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DPI O'Donnell

Date post: 06-Apr-2018
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  • 8/3/2019 DPI O'Donnell

    1/9

    J . ( 1 9 9 3 ) 2 9 0 , 4 1 - 4 9 ( P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n )

    o n t h e i n h i b i t o r y m e c h a n i s m o f i o d o n i u m c o m p o u n d ss p e c i a l r e f e r e n c e t o n e u t r o p h i l N A D P H o x i d a s eB . O ' D O N N E L L , * $ D a v i d G . T E W , t O w e n T . G . J O N E S * a n d P a u l J . E N G L A N D t

    o f B i o c h e m i s t r y , S c h o o l o f M e d i c a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f B r i s t o l , B r i s t o l B S 8 l T D , U . K . ,n d t S m i t h K l i n e B e e c h a m P h a r m a c e u t i c a l s , T h e F r y t h e , W e l w y n , H e r t s . A L 6 9 A R , U . K .

    ( D P I ) a n d i t s a n a l o g u e s h a v e b e e n p r e -s h o w n t o r e a c t v i a a r a d i c a l m e c h a n i s m w h e r e b y a ni s a b s t r a c t e d f r o m a n u c l e o p h i l e t o f o r m a r a d i c a l , w h i c ha d d s b a c k t o t h e n u c l e o p h i l e t o f o r m c o v a l e n t a d d u c t s( 1 9 6 6 ) C h e m . R e v . 6 6 , 2 4 3 - 2 6 6 ] . We p r o p o s e t h a t t h eo f n e u t r o p h i l NADPH o x i d a s e b y DP I o c c u r s v i a am e c h a n i s m . A r e d u c e d r e d ox c e n t r e i n t h e o x i d a s e c o u l dr v e a s e l e c t r o n d o n o r t o D P I , a n d i n h i b i t i o n w o u l d o c c u r a f t e rp h e n y l a t i o n o f t h e r e d o x c o f a c t o r , o r o f a d j a c e n t a m i n o

    g r o u p s b y t h e DPI r a d i c a l . I n t h e a b s e n c e o f a n a c t i v a t o r yh u m a n n e u t r o p h i l N A D P H - o x i d a s e w a s n o t i n h i b i t e dy D P I . T h e K 1 f o r t i m e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o n b y DPI o f humanm e m b r a n e NADPH o x i d a s e w a s f o u n d t o b e 5 . 6 , u M .

    oxygen s p e c i e s s u c h a s s u p e r o x i d e , H 2 0 2 a n d h y d r o x y lf o r m e d b y n e u t r o p h i l s p l a y a p r i m a r y r o l e i n h o s ta g a i n s t d i s e a s e ( B a b i o r , 1 9 7 8 ) . T h e y are a l s o i m p l i c a t e dn t h e p a t h o g e n e s i s o f many d i s e a s e s t a t e s , e . g . r h e u m a t o i di s c h a e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y a n d a c u t e r e s p i r a t o r ys y n d r o m e ( H a l l i w e l l , 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e t h e r e i s g r e a ti n t h e d e v e l o p m e n t o f m e t h o d s f o r c o n t r o l o f t h e i r

    T h e enzyme r e s p o n s i b l e f o r n e u t r o p h i l - d e r i v e d o x y g e n - r a d i c a li s a m e m b r a n e - b o u n d NADPH o x i d a s e w h i c h c a t a -t h e o n e - e l e c t r o n r e d u c t i o n o f oxygen t o s u p r o x i d e . O t h e rt i v e s p e c i e s a re f o r m e d a s a r e s u l t o f d i s m u t a t i o n a n d b yo f o t h e r enzymes, s u c h a s m y e l o p e r o x i d a s e . N e u t r o p h i lo x i d a s e i s an enzyme c o m p l e x w i t h FAD a n d l o w -c y t o c h r o m e b as r e d o x c e n t r e s , p o s s i b l y c o n t a i n e d on

    e p r o t e i n s u b u n i t ( S e g a l e t a l . , 1 9 9 2 ) , a l o n g w i t h o t h e ra n d c y t o s o l i c p r o t e i n s ( S m i t h a n d C u r n u t t e ,E l e c t r o n s a re d o n a t e d f r o m NADPH t o t h e c y t o c h r o m ei a FAD a n d u l t i m a t e l y r e d u c e oxygen t o f o r m s u p e r o x i d e& J o n e s , 1 9 9 1 ) , a s s h o w n i n S c h e m e 1 .I n t h e p r e s e n t paper we d e s c r i b e i n v e s t i g a t i o n s on t h e mode o fo f a group o f i o d o n i u m c o m p o u n d s w h i c h d i r e c t l y i n h i b i t

    o x i d a s e a c t i v i t y , l e a d i n g t o a t i m e - d e p e n d e n t i n h i b i t i o nf s u p e r ox i d e p r o d u c t i o n ( C r o s s a n d J o n e s , 1 9 8 6 ) . l o d o n i u mi n h i b i t t h e a c t i v i t y o f a v a r i e t y o f f l a v o p r o t e i n s a n dt l e a s t on e haem p r o t e i n . D i p h e ny l e n e i od o n i u m ( D PI ) causesi n h i b i t i o n o f m i t o c h o n d r i a l NADH d e h y d r o -( R a g a n a n d B l o x h a m , 1 9 7 7 ) , w h e r e a s i t s a n a l o g u e d i -( I D P ) h a s b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t NO s y n t h a s ef m a c r o p h a g e s ( S t u e h r e t a l . , 1 9 9 1 ) , b a c t e r i a l n i c o t i n e o x i d a s ea n d B i c h l e r , 1 9 8 7 ) , x a n t h i n e o x i d a s e ( V . B . O ' D o n n e l l ,

    I n h i b i t o r y p o t e n c y o f DPI w a s s h o w n t o b e d i r e c t l y r e l a t e d t or a t e o f e n z y m e t u r n o v e r , i n d i c a t i n g t h e n e e d f o r a r e d u c e d r e d o xc e n t r e . A d d u c t s w e r e f o r m e d b e t w e e n p h o t o r e d u c e d f l a v i n (FADo r FMN) a n d i n h i b i t o r ( D P I o r d i p h e n y l i o d o n i u m ) . T h e s e w e r es e p a r a t e d b y h . p . l . c . a n d c h a r a c t e r i z e d b y a b s o r b a n c e s p e c -t r o s c o p y , ' H - n . m . r . a n d f a s t - a t o m - b o m b a r d m e n t m . s . a n d f o u n dt o h a v e p r o p e r t i e s c o n s i s t e n t w i t h s u b s t i t u t e d 4 a , 5 - d i h y d r o -f l a v i n s . A f t e r i n c u b a t i o n o f p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e s w i t h D P I ,t h e q u a t t i t y o f r e c o v e r a b l e i n t a c t f l a v i n w a s g r e a t l y d i m i n i s h e d 'w h e n NADPH w a s p r e s e n t t o i n i t i a t e o x i d a s e t u r n o v e r , i n d i c a t i n gt h a t t h e f l a v i n may b e t h e s i t e o f DPI - a c t i v a t i o n . T h e s e r e s u l t smay p r o v i d e a common m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r i o d o n i u mc o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s o f o t h e r f l a v o e n z y m e s .

    u n p u b l i s h e d w o r k ; D o u s s i e r e a n d V i g n a i s , 1 9 9 2 ) a n d c y t o c h r o m eP - 4 5 0 r e d u c t a s e ( D . G . T e w , u n p u b l i s h e d w o r k ) . B a t t i o n i e t a l . ,( 1 9 8 8 ) s h o w e d t h a t ID P c a n i n t e r a c t w i t h r e d u c e d c y t o c h r o m eP - 4 5 0 , l e a d i n g t o s p e c t r a l c h a n g e s s t r o n g l y s u g g e s t i v e o f c o v a l e n tm o d i f i c a t i o n o f t h e h a e m p r o s t h e t i c g r o u p .l o d o n i u m h a l i d e s a r e p o t e n t a r y l a t i n g a g e n t s ( t h e y m e d i a t ea d d i t i o n o f p h e n y l r i n g s ) , u n d e r g o t h e r m a l a n d p h o t o c h e m i c a lc l e a v a g e u n d e r r e l a t i v e l y m i l d c o n d i t i o n s a n d r e a c t r e a d i l y w i t ho r g a n o m e t a l l i c c o m p o u n d s ( B a n k s , 1 9 6 6 ) . A r y l a t i o n o f n u c l e o -p h i l e s b y i o d o n i u m c o m p o u n d s h a s b e e n p r o p o s e d ( B a n k s , 1 9 6 6 )t o o c c u r b y a r a d i c a l m e c h a n i s m , w h e r e b y t h e i n h i b i t o r a b s t r a c t sa n e l e c t r o n f r o m t h e n u c l e o p h i l e t o f o r m a r a d i c a l w h i c h t h e n c a na d d o n t o t h e d o n o r m o l e c u l e f o r m i n g p h e n y l a t e d p r o d u c t s . A ss h o w n i n F i g u r e 1 , r a d i c a l f o r m a t i o n f r o m I D P i s a s s o c i a t e d w i t ha s p l i t t i n g o f t h e m o l e c u l e t o g i v e a p h e n y l r a d i c a l a n d t h e l o s so f i o d o b e n z e n e i n s o l u t i o n . I n c o n t r a s t , d u e t o t h e p r e s e n c e o f a ne x t r a c r o s s - b r i d g e , DPI f o r m s a n i n t a c t r a d i c a l ( B e r i n g e r e t a l . ,1 9 5 8 ) . P r e v i o u s s t u d i e s i n t h i s l a b o r a t o r y h a v e s h o w n t h a t DPIi n h i b i t s NADPH o x i d a s e o f b o t h p i g ( C r o s s a n d J o n e s , 1 9 8 6 ;C r o s s , 1 9 8 7 ) a n d human ( E l l i s e t a l . , 1 9 8 8 ) n e u t r o p h i l s a n d r a tp e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s ( H a n c o c k a n d J o n e s , 1 9 8 7 ) . C r o s s a n dJ o n e s ( 1 9 8 6 ) s h o w e d t h a t w h e n D P I w a s a d d e d t o NADPHo x i d a s e d u r i n g t u r n o v e r t h e r e w a s a l o s s o f r e d u c t i o n o f b o t hf l a v i n a n d c y t o c h r o m e b , a c c o m p a n i e d b y l a b e l l i n g b y D P I o f a4 5 kD a p r o t e i n . T h i s s u g g e s t e d t h a t t h e f l a v i n w a s t h e s i t e o fa t t a c k a n d t h a t 4 5 kDa p r o t e i n w a s a s s o c i a t e d w i t h FAD.I n t h i s p a p e r we d e s c r i b e a n i n v e s t i g a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n s o fb o t h DPI a n d I DP w i t h f r e e f l a v i n s i n a q u e o u s s o l u t i o n , s h o w i n gt h e p r o d u c t i o n o f c o v a l e n t a d d u c t s . T h e f o r m a t i o n o f t h e s ea d d u c t s w a s s h o w n t o b e d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f r e d u c e df l a v i n . We d e s c r i b e k i n e t i c s o f i n h i b i t i o n o f N A D P H / o x i d a s e b yDPI w h i c h i n d i c a t e t h e m e c h a n i s m o f i n h i b i t i o n t o b e s i m i l a r t ot h e i n t e r a c t i o n s o b s e r v e d w i t h f r e e f l a v i n s . We a l s o s h o w t h a t DPI

    A b b r e v i a t i o n s u s e d : P M A , p h o r b o l 1 2 - m y r i s t a t e 1 3 - a c e t a t e ; I D P , d i p h e n y l i o d o n i u m ; D P I , d i p h e n y l e n e i o d o n i u m ; f . a . b . - m . s . , f a s t - a t o m - b o m b a r d m e n tt T o w hom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d .

    4 1

  • 8/3/2019 DPI O'Donnell

    2/9

    4 2 V . B . O ' D o n n e l l a n d o t h e r sNADPH 0 .NADH) FA D CYT b

    NADP+ 0 2+ H +S c h e m e 1 S u g g e s t e d a r r a n g e m e n t o f e l e c t r o n c a r r i e r s i n n e u t r o p h i lN A D P H o x i d a s eA b b r e v i a t i o n : C Y T , c y t o c h r o m e .

    ( a )1 .

    + e

    P h e n y l l o d o b e n z e n er a d i c a l Q . +l\\v A r y l a t i o n o fn u c l e o p h i l e s

    P r o t o na b s t r a c t i o n

    D o u b l e - b o n d a d d i t i o n

    ( b )(>) + e ~

    i P h e n y lI [- r a d i c a l| \Arylation o fn u c l e o p h i l e s

    P r o t o na b s t r a c t i o n

    D o u b l e - b o n d a d d i t i o nF i g u r e 1 R e a c t i o n p a t h w a y s o f ( a ) I D P a n d ( b ) D P I

    t r e a t m e n t o f NADPH o x i d a s e d u r i n g t u r n o v e r l e a d s t o l o s s o fr e c o v e r a b l e FAD. F o l l o w i n g t h i s s t u d y o n t h e r e a c t i v i t y o fi o d o n i u m c o m p o u n d s t o w a r d s f r e e f l a v i n s a n d NADPH o x i d a s e ,we p o s t u l a t e a m e c h a n i s m o f a c t i o n w h e r e b y t h e i n h i b i t o ra b s t r a c t s a n e l e c t r o n f r o m t h e r e d u c e d r e d o x c e n t r e t o f o r m ar a d i c a l , w h i c h t h e n a d d s b a c k d i r e c t l y o n t o t h e p r o s t h e t i c g r o u po r a d j a c e n t p r o t e i n g r o u p s i n o r n e a r t h e a c t i v e s i t e t o f o r ma d d u c t s .M E T H O D S A N D M A T E R I A L SM a t e r i a l sDPI s u l p h a t e w a s a g i f t f r o m M r . T . R e i d o f t h e D e p a r t m e n t o fB i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f B r i s t o l . I t w a s d i s s o l v e d i n d i m e t h y ls u l p h o x i d e t o g i v e a 1 0 mM s t o c k s o l u t i o n . [ 1 2 5 1 ] D P I w a ss y n t h e s i z e d a s d e s c r i b e d b y G a t l e y a n d S h e r r a t t ( 1 9 7 6 ) . N a - ' 2 5 1w a s o b t a i n e d f r o m A m e r s h a m I n t e r n a t i o n a l , A m e r s h a m ,B u c k s . , U . K . ID P w a s o b t a i n e d f r o m F l u k a C h e m i c a A . G . ,B u c h s , S w i t z e r l a n d . F A D a n d FMN w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m aC h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , MO 6 3 1 7 8 , U . S . A .P r e p a r a t i o n o f n e u t r o p h i l s a n d a c t i v a t e d n e u t r o p h i l m e m b r a n e sH u m a n n e u t r o p h i l s w e r e i s o l a t e d f r o m b u f f y c o a t s o b t a i n e df r o m t h e S o u t h W e s t R e g i o n a l B l o o d T r a n s f u s i o n S e r v i c e ,S o u t h m e a d H o s p i t a l , a s d e s c r i b e d b y S e g a l a n d J o n e s ( 1 9 7 9 ) . P i gn e u t r o p h i l s w e r e i s o l a t e d f r o m w h o l e p i g b l o o d o b t a i n e d f r o mt h e l o c a l a b b a t o i r , a s d e s c r i b e d b y C r o s s e t a l . ( 1 9 8 4 ) . A c t i v a t e dm e m b r a n e s f r o m p h o r b o l m y r i s t a t e a c e t a t e ( P M A ) - t r e a t e dn e u t r o p h i l s ( 1 , u g / m l ) w e r e p r e p a r e d b y n i t r o g e n c a v i t a t i o n a n dd i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n a n d w e r e r e s u s p e n d e d i n p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) ( 1 3 7 mM N a C l / 2 . 6 8 mM K C I / 8 . 1 mMN a 2 H P O 4 / 1 . 4 7 mM K H 2 P O 4 ) b e f o r e a s s a y ( C r o s s e t a l . , 1 9 8 5 ) .A l t h o u g h human n e u t r o p h i l m e m b r a n e s w e r e u s e d f o r moste x p e r i m e n t s , i t w a s n e c e s s a r y t o u s e p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e sw h e r e g r e a t e r e n z y m e c o n c e n t r a t i o n s w e r e n e e d e d .

    D e t e r m i n a t i o n o f s u p e r o x i d e p r o d u c t i o nN A D P H - d e p e n d e n t s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d a st h e s u p e r o x i d e d i s m u t a s e - s e n s i t i v e r a t e o f r e d u c t i o n o f c y t o -c h r o m e c , a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y C r o s s e t a l . ( 1 9 8 2 ) . T h ei n c u b a t i o n m i x t u r e f o r a s s a y o f i s o l a t e d m e m b r a n e s c o n s i s t e d o f5 0 4 u g o f m e m b r a n e p r o t e i n , 1 0 0 , u M h o r s e h e a r t c y t o c h r o m e c( S i g m a t y p e I I I ) a n d 5 0 0 , u M NADPH i n 1 m l o f P B S , pH 7 . 4 , a t2 0 ' C . W h o l e n e u t r o p h i l s u p e r o x i d e p r o d u c t i o n w a s d e te r m i n e da f t e r a d d i t i o n o f PMA t o t h e a s s a y c u v e t t e , w h i c h c o n t a i n e d4 . 8 x 1 0 6 c e l l s a n d 1 0 0 , u M c y t o c h r o m e c i n 1 m l o f K r e b s - R i n g e rb u f f e r , a t 3 7 ' C ( C r o s s e t a l . , 1 9 8 4 ) . S u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( 3 7 5u n i t s ) w a s a d d e d a t e n d o f t h e a s s a y t o e s t a b l i s h t h e s u p e r o x i d e -d e p e n d e n t r a t e o f c y t o c h r o m e c r e d u c t i o n . T h e k i n e t i c s o fi n h i b i t i o n o f human n e u t r o p h i l m e m b r a n e NADPH o x i d a s e w e r ed e t e r m i n e d b y u s i n g E n z f i t t e r ( R . J . L e a t h e r b a r r o w , E l s e v i e r -B i o s o f t , 1 9 8 7 ) . DPI ( 1 - 2 5 , u M ) w a s p r e s e n t i n t h e a s s a y m i x t u r eb e f o r e a c t i v i t y w a s i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f a c t i v a t e d mem-b r a n e s .T h e e f f e c t s o f DPI o n NADPH o x i d a s e i n t h e a b s e n c e o fe n z y m e t u r n o v e r w e r e i n v e s t i g a t e d b y p r e i n c u b a t i n g w h o l en e u t r o p h i l s i n DPI ( 1 - 1 0lM) i n t h e a b s e n c e o f PMA ( 3 7 ' C ,5 m i n ) . N e u t r o p h i l NADPH o x i d a s e a c t i v i t y w a s a s s a y e d a f t e rd i l u t i n g t h e s u s p e n s i o n b y a d d i n g 2 0 , u l o f i n c u b a t i o n m i x t u r e t o1 m l o f 1 0 0 , t M c y t o c h r o m e c i n K r e b s - R i n g e r b u f f e r , pH 7 . 4( C r o s s e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e c e l l s w e r e a c t i v a t e d b y u s i n g PMA.L a b e l l i n g o f p r o t e i n s w i t h [ 1 2 5 1 ] D P IP M A - a c t i v a t e d human n e u t r o p h i l m e m b r a n e s w e r e s o l u b i l i z e da s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( C r o s s e t a l . , 1 9 8 5 ) . S a m p l e s ( 4 0 , u 1 ;1 2 0 , g o f p r o t e i n ) o f s o l u b i l i z e d e n z y m e w e r e i nc u b a t e d f o r5 m i n a t 3 7 C o r 4 C r e s p e c t i v e l y i n t h e p r e s e n c e o f [ 1 2 5 I ] D P Iw i t h o r w i t h o u t a c t i v a t i o n o f NADPH o x i d a s e t u r n o v e r ( 2 mMNADPH). A f t e r i n c u b a t i o n , 1 0 mM u n l a b e l l e d DP I w a s a d d e dt o b l o c k p r o t e i n r e a c t i o n w i t h r a d i o a c t i v e D PI d u r i n g t h ep r o c e d u r e s f o r SDS/PAGE.S D S / P A G ES a m p l e s w e r e s o l u b i l i z e d i n SDS b u f f e r a n d s e p a r a t e d b ye l e c t r o p h o r e s i s o n 1 2 O % ( w / v ) - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l s i n t h eL a e m m l i ( 1 9 7 0 ) s y s t e m o f b u f f e r s . G e l s w e r e f i x e d i n 2 0 % ( v / v )m e t h a n o l / 5 % ( v / v ) g l y c e r o l f o r 3 0 m i n a n d d r i e d a t 8 0 C f o r2 h . D r i e d g e l s w e r e a u t o r a d i o g r a p h e d a g a i n s t f l a s h e d F u j i - R xf i i m f o r 1 w e e k a t - 8 0 C . A f t e r a u t o r a d i o g r a p h y t h e g e l s w e r er e h y d r a t e d a n d s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e .A n a e r o b i c p h o t o r e d u c t i o n o f f l a v i n sFAD ( 8 5 , u M ) i n P B S , pH 7 . 4 a t 2 0 C , w a s d e o x y g e n a t e d i n as t o p p e r e d 3 m l c u v e t t e b y f l u s h i n g w i t h o x y g e n - f r e e a r g o n f o r1 5 m i n b e f o r e a n d d u r i n g a s s a y . E D T A a n d ID P w e r e s i m i l a r l yd e o x y g e n a t e d b e f o r e u s e ( M e r k e l a n d N i c k e r s o n , 1 9 5 4 ) . A d d i -t i o n s t o t h e a n a e r o b i c c u v e t t e w e r e m a d e w i t h a g a s - t i g h t S G Es y r i n g e w h i c h h a d b e e n f l u s h e d w i t h a r g o n b e f o r e u s e , t o m a i n t a i na n a e r o b i o s i s . FAD ( 8 5 , u M ) r e d u c t i o n t o a p p r o x . 1 0 % wasa c h i e v e d b y a d d i t i o n o f E D T A ( 1 mM. f i n a l c o n c n . ) t o t h ec u v e t t e a n d s u b s e q u e n t i l l u m i n a t i o n b y a 1 . 0 kW t u n g s t e n -f i l a m e n t l a m p f o r 1 0 s . T h e c u v e t t e was p l a c e d i n a w a t e r b a t hd u r i n g i l l u m i n a t i o n t o p r e v e n t h e a t i n g . R e d u c t i o n o f f l a v i n wa sm o n i t o r e d b y s c a n n i n g b e t w e e n 3 0 0 a n d 5 0 0 nm a n d u s i n gAA4so0= 1 I . 3 mM-1 c m - ' . Maximum r e o x y g e n a t i o n wa sm e d i a t e d b y f l u s h i n g t h e c u v e t t e w i t h a i r . P e r c e n t a g e r e o x i d a t i o nw a s c a l c u l a t e d a s p e r c e n t a g e o f r e d u c e d FAD r e c o v e r e d onr e o x y g e n a t i o n .

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    l o d o n i u m c o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s o f n e u t r o p h i l N A D P H o x i d a s e 4 3o f p r o t e i n c o n t e n t

    n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n was d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f( 1 9 7 6 ) .

    o f f l a v i n a n d c y t o c h r o m e b c o n t e n t o f N A D P Hp r e p a r a t i o n swer e a s s a y e d b y o x i d i z e d - m i n u s - r e d u c e d d i f f e r e n c e spec-b y u s i n g A A 4 5 0 5 0 0 =11.3 mM-1 c m - ' . C y t o c h r o m e

    was d e t e r m i n e d f r o m r e d u c e d - m i n u s - o x i d i z e d d i f f e r e n c eb y u s i n g A A 5 5 9 5 4 0 =2 1 . 6 mM-1 * c m - ' ( C r o s s e t a l . , 1 9 8 2 ) .

    o f f l a v i n a d d u c t sa d d u c t s wer e s e p a r a t e d on e i t h e r a C 8 ( B e c k m a n ;. 6 mmx 15 c m ) or a C 1 8 ( H i c h r o m ; 5 mmx 2 0 c m ) h . p . l . c .u s i n g a w a t e r ( M i l l i - Q ) t o m e t h a n o l ( h . p . l . c . g r a d e )( 0 - 1 0 0 %) over 2 0 m i n ( f l o w r a t e 1 m l / m i n ) w i t h 2 0 mMa c e t a t e ( A n a l a R ) a s b u f f e r a n d i o n - p a i r i n g a g e n t ; 1 m lwer e c o l l e c t e d f o r a n a l y s i s . T h e h . p . l . c . s y s t e m c o n s i s t e d

    f a n LDC G r a d i e n t M a s t e r a n d C o n s t a m e t r i c p u m p s , a 2 5 0 , u li n j e c t i o n l o o p , C e c i l I n s t r u m e n t s u . v . - d e t e c t i o n m o n i -o r a n d LKB 1 c h a n n e l r e c o r d e r . A b s o r b a n c e was m o n i t o r e d a t2 5 nm. S a m p l e s were t h e n p o o l e d a n d f r e e z e - d r i e d b e f o r e b e i n gi n M i l l i - Q w a t e r f o r r e m o v a l o f s o d i u m a c e t a t e b y

    ( c o n d i t i o n s a s b e f o r e b u t w i t h o u t s o d i u m a c e t a t e ) . F a s t -s p e c t r o s c o p y ( f . a . b . - m . s . ) was k i n d l y per-b y D r . N . H a s k i n s a t S m i t h K l i n e B e e c h a m , The F r y t h e ,G a r d e n C i t y , H e r t s . , U . K . ' H - n . m . r . ( 5 0 0 MHz) wasi n 2H20 ( r e f e r e n c e H 2 0 ) b y D r . G . B l o o m b e r g a n dr . M. M u r r a y a t t h e M o l e c u l a r R e c o g n i t i o n C e n t r e , U n i v e r s i t y

    f B r i s t o l , B r i s t o l B S 8 I T D , U . K .

    o f f l a v i n f r o m p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e sw e re e x t r a c t e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o fa n d S i e g e l ( 1 9 7 3 ) . B r i e f l y , s a m p l e s o f p i g n e u t r o p h i li s o l a t e d as d e s c r i b e d a b o v e ( 1 . 4 5 mg o f p r o t e i n i n. 5 m l o f P B S , i n d u p l i c a t e ) w e re i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 2 0 C

    or w i t h o u t NADPH ( 9 0 0 , u M ) a n d D P I ( 5 0 , u M or 5 0 0 4 a M ) .were t h e n b o i l e d i n f o i l - c o v e r e d g l a s s t u b e s f o r 1 0 m i n . Anv o l u m e o f 0 . 3 M HC104 was a d d e d , a n d s a m p l e s were

    a t 2 0 0 0 0 0 g f o r 2 h t o remove p r e c i p i t a t e d p r o t e i n .t h i s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f HC104 was r a i s e d t o 1 M b y t h eo f 1 1 8 , I l o f 7 . 2 MH C 1 0 4 s t o c k t o t h e s u p e r n a t a n t s , a n d

    h e s a m p l e s were b o i l e d f o r 1 0 m i n t o f a c i l i t a t e c o n v e r s i o n o fi n t o FMN ( C h a p p e l l e a n d P i c c i o l o , 1 9 7 1 ) . Th e pH o f t h ewas r a i s e d t o 7 . 7 b y a d d i t i o n o f s m a l l v o l u m e s o f( 1 0 M ) . F l u o r e s c e n c e s p e c t r a were r e c o r d e d w i t h aLS5B s c a n n i n g f l u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t e r .

    was m o n i t o r e d a t 5 2 5 nm w i t h e x c i t a t i o n a t 4 5 0 nm.s a m p l e s o f FMN ( 4 0 , u M ) w e re t r e a t e d s i m i l a r l y i n o r d e r

    o d e t e c t a n y d e g r a d a t i o n o f f l a v i n b y t h i s m e t h o d .

    e x p e r i m e n t sn w h o l e r e s t i n g n e u t r o p h i l s , p r e i n c u b a t i o n w i t h D P I had a l m o s t

    i n h i b i t o r y e f f e c t on s u b s e q u e n t P M A - s t i m u l a t e d a c t i v i t y .2 s h o w s p e r c e n t a g e o f i n i t i a l a c t i v i t y r e m a i n i n g a f t e r

    w h o l e n e u t r o p h i l s w e r e p r e i nc u ba t e d f o r 5 m i n a t 3 7 C w i t hv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f DPI o r b u f f e r . DPI w a s d i l u t e d o u tb e f o r e PMA s t i m u l a t i o n o f t h e c e l l s . T h e s t r o n g i n h i b i t o r y e f f e c to f D PI a d d e d a f t e r PMA s t i m u l a t i o n i s s h o w n .I n h i b i t i o n k i n e t i c sA t s a t u r a t i n g [ N A D P H ] , t h e i n h i b i t i o n o f NADPH o x i d a s e i ni s o l a t e d human n e u t r o p h i l m e m b r a n e s b y DPI i s c l e a r l y b o t ht i m e - d e p e n d e n t a n d c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t ( F i g u r e 3 ) a n dc l o s e l y r e s e m b l e s t h e i n h i b i t i o n o f m i t o c h o n d r i a l N A D H - u b i q u i -n o n e r e d u c t a s e b y DPI d e s c r i b e d b y R a g a n a n d B l o x h a m ( 1 9 7 7 ) .F o r a n i r r e v e r s i b l e e n z y m e - i n a c t i v a t i o n p r o c e s s , t h e r a t e o fe n z y m e i n h i b i t i o n ( k ) c a n b e s h o w n t o b e g i v e n b y

    ' ak = -dE/dt+e - k lw h e r e E i s a c t i v e e n z y m e c o n c e n t r a t i o n . T h u s f o r a r e a c t i o n

    S 8 0' 6 00m 4 00 2 0

    0 2 4 6 8 1 0 1 2[ D P I J ( / I M )

    F i g u r e 2 D P I i n h i b i t i o n o f N A D P H o x i d a s e i s l e s s e f f e c t i v e w h e n o x i d a s ei s n o t t u r n i n g o v e rD P I w a s a d d e d t o P M A - a c t i v a t e d w h o l e n e u t r o p h i l s ( 4 . 8 x 1 0 6 c e l l s i n 1 m l o f c y t o c h r o m ec i n K r e b s b u f f e r ) a t 3 7 C ( ) , o r D P I w a s a d d e d f o r 5 m i n ( 4 . 8 x 1 0 6 c e l l s i n 2 0 , u 1 o fK r e b s b u f f e r ) a n d t h e n d i l u t e d o u t b e f o r e P M A a c t i v a t i o n a n d a s s a y a s d e s c r i b e d i n t h eM a t e r i a l s a n d m e t h o d s s e c t i o n ( - - - - ) . S u p e r o x i d e g e n e r a t i o n w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i nt h e M e t h o d s a n d m a t e r i a l s s e c t i o n .

    10

    - 1 0 -.

    0c0p(Uc4a)

    x00-a zQ

    5 0 1 0 0 1 5 0T i m e ( s )

    F i g u r e 3 I n h i b i t i o n o f NADPH o x i d a s e a c t i v i t y b y D P IS u p e r o x i d e g e n e r a t i o n b y d i s r u p t e d h u m a n n e u t r o p h i l m e m b r a n e s w a s m e a s u r e d a s d e s c r i b e di n t h e M e t h o d s a n d m a t e r i a l s s e c t i o n i n t h e a b s e n c e ( O ) a n d p r e s e n c e o f D P I : A, 0 . 5 , u M ;0, 1 . 0 u M ; * , 5 , u M ; U, O 1,M; A, 2 0 , t M ; 0, 2 5 1M. T o e a c h a s s a y 5 0 1 s g o fm e m b r a n e p r o t e i n w a s a d d e d ( p H 7 . 4 , 2 0 C ) .

    IAA ~~~~AI'F

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    44 V . B . O ' D o n n e l l a n d o t h e r s0 . 0 1 2

    0 . 0 1 0

    0 . 0 0 8Ilc )c oL - 0 . 0 0 60. 00-0 . 0 0 4

    0 . 0 0 2 [7 .[ I 0 2 00

    1 0 ( I N A0 5 1 0[ D P I I ( y M )

    F i g u r e 4 I n h i b i t l o n o f N A D P H o x i d a s e b y D P I : c a l c tI n h i b i t i o n r a t e ( k ) i s d e r i v e d f r o m t h e r a t e o f d e c r e a s e i n s u p e r o x i d io f e n z y m e ( 6 . 2 j / l g o f m e m b r a n e p r o t e i n ) t o t h e a s s a y m i x t u r e . D Pb e f o r e e n z y m e . A s s a y w a s p e r f o r m e d a t p H 7 . 4 , 2 0 ' C . k = k . , [ 1 ] /s e c t i o n f o r m o r e d e t a i l s . I n s e r t : e f f e c t o f [ N A D P H ] o n i n h i b i t i o n O lI n h i b i t i o n r a t e w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d f o r t h e m a i n F i g u r e . [ D F( 5 . 6 , u M ) , w h e r e a s [ N A D P H ] w a s v a r i e d a r o u n d K m . N o t e : m a xd o u b l e t h a t o b s e r v e d w h e n [ N A D P H ] = 5 0 j u M ( K m ) . S e e t h e t e x t

    o r r e m a i n i n g u n c h a n g e d ) c a n o n l y b e a c c ou n te d f o r i f DPI i s , a tl e a s t q u a l i t a t i v e l y , u n c o m p e t i t i v e w i t h r e s p e c t t o NADPH. T h i ss t r o n g l y s u g g e s t s t h a t DPI r e a c t s w i t h r e d u c e d NADPH o x i d a s eo n l y . T h i s r e s u l t w a s i n c o n t r a s t w i t h t h o s e p r e v i o u s l y r e p o r t e d( C r o s s a n d J o n e s , 1 9 8 6 ) , w h e r e a l e s s d i r e c t a s s a y w a s u s e d ,i n v o l v i n g t h e r e a c t i o n s o f l a b e l l e d DP I a n d o x i d a s e , f o l l o w e d b ySDS/PAGE ( s e e b e l o w ) .R e a c t i o n s o f f l a v i n a n d l o d o n i u m c o m p o u n d s m o n i t o r e d b ya n a e r o b i c s p e c t r o s c o p yW h e r e l a r g e q u a n t i t i e s o f i n h i b i t o r w e r e n e c e s s a r y , ID P w a su s e d , a s t h i s i s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e . Key e x p e r i m e n t s , s u c h a si s o l a t i o n o f a d d u c t s , a b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p y a n d m a s s s p e c t r o -m e t r y , w e r e r e p e a t e d w i t h D PI .T h e e f f e c t o f I D P o n p h o t o r e d u c t i o n a n d r e o x i d a t i o n o f f r e ef l a v i n s i n b u f f e r e d a q u e o u s s o l u t i o n ( p H 7 . 4 ) w a s i n v e s t i g a t e d .F l a v i n s c a n b e s p e c i f i c a l l y p h o t o r e d u c e d b y u s i n g E D T A a se l e c t r o n d o n o r ; l i g h t e x c i t e s t h e f l a v i n t o a t r i p l e t s t a t e , w h i c h c a na b s t r a c t a n e l e c t r o n f r o m E D T A ( H e e l i s , 1 9 9 0 ) . R e o x i d a t i o n c a n4 0 0 6 0 0 t h e n b e a c h i e v e d b y a e r a t i o n o f t h e a n a e r o b i c c u v e t t e . WhenD P H I ( p M ) e x a m i n i n g r e o x i d a t i o n o f p h o t o r e d u c e d FAD, IDP w a s a d d e da f t e r i l l u m i n a t i o n t o e n s u r e t h a t d i r e c t r e d u c t i o n o f t h e i n h i b i t o r1 5 2 0 w a s n o t t a k i ng p l a c e . D i t h i o n i t e w a s n o t u s e d a s f l a v i n r e d u c t a n t ,s i n c e t h i s m i g h t d i r e c t l y r e d u c e I D P , a l l o w i n g p h e n y l - r a d i c a lu l a t i o n o f K , f o r m a t i o n w i t h o u t t h e n e e d f o r r e d u c e d f l a v i n a s e l e c t r o n d o n o r .

    e p r o d u c t i o n a f t e r a d d i t i o n IDP ( 5 0 , M ) h a d n o e f f e c t on t h e e x t e n t or r a t e o f p h o t o -' I w a s a d d e d t o t h e a s s a y r e d u c t i o n o f FAD ( 1 0 0 g M ) ; h o w e v e r , a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i nl ( K / + [ I ] ) . S e e t h e R e s u l t s r e c o v e r y o f o x i d i z e d FAD o n r e o x i d a t i o n w a s n o t e d ( F i g u r e 5 ) .i f N A D P H o x i d a s e b y D P I . A t a r a t i o o f I D P : FAD o f 1 : 1 , o n l y 62% o f t h e FAD wasP l ] w a s k e p t c o n s t a n t a t K / r e c o v e r e d o n r e o x i d a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t s o m e r e d u c e d FADi m u m i n h i b i t i o n r a t e w a s h a d b e e n m o d i f i e d b y r e a c t i o n w i t h I D P .t o r a e t a n i s .

    p r o c e e d i n g w i t h an i n i t i a l r a t e A , i t c a n b e seen t h a t t h e r a t e ( v )a t a n y t i m e ( t ) i s g i v e n b y :

    v =A e - k tI n t e g r a t i n g w i t h r e s p e c t t o t , b e t w e e n t =0 a n d t =o o g i v e s t h et o t a l t u r n o v e r o f s u b s t r a t e ( V ) , a s :

    V=A(l- e - k ) / kB y f i t t i n g t h e o b s e r v e d a b s o r b a n c e - v e r s u s - t i m e t r a c e s t o t h i se q u a t i o n ( F i g u r e 3 ) , v a l u e s o f k ca n b e d e r i v e d . R e p l o t t i n g ka g a i n s t D P I c o n c e n t r a t i o n ( F i g u r e 4 ) s h o w s t h a t , a t h i g hc o n c e n t r a t i o n s o f D P I , t h e i n a c t i v a t i o n r a t e k a p p r o a c h e s amaximum v a l u e , k c a t (= 0 . 0 1 4 s - ' ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t a ne n z y m e - i n h i b i t o r c o m p l e x i s f o r m e d b e f o r e t h e i n a c t i v a t i o np r o c e s s , s i n c e a s i m p l e o n e - s t e p i n a c t i v a t i o n process w o u l d g i v ea l i n e a r k - v e r s u s - I ( i n h i b i t o r c o n c n . ) p l o t . The p l o t o f k versus Imay a l s o b e u s e d t o g i v e a v a l u e o f t h e a p p a r e n t K , f o r D P I b yu s i n g t h e e q u a t i o n ( K i t z a n d W i l s o n , 1 9 6 2 ) :

    k =k c a t I / ( K i + I )T h i s g i v e s a v a l u e o f 5 . 6 4 u M f o r K i .On i n c r e a s i n g t h e NADPH c o n c e n t r a t i o n a t c o n s t a n t i n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o n ( 5 . 6 j M ) , t h e r a t e o f i n a c t i v a t i o n i n c r e a s e s t o amaximum v a l u e ( F i g u r e 4 , i n s e r t ) . T h i s s h o w s t h a t D P I i s a nu n c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r w i t h r e s p e c t t o NADPH. B e c a u s eNADPH o x i d a s e i s a membrane-bound enzyme, i t i s n o t p o s s i b l et o vary t h e c o n c e n t r a t i o n o f o t h e r c o m p o n e n t s i n t h e r e a c t i o n( e . g . c y t o c h r o m e b ) . Hence a f u l l k i n e t i c a n a l y s i s o f t h e enzyme i sn o t p o s s i b l e . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t i n c r e a s i n g NADPH con-c e n t r a t i o n causes k t o i n c r e a s e ( a s o p p o s e d t o e i t h e r d e c r e a s i n g

    D e t e c t i o n o f f l a v i n a d d u c t s b y h . p . l . c .To e l u c i d a t e w h e t h e r l o w r e c o v e r y o f FAD w a s d u e t o c o v a l e n ta d d u c t f o r m a t i o n , a s a m p l e o f r e a c t i o n p r o d u c t s w a s e x a m i n e db y h . p . l . c . EDTA, F A D a n d I D P w e r e i n j e c t e d s e p a r a t e l y t os t a n d a r d i z e r e t e n t i o n t i m e s . S e p a r a t i o n i n t o e x p e c t e d p e a k s w a sf o u n d o n i n j e c t i o n o f m i x t u r e s o f E D T A w i t h e i t h e r FAD o rI D P , o r F A D a n d ID P t o g e t h e r . R e t e n t i o n t i m e s f o r EDTA,F A D a n d I DP w e r e 2 , 1 0 a n d 1 7 m i n r e s p e c t i v e l y .To f o r m a d d u c ts w i t h I D P , F A D ( 5 m M) w a s f i r s t r e d u c e dw i t h l i g h t a n d E D T A ( 1 0 mM). An e q u a l v o l u m e o f IDP ( 1 0 m M)w a s t h e n a d d e d a n d a l l o w e d t o r e a c t a t 2 0 C b e f o r e s a m p l e s w e r er e m o v e d f o r a n a l y s i s b y h . p . l . c . An a d d i t i o n a l p e a k w i t h ar e t e n t i o n t i m e o f 1 5 . 5 m i n w a s o b s e r v e d , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o no f a n o v e l p r o d u c t . T h i s f r a c t i o n w a s c o l l e c t e d a n d i t s u . v .a b s o r b a n c e s p e c t r u m r e c o r d e d . I n o r d e r t o c o l l e c t e n o u g hp r o d u c t f o r s t r u c t u r a l a n a l y s i s , d i t h i o n i t e w a s u s e d a s r e d u c t a n ti n p l a c e o f E D T A a n d l i g h t , s o t h a t c o m p l e t e f l a v i n r e d u c t i o nc o u l d b e a c h i e v e d . A s f o u n d f o r p h o t o r e d u c e d FAD, t h e newp e a k a p p e a r e d o n l y i n t h e p r e s e n c e o f r e d u c t a n t . I t s r e t e n t i o nt i m e a n d u . v . s p e c t r u m w e r e i d e n t i c a l w i t h t h o s e o b s e r v e d o np h o t o r e d u c t i o n , a n d i t w a s a s s u m e d t o b e t h e same d e r i v a t i v e .S a m p l e s w e r e d e s a l t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s a n d m a t e r i a l ss e c t i o n , a n d c h r o m a t o g r a m s f r o m t h e d e s a l t i n g g r a d i e n t s h o w e dt h e p r o d u c t t o b e p r e s e n t a s a s i n g l e p e a k , w i t h u . v . s p e c t r u m a sb e f o r e .R e a c t i o n o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d f l a v i n w i t h I D P a p p e a r e d r a p i da n d c o m p l e t e , s i n c e n o i n c r e a s e i n y i e l d o f t h e s u g g e s t e d a d d u c tw a s o b s e r v e d i f s a m p l e s w e r e a l l o w e d t o s t a n d b e f o r e h . p . l . c .s e p a r a t i o n . W i t h FAD: ID P a t 1 : 2 , a p p r o x . 56% o f t h e FADw a s m o d i f i e d , a s e s t i m a t e d f r o m t h e c h r o m a t o g r a m p e a k h e i g h t .H o w e v e r , w h e n D P I w a s s u b s t i t u t e d f o r I D P , w i t h FAD: D PI a t

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    5/9

    l o d o n i u m c o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s o f n e u t r o p h i l N A D P H o x i d a s e

    a0._4-

    a0

    00

    0 1 0 0 2 0 0 3 0 0[ I D P I ( u M )

    1 0 0 !9 08 0 -7 0 -6 05 04 03 02 01 004 4

    5 3 3

    4 5 9

    1 O

    ( a )S p e c t r u m n o r m a l i z e d t o m/z 5 3 3

    A -5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 1 0 0 0

    5 E f f e c t o f I D P o n r e c o v e r y o f o x i d i z e d F A D a f t e r E D T A - m e d l a t e dA D ( 8 5 , u M ) w a s p h o t o r e d u c e d b y E D T A ( 1 m M ) i n a 3 m l a n a e r o b i c c u v e t t e . D e g a s s e d b u f f e ro r I D P ( t o 3 0 0 a M ) w a s t h e n a d d e d . R e o x i d a t i o n w a s m e d i a t e d b y f l u s h i n g t h e c u v e t t e

    a i r . O x i d a t i o n s t a t e w a s m o n i t o r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 4 5 0 - 5 0 0 n m . P e r c e n t a g er e f e r s t o p r o p o r t i o n o f F A D H 2 w h i c h w a s r e c o v e r a b l e a s r e o x i d i z e d a f t e r a e r a t i o n .

    1.0 1.0(a ) (b )

    0.75 0.75

    A0.50 0.50

    0.25 0.25

    0 02 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0W a v e l e n g t h ( n m ) W a v e l e n g t h ( n m )

    6 A b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p y o f f l a v i n s a n d h . p . l . c . - p u r l f l e d f l a v i n -a d d u c t s

    1 009 08 07 06 05 04 0 -3 0 -2 0 -1 0 -0

    100'9 08 070-60-5 0 -4 0 -3 0 -2 0 -1 0 -0-

    5 3 5

    4 0 0

    ( b )

    I L k I6 0 0

    1 1 2 4I 1 . I .

    8 0 07 3 7

    4 7 8

    61 1

    I L

    1 0 0 0 1 2 0 0 1 4 0 0

    ( c )

    1 5 2 8--II- - ' -I , . . I . . . I I4 0 0 60 0 8 0 0 1 00 0 1 20 0 1 4 0 0 1 6 0 0 1 8 0 0 2 0 0 0m/z

    F r e e F M N ; ----, F M N - I D P a d d u c t . ( b ) F r e e F A D ; ----, F A D - I D P-0-,F A D - D P I a d d u c t .

    : 2 , more t h a n 90% o f FAD was m o d i f i e d a f t e r r e d u c t i o n .r e s u l t s w e re o b t a i n e d when d i t h i o n i t e - r e d u c e d FMN wasf o r FAD. F i g u r e 6 s h o w s t h e a b s o r b a n c e s p e c t r a o fh e h . p . l . c . - p u r i f i e d a d d u c t s o f d i t h i o n i t e - r e d u c e d FMN or FADe i t h e r D P I or I D P . S p e c t r a o f FAD a n d FMN are p r o v i d e d

    F i g u r e 7 F . a . b . - m . s . o f h . p . l . c . - p u r i f e d f l a v i n - i n h i b i t o r a d d u c t s( a ) S p e c t r u m o f F M N - I D P a d d u c t ( n e g a t i v e - i o n m o d e ) ; m o l e c u l a r i o n a t m / z 5 3 4 . ( b ) S p e c t r u mo f F A D - I D P a d d u c t ( p o s i t i v e - i o n m o d e ) ; m o l e c u l a r i o n a t 1 1 2 3 . ( c ) S p e c t r u m o f F A D - D P Ia d d u c t ( p o s i t i v e - i o n m o d e ) ; m o l e c u l a r i o n a t 1 5 2 7 .

    f o r c o m p a r i s o n . The l o s s o f t h e 4 5 0 nmp e a k on a d d u c t f o r m a t i o ni s i n d i c a t i v e o f a r e d u c e d f l a v i n c h r o m o p h o r e , q u i t e s i m i l a r t ot h o s e d e s c r i b e d b y G h i s l a e t a l . ( 1 9 7 4 ) and Schonbrunn e t a l .( 1 9 7 6 ) f o r C 4 a - a n d N 5 - s u b s t i t u t e d d i h y d r o f l a v i n s a n d a l s o t h a t

    4 5

    M O R L A A L - I --. I .. J A II . . - I . . I .

    I a

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    4 6 V . B . O ' D o n n e l l a n d o t h e r s( a )

    I i8 7 6 5 4 3 2 8 7 6 5 4 3 2 1

    ( d )

    9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 26 ( p . p . m . ) 5 ( p . p . m . )

    F i g u r e 8 ' H - n . m . r . s p e c t r o s c o p y o f f l a v i n s a n d h . p . l . c . - p u r H f i e d f l a v i n - i n h i b i t o r a d d u c t s( a ) F r e e F M N ; ( b ) F M N - I D P a d d u c t ( n o t e : s o d i u m a c e t a t e a t 2 p . p . m . ) ; ( c ) f r e e F A D ; ( d ) F A D - I D P a d d u c t .

    s h o w n b y K e m a l a n d B r u i c e ( 1 9 7 6 ) f o r C 4 a s u b s t i t u t i o n . T h i smay p o s s i b l y i n d i c a t e C 4 a a n d / o r N5 t o b e t h e s i t e s o f a t t a c k o na d d u c t f o r m a t i o n .A p p r o x . 3 - 8 m g o f e a c h a d d u c t s h o w n i n F i g u r e 6 w a s i s o l a t e df o r f u r t h e r a n a l y s i s . A l l w e r e n o n - f l u o r e s c e n t a n d o n f r e e z e -d r y i n g a p p e a r e d p a l e y e l l o w , i n d i c a t i n g t h a t a b l e a c h i n g o fc o l o u r o f t h e n a t i v e f l a v i n s h a d o c c u r r e d .M a s s s p e c t r o m e t r y o f t h e f l a v i n a d d u c t sM o l e c u l a r m a s s e s o f t h e h . p . l . c . - p u r i f i e d a d d u c t s o f r e d u c e df l a v i n s w i t h I DP a n d D P I w e r e d e t e r m i n e d b y f . a . b . - m . s . ( F i g u r e7 ) . On r e d u c t i o n , I D P a n d D P I f o r m p h e n y l r a d i c a l s . R a d i c a lf o r m a t i o n b y I D P i s a l s o a s s o c i a t e d w i t h t h e l o s s o f i o d o b e n z e n ei n s o l u t i o n ( F i g u r e 1 ) . T h e FMN-I D P a d d u c t w h i c h we i s o l a t e dh a d a m o l e c u l a r m a s s o f 5 3 4 , w h i c h e x a c t l y c o r r e s p o n d s t o FMNw i t h o n e p h e n y l r i n g a t t a c h e d ( F i g u r e 7 a ) . F A D a d d u c t s ,h o w e v e r , d i d n o t g i v e s u c h c l e a r r e s u l t s . On r e a c t i o n w i t h e i t h e rI D P o r D P I , t h e r e d u c e d FAD o r i t s p r o d u c t s a p p e a r t o b eh y d r o l y s e d t o g i v e t h e p h e n y l a t e d FMN a d d u c t s . T h e s e c a n b es e e n a t 5 3 4 a n d 7 3 6 o n t h e m a s s s p e c t r a f o r I D P a n d DP Ir e s p e c t i v e l y ( F i g u r e s 7 b a n d 7 c ) . H o w e v e r , o t h e r p e a k s a r ea p p a r e n t , n o t a b l y a h i g h e r - m o l e c u l a r - m a s s p e a k w h i c h a p p e a r si n b o t h c a s e s , b u t d o e s n o t c o r r e s p o n d t o a n y e x p e c t e d a d d u c t s .N . m . r . s p e c t r o s c o p y o f f l a v i n a d d u c t s' H - n . m . r . s p e c t r o s c o p y w a s p e r f o r m e d o n t h e h . p . l . c . - p u r i f i e dFAD-I D P a n d F MN- I D P a d d u c t s . I n c o m p a r i s o n w i t h t h e

    s t a n d a r d FMN s p e c t r u m ( F i g u r e 8 a ) , t h e F MN- I D P a d d u c ts p e c t r u m ( F i g u r e 8 b ) s h o w e d t h e a p p e a r a n c e o f s i g n a l s a t7 - 7 . 5 p . p . m . , i n d i c a t i n g a d d i t i o n o f a p h e n y l g r o u p . I n t e g r a t i o no f t h e s e s i g n a l s c o n f i r m e d t h e m a s s - s p e c t r o s c o p y r e s u l t , i n d i -c a t i n g a d d i t i o n o f 1 p h e n y l g r o u p p e r f l a v i n m o l e c u l e . I t i su n c l e a r w h e t h e r o n e o f t h e i s o a l l o x a z i n e p r o t o n p e a k s h a sd i s a p p e a r e d o r s h i f t e d .A l t h o u g h i n t e g r a t i o n o f t h e n . m . r . s p e c t r u m o f FAD-IDPc o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f p h e n y l g r o u p s a n d f l a v i n , c o m p l e t es t r u c t u r a l i n t e r p r e t a t i o n w a s n o t p o s s i b l e ( F i g u r e 8 d ) . F o u rp r o t o n s a r e s e e n a t 8 p . p . m . a s w i t h t h e FAD s t a n d a r d ( F i g u r e8 c ) , a n d f o u r m e t h y l g r o u p s a r e s e e n a t 2 p . p . m . i n s t e a d o f t h ee x p e c t e d t w o . N u m e r o u s s i g n a l s a r o s e i n t h e r e g i o n o f 5 . 8 -7 p . p . m . , w h i c h c o u l d n o t b e a s s i g n e d . E v i d e n t l y , a s w i t h FMN,f u r t h e r r e a r r a n g e m e n t t a k e s p l a c e . H o w e v e r , p o s s i b l y o w i n g t ot h e g r e a t e r c o m p l e x i t y o f t h e FAD, n o t o n l y i s i n t r a m o l e c u l a rr e a r r a n g e m e n t o b s e r v e d , b u t a s s o c i a t i o n o f f r a g m e n t a t i o n p r o -d u c t s m ay o c c u r .R a d i o l a b e l l i n g o f n e u t r o p h i l m e m b r a n e sD u r i n g i n h i b i t i o n o f o x i d a s e , t h e g e n e r a t i o n o f r e a c t i v e r a d i c a l smay b e a s s o c i a t e d w i t h l a b e l l i n g o f p r o t e i n g r o u p s a d j a c e n t t ot h e s i t e o f i n h i b i t o r a c t i v a t i o n . We t h e r e f o r e e x a m i n e d p r o t e i nl a b e l l i n g i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f e n z y m e t u r n o v e r , u s i n gSDS/PAGE f o l l o w e d b y a u t o r a d i o g r a p h y o f e n z y m e i n c u b a t e dw i t h [ 1 2 5 1 ] D P I . [ 1 2 5 I ] D P I l a b e l l i n g o f m e m b r a n e p r o t e i n s wa si n c r e a s e d b y a d d i t i o n o f NADPH d u r i n g i n c u b a t i o n . Non-

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    7/9

    l o d o n i u m c o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s o f n e u t r o p h i l N A D P H o x i d a s e2 3 4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,!. _ . . . . . . .___. . . . .

    _ : : :__S:._: : : : : :_.F. .. .Z : : :o p o f S D S / P A G E o - ;( k D a )6 6

    4 5

    3 62 9 -2 4

    2 0 . 1

    1 4 . 2

    F i g u r e 9 L a b e l l i n g o f h u m a n n e u t r o p h i l m e m b r a n e s w i t h [ 1 2 I ] D P IL a b e l l i n g o f p r o t e i n s w i t h [ 1 2 5 1 ] D P I , a u t o r a d i o g r a p h y , a n d p r o t e i n s t a i n i n g w e r e p e r f o r m e d a sd e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s a n d m a t e r i a l s s e c t i o n . N A D P H w a s a d d e d d u r i n g i n c u b a t i o n w i t h[ 1 2 5 1 ] D P I t o t r a c k s 2 a n d 4 . U n l a b e l l e d D P I ( 1 0 m M ) w a s a d d e d a f t e r i n c u b a t i o n w i t h [ 1 2 5 1 ] D P It o t r a c k s 3 a n d 4 .

    s p e c i f i c l a b e l l i n g i n d u c e d b y s a m p l e p r e p a r a t i o n a f t e r i n c u b a t i o nw a s g r e a t l y d e c r e a s e d b y t h e a d d i t i o n o f u n l a b e l l e d D P I ( 1 0 m M)a f t e r i n c u b a t i o n ( F i g u r e 9 ) .F l a v i n r e c o v e r y f r o m p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e sH a v i n g shown t h a t r e d u c e d f l a v i n c o u l d b e m o d i f i e d b yr e a c t i o n w i t h i o d o n i u m c o m p o u n d s , we i n v e s t i g a t e d w h e t h e rl e v e l s o f e x t r a c t a b l e f l a v i n f r o m n e u t r o p h i l membranes w e rea f f e c t e d b y D P I i n h i b i t i o n o f o x i d a s e a c t i v i t y . I n o r d e r t o e x t r a c td e t e c t a b l e f l a v i n , p i g n e u t r o p h i l s wer e u s e d , a s g r e a t e r enzymec o n c e n t r a t i o n s c o u l d b e o b t a i n e d i n t h i s way. F l u o r e s c e n c e o ft o t a l f l a v i n r e c o v e r e d i s shown i n F i g u r e 1 0 ( a ) , w i t h f r e e FMN( 1 0 0 n M) a s c o m p a r i s o n . S i n c e t h e use o f H C l 0 4 ( 0 . 1 5 M) t of a c i l i t a t e p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n may l e a d t o h y d r o l y s i s o f FAD t ot h e more f l u o r e s c e n t FMN, a l l s u p e r n a t a n t s f r o m t h e c e n t r i -f u g a t i o n s t e p w e re b o i l e d i n 1 MH C l 0 4 f o r 1 0 m i n . I n t h i s way,a l l FAD was c o n v e r t e d i n t o FMN b e f o r e f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s .T h e r e was no a p p a r e n t d e g r a d a t i o n o f s t a n d a r d FMN whent r e a t e d a s a b o v e , a s j u d g e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y . I no r d e r t o recover d e t e c t a b l e f l a v i n , h i g h enzyme c o n c e n t r a t i o n sw e re necessary. The i n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n was t h e r e f o r e r a i s e dt o ensure t h a t t h e r a t i o o f enzyme t o i n h i b i t o r was s i m i l a r t o t h a tu s e d f o r k i n e t i c a s s a y s .The a d d i t i o n o f D P I , w i t h NADPH a s e l e c t r o n d o n o r i n t h ei n c u b a t i o n m i x t u r e t o promote o x i d a s e t u r n o v e r , r e s u l t e d i n as i g n i f i c a n t l o s s o f r e c o v e r a b l e f l a v i n . A f t e r i n c u b a t i on o f enzymew i t h 3 4 . 5 nmol o f D P I/mg o f membrane p r o t e i n ( 5 0 ,u M D P I )a n d 9 0 0 # a M NA D P H, o n l y 5 0 % o f t h e t o t a l membrane f l a v i n

    w a s r e c o v e r e d ( F i g u r e 1 0 b ) . When DPI c o n c e n t r a t i o n was r a i s e dt o 3 4 5 n m o l / m g o f p r o t e i n ( 5 0 0 , u M D P I ) , f l a v i n r e c o v e r y wa sf u r t h e r d e c r e a s e d t o 2 4 . 2% o f t h a t a f t e r i n c u b a t i o n w i t h NADPHa l o n e . I n t h e a b s e n c e o f NADPH, t h e r e w as n o l o s s o f r e c o v e r a b l ef l a v i n a s s o c i a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f 5 0 , # M DPI ( F i g u r e 1 0 c ) ,s h o w i n g t h a t e n z y m e t u r n o v e r wa s e s s e n t i a l f o r t h i s p r o c e s s .D I S C U S S I O NDP I i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f NADPH o x i d a s e w h e n a d d e d t os t i m u l a t e d n e u t r o p h i l s . H o w e v e r , w h e n w h o l e n e u t r o p h i l s werep r e i n c u b a t e d i n D P I , t h e a c t i v i t y o b s e r v e d a f t e r d i l u t i o n a n da c t i v a t i o n was f o u n d t o b e a l m o s t u n a f f e c t e d , c o m p a r e d w i t ht h a t s e e n w h e n DPI was a d d e d t o a c t i v a t e d n e u t r o p h i l s ( F i g u r e2 ) . T h i s i n d i c a t e d e i t h e r a n e e d f o r e l e c t r o n f l o w t h r o u g h t h ee n z y m e c o m p l e x , o r t h a t a c o n f i g u r a t i o n c h a n g e i n v o l v e d i n t h ec h a n g e f r o m r e s t i n g t o a c t i v e o x i d a s e e x p o s e d a D P I - s e n s i t i v es i t e . O u r r e s u l t s n ow s u g g e s t t h a t t h e c h a n g e i n e n z y m e c o n -f i g u r a t i o n on a c t i v a t i o n i s u n l i k e l y t o b e t h e f a c t o r g o v e r n i n gi n h i b i t o r y a c t i v i t y , s i n c e we h a v e s h o w n t h a t i n h i b i t i o n r a t e mayb e r e l a t e d t o r a t e o f e n z y m e t u r n o v e r ( s e e F i g u r e 4 i n s e r t ) .DPI a n d i t s a n a l o g u e I DP a p p e a r t o i n h i b i t a v a r i e t y o fe l e c t r o n - t r a n s p o r t s y s t e m s b y s i m i l a r m e c h a n i s m s . T h e o b s e r -v a t i o n t h a t t h e r a t e o f i n h i b i t i o n o f NADPH o x i d a s e b y DPIi n c r e a s e s on i n c r e a s i n g NADPH c o n c e n t r a t i o n i n d i c a t e s t h a ti n h i b i t i o n i s u n c o m p e t i t i v e w i t h r e s p e c t t o NA D PH . D . G . Tew( u n p u b l i s h e d w o r k ) f o u n d t h a t IDP c a u s e d a t i m e - d e p e n d e n ti n h i b i t i o n o f c y t o c h r o m e P - 4 5 0 r e d u c t a s e w h i c h was d i r e c t l yp r o p o r t i o n a l t o s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n , w h e r e a s R a g a n a n dB l o x h a m ( 1 9 7 7 ) f o u n d no e f f e c t on t h e i n h i b i t o r y p o t e n c y o f DPIon i n c r e a s i n g t h e i n c u b a t i on t i m e o f r e s t i n g NADH: u b i q u i n o n er e d u c t a s e w i t h D P I , a l t h o u g h i n h i b i t i o n d u r i n g t u r n o v e r wa st i m e - d e p e n d e n t . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e v i e w t h a t e n z y m e

    t u r n o v e r i s a n e c e s s a r y r e q u i r e m e n t f o r i n h i b i t i o n .NADPH o x i d a s e c o n t a i n s two r e d o x c e n t r e s , F A D ( E m 7 =- 2 8 0 mV; K a k i n u m a e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d a b - t y p e c y t o c h r o m e( E m 7 = -245 m V ; C r o s s e t a l . , 1 9 8 1 ) . D u r i n g c a t a l y s i s , t h e s etwo c e n t r e s a l t e r n a t e b e t w e e n r e d u c e d a n d o x i d i z e d r e d o x s t a t e s .From t h e k n o w n r e a c t i v i t i e s o f i o d o n i u m c o m p o u n d s ( B a n k s ,1 9 6 6 ) a n d t h e n a t u r e o f t h e i n h i b i t i o n o b s e r v e d , we h a v ep o s t u l a t e d a m e c h a n i s m o f i n h i b i t i o n i n v o l v i n g t h e n e e d f o r ar e d u c e d r e d o x c e n t r e . T h i s r e d u c e d c e n t r e c o u l d s e rv e a s ane l e c t r o n d o n o r t o t h e i o d o n i u m i n h i b i t o r , a l l o w i n g p h e n y l -r a d i c a l f o r m a t i o n ( F i g u r e 1 ) . T h e r a d i c a l c o u l d t h e n i n h i b i t t h ee n z y m e b y a d d i t i o n t o t h e f l a v i n o r haem c o f a c t o r d i r e c t l y , o r t oa m i n o a c i d s i d e c h a i n s a d j a c e n t t o t h e a c t i v e s i t e . NADPH i n t h ea b s e nc e o f o x i d a s e p r e p a r a t i o n s i s i n c a p a b l e o f a c t i v a t i n g IDP t of o r m r a d i c a l s i n s o l u t i o n ( d e m o n s t r a t e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y ;r e s u l t n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t d u r i n g e n z y m e i n h i b i t i o n ar e d u c e d r e d o x c e n t r e m i g h t m e d i a t e e l e c t r o n d o n a t i o n t o t h ei n h i b i t o r .I t h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t h a t ID P i s c a p a b l e o f m o d i f i -c a t i o n o f r e d u c e d h a e m c o f a c t o r s . S p e c t r a l c h a n g e s i n d i c a t i v e o fp h e n y l a t i o n o f haem o f c y t o c h r o m e P - 4 5 0 b y I D P h a v e b e e ns h o w n t o o c c u r o n l y i n t h e p r e s e n c e o f r e d u c t a n t ( d i t h i o n i t e o rNADPH) b y B a t t i o n i e t a l . ( 1 9 8 8 ) . R e c e n t l y , D o u s s i e r e a n dV i g n a i s ( 1 9 9 1 ) s u g g e s t e d a s i m i l a r m e c h a n i s m o f a c t i o n o f I D Pd u r i n g i n h i b i t i o n o f b o v i n e NADPH o x i d a s e . H o w e v e r , i n t h i sc a s e d i t h i o n i t e wa s a d d e d a s r e d u c t a n t . T h i s w o u l d l e a d d i r e c t l yt o f o r m a t i o n o f p h e n y l r a d i c a l s w i t h o u t t h e n e e d f o r r e d u c t i o n o ft h e I DP b y a r e d u c e d r e d o x c e n t r e . A l t h o u g h NADPH o x i d a s eh a s two r e d o x c e n t r e s , e i t h e r o f w h i c h may b e t h e s i t e o fi n h i b i t i o n , we s u g g e s t t h a t t h e f l a v i n m ay b e t h e p r e f e r r e d s i t e o fa t t a c k . D u r i n g s t e a d y - s t a t e e l e c t r o n t r a n s f e r f r o m NADPH t o0 2 t h e c y t o c h r o m e b i s t y p i c a l l y a r o u n d 1 0 0 % r e d u c e d a n d t h e

    4 7

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    8/9

    4 8 V . B . O ' D o n n e l l a n d o t h e r s

    C ,C D

    3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 S 0 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0

    . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ( b ) ( c )

    0Za,a ,

    5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0W a v e l e n g t h ( n m )

    F i g u r e 1 0 R e c o v e r y o f i n t a c t f l a v i n f r o m p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e sF l a v i n s w e r e e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s a n d m a t e r i a l s s e c t i o n ( 1 . 4 5 m g i n 0 . 5 m l o f b u f f e r ) . ( a ) ( i ) E x c i t a t i o n ( e m i s s i o n a t 5 2 5 n m ) a n d ( i i ) e m i s s i o n ( e x c i t a t i o n a t 4 5 0 n m ) s p e c t r ao f f l a v i n e x t r a c t e d f r o m p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e s ( . S t a n d a r d F M N f l u o r e s c e n c e s p e c t r a ( 1 0 0 n m ) a r e p r o v i d e d f o r c o m p a r i s o n (--). ( b ) F l u o r e s c e n c e o f f l a v i n s e x t r a c t e d f r o m p i gn e u t r o p h i l m e m b r a n e s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h N A D P H w i t h o r w i t h o u t D P I a s i n d i c a t e d ( 3 0 m i n a t 2 0 O C ) : ~, c o n t r o l , n o a d d i t i o n s ; - - , N A D P H ( 1 m M ) o n l y ; . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .( 5 0 , u M ) ; - - , N A D P H , p l u s D P I ( 5 0 0 , u M ) . ( c ) F l u o r e s c e n c e o f f l a v i n s e x t r a c t e d f r o m p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n e s a f t e r i n c u b a t i o n w i t h ( - - ) o r w i t h o u t D P I ( 5 0 , u M ) ( ~ ) a l o n e f o r 3 0 m i na t 2 0 C a s i n d i c a t e d .

    FA D 40% r e d u c e d ( C r o s s e t a l . , 1 9 8 5 ; P a r k i n s o n , 1 9 8 5 ) . U s i n gt h e N e r n s t e q u a t i o n i t c a n b e c a l c u l a t e d t h a t d u r i n g t u r n o v e r t h ec y t o c h r o m e b i s p o i s e d a t - 1 8 9 mV, a n d t h e f l a v i n a t -270 mV.S i n c e DPI h a s a m i d p o i n t p o t e n t i a l o f - 4 2 0 mV ( B e r i n g e r ,1 9 7 2 ) , F A D w o u l d b e a much m o r e e f f e c t i v e r e d u c t a n t o f DPIt h a n t h e c y t o c h r o m e b . l o d o n i u m c o m p o u n d s a r e i n h i b i t o r s o fs u c h f l a v o e n z y m e s a s x a n t h i n e o x i d a s e ( V . B . O ' D o n n e l l ,u n p u b l i s h e d w o r k ; D o u s s i e r e a n d V i g n a i s , 1 9 9 2 ) , m i t o c h o n d r i a lNADH d e h y d r o g e n a s e ( R a g a n a n d B l o x h a m , 1 9 7 7 ) a n dm a c r o p h a g e NO s y n t h a s e ( S t u e h r e t a l . , 1 9 9 1 ) , n o n e o f w h i c hc o n t a i n s h a e m p r o s t h e t i c g r o u p s , i n d i c a t i n g t h a t t h e s e c o f a c t o r sa r e n o t n e c e s s a r y f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e i n h i b i t o r y r a d i c a l .C o n t r o l l e d a n a e r o b i c r e d u c t i o n a n d r e o x i d a t i o n o f FAD i nt h e p r e s e n c e o f I D P i n d i c a t e d t h a t r e d u c e d , b u t n o t o x i d i z e d ,F A D i s a t t a c k e d b y t h e i n h i b i t o r , l e a d i n g t o l o s s o f r e o x i d i z a b l ef l a v i n . M a s s s p e c t r o m e t r y a n d n . m . r . s p e c t r o s c o p y o f F A D a n dFMN a d d u c t s f or m e d s h o w e d t h i s l o s s t o b e d u e t o d i r e c tp h e n y l a t i o n o f t h e f l a v i n m o l e c u l e . A l t h o u g h we c o u l d n o te l u c i d a t e t h e s i t e o f a t t a c h m e n t , a b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p y i n d i -c a t e d t h i s t o b e e i t h e r C4 a o r N5 o f t h e i s o a l l o x a z i n e r i n g . FMNg a v e much c l e a r e r r e s u l t s t h a n F A D , p o s s i b l y o w i n g t o i t ss i m p l e r s t r u c t u r e . A l t h o u g h we w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e F A D -I D P a n d FAD-DPI a d d u c t f o r m a t i o n , we w e r e n o t a b l e t oc h a r a c t e r i z e t h e p r o d u c t s f o r m e d , s i n c e c o n s i d e r a b l e h y d r o l y s i so f FAD t o FMN a p p e a r e d t o o c c u r on p h e n y l a t i o n . I t was c l e a rf r o m t h i s w o r k t h a t r e d u c e d f l a v i n , b u t n o t o x i d i z e d f l a v i n , c o u l dr e a c t w i t h i o d o n i u m c o m p o u n d s . D u r i n g i n h i b i t i o n o f c y t o -c h r o m e P - 4 5 0 r e d u c t a s e ( a n e n z y m e w i t h FMN a n d F A Dp r o s t h e t i c g r o u p s ) b y I D P , o n e o f u s ( D . G . T e w , u n p u b l i s h e dw o r k ) d e m o n s t r a t e d t h e f o r m a t i o n o f p h e n y l a t e d FMN, b u t n o t

    FAD. T h i s m ay i n d i c a t e t h a t i n t h e s y s t e m , t o o , o n p h e n y l a t i o nt h e FAD m o l e c u l e b e c o m e s d e g r a d e d , l e a d i n g t o a l o s s o fd e t e c t a b l e a l t e r e d f l a v i n .I n o r d e r t o e x a m i n e t h e l a b e l l i n g o f n e u t r o p h i l m e m b r a n ep r o t e i n s w i t h D P I , r a d i o l a b e l l e d i n h i b i t o r w a s i n c u b a t e d w i t hs a m p l e s o f e n z y m e , w i t h o r w i t h o u t o x i d a s e t u r n o v e r . I n c l u s i o no f NADPH i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e w a s a s s o c i a t e d w i t hi n c r e a s e d l a b e l l i n g o f a n u m b e r o f b a nd s , p a r t i c u l a r l y t h o s e o f4 5 kD a a n d 6 6 k D a , a l o n g w i t h i n c r e a s e d b a c k g r o u n d l a b e l l i n g .S i n c e NADPH c a n n o t a c t i v a t e D P I d i r e c t l y , t h i s o b s e r v a t i o nm ay i n d i c a t e t h a t t h e m o b i l i t y o f t h e r a d i c a l s g e n e r a t e d w a s s u c ht h a t t h e y w e r e a b l e t o d i f f u s e f r o m t h e i r s i t e o f g e n e r a t i o n b e f o r er e a c t i n g w i t h p r o t e i n . T h e l a b e l l i n g o f a l l p r o t e i n b a n d s w a s

    a p p r e c i a b l y d e c r e a s e d b y a d d i n g a s a t u r a t i n g d os e o f u n l a b e l l e di n h i b i t o r i m m e d i a t e l y a f t e r t h e i n h i b i t i o n i n c u b a t i o n . T h i s mayi n d i c a t e t h a t D P I l a b e l l i n g i n t h e a b s e n c e o f t u r n o v e r ( C r o s s a n dJ o n e s , 1 9 8 6 ) may a r i s e d u r i n g p r e p a r a t i o n o f s a m p l e s f o r S D S -PAGE.We w e r e u n a b l e t o i s o l a t e p h e n y l a t e d FAD a s s o c i a t e d w i t hi n h i b i t i o n d u r i n g t u r n o v e r o f NADPH o x i d a s e o f p i g mem-b r a n e s ; h o w e v e r , s i g n i f i c a n t l y l e s s i n t a c t f l a v i n was r e c o v e r e da f t e r i n c u b a t i o n w i t h D P I a n d NADPH, b u t n o t w i t h D PI o rNADPH a l o n e . I f i n h i b i t i o n o f e n z y m e o c c u r r e d a f t e r a t t a c k o fp h e n y l r a d i c a l s o n p r o t e i n s i d e c h a in s w i th i n t h e a c t i v e s i t e , l i t t l el o s s o f f l a v i n w o u l d b e s e e n . Our r e s u l t s s u g g e s t t h a t f l a v i n r a t h e rt h a n p r o t e i n m ay b e t h e most s e n s i t i v e s i t e a t t a c k e d b y DPI i nt h e o x i d a s e c o m p l e x . A l s o , s i n c e n o t a l l p i g n e u t r o p h i l m e m b r a n ef l a v i n w i l l b e a s s o c i a t e d w i t h NADPH o x i d a s e , o r i n d e e d b eN A D P H - r e d u c i b l e , n o t a l l w o u l d b e a t t a c k e d b y D PI w h e r eNADPH i s u s e d a s r e d u c t a n t . T h e k i n e t i c s o f i n h i b i t i o n o f

  • 8/3/2019 DPI O'Donnell

    9/9

    l o d o n i u m c o m p o u n d s a s i n h i b i t o r s o f n e u t r o p h i l N A D P H o x i d a s eNADPH o x i d a s e b y DPI s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s o f am e c h a n i s m o f a c t i o n p r o p o s e d p r e v i o u s l y1 9 6 6 ) . U s i n g t h e f r e e f l a v i n c o e n z y m e s F A D a n d FMN,e h a v e d e m o n s t r a t e d r e d u c t a n t - d e p e n d e n t a d d u c t f o r m a t i o nb o t h DPI a n d I D P . T h i s may p r o v i d e a common m e c h a n i s mf f l a v o e n z y m e i n h i b i t i o n f o r t h e s e i o d o n i u m c o m p o u n d s a n dt o d e s i g n o f a n a l o g u e s s p e c i f i c f o r c e r t a i n f l a v o p r o t e i n a c t i v e

    e t h a n k S m i t h K l i n e B e e c h a m , S . E . R . C . a n d t h e A r t h r i t i s a n d R h e u m a t i s m C o u n c i lo r f i n a n c i a l s u p p o r t . W e a r e g r a t e f u l t o D r . G r a h a m B l o o m b e r g a n d D r . M a r t i nf r o m t h e U n i v e r s i t y o f B r i s t o l M o l e c u l a r R e c o g n i t i o n C e n t r e f o r n . m . r .a n d D r . N e v i l l e H a s k i n s o f S m i t h K l i n e B e e c h a m f o r m a s s s p e c t r o s c o p y . W et h a n k t h e S o u t h - W e s t R e g i o n a l T r a n s f u s i o n C e n t r e f o r t h e i r k i n d g i f t o f b u f f y

    B . M . ( 1 9 7 8 ) N e w E n g l . J . M e d . 2 9 8 , 6 5 9 - 6 6 8D . F . ( 1 9 6 6 ) C h e m . R e v . 6 6 , 2 4 3 - 2 6 6J . P . , D u p r e , D . , D e l a f o r g e , M . , J a o u e n , M . a n d M a n s u y , D . ( 1 9 8 8 )J . O r g a n o m e t a l l i c C h e m . 3 5 8 , 3 8 9 - 4 0 0

    F . M . ( 1 9 7 2 ) J . O r g . C h e m . 3 7 , 2 4 8 4 - 2 4 8 9F . M . , B a c h o f n e r , H . E . , F a l k , R . A . a n d L e f f , M . ( 1 9 5 8 ) J . O r g . C h e m . 2 0 ,4 2 7 9 - 4 2 8 1M . M . ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4R . a n d B i c h l e r , V . ( 1 9 8 7 ) F E B S L e t t . 2 2 4 , 1 2 1 - 1 2 4E . W . a n d P i c c i o l o , G . L . ( 1 9 7 1 ) M e t h o d s E n z y m o l . 1 8 B , 3 8 1 - 3 8 5A . R . ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 6 , 4 8 9 - 4 9 3

    C r o s s , A . R . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 6 ) B i o c h e m . J . 2 3 7 , 1 1 1 - 1 1 6C r o s s , A . R . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 9 1 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 5 7 , 2 8 1 - 2 9 8C r o s s , A . R . , J o n e s , 0 . T . G . , H a r p e r , A . M . a n d S e g a l , A . W . ( 1 9 8 1 ) B i o c h e m . J . 1 9 4 ,5 9 9 - 6 0 6C r o s s , A . R . , H i g s o n , F . K . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 2 ) B i o c h e m . J . 2 0 4 , 4 7 9 - 4 8 5C r o s s , A . R . , P a r k i n s o n , J . F . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 4 ) B i o c h e m . J . 2 2 3 , 3 3 7 - 3 4 4C r o s s , A . R . , P a r k i n s o n , J . F . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 5 ) B i o c h e m . J . 2 2 6 , 8 8 1 - 8 8 4D o u s s i e r e , J . a n d V i g n a i s , P . V . ( 1 9 9 1 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 7 5 , 2 8 1 - 2 9 8D o u s s i e r e , J . a n d V i g n a i s , P . V . ( 1 9 9 2 ) E u r . J . B i o c h e m . 2 0 8 , 6 1 - 7 1E l l i s , J . A . , M a y e r , S . J . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 8 ) B i o c h e m . J . 2 5 1 , 8 8 7 - 8 9 1F a e d e r , E . J . a n d S i e g e l , L . M . ( 1 9 7 3 ) A n a l . B i o c h e m . 5 3 , 3 3 2 - 3 3 6G a t l e y , J . S . a n d S h e r r a t t , H . S . A . ( 1 9 7 6 ) B i o c h e m . J . 1 5 8 , 3 0 7 - 3 1 5G h i s l a , S . , M a s s a y , V . , L h o s t e , J . M . a n d M a y h e w , S . G . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y 1 3 , 5 8 9 - 5 9 7H a l l i w e l l , B . ( 1 9 8 7 ) F A S E B J . 1 , 3 5 8 - 3 6 4H a n c o c k , J . T . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 8 7 ) B i o c h e m . J . 2 4 2 , 1 0 3 - 1 0 7H e e l i s , P . F . ( 1 9 9 0 ) i n C h e m i s t r y a n d B i o c h e m i s t r y o f F l a v o e n z y m e s ( M u l l e r , F . , e d . ) ,p p . 1 7 1 - 1 9 4 , C R C P r e s s , B o s t o nK a k i n u m a , K . , K a n e s a , M . , C h i b a , T . a n d O n i s h i , T . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 9 4 2 6 - 9 4 3 2K e m a l , C . a n d B r u i c e , T . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 3 , 9 9 5 - 9 9 9K i t z , R . a n d W i l s o n , I . B . ( 1 9 6 2 ) J . B i o l . C h e m . 2 3 7 , 3 2 4 5 - 3 2 4 9L a e m m l i , U . K . ( 1 9 7 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5M e r k e l , J . R . a n d N i c k e r s o n , W . J . ( 1 9 5 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 4 , 3 0 3 - 3 1 1P a r k i n s o n , J . F . ( 1 9 8 5 ) P h . D . T h e s i s , U n i v e r s i t y o f B r i s t o lR a g a n , C . I . a n d B l o x h a m , D . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m . J . 1 6 3 , 6 0 5 - 6 1 5S c h o n n b r u n n , A . , A b e l e s , R . H . , W a l s h , C . T . , G h i s l a , S . , O g a t a , H . a n d M a s s e y , V . ( 1 9 7 6 )B i o c h e m i s t r y 1 5 , 1 7 9 8 - 1 8 0 7S e g a l , A . R . a n d J o n e s , 0 . T . G . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m . J . 1 8 2 , 1 8 1 - 1 8 8S e g a l , A . W . , W e s t , I . , W i e n t j e s , F . , N u g e n t , J . H . A . , C h a v a n , A . J . , H a l e y , B . , G a r c i a , R . C . ,R o s e n , H . a n d S c r a c e , G . ( 1 9 9 2 ) B i o c h e m . J . 2 8 4 , 7 8 1 - 7 8 8S t u e h r , D . J . , F a s e h u n , 0 . A . , K w o n , N . S . , G r o s s , S . S . , G o n z a l e s , J . A . , L e v i , R . a n dN a t h a n , C . F . ( 1 9 9 1 ) F A S E B J . 5 , 9 8 - 1 0 3S m i t h , R . A . a n d C u r n u t t e , J . ( 1 9 9 1 ) B l o o d 7 7 , 6 7 3 - 6 8 67 M a y 1 9 9 2 / 4 S e p t e m b e r 1 9 9 2 ; a c c e p t e d 2 8 S e p t e m b e r 1 9 9 2

    4 9


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