CURRICULUM Name : Indah S Tantular, dr., VITAEMKes., PhD.,SpParK Department : a. Department of Parasitology, Faculty of Medicine Disease (ITD), Airlangga University Email : indahst99@yahoo.com1

indahst

b. Institute of Tropical

QUALIFICATI Graduated on Specialist ON Parasitology ,

of Clinical

June 2004 Graduated on Ph.D program , Nagoya University, Japan, July 2003. Graduated on Master of Science, Post Graduate Program, Airlangga University Surabaya, March 1997. Graduated on Under Graduate Program, Faculty 2 of Medicine, Airlangga University, Surabaya,

indahst

PEMERIKSAAN MALARIA DENGAN PEWARNAAN ACRIDINE ORANGE DAN TEKNIK PCR INDAH S TANTULAR DEPARTMENT PARASITOLOGI FK UNAIR INSTITUTE OF TROPICAL DISEASES UNAIR3

indahst

Merupakan masalah kesehatan masyarakat

Menyebabkan kesakitan dan kematian terutama pada bayi ,anak balita, dan ibu hamil Diagnosa terhadap penyakit malaria dibuat berdasarkan kriteria klinis yang dibantu oleh pemeriksaan darah secara mikroskopis Berdasarkan strategi pemberantasan malaria dari WHO, diperlukan suatu diagnosa malaria secara cepat di daerah perifer sehingga pengobatan efektif dapat segera diberikanindahst 4

UPAYA MENEKAN ANGKA KESAKITAN DAN KEMATIAN MELALUI PROGRAM PEMBERANTASAN MALARIA :-- DIAGNOSIS DINI -- PENGOBATAN CEPAT DAN TEPAT -- PENGENDALIAN VEKTOR.5

indahst

indahst

6

Pewarnaan Giemsa Metode standar hapusan darah baik tetes tebal maupun tetes tipis.-

Dapat membedakan spesies Plasmodium dan stadium parasit Memerlukan keahlian dan pengalaman yang khusus (deteksi 20-40 parasit/ul darah)

-

- Pada daerah endemis malaria dengan populasi masyarakat yang besar indahst 7 dan banyaknya infeksi malaria , maka diagnosa malaria yang

indahst

8

Plasmodium falciparumindahst 9

Hapusan darah tipis, pewarnaan langsung dengan AO Pewarnaan hanya memerlukan waktu 0,5 menit ( Giemsa memerlukan waktu 30-40 menit ). Diagnosa cepat hanya dalam waktu 3-5 menit Parasit berfluoresen, latar belakang hijau, Inti hijau kapur, sitoplasma orange Bentuk bentuk spesifik mudah diidentifikasi Morfologi eritrosit dapat diamati, parasitemia dapat indahst diestimasi

10

PEWARNAAN AO DAPAT DIGUNAKAN SEBAGAI METODE ALTERNATIF :- DAPAT MENDIAGNOSA MALARIA SECARA CEPAT - PENGOBATAN DAPAT SEGERA DIBERIKAN SECARA LANGSUNG DAN CEPAT

SEGI NEGATIFNYA : - HARGA MIKROSKOP FLUORESEN YANG SANGAT MAHAL - MEMERLUKAN ALIRAN LISTRIK - TIDAK MEMUNGKINKAN UNTUK DIBAWA KE11

indahst

LAPANGAN

indahst

12

indahst

13

PEWARNAAN KEMBALI DENGAN AO ATAU GIEMSA * SEDIAAN DARI AOindahst

- HAPUSAN DI CELUPKAN KE DALAM AIR / METHANOL 5 10 MENIT - COVER GLASS TERLEPAS - SLIDES CUCI DENGAN METHANOL 5 - 10 MENIT - KERINGKAN DI UDARA

14

* Hapusan dari Giemsa dapat dicat AO - Hapusan dicuci dengan xylol - direndam dalam methanol 1 hari - Cuci dengan methanol beberapa jam - Hasil terbaik --- > pencucian dengan 50% methanol selama 30 menit. Cover glass : di cuci dengan air bersih Objek glass : direndam detergen semalam ----> cuci dengan air bersih --- > keringkan dengan kertasindahst

15

Modifikasi metode pemeriksaan malaria AO( tanpa menggunakan mikroskop fluoresen )- mikroskop cahaya biasa dikombinasi - lampu halogen eksternal - filter Lampu halogen dapat dioperasikan dengan menggunakan baterai mobil, untuk jangka waktu beberapa jam

Mobile mikroskop / mudah dibawa ke daerah endemis malaria yang terpencilindahst 16

Modifikasi mikroskop fluoresen

indahst

17

Metode modifikasi mikroskop fluoresens ini dapat digunakan sebagai "mobile malaria clinic system",

untuk screening penderita malaria secara aktif : pada daerah terpencil yang sulit terjangkau kondisi jalan yang sangat jelek pada daerah yang belum terdapat aliran listrik untuk pemeriksaan penderita secara massal / screening di lapangan sehingga dapat segera dilakukan diagnosa dan pengobatan SEGERA ( on-site) secara tepat.indahst 18

AO method

Giemsa stain

Plasmodium falciparum microgametocyte (male)indahst 19

Plasmodium ovale trophozoit AO Giemsa

indahst

20

Plasmodium malariae schizont AO Giemsa

indahst

21

Deteksi parasit dengan cara biologi molekuler Identifikasi empat spesies malaria adalah sangat penting : - untuk pengobatan - untuk menegakkan prognosa Diagnosa secara mikroskopis untuk menentukan keempat spesies Plasmodium memerlukan waktu yang lama bila parasitemia sangat rendah.indahst

22

- amplifikasi asam nukleat invitro, dengan menggunakan suatu primer spesifik yang hanya mengenal dan berhibridisasi pada DNA target, DNA parasit. - Target : small subunit ribosomal RNA (18S rRNA gene) - Siklus reaksi : - Denaturasi ( pemisahan ke dua rantai DNA) - Annealing ( perlekatan primer pada DNA template ) indahst 23 - Extensi ( perpanjangan rantai )

Nested PCR- Untuk identifikasi spesies - menggunakan 4 macam primer yang spesifik untuk setiap spesies Plasmodium.

Kelebihan PCR. Spesifik untuk genus dan spesies ( deteksi 2parasit/ul darah) . Sensitifitas genus mencapai 100%. . Sampel dalam jumlah besar, segera dpt diperiksa dg cepat . Interpretasinya mudahindahst 24

Keterbatasan PCR Harga mahal ( primer, enzyme ) Peralatan yang canggih dan mahal Memerlukan ketrampilan yang tinggi Penggunaan dalam skala besar sulit

indahst

25

Hasil PCR ( first PCR )

W = air sebagai kontrol NC = kontrol negatif MK = marker 2-6 = sampelindahst 26

Nested PCRindahst 27

Nested PCR

Sampel 1 = infeksi P.vivax Sampel 2-6 = infeksi campuran P.vivax dan P.malariaeindahst 28

Nested PCR

Infeksi campuran P. falciparum, P.vivax, Pmalariae, P.ovaleindahst 29

DIAGNOSA CEPAT MALARIA dengan metode AO

DIAGNOSA CEPAT G6PD DEFISIENSI dengan metode Tantular & Kawamoto

Malaria positive P. falciparum Artesunate + Amodiaquine P. vivax Chloroquine + Primaquineskrining kadar enzym G6PD ini dapat dilakukan secara simultan dengan diagnosa cepat malaria di lapangan

G6PD normal dapat diberikan Primaquinindahst 30

Orange color development by the WST-8 methodReaction mixtures in a tube: (1) 40l of the substrate/dye solutions (2) 760l of water (drinking mineral water) (3) 5l of finger prick blood or blood on filter paper (6-mm in diameter)

1 2 3 4-6 7

No blood No substrate G6PD-deficient blood G6PD-deficient blood + normal blood at ratio of 3:1, 1:1, 1:3 Normal blood31

indahst

Kontrol negatif (darah normal tanpa substrat)

G6PD deficiency (2 panah) di P. Flores, Desember, 2006indahst 32

G6PD Deficiency Screening Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan)1 2 Substrate mixture Dye mixture

Total 500 test kits/Pack (cost; US$ 0.5/one kit)

indahst

33

Incidence and Mutation Analysis of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency in Eastern Indonesian Populations ( Indah S. Tantular, HMatsuoka, Suhintam P, JS. B. Tuda,, F Kawamoto. Acta Medica Okayama 2010, vol 64, no 6, pp 367373. Futher investigations of Glucose-6-phosphate dehydrogenase variants in Flores island, eastern Indonesia. (Kawamoto F, Matsuoka H, Kanbe T, Tantular IS, Suhintam et all ) J. Human Genet. 51 (11), 952-957,2006 Rapid epidemiologic assessment of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in malaria-endemic areas in Southeast Asia using a novel diagnostic kit. ( A Jalloh, I S Tantular, S Pusarawati, F Kawamoto et al) Tropical Medicine and International Health vol 9, no 5,pp 1-9 May 2004 An Improved, simple screening method for detection of Glucose-6Phosphate indahst Dehydrogenase deficiency. (Indah S.Tantular, F.Kawamoto).Tropical

34

S.Mizuno, K.Lin, 88 (2),350357,2002.

O.Kyaw, I.S.Tantular et all). J. Parasitology

Field trials of rapid test for G6PD deficiency in combination with a rapid diagnosis of malaria. (I.S.Tantular, K.Iwai, Khin Lin, F.Kawamoto et all).Trop Med and International Health vol 4,no 4, 245-250 April 1999. Field survey of malaria at Flores island,east Nusa Tenggara Province, and detection of P malariae and P ovale using two PCR based diagnoses.( Indah S Tantular,S Pusarawati,B Wirjamadi,H Marwoto,Y P Dachlan,M Kimura, F Kawamoto ). Folia Medica Indonesiana XXXV April-June 1999, 38-42. How prevalent are P ovale and P malariae in East Asia? (F.Kawamoto, Q.Liu, indahst M.U.Ferreira, I.S.Tantular). Parasitology Today vol 15,no 1035