostérone, de [3- et a-trenbolone et de mé-thyltestostérone au mélange de fèces d’animauxnon traités.

Extraction

Les échantillons de fèces (1 g) ont été mélan-gés à 3 mi d’eau distillée puis homogénéiséspar agitation sur un vortex pendant 1 min. De laméthyltestostérone tritiée (55 Bq) a été ajoutéeà tous les échantillons pour déterminer les

pertes liées aux différentes étapes d’extractionet de purification. Le mélange a ensuite été ex-trait par 2 fois 5 ml d’acétate d’éthyle sur un agi-tateur va-et-vient pendant 20 min. Après centri-fugation et décantation, la phase organique aété évaporée à sec.

Lavage

Le résidu d’extraction a été repris dans un mé-lange méthanol (400 Ill)leau (100 gl) puis lavé 2fois avec 2 ml d’éther de pétrole. Après centrifu-gation, l’éther de pétrole a été décanté par suc-cion et les dernières traces de solvants organi-ques ont été éliminées par évaporation souscourant d’azote.

Précipitation des pigments biliaires

A la solution obtenue après lavage, 1 ml d’hy-droxyde de sodium 1 N a été ajouté. Après agita-tion les pigments biliaires ont été précipités paraddition de 0,7 ml d’acide phosphorique 1 Mcontenant du sulfate ferrique d’ammonium

(53 mM). Les tubes ont alors été laissés 10 minà température ordinaire puis agités vigoureuse-ment, refroidis à 4 °C pendant 10 min puis cen-trifugés (2 100 g) à 4 °C pendant 10 min.

Extraction en phase solide

Le surnageant obtenu après centrifugation a étédéposé sur une colonne disposable phase in-verse C18 de 100 mg (Analytichem Internatio-

nal, Harbor City, CA USA) préalablement équili-brée avec 2 ml de tampon Tris (20 mM pH 8,5).La colonne a été ensuite rincée successivementavec 2 ml d’eau puis lavée avec 1 mi d’un mé-

lange méthanol (0,55 ml)/eau (0,45 ml) et 1 mld’hexane. L’élution des androgènes a été réali-sée par 0,5 ml d’acétate d’éthyle. L’éluat a étéévaporé à sec puis repris par agitation dans300gl d’un mélange acétonitrile (1001il)/eau(200 gl).

Chromatographie liquideà haute performance (CLHP)

Matériel

L’appareil de chromatographie liquide à hauteperformance, Gilson (Middleton, USA) compor-tait les éléments suivants : 2 pompes modèle302, 1 module de pression 802, 1 échantillon-neur automatique modèle 231 et 1 collecteur defraction type 202. L’ensemble était contrôlé parun ordinateur personnel Apple Il E. L’absorptionUV de l’effluent a été mesurée à 254 nm au

moyen d’un détecteur Pharmacia (Uppsala,Suède) type UV2. Les solvants et la colonneétaient thermostatisés par un bain-marie JulaboV et une jaquette de colonne Altex. La colonneutilisée était une Ultrasphere Altex, type ODS 5RP 18 de 4,6 mm de diamètre intérieur et 15 cmde longueur tandis que la pré-colonne consistaiten une guard Pack C 18 de chez Millipore (Bed-ford, USA). Les fioles de l’échantillonneur deforme cônique (Analis Namur, Belgique) peu-vent contenir un volume de 300 J.11.

Conditions opératoires

Les 300 pl d’extrait purifié ont été filtrés au tra-vers d’un filtre (Millipore) de 0,45 J.1m et transfé-rés dans une fiole adaptée à l’injecteur automati-que. Pour réaliser la séparation et la purificationdes principaux androgènes, 150 J.11 ont été injec-tés sur la colonne à une pression de 1 400 psiavec un débit de 1,5 ml/min, à une températurede 20 °C. L’élution isocratique a été réalisée parun mélange acétonitrile/eau 42/58 (v/v). Les dif-férentes fractions ont été récoltées et évaporéesà sec. Le résidu sec a été ensuite redissousdans 1 ml de tampon phosphate 0,01 M pH 7,4contenant 1 g/1 de gélatine et 0,01 % d’azide desodium sous agitation à 37 °C. Le rendementd’extraction et de purification a été déterminépar mesure de la radioactivité contenue dans300 J.11 provenant de la fraction contenant la mé-thyltestostérone.

Dosage radio-immunologique

Réactifs et appareils

Les dosages ont été réalisés en tampon phos-phate-gélatine. La suspension de charbon dex-

tran utilisée pour la séparation des stéroïdeslibres des complexes stéroïdes-anticorps a étépréparée en ajoutant 6 g de charbon actif NoritA (Serva Feinbiochemica, Heidelberg, RFA) et0,6 g de dextran T 70 (Pharmacia, Uppsala,Suède) par litre de tampon phosphate-gélatine.Les anticorps anti-méthyltestostérone, anti-

nortestostérone et anti-trenbolone ont été pré-parés chez les lapins selon la technique de Vai-tukaitis (1971) au Laboratoire d’hormonologieanimale (CER, Marloie, Belgique). Les immuno-gènes utilisés sont indiqués dans le tableau I.

Les mesures de radioactivité ont été effec-

tuées au moyen d’un compteur à scintillation li-

quide (LKB-Rack-Beta, type 12/2).

Méthode

Le dosage radio-immunologique a été effectuésur 50, 100 et 300 ,.11 de chaque fraction purifiéepar chromatographie. Seules les prises d’essaisdont les valeurs correspondaient à la partie laplus précise de la courbe étalon ont été prisesen considération. Afin d’uniformiser le volume

des échantillons à doser, les tubes ne conte-

nant que 50 et 100 yl ont été additionnés res-

pectivement de 250 et 200 pl de tampon phos-phate-gélatine. Une courbe étalon a été établiepour chaque hormone en prélevant 100 J.1I d’unesolution éthanolique contenant des quantitéscroissantes des différentes antigènes ((3-trenbolone, p-nortestostérone et méthyltestosté-rone) soit 7,8, 15,6, 31,25, 62,5, 125, 250, 500,1 000 pg/100 gl. Les 100 ul d’éthanol ont étéévaporés puis le résidu sec a été repris par 300jii de tampon phosphate-gélatine.

Dans tous les tubes des fractions correspon-dant à la p-nortestostérone et à son métabolitel’a-nortestostérone ainsi que dans les tubes cor-

respondants de la courbe étalon ont été ajoutés100 yl (140 Bq) de nortestostérone tritiée et 100wl de l’antisérum adéquat préalablement dilué(sauf dans les tubes qui permettent de détermi-ner la liaison non spécifique et l’activité totale).Les tubes contenant la méthyltestostérone, la

[3-trenbolone et son métabolite l’a-trenboloneont été traités de la même manière en utilisant

l’hormone radioactive et l’antisérum adéquat.Les dilutions de travail des antisérums sont indi-

quées au tableau 1. Les tubes ont été ensuite

sucessivement incubés 30 min à 37 °C, puis 30min à 4 °C, additionnés de 500 wl d’une suspen-sion de charbon dextran à 4°C et enfin centrifu-

gés à 2 100 g pendant 10 min à 4 °C.

Des volumes de 500 III de surnageant ontété prélevés et transférés dans une fiole à scin-tillation liquide contenant 3 ml de liquide scin-tillant (Aqualuma plus).

Calcul des résultats

Pourcentage de récupération (Rec %)

Les valeurs obtenues doivent être corrigées afinde tenir compte du rendement de récupérationdes diverses étapes décrites antérieurement.

avec : Rec = radioactivité (cpm) dans 300 III del’extrait provenant des fractions CLHP; BF =bruit de fond du compteur de radioactivié (cpm);IS = radioactivité totale (cpm) introduite au dé-part (voir rubrique : extraction); 6,66 = facteur decorrection justifié pour une prise d’échantillon de300 wl (x 3,33) et pour une injection de 150 glsur une colonne CLHP (x2).

Radioactivité corrigée

Les valeurs de la fraction contenant le complexeméthyltestostérone-anticorps doivent être corri-gées en tenant compte de la radioactivité rési-duelle présente dans les fractions soumises auxdosages radio-immunologiques. Pour un volumede 300 wl, on a

avec Rad mesurée = radioactivité mesurée

(cpm) par le compteur p pour un échantillon de300 ¡11; TC = activité totale introduite dans tousles tubes pour le dosage radio-immunologique(voir rubrique dosage RIA).

Calcul de la teneur en antigène aumoyen de la courbe de calibration

La quantité (pg) d’antigène présent dans les

tubes soumis à l’analyse radio-immunologique a

été déterminée à partir d’une courbe logit-logpar méthode graphique ou au moyen d’un logi-ciel de calcul sur un micro-ordinateur.

Teneur en résidusdans les matières fécales

Quantité de résidus (pg/g/fèces)= échantillon x 6,66 x 100/Rec %

avec : échantillon = quantité d’hormone (pg)dans les échantillons correspondant à la radio-activité liée aux anticorps selon la courbe de ca-libration; 6,66 = facteur de correction justifiépour une prise d’échantillon de 300 ,.11 (x 3,33) etpour une injection de 150 111 sur une colonneCLHP (x 2).

En tenant compte des recommandations dela CEE (87/410/CEE) les limites de détectiondoivent correspondre «à la moyenne de la te-neur mesurée d’échantillons témoins représen-tatifs (blancs biologiques : n 20) augmentéede 3 fois l’écart type de la moyenne...

RÉSULTATS

Évaluation des méthodes

Séparation des hormonespar chromatographie liquidehaute performance

Les 3 androgènes de synthèse ([3-tren-bolone, p-nortestostérone et méthyltestos-térone) ainsi que certains de leurs métabo-lites (a-trenbolone et a-nortestostérone)ont pu être isolés à partir d’un extrait dematières fécales (fig 1 Les valeurs destemps de rétention et de leur coefficient devariation montrent que la résolution et la

reproductibilité du chromatogramme ont

été suffisantes pour éviter toute confusion

à condition que les périodes de collectessoient respectées (tableau 11). Le rende-ment moyen de récupération a été de

44 ± 7%. Les pertes au cours de la chroma-tographie elle-même ont été inférieures à10% et n’ont pas varié pour les différentesfractions au cours d’un même cycle.

Dosage radio-immunologiquedes hormones

La spécificité des antisérums préparés estindiquée dans le tableau 1. Ces antisérumsont permis de détecter la totalité des hor-mones correspondantes, mais seulementenviron la moitié de leur métabolite. Ladose qui inhibe 50% de la liaison de l’hor-mone marquée à l’antisérum (tableau 1)nous renseigne sur la sensibilité du do-

sage radio-immunologique.

Application au dosage d’hormonesdans les fèces

Les valeurs obtenues sur des échantillonsde matières fécales provenant d’animauxnon dopés sont indiquées dans le tableauIII. A partir de celles-ci nous avons pu cal-culer les limites de détection, à savoir

0,25, 0,23 et 0,32 ng/g de fèces pour la

nortestostérone, la trenbolone et la méthyl-testostérone respectivement. On observeune bonne correspondance entre les quan-tités moyennes d’hormones ajoutées auxéchantillons de matières fécales et les va-leurs moyennes obtenues par dosageradio-immunologique après purification parchromatographie (tableaux IV et V). Parcontre les valeurs obtenues par dosagedes métabolites sont inférieures aux quan-tités de métabolites ajoutées dans les

fèces (tableaux IV et V). Les variationsintra-essais sont relativement faibles.

Quant aux variations inter-essais elles sontnettement plus importantes en raison denombreuses étapes de purification néces-sitées par la complexité de la matrice ana-lysée.

DISCUSSION

Les récentes directives européennes impo-sent l’obligation des contrôles en ferme

pour la recherche des substances à actionhormonale. Les matières fécales consti-tuent de loin le prélèvement le plus facile àréaliser sur l’animal vivant qu’il soit mâleou femelle. La seule méthode qui ait étédécrite pour le dosage radio-immuno-

logique des androgènes anabolisants dansles fèces concerne la trenbolone (VonSchopper, 1981; Rapp et Meyer, 1985).Les dosages radio-immunologiques appli-qués à la détermination des résidus demédicaments vétérinaires dans les ma-

tières fécales des animaux traités sont trèssensibles aux interférences de la matrice

biologique. Une purification poussée desextraits était donc nécessaire avant le do-

sage proprement dit pour éviter les interfé-rences liées aux pigments biliaires et

autres substances responsables des va-leurs élevées du bruit de fond. Le recoursà une purification par CLHP apporte unesolution à cet obstacle. En outre, la col-lecte de fractions, en vue du dosage radio-immunologique, aux temps de rétention

caractéristiques des substances recher-

chées diminue considérablement le risquede «faux positifs» en améliorant l’exacti-

tude de l’analyse. Jansen et ai (1984,1985a, 1985b, 1986) ainsi que Van Den

Berg et ai (1986) préconisent cette mé-thode pour la recherche d’anabolisantsdans l’urine. Plusieurs conditions sont né-

cessaires pour obtenir une méthode sen-sible et fiable :

(i) Le fractionnement chromatographiquedoit être reproductible. Il est donc souhai-table de disposer d’une thermostatisationde l’ensemble du système (colonne et sol-vants) et d’injecter les échantillons au

moyen d’un dispositif automatique.(ii) L’addition d’un standard interne, à sa-voir la méthyltestostérone tritiée permet detenir compte des pertes relativement im-portantes subies au cours des différentesopérations d’extraction et de purification etde corriger les résultats en conséquence.La méthyltestostérone a été choisie parce

qu’elle était éluée de la colonne en dernierlieu et que les «résidus» de méthyltestos-térone dans les fèces de bovins sont es-sentiellement constitués de la méthyltes-tostérone elle-même et non d’un mélangede le molécule mère et d’un ou plusieursmétabolites comme c’est le cas pour la

#-trenbolone et la P-nortestostérone. Cetteobservation justifie l’usage d’un seul stan-dard interne : la méthyltestostérone tritiée.

La méthode décrite dans cet article per-met de séparer et de doser simultanément3 androgènes fréquemment utilisés en en-graissement des bovins : la nortestosté-

rone ou nandrolone, la trenbolone et la

méthyltestostérone. Le dosage des frac-tions contenant les métabolites est égale-ment important à réaliser car c’est souscette forme qu’est éliminé l’essentiel del’hormone chez un animal traité. Cepen-dant les valeurs obtenues dans ce cas

sont sous-estimées du fait des réactions

incomplètes des antisérums avec les mé-tabolites. Pour l’a-nortestostérone et l’a-

trenbolone les valeurs trouvées représen-tent environ 50% de la quantité introduiteau départ dans le mélange de matières fé-cales provenant d’animaux non dopés.

L’intérêt du dosage radioimmunologiqueréside dans sa grande sensibilité ainsi que

dans la possibilité d’analyser un nombreimportant d’échantillons. Les autres mé-thodes de détection (chromatographie surcouche mince ou en phase gazeuse et

spectrométrie de masse) sont beaucoupplus lourdes à mettre en oeuvre et devrontêtre réservées pour la confirmation. Un

analyste entraîné peut effectuer un maxi-mum de 50 échantillons par semaine.

Pour la nortestostérone, la méthyltes-tostérone et la trenbolone les limites dedétection estimées à 0,2-0,3 ng/g defèces sont bien inférieures à la limite re-

quise de 0,5 ng/g fixée pour les matièresfécales (Meyer et Hoffmann, 1987). La li-mite de décision devra bien entendu êtrefixée en fonction des méthodes de confir-mation qui seront appliquées aux échan-tillons de matières fécales.

REMERCIEMENTS

Nous remercions la firme Roussel-Uclaf (Ro-mainville, France) pour nous avoir offert la tren-bolone et sa forme tritiée, Dr Winand (IRE Fleu-rus, Belgique) pour la méthyltestostérone tritiéeainsi que Dr Kuys (Organon Oss, Nederlands)pour les métabolites de la nortestostérone.Nous remercions également Messieurs H Del-fosse et Ch Lagasse pour leur précieuse colla-boration technique.

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