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Research Collection
Doctoral Thesis
Résistance des racines et des cultures de tissus du tabac auChalara elegansRôles des acides aminés et des phénylpropanoides
Author(s): Poitry, Robert
Publication Date: 1985
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000364718
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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Thèse EPFZ No. 7777
RESISTANCE DES RACINES ET DES CULTURES
DE TISSUS DU TABAC AU CHALARA ELEGANS:
ROLES DES ACIDES AMINES ET DES PHENYLPROPANOIDES
présentée à
L'ECOLE POLYTECHNIQUE FEDERALE ZURICH
pour l'obtention du titre de
Docteur es sciences techniques
par
ROBERT POITRY
ing. agr. dipl. EPFZ
né le 12 mai 1953
originaire de Coppet (VD)
et Vandoeuvres (GE)
acceptée sur proposition du
Prof. Dr. H. Kern, Rapporteur
Prof. Dr. R. Corbaz, Corapporteur
1985
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TABLE DES MATIERES
1. INTRODUCTION 1
1.1. Revue bibliographique 3
1.1.1. Chalara elegans 3
1.1.2. Origine génétique de la résistance
au C. elegans chez le tabac 5
1.1.3. Mise en évidence de la résistance
dans les cultures de tissus 6
1.1.4. Les mécanismes de résistance au
C. elegans 7
1.1.4.1. Le rôles des acides aminés 7
1.1.4.2. Le rôle des composés phénoliques 8
a) biosynthèse des phénols et
formation de lignine 8
b) teneur et composition en phénolschez le taoac 10
c) le rôle des phénols dans la
résistance aux parasites 10
Chalara elegans 11
Phytophthora 12
TMV 12
Conclusion 12
2. MATERIEL ET METHODES
Pathogène 14
Les variétés de tabac 14
Conditions de culture 15
Explants, transplants et cals de tabac
parasités par le C. elegans 15
Préparation de l'inoculum 16
Infections 17
Plantes entières en terre 17
Plantes entières dans du papier buvard 17
Microscopie 17
Les cals 18
2.,1.
2.,2
2..3.
2.,4.
2.,5.
2.,6.
2.,6. 1.
2.,6. 2.
2.,6. 3.
2..6. 4.
Page 4
2..7.
2.,8.
2.,8.,1.
2.,8.,2.
2.,8.,3.
2.,8..4.
2. 8. 5.
2.,8. 6
2.,9.
2.,9. 1
Teneur en acides aminés 19
Teneur en phénols solubles 19
Les extraits bruts 19
Dosage global des phénols solubles 20
Chromatographie liquide sous
haute pression (HPLC) 20
Chromatographie sur couche mince (CCM) 21
Chromatographie sur papier (CSP) 21
Substances de référence 21
Biotests des extraits phénoliques bruts 23
Inhibition de la croissance du Clado-
sporium cucumerinum sur couche mince 23
2.9.2. Inhibition de la germination des
endoconidies 23
3. RESULTATS 24
Degré de résistance des plantes entières 24
Développement du C. elegans sur les
racines 25
Infection en terre 25
Infection des racines dans du papierbuvard 27
Degré de maladie des cals 30
Degré de maladie en fonction de la
concentration en 2,4-D 30
Influence de la quantitié d'inoculum sur
le degré de maladie des cals 32
Degré de maladie des cals cultivés avec
de l'ANA 35
Morphologie des cals et progression du
C. elegans 36
Influence de l'infection par le
Ç. elegans sur la teneur en acide 38
aminés des racines et des explants
3.4.1. Teneur en acides aminés totaux 38
3.,3. 1
3.,2.
3.,2. 1.
3.,2. 2.
3.,3.
3.,3. 1.
3.,3. 2.
3..3. 4.
3..3. 5.
3.,4.
Page 5
3.5. Spectre des acides aminés 40
3.5.1. Les tissus sains 40
3.5.2. Les tissus infectés 40
3.6. Composés phenoliques 45
3.6.1. Chromatographie liquide sous haute
pression (HPLC) des extraits bruts 45
3.6.1.1. Identification des composés phenoliques 45
3.7. Evolution de la teneur en phénolssolubles au cours de l'infection 53
3.7.1. Les racines 53
3.7.1.1 Les phénols solubles totaux 53
3.7.1.2. L'acide chlorogénique 53
3.7.1.3. La scopoline 55
3.7.1.4. Substances no.2 et 4 56
3.7.2. Les explants cultivés avec du 2,4-D 59
3.7.2.1. Les phénols solubles totaux 59
3.7.2.2. L'acide chlorogénique 60
3.7.2.3. La scopoline 61
3.7.2.4. Substances no.2 et 4 62
3.7.3. Les explants cultivés avec de l'AIA 65
3.7.3.1. Les phénols solubles totaux 65
3.7.3.2. L'acide chlorogénique 67
3.7.3.3. La scopoline 68
3.7.3.4. Substance no.2 69
3.7.3.5. Substance no.4 70
3.7.4. Influence du C. elegans sur la teneur
en phénols des différentes couches
de tissus des explants 73
3.7.4.1. Les explants cultivés avec du 2,4-D 73
3.7.4.2. Les explants cultivés avec de l'AIA 75
3.8. Biotests 78
3.8.1. Inhibition du C. cucumerinum
sur couche mince 78
3.8.2. Inhibition de la germination des
endoconidies du C. elegans 78
3.8.2.1. Influence des extraits phenoliquesbruts sur la germination des
endoconidies du C. elegans 80
Page 6
4. DISCUSSION 84
4.1. Déroulement de l'infection et
de la colonisation des racines 84
4.2. La résistance dans les cals 84
4.3. Les acides aminés 86
4.4. Les phénols 87
5. RESUME 89
ZUSAMMENFASSUNG 91
ABSTRACT 93
6. BIBLIOGRAPHIE 94
Page 7
- 1 -
1. INTRODUCTION
L'arrivée du mildiou du tabac (Peronospora tabacina) en
Europe a nécessité un changement de l'assortiment des varié¬
tés qui étaient toutes sensibles à ce pathogène. Mais les
nouvelles variétés, plus résistantes au mildiou, se sont ré¬
vélées d'une plus grande sensibilité que les anciennes à la
pourriture noire des racines causée par le Chalara elegans
(Genève, 1972; Corbaz, 1971). L'élimination du C. elegans
du sol n'a pas été entièrement résolue par des moyens de
lutte chimique. De plus, la culture du tabac est souvent li¬
mitée aux mêmes parcelles ce qui augmente la pression d'in¬
fection. La sélection de variétés résistantes au C. elegans
est devenue non seulement une nécessité, mais constitue la
solution la moins coûteuse (Clayton 1953; Delon et al.,
1977).
Dans le but de mieux discerner la part de résistance dévolue
aux gènes, de nombreux auteurs ont inoculé une partie ou un
organe de la plante, isolé de son environnement naturel. Ces
efforts se sont poursuivis avec l'utilisation de cultures de
tissus (Helgeson et al., 1972 a et b) et les cals ont même
été séparés du milieu nutritif (Deaton et al., 1982).
Parmi les substances impliquées dans les mécanismes de ré¬
sistance des plantes aux parasites, les composés phenoliques
jouent un rôle important (Ride, 1983; Legrand, 1983). Chez
les Nicotiana tabacum, leur teneur augmente fortement dans
les tissus infectés ou stimulés par un parasite (Gayed et
Rosa, 1975; Legrand, 1983). Par contre le rôle et l'action
des acides aminés, dans la résistance aux maladies fongiques,
est bien moins connu que celui des phénols. Néanmoins, la
phytotoxicité de certains acides aminés a été corrélée à la
sensibilité des variétés de tabac au C. elegans (Steinberg,
1951).
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- 2 -
Le but de ce travail est d'examiner le développement du
C. elegans sur une variété de tabac résistante et une autre
sensible au champignon et de montrer que la résistance
s'exprime aussi bien en culture de tissus que dans la plante
entière. Les teneurs en acides aminés serviront à mieux
comparer le métabolisme des cals à celui des racines et per¬
mettront d'évaluer le rôle qu'elles jouent dans la sensibi¬
lité du tabac au champignon. Un mécanisme de résistance au
C. elegans à mettre en évidence sera l'accumulation de
composés phenoliques fongitoxiques ou impliqués dans la
lignification des parois cellulaires.
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- 3 -
1.1. Revue bibliographique
1.1.1. Chalara elegans (synonyme Thielaviopsis basicola)
Le C. elegans est un Deuteromycète saprophyte très répandu
dans les sols (Lucas, 1975). Il s'attaque aux racines d'un
grand nombre de plantes de diverses familles (Johnson, 1916)
et provoque une pourriture, qui est parfois recouverte de
taches noires; celles-ci sont dues à la présence de chlamydo-
spores, d'où le nom de pourriture noire qui est donné à cette
maladie. Stover (1950 b) distingue deux types d'isolats, l'un
gris et l'autre brun, différant entre eux par leur pouvoir
pathogène pour une même variété de tabac; plus tard Gayed
(1969) découvre une souche pathogène du petit pois, qui est
apathogène pour le tabac. Huang et Patrick (1970) remarquent
que la morphologie et le pouvoir pathogène des isolats sont
très instables et les mutations fréquentes. Bozarth et
Goenaga (1977) décrivent différentes particules semblables
aux virus qui pourraient influencer le pouvoir pathogène du
C. elegans.
Le mycélium produit des endoconidies et des chlamydospores.
La formation des endoconidies et la croissance du mycélium ne
sont pas affectés par la composition en acides aminés du
milieu nutritif. Les acides aminés qui contiennent du soufre
stimulent la formation des chlamydospores; l'asparagine l'in¬
hibe chez les isolats bruns et favorise la pigmentation du
mycélium et des endoconidies. La production des chlamydo¬
spores varie selon les souches et l'acide aminé qui est uti¬
lisé comme source unique d'azote. En général, le saccharose
révèle mieux l'influence d'un acide aminé sur la production
de chlamydospores, alors que le glucose la dissimule. La pro-
line, l'acide glutamique, la lysine, l'histidine et l'argi-
nine stimulent peu la production de chlamydospores des deux
souches cultivées en présence de saccharose (Stover, 1956).
Chez le tabac, une attaque sévère du C. elegans provoque
un jaunissement des semis dans les couches. En champ, les
plantules attaquées se distinguent des saines par une déco¬
loration des feuilles, une taille réduite et une croissance
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- 4 -
ralentie. La maladie est favorisée au printemps par un temps
pluvieux, froid (Johnson et Hartmann, 1919) et un manque de
lumière (Stover, 1950 b).
Toutes les conditions défavorables à la croissance de la
plante hôte favorisent l'attaque du C. elegans; raison pour
laquelle on dit souvent qu'il est un parasite de faiblesse
(Genève, 1972; Lucas, 1975). Par temps chaud et sec, les
plantes de tabac attaquées se fanent plus rapidement que les
saines à cause de leur système racinaire endommagé. Lors¬
qu'elles ne sont que légèrement parasitées, elles peuvent
reprendre une croissance normale.
Les phases de l'infection ne sont connues que chez les
variétés sensibles. L'infection se déroule de la façon sui¬
vante. Les spores germent à la surface de la racine. Le tube
de germination s'allonge et un hyphe (hyphe de pénétration),
dont l'extrémité est très fine, pénètre dans une cellule
corticale, quel que soit l'hôte (Stover, 1950 a; Christou,
1962; Tsao et Van Gundys, 1962; Marthe et al., 1966 a; Wick
et Moore, 1983).
Le protoplasme des cellules envahies demeure tout d'abord
intact et la région entourant la pointe de 1'hyphe se colore
moins bien que le reste de la cellule (Christou, 1962, obser¬
vation chez le haricot). Le noyau des cellules avoisinantes
augmente fortement de volume chez le houx, mais pas chez le
coton et le tabac (Marthe et al., 1966 a; Wick et Moore,
1983).
Juste après la pénétration, 1'hyphe peut soit ressortir et
coloniser la surface de la racine (mycélium de surface), soit
demeurer dans la cellule corticale et la remplir lentement
par des hyphes renflés et sinueux (mycélium nourricier). Le
mycélium nourricier permet d'identifier le parasite avec cer¬
titude en l'absence de spores (Stover, 1950 a; Christou,
1962; Pierre et Wilkinson, 1970). Il cause la mort des cel¬
lules qui deviennent brunes (Christou, 1962).
Chez le coton, les premiers hyphes intracellulaires sont ob¬
servés au-devant des zones brunes et nécrotiques, alors que
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- 5 -
plus tard des substances brunes s'accumulent dans les cel¬
lules situées au-devant de ces mêmes hyphes (Pierre et
Wilkinson, 1970).
Le mycélium nourricier forme des hyphes de pénétration et
s'étend dans un certain nombre de cellules adjacentes. De ce
site d'infection localisé prend naissance un hyphe de repro¬
duction qui, lorsque l'humidité est élevée, croît vers la
surface de la racine. Le mycélium de reproduction a des pa¬
rois plus épaisses et brunes que le mycélium nourricier. Il
forme des chlamydospores dans les cellules et à la surface
de la racine et des endoconidiophores seulement à la surface.
Après les premières infections, les endoconidies sont pro¬
duites en masse et constituent un inoculum indispensable à
la propagation du champignon sur la racine. Dès que le para¬
site est installé dans la racine, il peut même coloniser la
partie basale des feuilles de plantules (Stover, 1950 a;
Christou, 1962).
1.1.2. Origine génétique de la résistance
au C. elegans chez le tabac
Les variétés cultivées sont en général très sensibles au
C. elegans. Cependant, il existe quelques variétés résistan¬
tes. Dans la plupart des cas, cette résistance provient du
Nicotiana tabacum et on admet qu'elle est polygenique (Burk
et Heggestad, 1966; Clayton, 1969; Corbaz, 1971; Genève,
1972; Litton et Stokes, 1966). Chez quelques cultivars, on a
introduit des gènes de résistance provenant du N. debneyi ou
d'autres espèces sauvages comme le N. alata ou le N. rustica.
Selon Clayton et Foster (1940), ces espèces sauvages sont
réfractaires (aucun foyer d'infection) au C. elegans et leur
résistance probablement monogénique est transmissible au
N. tabacum (Clayton, 1969). Toute fois 1'héritabilité de
cette résistance monogénique et dominante est très faible
(Clayton, 1969) et Corbaz (1971) constate que son caractère
doit être nuancé. Chez les variétés sensibles, la résistance
à la maladie augmente avec l'âge. En plus d'une résistance
variétale, il existe donc une résistance ontogénique (Lucas,
1975; Gayed et Rosa, 1975).
Page 12
- 6 -
1.1.3. Mise en évidence de la résistance
dans les cultures de tissus
L'utilisation des cultures de tissus ouvre de nouvelles pers¬
pectives en phytopathologie pour la sélection et la produc¬
tion de variétés résistantes, ainsi que pour l'étude de la
relation hôte-parasite. Il est plus facile d'évaluer les mul¬
tiples facteurs impliqués dans l'expression de la résistance
avec des cellules libérées des contraintes morpho-physiologi¬
ques de la plante entière que chez celle-ci. L'expression de
la résistance en culture de tissus constitue une condition
préalable à l'étude des mécanismes physiologiques qui la gou¬
verne. Cette expression n'est pourtant pas toujours possible
(Brettel et Ingram, 1979; Ingram, 1980).
La résistance du tabac au Phytophthora parasitica var.
nicotianae se manifeste, dans les plantes, soit par une réac¬
tion d'hypersensibilité, dépendante d'un facteur monogénique
dominant, soit par une réaction quantitative dépendante de
plusieurs gènes. Les deux types de résistance sont exprimés
dans les cals (Helgeson et al., 1972 a; Deaton et al., 1982).
Les cals possédant une résistance monogénique deviennent
sensibles au P. parasitica dès que les concentrations en
kinétine et en acide indolylacétique (AIA) tendent vers un
rapport équimolaire de 10.uM. La benzèneadénine (BA), mais
pas le 2iP (3-méthyle-2-butènyl-6-aminopurine) influence la
sensibilité de ces cals de la même façon que la kinétine.
L'AIA peut être substitué par dix fois moins d'acide
2,4-dichloro-phénoxyacétique (2,4-D). Cependant, les cals de
la variété résistante restent sensibles lorsque le rapport
des concentrations en 2,4-D et en kinétine dépasse l'unité
(Haberlach et al., 1978). Par contre, chez les cals possédant
une résistance polygenique au P. parasitica, la substitution
de la kinétine par du 2iP n'influence pas leur résistance
jusqu'au cinquième jour après l'inoculation lorsqu'ils
sont séparés du milieu nutritif (Deaton et al., 1982). L'uti¬
lisation d'un milieu nutritif différent, ainsi que le rem¬
placement de l'acide indolylacétique par de l'acide naphta-
lèneacétique (ANA) sont peut-être à l'origine de ces résul¬
tats contradictoires.
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- 7 -
1.1.4. Les mécanismes de résistance au C. elegans
Les mécanismes de la résistance ont été étudiés par diffé¬
rents auteurs qui souvent ne précisent pas l'origine des
gènes de résistance. En 1927, Conant a proposé un mécanisme
de résistance au C. elegans de nature morphologique, dû à la
formation d'une barrière de liège et de nouvelles cellules
(cal). Ce mécanisme a été rejeté par Jewett (1938), qui
l'attribue à une action régénératrice de la plante. La ré¬
sistance au C. elegans aurait lieu plus tôt et proviendrait
de molécules fongitoxiques.
Schiltz et Genève (1968) corrèlent le degré de résistance
des variétés à leur capacité de former de nouvelles racines.
Ils montrent, en outre, que les facteurs climatiques influ¬
encent la rhizogénèse ainsi que le degré de résistance de
ces variétés à la pourriture noire. La résistance s'exprime
déjà au stade cotylédonaire, mais seulement si les les plan-
tules sont normalement pourvues en magnésium (Corbaz, 1971;
Genève, 1972).
1.1.4.1. Le rôle des acides aminés
Les teneurs en amides, asparagine et glutamine des feuilles
et des tiges de tabacs augmentent avec l'âge. Les teneurs
des autres acides aminés fluctuent peu (Vallée et al., 1967;
Dumas et al., 1981). La teneur en acides aminés solubles est
plus élevée dans les cals que dans le parenchyme médullaire
du tabac et cette différence provient d'une teneur plus éle¬
vée en glutamine et en asparagine (Kasperbauer et Hamilton,
1977).
La formation des chlamydosores est influencée par la source
d'azote et de carbone (cf. 1.1.1.).
Un certain rôle a été attribué aux acides aminés dans la ré¬
sistance au C. elegans. L'analine, 1'hydroxyproline et la se¬
rine sont toxiques pour toutes les variétés de tabac testées
par Steinberg (1951). L'acide aspartique, la lysine, la se¬
rine, la valine, la méthionine et la thréonine sont plus
toxiques pour les variétés sensibles au C. elegans que pour
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- 8 -
les résistantes. La phytotoxicité des acides aminés pour les
variétés de tabac est donc corrélée à leur sensibilité au
C. elegans. Mais il n'y a pas toujours une relation entre la
teneur en acides aminés d'une plante et sa résistance à un
parasite. Après une infection fongique, certains acides
aminés s'accumulent dans les tissus tandis que d'autres
voyent leur teneur diminuer. Les acides aminés peuvent
nourrir le parasite ou être utilisés pour une réaction de
défense contre le pathogène (Van Andel, 1966). Les tiges et
les feuilles de tabac, parasitées par le Pseudomonas solana-
cearum, diminuent leur teneur en acides aminés à l'exception
de la phenylalanine et du tryptophane qui s'accumulent
24 heures après l'infection (Pegg et Sequeria, 1968).
1.1.4.2. Le rôle des composés phenoliques
a) biosynthèse des phénols et formation de lignine
Les acides cinnamiques, les coumarines, les flavonoides et
la lignine font partie des composés phenoliques naturels. Les
voies de l'acide shikimique aboutissent à la formation du
tryptophane, qui est un précurseur de l'acide indolylacétique
(Wightman, 1962), et de la phenylalanine et de la tyrosine
qui sont des précurseurs des acides cinnamiques (Neish,
1964). La phenylalanine ammonia-lyase (PAL) et la tyrosine
ammonia-lyase (TAL) sont les deux enzymes importantes qui
gouvernent la synthèse des composés phenoliques (Camm et
Towers, 1973; Lamb et al., 1980).
Chez le tabac et dans ses cals, la TAL paraît absente. La
principale voie de biosynthèse des phénylpropanoides débute
par la phenylalanine et passe par l'acide cinnamique, l'acide
p-coumarique, l'acide caféique, l'acide férulique et la sco-
polétine. L'acide férulique et l'acide sinapique sont les
précurseurs de la lignine; ce dernier acide est aussi un pré¬
curseur des flavonoides (Legrand, 1983). La scopoline, les
esters de l'acide quinique (les acides caféylquiniques,
p-coumarylquiniques et férulylquiniques) et les acides café-
iques et féruliques estérifiés avec du glucose sont des
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- 9 -
formes de stockage (Ravisé et Tanguy, 1973; Fritig et al.,
1970). Fritig et al. (1970) constatent que la conversion de
/ 14l'acide férulique (C ) en scopoletine est faible, la majeur
partie de la radioactivité reste localisée dans les parois
cellulaires, et que l'acide cinnamique est un meilleur pré¬
curseur. La radioactivité (C ) de la scopoline ou de la sco-
polétine se partage entre une fraction digérée par la pronase
(12%) et une fraction "lignine" (33%), alors que le 47% reste
dans la fraction soluble. Cependant, la part de lignine vraie
est faible dans la fraction "lignine" (Loewenberg, 1969).
Toutefois, la scopolétine n'est pas le seul précurseur de la
lignine. L'acide p-coumarique, l'acide férulique et l'acide
sinapique remplissent aussi cette fonction. Les activités
maximales des enzymes principales du métabolisme des phényl-
propanoides £la phenylalanine ammonia lyase (PAL), la cinna-
mate 4-hydroxylase et la o-méthyltransférase 3 apparaissent
de façon séquentielle selon l'accumulation des composés phe¬
noliques décrite plus haut. L'activité enzymatique des
peroxydases devient maximale lorsque celle de la o-méthyl¬
transférase décline (Legrand et al., 1975). Les peroxydases
participeraient à la polymérisation des alcools coniféry-
lique, coumarilyques et sinapilyques lors de la formation de
la lignine (Mâder et al., 1977). L'activité des peroxydases
augmente dans les cellules saines stimulées par le TMV et
ayant déjà accumulé de la scopoline et de la scopolétine
(Legrand et al., 1975). Mâder et al. (1977) distinguent trois
groupes d'isoenzymes à activité peroxydasique. La scopolé¬
tine, ainsi que les alcools conyférylique et coumarilyque,
possèdent une très grande affinité pour le groupe G locali¬
sé dans la paroi des cals du tabac. Le même groupe d'isoen¬
zymes G a, en outre, une grande affinité pour les substrats
artificiels et dégraderait des substances étrangères élabo¬
rées lors d'une blessure ou d'une infection parasitaire.
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- 10 -
b) teneur et composition en phénols chez le tabac
La teneur et la composition en phénols varie non seulement
en fonction de l'organe et de son âge (Sheen, 1969; Gayed et
Rosa, 1975), mais aussi de la variété de tabac (Ravisé et
Tanguy, 1973). La teneur en acide chlorogénique augmente
avec l'âge des plantes (Gayed et Rosa, 1975). Mais les
plantules âgées de 3 semaines en contiennent plus que celles
âgées de 4 semaines. Les racines ont une teneur en acide
chlorogénique plus élevée que les feuilles entre la cinquième
et la septième semaine et à partir de la treizième semaine
les feuilles en contiennent plus que les racines. La teneur
en scopoline est plus élevée dans les racines que dans les
feuilles matures (Sheen, 1969). Les flavonoides sont pré¬
sents à l'état de trace dans la plante, sauf dans les an¬
thères et la corolle (Sheen, 1969). Les cals du tabac ont
une teneur en scopoline et en scopolétine plus élevée que les
racines. La scopolétine est excrétée dans le milieu de cul¬
ture avec des concentrations croissantes d'AIA mais pas de
2,4-D (Sargent et Skoog, 1960). L'influence de l'AIA sur la
concentration en scopoline des cals est indirecte (Loewen-
berg, 1969).
c) rôle des phénols dans la résistance aux parasites
Le métabolisme des phénols du tabac est perturbé par un grand
nombre de stimuli tels que: la lumière, des agents chimiques,
des infections fongiques, bactériennes et virales (Wender,
1970; Fritig et al., 1972; Ravisé et Tanguy, 1973; Gayed et
Rosa 1975; Legrand et al., 1975). Une synthèse accrue et une
accumulation de phénols solubles accompagnent en général
l'infection. Les phénols peuvent contribuer à la formation de
papilles, à une lignification plus intensive des cellules
voisines ou à la production de substances fongitoxiques comme
les phytoalexines (Friend, 1981; Ride, 1983; Mansfield,
1983). La seule phytoalexine qui a été identifiée dans les
cals du tabac est le capsidiol, un terpénoide (Helgeson et
al., 1978).
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- 11 -
Une lignification accélérée des parois cellulaires a plu¬
sieurs conséquences sur la progression d'un parasite dans les
tissus de l'hôte (Ride, 1975, 1983). Les parois lignifiées
forment une barrière plus résistante à la pénétration de
l'hyphe et à la dégradation enzymatique par le parasite que
les parois essentiellement cellulolytiques. La lignine pro¬
tège les polysaccharides ou modifie leur structure de telle
façon à ce qu'ils ne soient plus des substrats convenables
pour les enzymes cellulolytiques du champignon. La lignine
imperméabilise en même temps les parois cellulaires et dimi¬
nue les échanges de molécules (enzymes, toxines, nutriments
et eau) entre la cellule de l'hôte et le parasite. L'activité
des peroxydases pariétales, éventuellement hostiles à cer¬
tains métabolites du parasite, est stimulée lors de la ligni¬
fication (Mâder et al., 1977). Ainsi la lignification indui¬
rait une double protection, physique et chimique, contre les
parasites.
Chalara elegans
Dans les feuilles et les racines de N. tabacum inoculés et
résistants au C. elegans, la teneur en acide chlorogénique
augmente plus fortement que dans celles des sensibles. Les
racines et les feuilles de plantules inoculées ont une teneur
en acide chlorogénique supérieure à celles des tissus sains,
13 et 15 semaines après l'inoculation. Cependant, les racines
inoculées du N. debneyi, réfractaire au C. elegans, augment¬
ent très peu leur teneur en acide chlorogénique et en con¬
tiennent à peine plus que les racines saines des N. tabacum.
L'acide chlorogénique peut être toxique pour le C. elegans.
Des concentrations élevées, à partir de 1 mg/1, diminuent le
pourcentage de germination des endoconidies ainsi que la
longueur des hyphes de germination (Gayed, 1969; Gayed et
Rosa, 1975). Mais ces concentrations élevées ne sont proba¬
blement pas atteintes dans les plantes lors de l'infection.
Selon ces auteurs, le rôle de l'acide chlorogénique dans la
résistance au C. elegans serait plutôt de participer à l'édi¬
fication d'une barrière ligneuse servant à isoler les tissus
parasités des sains que d'agir directement sur le parasite.
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- 12 -
D'autres composés phenoliques ont été impliqués lors d'une
plus grande sensibilité des plantes aux champignons. Ainsi
les acides benzoique, phénylacétique, hydrocynnamiques et
phénylpropioniques sont libérés par les déchets organiques
en décomposition dans les sols lourds et humides, à basse
température (Patrick et Koch, 1963). Ces composés stimulent
la germination des chlamydospores sur les racines traitées.
Ils augmentent la perméabilité cellulaire et favorisent
l'émission d'exudats racinaires. Mais leur action sur la
perméabilité cellulaire n'est pas plus effective que celle
d'autres composés phytotoxiques. Leur spécificité est plutôt
à rechercher dans leur faculté de stimuler la germination des
chlamydospores (Linderman, 1970).
Phytophthora
Des plantules de tabac inoculées par diverses souches de
Phythophthora ont une teneur en phénols solubles plus élevée
que les saines. Toutefois le degré de fongitoxicité des ex¬
traits de plantules saines et inoculées ne correspond pas à
leur teneur en phénols solubles totaux (Ravisé et Tanguy,
1973).
TMV
Les feuilles du N. tabacum var. Samsoun NN inoculées avec du
TMV accumulent des phénols et réagissent par la formation de
nécroses locales au site d'infection. La concentration de
l'acide chlorogénique diminue avant l'apparition des symp¬
tômes (34 heures après l'inoculation) et augmente rapidement
pendant les 12 heures suivantes, pour ensuite diminuer à nou¬
veau. L'accumulation d'acide chlorogénique est la conséquence
d'une synthèse accrue, tandis que sa disparition serait due à
une stimulation de son catabolisme. Par contre, la concentra¬
tion en scopoline augmente dès l'inoculation et son accumula¬
tion est la conséquence d'une synthèse accrue et d'un ralen¬
tissement de son catabolisme (Fritig et al., 1972). Les con¬
centrations maximales en phénols, au site d'infection, sont
atteintes bien après l'apparition des symptômes. Cependant,
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- 13 -
la stimulation du métabolisme des phénols débute bien avant
l'apparition des symptômes. Les cellules situées à la péri¬
phérie des nécroses sont fluorescentes à cause d'une accumu¬
lation de scopoline et de scopolétine. Ces cellules intensi¬
fient la lignification de leur paroi et érigent ainsi une
barrière qui freine la propagation du TMV (Massala, 1981).
Conclusion
Chez les N. tabacum, la quantité de phénols solubles accumu¬
lés après une infection fongique ou virale correspond à un
degré de résistance. Cependant cette corrélation ne peut être
généralisée pour d'autres Solanacées. Ainsi les tubercules
infectés de la pomme de terre augmentent leur concentration
en scopoline avec la sensibilité du clone au Phytophthora
infestans. L'acccumulation d'acide chlorogénique est minime
dans les tubercules infectés, mais par contre très forte
dans les tissus blessés. L'accumulation de scopoline est un
facteur de sensibilité qui dépend de l'hôte et n'est pas in¬
fluencé par le genre de pathogène (Clarke, 1973; Clarke et
Baines, 1976). Dans les tubercules de la pomme de terre, la
résistance au P. infestans est corrélée à une accumulation
de terpénoides (rishitine et lubimine) qui sont élicités par
des acides gras insaturés (acides arachidonique et ecosa-
pentaneoique) d'origine fongique. Ces deux éliciteurs in¬
hibent la synthèse des glycoalcaloides (solanines et chaco-
nines) au profit de celle des deux phytoalexines (Tjamos et
Kuc, 1982). L'accumulation de phénols solubles dans les
tubercules infectés est une réaction secondaire. Chez une
variété sensible au P. infestans, l'activité de la PAL et la
teneur en acide chlorogénique sont maximales 24 heures après
l'inoculation ou une blessure des tissus. L'activation de la
PAL et de la synthèse d'acide chlorogénique sont les consé¬
quences d'une blessure des cellules provoquées par les hyphes
lors de l'infection et ne dépend pas du pouvoir pathogène du
P. infestans (Smith et Rubery, 1981). Cependant l'éliciteur
de la PAL demeure inconnu, tant chez la pomme de terre que
chez le tabac.
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- 14 -
2. MATERIEL ET METHODES
2.1. Pathogène
Chalara elegans Nag Raji et Kendrick, synonyme Thielaviopsis
basicola (Berk. et Br.) Ferraris, souche EPF-Z no.771-c, a
été isolé en 1980, selon la méthode de Delon et al. (1977),
des racines du Nicotiana tabacum, variété Sota 50 infectée
artificiellement avec la souche 771 du Centre de recherches
sur le tabac, à Nyon.
2.2. Les variétés de tabac
Les variétés de tabac utilisées et leurs caractéristiques
sont mentionnées dans le tableau no.1.
Tab. 1: Les variétés de tabac
Espèces et
variétésParticularités
agronomiques
Résistance à la
pourriture noire
Nicotiana tabacum
Kentucky 170
Mont-Calme-Brun
Sota 50
germination lente,croissance rapide
germination et
croissance rapides
croissance rapide
résistance issue
du N. debneyi, a
résistance hori¬
zontale, b
très sensible, b
Nicotiana rustica
NRT croissance lente résistant, c
a: Litton et Stokes 1966, b: Corbaz 1971 et 1978,
c: Genève 1972
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- 15 -
2.3. Conditions de culture
Les semences désinfectées (1 min dans 70% EtOH, 10 min dans
2% H_0 et rincées 3 fois à l'eau distillée) sont mises à
germer en terre. Après 3 semaines, les plantules sont repi¬
quées à raison d'une plante par pot. Pour les essais d'infec¬
tion, que ce soit dans de la terre ou du sable, on utilise
des pots d'un diamètre de 11 cm et de 8 cm de hauteur et les
plantes reçoivent une solution de Knop à demi concentration
[composition en g/1, pour la concentration normale: 0,5g
Ca(N03)2 x 4H20, 0,125 g KNO-j, 0,125 g KH2P04, 0,125 g
MgSO. x 4H20 ] et sont placées en chambre climatisée (16 h à
4000 lux et 22 °C et 8 h à l'obscurité et à 15 °C; humidité
relative de l'air 60%).
Pour les cultures de tissus, les plantules sont repiquées en
terre (0 des pots 25 cm et hauteur 27 cm), placées en serre
et arrosées d'une solution de Knop à concentration normale.
2.4. Explants, transplants et cals de tabac parasitéspar le C. elegans
Au cours de ce travail, les termes: explant, transplant et
cal reviendront souvent dans le texte. Un explant correspond
à la masse de cellules, tissu, que l'on obtient après les
premiers 28 jours de culture et le transplant désigne un
tissu qui a déjà été subcultivé. Le terme de cal sera utili¬
sé pour désigner l'un ou l'autre de ces tissus sans préciser
son origine.
Les explants du parenchyme médullaire de la tige sont préle¬
vés selon la méthode d'Helgeson (1979) légèrement modifiée.
Les inter-noeuds sont rincés plusieurs fois à l'eau courante
puis égouttés et transférés dans une hotte à flux laminaire.
Ils sont ensuite plongés pendant 30 s dans 70% d'alcool addi¬
tionné de quelques gouttes de Tween 20 et transférés dans 5%
d'eau oxygénée pendant 10 min.
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- 16 -
Un cylindre de tissu est prélevé dans le parenchyme médul¬
laire avec un emporte-pièce (0 4mm); les extrémités, au
moins 1 cm, sont éliminées et le reste débité en rondelles de
2 mm d'épaisseur. Les explants sont cultivés sur le milieu
nutritif de Linsmaier et Skoog (1965; 40 ml/boîte de Pétri,
de 9 cm) dépourvu des éléments à option, avec diverses con¬
centrations d'acide indolylacétique (AIA), d'acide naphta-
lèneacétique (ANA), ou d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
(2,4-D), tandis que la même concentration de kinétine
(6-furfurylaminopurine) a été choisie pour tous les essais
(4,64,uM). Les hormones, la vitamine 3, ainsi que l'inosi-
tol sont ajoutés au milieu nutritif autoclave, par filtration
à travers une membrane stérile (diamètre des pores de
0,2.uni). Les cals (5 par boîte de Pétri fermée par une
bande de Parafilm de 1'American Can Company) sont incubés à
27 C et à l'obscurité pendant 28 jours, avant d'être in¬
fectés ou subcultivés.
2Pour les subcultures successives, des transplants de 20 mm
et 100 mg de poids frais au moins sont transférés sur le nou¬
veau milieu nutritif tout en veillant à maintenir l'orienta¬
tion originale de l'expiant.
2.5. Préparation de 1'inoculum
Le champignon est cultivé pendant 15 jours à 25 C sur de la
gélose maltée à 2%, sauf lors d'expériences pour l'infection
des racines où l'on utilise un milieu liquide (potato dex¬
trose broth -PDB- additionné de 5 g/1 d'extrait de levure,
200 ml/elenmeyer de 500 ml).
Les suspensions d'endoconidies s'obtiennent par un rinçage
des jeunes colonies selon la méthode de Corbaz (1971).
Le nombre d'endoconidies est déterminé avec un hématimètre
(Thoma) et ajusté à la concentration désirée avec de l'eau
distillée stérile. Lors de l'infection de racines, cultivées
selon la méthode du papier buvard, une solution de Knop rem¬
place l'eau distillée. Pour l'infection de racines cultivées
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- 17 -
en terre, 200 ml de culture du C. elegans sont broyés à
l'ultraturrax (deux fois 30 secondes, 2000 tours/min) et di¬
visés en portions de 50 ml. L1inoculum est utilisé immédiate¬
ment.
2.6. Infection
2.6.1. Plantes entières en terre
L'inoculum est réparti dans quatre trous, percés dans le
substrat à 3 cm de la tige des plantules âgées de 6 semaines.
Après 20 jours, les racines de chaque plante sont lavées et
pesées séparément (5 plantes par répétition et procédé; 3 ré¬
pétitions). Dans un autre essai, les racines sont prélevées
après 10 et 34 jours, découpées en segments de 1,5 cm à par¬
tir de 1'hypocotyle et conservées dans du lactophénol addi¬
tionné de bleu d'aniline pour être examinées au microscope.
2.6.2. Plantes entières dans du papier buvard
Les plantes cultivées dans le sable pendant 6 semaines sont
soigneusement dégagées des pots et le système racinaire lavé
à l'eau courante. Les racines sont égouttées avant de rece-
5voir 20 ml d'une suspension d'endoconidies (10 /ml de solu¬
tion de Knop) par pulvérisation. Les racines, enveloppées
d'un buvard resserré autour de 1'hypocotyle, sont introduites
dans un gobelet contenant 10 ml de solution de Knop. Seul le
papier buvard est en contact avec la solution nutritive.
Après 5 et 10 jours d'incubation, en chambre climatique, les
racines sont soit lyophilisées soit préparées pour la micro-
scopie (cf. 2.6.1).
2.6.3. Microscopie
On relève (objectif 40) le nombre de chlamydospores et d'en-
doconidiophores, ainsi que le pourcentage de la surface des
racines occupé par du mycélium. Le degré de maladie est éva¬
lué selon l'échelle suivante: 0 = 0, + = 1 à 49, ++ = 50 à 75
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- 18 -
et +++ > 75, nombre par 1.5 cm de racine ou pourcentage de la
surface couverte par du mycélium. Chaque relevé résume l'ob¬
servation de 5 plantes, à raison de douze racines par plante.
2.6.4. Les cals
L'inoculum est déposé au sommet du cal, soit à l'intérieur
d'un anneau de silicone (0 intérieur 4 mm) qui le couronne,
avec une concentration de 250 endoconidies/50 ,ul, soit di¬
rectement pour une concentration de 20 endoconidies/1 0,ul.
Les témoins sont cultivés dans des boîtes de Pétri séparées
et reçoivent de l'eau distillée. Au bout de 0, 4, 7 et 10
jours, les cals sont lyophilisés après que leur degré de
maladie ait été évalué selon l'échelle suivante: 0 = pas de
mycélium ni de spores visibles, 1 = le champignon recouvre
jusqu'au quart de la surface du cal, 2 = le champignon re¬
couvre plus de la moitié mais moins que les 3/4 du cal,
3 = le champignon recouvre plus des 3/4 du cal. Le degré de
maladie de chaque cal est évalué séparément et on calcule
l'indice moyen de la répétition. Les différences significa¬
tives entre les indices moyens de maladie sont calculées
d'après un X-test et données pour une probabilité de 99,99%.
Tous les essais d'infection entrepris avec un inoculum de 20
endoconidies ont été répétés deux fois, avec au moins 30 cals
par procédé et répétition. Lors de l'utilisation d'un inocu¬
lum plus massif (250 endoconidies), les essais n'ont pas été
répétés, mais le nombre de cals inoculés a été élevé à 200
par procédé pour le 2,4-D et 80 cals avec l'AIA.
Page 25
- 19 -
2.7. Teneur en acides aminés
Les explants sont cultivés sur le milieu de Linsmaier et
Skoog (1965) avec 4,64.uM de kinétine et 5,7,uM d'AIA ou
4,52,uM de 2,4-D et inoculés avec 250 endoconidies/50,ul.
Les tissus bruns et parasités des explants sont découpés et
réduits en poudre avant d'être soumis à l'analyse, tandis que
que l'ensemble du système racinaire broyé d'une plante, cul¬
tivée selon la méthode papier buvard, sert d'échantillon. La
méthode d'extraction est inspirée des procédures d'Hill-
Cottingham et Cooper (1969) et de Kasperbauer et Hamilton
(1977). Les tissus réduits en poudre (50 mg de matière sèche)
sont infiltrés sous vide par 50 ml d'une solution acétone-eau
(1/1, v/v) à 2 °C et agités pendant 24 h. Après filtration
(fibre de verre, Whatmann G/FA), les extraits aqueux sont
lavés avec le même volume de chloroforme. La phase aqueuse
est réduite à sec, sous vide (température de l'eau inférieure
à 40 C) et reprise par 1 ml d'acide chlorhydrique 6N puis
hydrolyse 24 h à 110 °C, sous azote. L'acide chlorhydrique
est évaporé sous vide et repris dans un tampon d'acide ci¬
trique à pH 2,2 puis filtré sur une fritte de verre G.. Les
échantillons ont été analysés selon la méthode d'Amadô et al.
(1983) avec un analyseur d'acides aminés Liquimat III (Kon-
tron AG, Zurich) équipé d'une résine Dionex DC 6A. Les ex¬
tractions ont été faites deux fois. La teneur en acides ami¬
nés totaux correspond à l'addition de la teneur en acides
aminés individuels.
2.8. Teneur en phénols solubles
2.8.1. Les extraits bruts
Les tissus sont obtenus comme décrit en 2.6.2. et 2.6.4. et
réduits en poudre. Ils sont extraits trois fois au méthanol
à 80% (3 ml/10 mg de MS pour les explants et 3 ml/50 mg de
MS pour les racines). Les extraits sont d'abord portés à
ébullition pendant 5 minutes et, une fois refroidis, traités
aux ultrasons, 5 fois une minute à 30 s d'intervalle. Après
Page 26
- 20 -
centrifugation (20 000 g, 20 min), le culot est défait au
Vortex avant d'être extrait à nouveau au methanol et traité
aux ultrasons. Les surnageants réunis sont réduits à sec et
repris par 0,5 ml de methanol à 15%, centrifugés 60 min et
conservés à -20 C. Chaque extrait est analysé par les deux
méthodes suivantes: le dosage global des phénols solubles
et par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC).
2.8.2. Dosage global des phénols solubles
Les phénols solubles totaux ont été dosés avec le réactif
de Folin-Ciocalteau (Merck) selon la méthode de Swain et
Hillis (1959) dans des échantillons de 0,1 ml; l'acide féru¬
lique sert d'étalon.
2.8.3. Chromatographie liquide sous haute pression (HPLC)
Le système de Court (1977) de chromatographie en phase re¬
verse pour l'analyse des phénols des feuilles de tabac a été
retenu. L'appareillage disponible se composait de deux pompes
Altex (modèle 110) reliées à un amortisseur (Touzard et
Matignon) et une valve d'injection Valco (7000 PSI), ainsi
que d'un programmeur de solvant (Altex, Gradient Master).
Une précolonne Waters, remplie de Lichrosorb RP 8 (10,um,
Merck) remplacé occasionnellement et une colonne Waters Bond-
pak C_, 10,um (3,9 x 300 mm), ont été couplées à un dé¬
tecteur UV (Uvikon LCD 725, Kontron) à longueur d'onde vari¬
able. La surface des pics a été intégrée avec un intégrateur
HP 3385 A (Automation System) à 330 nm. L'élution est accom¬
plie selon un gradient linéaire de A (16% MeOH dans 0,1M
KH2P04) à B (40% MeOH dans 0,1M KH2P04) en 20 min, avec un
flux de 1 ml/min et une pression initiale de 1200 PSI. Les
échantillons ont été analysés trois fois, à raison de 10,ul
par injection. Les substances de référence (acide caféyl-3
quinique, scopoline et scopolétine) ont été injectées toutes
les dix chromatographies.
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- 21 -
2.8.4. Chromatographie sur couche mince (CCM)
Des extraits ont été chromatographiés sur couche mince de gel
de silice 60 (0,2 mm, Merck) avec le mélange butanol/acide
acétique/eau (4/1/1; Wegen et Glase, 1981) ou avec un mélange
chloroforme/méthanol (1/9). Ils ont été chromatographiés sur
gel de silice G avec le mélange benzène-acide acétique (9/1;
Fry, 1982).
Les composés phenoliques ont été mis en évidence par pulvéri¬
sation des réactifs suivants (préparés selon Stahl, 1967):
Folin-Ciocalteau, para-nitroaniline diazotée, ninhydrine,
Ehrlich, sel de bleu solide B (Fluka), anisaldéhyde, A1C13 et
vaniline HC1. La couleur des taches obtenues avec ces réac¬
tifs a été comparée à celles des substances de référence et à
celles données dans la bibliographie.
2.8.5. Chromatographie sur papier (CSP)
Des extraits ont été chromatographiés sur papier Whatmann
no. 2, direction descendante, avec la phase supérieure du mé¬
lange butanol/acide acétique/eau (4/1/5) ou avec 2% d'acide
acétique. Les bandes fluorescentes ont ensuite été analysées
par HPLC (cf. 2.8.3).
2.8.6. Substances de référence
L'acide caféyl-3 quinique (acide chlorogénique) a été acheté
(Fluka) alors que les acides caféyl-4 quinique ("Band 510")
et caféyl-5 quinique (acide néochlorogénique) ont été obte¬
nus selon la méthode de Scarpati et Esposito (1963). Les for¬
mes cis des acides cafeiques, feruliques et paracoumariques
ont été obtenues par irradiation d'échantillons commerciaux
des formes trans selon la méthode de Kahnt (1966). Les esters
de l'acide férulique (méthylférulate, éthylférulate et butyl-
férulate) ont été produits selon la méthode de Fry (1982). La
scopoline a été extraite au methanol des racines d'Atropa
belladonna et purifiée sur une colonne de Sephadex LH-20
(2,5 x 30 cm) éluée à l'eau. Le degré de pureté a été vérifié
par chromatographie sur couche mince et par HPLC. Un aliquot
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- 22 -
de la scopoline purifiée a été hydrolyse (2N HCl) à 1 10 °C
pendant 30 min et la quantité de scopolétine extraite, à
tate d'éthyle, comparée à la teneur connue d'un échantillon
commercial de scopolétine (Serva). Toutes les fractions ont
été analysées par HPLC pour vérifier le rendement de l'hydro¬
lyse. En HPLC, les pics ont été identifiés en injectant la
substance de référence seule et mélangée à l'extrait et en
comparant les temps de rétention et les spectres en UV. Les
pics des substances inconnues ont été hydrolyses une fois à
110 C en milieu acide (2N HCl) et une autre fois à tempéra¬
ture ambiante, sous azote, en milieu alcalin (2N NaOH), puis
rechromatographiés en HPLC et sur couche mince pour identi¬
fier l'aglycone.
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- 23 -
2.9. Biotests des extraits phenoliques bruts
2.9.1. Inhibition de la croissance du Cladosporiumcucumerinum sur couche mince
Les extraits bruts (cf. 2.8.1) sont chromatographiés sur
couche mince à raison de 1 mg de matière sèche (MS) pour les
explants et de 5 mg de MS pour les racines (cf. 2.8.4.). Les
chromatogranimes sont atomisés avec une suspension dense de
7spores (10 /ml pour le C. elegans ou pour le Cladosporium
cucumerinum, dans 2% de PDB et 0,1% de Tween 20), et incubés
3 jours à 27 C et 100% d'humidité; après quoi, on observe
les zones dépourvues de mycélium.
2.9.2. Inhibition de la germination des endoconidies
Les extraits bruts (cf. 2.8.1., l'équivalent de 0,4 mg de MS
pour les explants et de 2 mg de MS pour les racines) sont dé¬
posés sur de fines rondelles de gélose (2 mm de haut et 1 cm
de 0, 1% de gélose Difco). Celles-ci sont séchées pendant
24 h a 27 C, puis reçoivent 20,ul d'une suspension d'endo-c /
conidies (10 /ml de jus de carotte obtenu selon la méthode
de Mathre et Ravenscroft, 1966 a). Après 6 h d'incubation à
27 C et 100% d'humidité, on arrête la croissance des
hyphes avec une goutte de lactophénol-bleu d'aniline. Une en-
doconidie est considérée comme germée lorsque 1'hyphe dépasse
la longueur de celle-ci. Les résultats sont exprimés en pour¬
centage de germination. Le pourcentage de germination des té¬
moins ayant reçu 15% de methanol est égale à 100 (3 répéti¬
tions avec chacune 3 rondelles par extrait et l'observation
de 200 endoconidies par rondelle). Un essai est annulé si les
témoins n'atteignent pas 85% de germination.
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- 24 -
3. RESULTATS
3.1. Degré de résistance des plantes entières
Les variétés NRT et Kentucky 170 sont très résistantes au
C. elegans et ne montrent pas de symptômes. Le poids frais de
leurs racines n'est pas affecté, 20 jours après l'inoculation
(tab. 2).
Tab. 2: Influence du C. elegans sur le poids frais des ra¬
cines (20 jours après l'inoculation en terre, poids
frais des témoins = 100%).
Variétés Poids frais
de tabac
NRT 100,0 + 22,6 a 1,95 + 0,19
Kentucky 170 105,3 + 21,3 a 1,71 + 0,19
Mont-Calme-Brun 30,6 + 8,6 b 1,0 + 0,21
Sota 50 15,3 + 4,6 b 0,43 + 0,2
a, b: les nombres suivis de la même lettre ne présentent pas
de différences significatives entre eux.
Le feuillage des plantules infectées de la variété Mont-Calme
Brun pouvait facilement être confondu avec celui des plan¬
tules saines; pourtant leurs racines sont très malades (70%
de perte en poids frais). La variété Sota 50 est très sen¬
sible au parasite. Les plantules parasitées ont une taille
très réduite et des feuilles chlorotiques. Les rares racines
qui subsistent sont couvertes de mycélium (84% de perte en
poids frais des racines).
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- 25 -
Choix des variétés: la variété résistante Kentucky 170 sem¬
blait être la variété la plus appropriée de par ses quali¬
tés culturales. Elle offre l'avantage d'une croissance ra¬
pide et fournit des tiges d'un diamètre suffisant pour le
prélèvement aisé des explants. La variété Mont-Calme-Brun,
aux racines complètement ravagées par la pourriture noire,
conserve des tiges et des feuilles de la même taille que les
plantes témoins. Ceci nous laisse supposer que cette variété
possède ,un type de résistance différent des autres variétés.
Pour ces raisons, le Sota 50 très sensible à la pourriture
noire et le Kentucky 170 très résistant ont été choisis pour
les essais ultérieurs.
3.2. Développement du C. elegans sur les racines
3.2.1. Infection en terre
La variété sensible Sota 50, 5 jours après l'inoculation, est
uniquement parasitée dans la partie inférieure de l'hypoco¬
tyle (tab. 3). Par contre après 10 jours, les racines sont
moyennement envahies (classe + à ++) par du mycélium intra¬
cellulaire, aux hyphes renflées et sinueuses, et chargées de
chlamydospores. Le mycélium de surface ne couvre qu'un faible
pourcentage (1 à 49) des racines. Il est constitué d'hyphes
hyalines et peu ramifiées qui deviennent plus tard brunes et
s'épaissisent aux extrémités; celles-ci portent souvent des
fructifications. Ce dernier type de mycélium, appelé repro¬
ducteur, n'a pas été pris spécialement en considération.
Après 34 jours, le nombre de chlamydospores et de cellules
envahies par le mycélium intracellulaire augmente. Le mycé¬
lium de surface disparaît. Les racines de la variété ré¬
sistante Kentucky 170, à part de rares exceptions où des
cellules isolées sont envahies par du mycélium, sont exemptes
du C. elegans.
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- 26 -
Tab. 3: Développement de C. elegans sur les racines de
tabacs cultivés en terre.
Variétés
de tabac Sota 50 Kentucky 170
Jours après1'infection 10 34
Chlamydospores + à ++ +++
Cellules avec
mycéliumintracellulaire + à ++ +++
10 34
0 0
Mycélium de
surface (%)
Echelle: 0 = 0, + = 1 à 49, ++ = 50 à 74, +++ > 75, nombre
par 1.5 cm de racine ou pourcentage de la surface
couverte par du mycélium.
Progression du C. elegans sur les racines
D'une cellule parasitée au hasard, le C. elegans passe à la
suivante; aucune partie de la racine n'est apparue comme un
site d'infection privilégié. Des cellules qui souvent pa¬
raissent saines, sont en fait remplies de mycélium et ce
n'est que lorsque les chlamydospores se présentent nombreuses
et groupées, à la surface de la racine, que l'on observe un
brunissement cellulaire prononcé. Ainsi le brunissement des
racines, premier symptôme macroscopique généralement observé
après une attaque du C. elegans, est la conséquence d'un dé¬
veloppement fongique avancé.
Limites de la méthode: le défaut principal de cette méthode
est qu'elle ne nous permet pas de saisir le rôle important
que doivent jouer les endoconidiophores et éventuellement le
mycélium de surface dans la pathogénèse du C. elegans. Lors
des lavages répétés, pour dégager les racines de la terre,
Page 33
- 27 -
les endoconidiophores et les endoconidies sont emportés. Les
racines les plus fines, qui sont probablement plus rapide¬
ment parasitées, restent prises dans la terre. Ceci explique¬
rait le fait que 5 jours après l'inoculation, on trouve le
C. elegans principalement confiné à la base de 1'hypocotyle.
D'autre part, il est très difficile d'évaluer l'importance
du mycélium de surface qui relie des sites de pénétration
éloignés.
3.2.2. Infection des racines dans du papier buvard
Le 64% des racines de la variété sensible Sota 50 portent des
chlamydospores 5 jours après l'inoculation (fig. 1). La plu¬
part des racines en portent peu (entre 1 et 49), mais un
faible pourcentage en est déjà très chargé (plus de 100). Les
endoconidiophores sont peu nombreux. Le mycélium intracellu¬
laire est fréquent (sur le 64% des racines) mais peu déve¬
loppé et n'occupe qu'un petit nombre de cellules. Le mycélium
de surface est très fréquent (sur le 84% des racines) et en¬
core peu développé (classe +). Au dixième jour après l'inocu¬
lation, les chlamydospores et les cellules envahies par du
mycélium intracellulaire deviennent très fréquentes et nom¬
breuses sur les racines; le mycélium de surface, très fré¬
quent (sur le 89% des racines), est plus développé qu'au
cinquième jour après l'inoculation. Il couvre dans la plupart
des cas plus du 50% de la surface des racines. Par contre, le
nombre des endoconidiophores stagne et le 35% des racines
n'en portent que peu (de 1 à 49). Le développement du C. ele¬
gans sur les racines de la variété résistante Kentucky 170
est faible. Les chlamydospores, les endoconidiophores et le
mycélium intracellulaire sont peu fréquents même au dixième
jour après l'inoculation. Le mycélium de surface s'installe,
dès le cinquième jour, sur le 22% des racines et se déve¬
loppe à peine jusqu'au dixième jour (29% des racines parasi¬
tées, classe +). Les racines parasitées de la variété ré¬
sistante Kentucky 170 manifestent les mêmes symptômes que
ceux de la variété sensible Sota 50. Le développement des
sites d'infection et le brunissement ultérieur des tissus se
déroulent comme sur les racines inoculées en terre.
Page 34
- 28 -
Choix des conditions d'infection des racines
Les racines inoculées dans le papier buvard sont plus rapide¬
ment et plus intensément attaquées par le C. elegans que
celles inoculées en terre. Le dosage, la composition, ainsi
que l'application de l'inoculum sur les racines nues sont
plus contrôlables que l'adjonction d'un broyât de culture du
C. elegans à la terre. Enfin, un dernier avantage de la mé¬
thode du papier buvard est que les racines infectées ne sont
plus blessées, ni partiellement récoltées, lors du dégagement
de la terre. A cause des avantages énumérés, les racines ino¬
culées dans le papier buvard seront utilisées pour les ana¬
lyses des acides aminés et des phénols solubles.
Page 35
mycélium.
du
par
couverte
surface
la
de
pourcentage
ou
racine
de
cm
1,5
par
nombre
75,
>+++
et
74
à50
=++
49,
à1
=+
0,
=0
Echelle:
+++
++
+1+
++
++
++
++
+*M
++
JOURS
10
n
JOURS
5
U)
ACE
SURE
DE
MYCELIUM
ni
50
100
nnJOURS
10
1n
JOURS
5
-
END0C0NIDI0PH0RES
-
50
lO'J
+++
++
++++
++
+0
ni
JOURS
10
JOURS
5
50
INTRACELLULAIRE
MYCELIUM
100
++
+-I
++
+*
+++
+o
1£L
JOURS
10
XL
JOURS
5
-
50
CHLAMYD0SP0RES
100
50
Sota
,170
Kentucky
buvard;
papier
le
dans
elegans
C.
le
par
l'inoculation
après
jours
10
et
(5
d'infection
classes
les
selon
racines
des
Répartition
:
Page 36
- 30 -
3.3. Degré de maladie des cals
3.3.1. Degré de maladie en fonction de la concentration
en 2,4-D
Le développement de la pourriture noire est toujours plus
faible dans les transplants du Kentucky 170 que dans ceux du
Sota 50 (fig. 2), 10 et 14 jours après l'inoculation. Cette
différence est beaucoup plus faible que celle observée lors
de l'inoculation de plantes entières. Ceci est dû au fait que
les transplants du Kentucky 170 présentent une certaine
pourriture. Le degré de maladie des transplants des deux va¬
riétés n'est que peu influencé par la concentration en 2,4-D
lorsqu'elle varie entre 0,9,uM et 9,uM, avec 4,64,uM de kiné¬
tine. Dix jours après l'inoculation, la variété Sota 50 ob¬
tient un indice de maladie moyen de 1,75, alors que la varié¬
té résistante ne s'écarte que très peu d'un indice de maladie
moyen de 1,2. Quatorze jours après l'inoculation, les indices
de maladie se stabilisent à des valeurs moyennes atteignant
2,1 pour la variété Sota 50 et 1,4 pour la variété résistante
Kentucky 170.
Fig. 2: Développement du C. elegans dans les transplants
en fonction de la concentration en 2,4-D.
3
2
_j
<t
s:
0
o
2
ce
<=> 1
00.5 5 10
CONCENTRATION 2,4-D ^M
(kinétine 4.64 )jM, inoculum 20 endoconidies)
Les courbes suivies des lettres a et b sont
significativement différentes.
SOTA 50
KENTUCKY 170
10 JOURS
-. a
^-—-*-
14 JOURS
-A b
Page 37
- 31 -
Sur les transplants témoins, n'ayant reçu que de l'eau di¬
stillée, apparaissent des taches brun-clair limitées au site
occupé par la goutte d'eau. Seule une couche de cellules très
superficielle brunit au contact de l'eau.
Les diverses tentatives d'initier et de subcultiver des cals
du Sota 50 avec 0,9,uM de 2,4-D et 4,64,uM de kinétine sont
restées infructueuses. Bien souvent, ces transplants devien¬
nent bruns et dégénèrent; les tissus fragmentés donnent rare¬
ment naissance à des masses cellulaires compactes et homo¬
gènes. Pour toutes les autres concentrations de 2,4-D, les
transplants étaient compacts, translucides et légèrement
bruns en surface, d'un diamètre compris entre 7 et 9 mm.
Progression du C. elegans sur les transplants
Les transplants du Sota 50 (sensible) semblent exempts de
champignon, 3 jours après l'inoculation. A partir du site
d'inoculation, s'étend une zone brune où il est rare d'ob¬
server un mycélium aérien alors que la variété résistante
Kentucky 170 a de petits agrégats de cellules brunes, con¬
centrées au sommet, qui portent de nombreuses chlamydospo¬
res. Ainsi, au troisième jour après l'inoculation, les trans¬
plants de la variété résistante montrent des symtomes plus
marqués que ceux de la sensible. Au septième jour apparais¬
sent, au sommet des transplants du Sota 50, du mycélium
aérien et des chlamydospores. Une bande de tissu brun entoure
le mycélium. Cette large bande de tissu brun qui précède
l'apparition du mycélium aérien est très réduite chez la va¬
riété résistante. Les indices de maladie s'inversent à partir
de ce moment-là et le Sota 50 sera toujours plus malade que
le Kentucky 170. Les bandes de tissus bruns qui précèdent
l'apparition du mycélium aérien sont déjà envahies par le
C. elegans et les tissus situés juste au devant, d'aspect
sain, contiennent aussi le parasite. Comme sur les racines,
le brunissement est la conséquence d'un développement fongi¬
que avancé. Mais un tissu brun n'est pas toujours parasité,
car une goutte d'eau provoque le brunissement des tissus
sains.
Page 38
- 32 -
3.3.2. Influence de la quantité d'inoculum sur
le degré de maladie des cals
Les explants de la variété Sota 50, inoculés avec 250 endo¬
conidies, ont un degré de maladie plus élevé que ceux inocu¬
lés avec 20 endoconidies, alors que le nombre d'endoconidies
n'influence pas le degré de maladie du Kentucky 170 (fig.3).
Avec un inoculum de 20 endoconidies, les différences entre
les variétés Sota 50 et Kentucky 170 sont minimes en pré¬
sence de 2,4-D, voire inexistantes avec l'AIA. Par contre
avec un inoculum de 250 endoconidies une forte différence
apparaît entre les variétés. Les explants du Sota 50, inocu¬
lés avec 250 endoconidies et cultivés sur 2,4-D, ont un in¬
dice de maladie de 1,9 et 2,8 après 7 et 10 jours. Les ex¬
plants du Kentucky 170 sont très peu attaqués au bout de 7 et
10 jours (indice de maladie de 0,85 et 0,95). Les explants
des deux variétés, cultivés avec de l'AIA et inoculés avec
250 endoconidies, ont le même indice de maladie (1) au
quatrième jour après l'inoculation. Jusqu'au dixième jour,
les explants de la variété résistante conservent cet indice,
alors que chez ceux de la variété sensible, la maladie pro¬
gresse presque linéairement (après 7 et 10 jours, indices
Les transplants sont plus malades que les explants, surtout
avec un inoculum de 20 endoconidies (fig. 4). La quantité
d'inoculum influence aussi le degré de maladie des trans¬
plants, mais moins que celui des explants. Au contraire de
ce qui a été observé chez les explants, les transplants de
la variété sensible Sota 50, inoculés avec 20 endoconidies,
sont toujours plus malades que ceux de la variété résistan¬
te.
Indépendemment de l'auxine choisie, les explants comme les
transplants de la variété sensible Sota 50 sont toujours
plus malades que ceux de la variété résistante Kentucky 170
lorsqu'ils sont inoculés avec 250 endoconidies.
Page 39
- 33 -
Fig. 3: influence de la quantité d'inoculum sur le degré de
maladie des explants (kinétine 4,64,uM ).
- INOCULUM -
20 ENDOCONIDIES 250 ENDOCONIDIES-i r
2.4-D 4.5 jjM
SOTA 50
KENTUCKY 170 -a-
2 -
AIA 5.7 /jM
-A
JOURS
7 10 0 4 7 10
APRES L'INOCULATION
Pas de différences significatives
entre les variétés pour les points
marqués d'une astérisque.
Page 40
- 34 -
Influence de la quantité d'inoculum sur le degr
maladie des transplants (expl. cf. fig. 3).
- INOCULUM -
20 ENDOCONIDIES 250 ENDOCONIDIES-i r -t 1 r
2,4-D 4.5 /jM
SOTA 50
KENTUCKY 170 -a
AIA 5.7/jM
7 10 0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
Page 41
- 35 -
3.3.4. Degré de maladie des cals cultivés avec de l'ANA
L'acide naphtalèneacétique (ANA), une auxine de synthèse,
induit des cals spongieux lorsqu'elle est utilisée à des con¬
centrations comprises entre 5,3,uM et 10,7,uM avec 4,64,uM de
kinétine. Tout en conservant une forme en demi-sphère, ils
prennent un aspect quelque peu "éclaté". Le faible degré
d'agrégation cellulaire est aussi mis en évidence par la dis¬
parition rapide de 1'inoculum dans les cals après sa déposi¬
tion. Les explants et les transplants des premières généra¬
tions sont translucides; mais au cours des repiquages succes¬
sifs, de nombreux cals deviennent bruns. Les transplants sont
toujours plus parasités que les explants (fig. 5). Les in¬
dices de maladie des deux variétés restent proches tant chez
les explants que chez les transplants. On note une différence
significative seulement dix jours après l'inoculation
(Sota 50 indice de maladie 2,6 et Kentucky 170, 2,4). Au som¬
met des transplants du Kentucky 170 apparaissent, à ce
moment-là, des taches noires de chlamydospores groupées. Chez
la variété Sota 50, on observe une zone brune étendue par¬
semée de mycélium aérien.
Fig. 5: Degré de maladie des cals cultivés avec
8,59 ,uM d'ANA et 4,64 ,uM de kinétine.
INOCULUM 20 ENDOCONIDIES
ce
UJ
o
S 2
<
2:
EXPLANTS
SOTA 50
KENTUCKY 170 -*
7 10 0
JOURS APRÈS
TRANSPLANTS
7 10
L' INOCULATION
pas de différences significatives entre les variétés
pour les points marqués d'une astérisque.
Page 42
- 36 -
3.3.5. Morphologie des cals et progression du C. elegans
Les cals cultivés avec du 2,4-D sont petits, très compacts et
durs à découper au scalpel. Cultivés avec de l'AIA, ils sont
plus volumineux et spongieux. Cette augmentation de volume
est due à la taille des cellules. Les explants mesurent en
moyenne 2 à 3 mm de plus en présence d'AIA qu'en présence de
2,4-D. Ils ont, en présence d'AIA, 10 à 11 mm de diamètre
pour le Sota 50 et 8 à 9 mm pour le Kentucky 170. Ces diffé¬
rences se trouvent confirmées par le poids frais des explants
qui a une moyenne de 0,9 à 1 g en présence d'AIA, alors qu'en
présence de 2,4-D, il chute à 0,25-0,35 g. En présence de ces
deux auxines, les cals semblent couverts d'un épiderme blanc,
qui en fait n'est qu'une couche de cellules néoformées encore
peu agrégées. Les cals très spongieux obtenus avec l'ANA ne
possèdent un tel épiderme que par plaques.
En présence d'AIA, de 2,4-D et d'ANA, une bande de tissu brun
précède l'apparition du mycélium aérien. Elle est étendue
chez la variété sensible et très réduite chez la variété ré¬
sistante. Ces tissus bruns sont parasités. Lors de la sépara¬
tion des tissus parasités du reste de l'expiant, on observe
des différences nettes entre les variétés de tabac. Chez la
variété résistante Kentucky 170, en présence d'AIA ou de
2,4-D, le mycélium reste superficiel jusqu'au septième jour.
Ce n'est qu'à partir de ce moment-là, que l'on observe par¬
fois des percées du mycélium qui s'avancent plus en profon¬
deur dans le tissu. Chez la variété sensible Sota 50, en pré¬
sence d'AIA ou de 2,4-D, sept jours après l'inoculation, on
trouve 2 mm de tissu colonisé sous la couche de mycélium
superficiel. En présence de 2,4-D, les cals sont recouverts
de mycélium et de spores noirâtres dont la densité est bien
plus grande qu'en présence d'AIA, de plus, ils sont colonisés
en profondeur jusqu'à 3 ou 4 mm, voire jusqu'à la gélose. Les
indices de maladie augmentent plus rapidement, pour une même
dose d'inoculum, sur les cals cultivés en présence d'ANA que
sur ceux cultivés en présence de 2,4-D ou d'AIA. Les indices
de maladie augmentent aussi rapidement sur les cals cultivés
Page 43
- 37 -
en présence d'AIA que sur ceux cultivés en présence de 2,4-D.
L'indice de maladie reflète la proportion de la surface des
cals recouverte par le champignon et ne tient pas compte de
2la densité fongique (nombre de spores ou d'hyphes par cm ).
Les explants cultivés en présence d'AIA et inoculés ont, en
valeur absolue, une plus grande surface couverte par le
C. elegans que ceux cultivés en présence de 2,4-D. Mais ces
derniers sont recouverts d'un mycélium plus dense que les
premiers, dix jours après l'inoculation.
Conclusion
La différence de résistance au C.elegans, entre le Kentucky
170 et le Sota 50, est exprimée en culture de tissus. Le de¬
gré de maladie est influencé par la dose d'inoculum et l'uti¬
lisation de tranplants ou d'expiants. Le type d'auxine (AIA,
2,4-D, ANA) incorporée dans le milieu nutritif influence la
taille et le degré d'agrégation cellulaire des cals (spon¬
gieux ou compacts). Les tissus les plus spongieux s'obtien¬
nent en présence d'ANA et ils sont toujours plus malades que
les tissus plus compacts de cals cultivés en présence d'AIA
ou de 2,4-D. Une augmentation de la quantité d'inoculum
accentue le degré de maladie des cals de la variété sensible.
Sur les explants de la variété résistante, le degré de mala¬
die reste constant dès le quatrième jour après l'inocula¬
tion, alors qu'il continue d'augmenter sur les transplants.
Les explants ont une forme et une structure plus homogènes
que les transplants.
Pour ces raisons, des explants, cultivés en présence d'AIA
ou de 2,4-D, infectés avec 250 endoconidies (fig. 3) servi¬
ront d'échantillon pour les analyses des acides aminés et
des phénols solubles.
Page 44
- 38 -
3.4. Influence de l'infection par le C. elegans sur la
teneur en acides aminés des racines et des explants
3.4.1. Teneur en acides aminés totaux
Les racines du Sota 50 contiennent moins d'acides aminés
que les explants sains cultivés avec du 2,4-D ou de l'AIA
(fig. 6). Les racines et les explants du Kentucky 170, culti¬
vés avec du 2,4-D, contiennent moins d'acides aminés que ceux
du Sota 50. Les explants du Kentucky 170, cultivés avec de
l'AIA, ont une teneur en acides aminés bien supérieure à
celles des racines (+ 476%) et à tous les autres tissus. Les
racines parasitées de la variété sensible Sota 50 diminuent
leur teneur en acides aminés de 63% et les explants cultivés
avec du 2,4-D ou de l'AIA de 50% et de 61% respectivement.
Les racines attaquées de la variété résistante Kentucky 170
ont la même teneur en acides aminés que les racines saines.
Les explants parasités du Kentucky 170 réduisent de 22% leur
teneur en acides aminés lorsqu'ils sont cultivés avec du
2,4-D et de 42% lorsqu'ils sont cultivés avec de l'AIA.
Malgré une teneur en acides aminés très diverse entre les
racines et les explants sains, on constate que la diminution
de la teneur en acides aminés des tissus parasités est tou¬
jours plus importante chez la variété sensible que chez la
résistante.
Page 45
- 39 -
Influence du C. elegans sur la teneur en acides
aminés totaux des racines (R) et des explants
(AIA 5,7,uM ou 2,4-D 4,5,uM et kinétine 4,6,uM,
10 jours après l'inoculation).
500
SAIN D
INOCULÉ
400 SOTA 50
300
200
100
m
KENTUCKY
r*i
170 -{
R 2,4-D AIA
EXPLANTS
R 2,4-D AIA
EXPLANTS
R: Racines; AIA 5,7,uM; 2,4-D 4,5,uM; Kinétine 4,6
Page 46
- 40 -
3.5. Spectre des acides aminés
3.5.1. Les tissus sains
Le spectre des acides aminés soluble est différent dans les
quatre cas étudiés, racines et explants sains du Sota 50 et
du Kentucky 170. Celui des explants cultivés avec du 2,4-D
diffère de celui des explants cultivés avec de l'AIA. Les
racines de la variété Sota 50 contiennent énormément de pro-
line (27,1 nmole, fig. 7). La variété résistante se distingue
par une teneur plus élevée en asparagine, dans les racines et
les explants, que la variété sensible. Les explants cultivés
avec du 2,4-D (fig. 8) ont des teneurs en glycine supérieures
(Sota 50, +29,7 nmole et Kentucky 170, +18,7 nmole) à celles
des racines. Chez les explants du Kentucky 170, la tyrosine
et la phenylalanine, qui chez les racines se trouvent à
l'état de trace, sont décelées à des concentrations élevées,
respectivement 2,6 nmole et 1,4 nmole. Les explants cultivés
avec de l'AIA (fig. 9) sont très riches en glutamine
(Sota 50, 73% et Kentucky 170, 77% de la teneur en acides
aminés totaux).
3.5.2. Les tissus infectés
Les racines (fig. 7): chez la variété sensible, la concentra¬
tion de ceux des acides aminés qui sont présents en grande
quantité, diminue. L'arginine fait exception (+45%). La con¬
centration des autres acides aminés reste constante. Au con¬
traire, chez la variété résistante, la teneur en proline
(+140%), en asparagine (+52%) et en arginine (+43%) augmente
10 jours après l'inoculation. Hormis les concentrations de
la leucine, de la thréonine, de la lysine et de l'histidine
qui diminuent faiblement, celles des autres acides aminés ne
varie pas.
Les explants cultives avec du 2,4-D (fig. 8): chez les ex¬
plants de la variété sensible la teneur en glutamine diminue
(-57,4% = 53,7 nmole). La baisse de la teneur en asparagine
(-68,7% = 21,2 nmole), serine (-50,6% = 4,3 nmole), proline
(-55,5% = 3,3 nmole) et glycine (-70,3% = 23,6 nmole) bien
Page 47
- 41 -
que plus petite en valeur absolue atteint quand même des
pourcentages élevés. Par contre, la lysine (+160% = 5,1 nmole)
et l'arginine (+360% = 5,3 nmole) s'accumulent dans les tis¬
sus parasités. Chez la variété résistante, on décelé surtout
une diminution de la teneur en glutamine (-28% = 17,5 nmole).
Celles de la serine (-22,8% = 2,6 nmole), de la glycine (-21%
= 5,9 nmole), de la tyrosine (-100% = 2,6 nmole) et de la
phenylalanine (-100% = 1,4 nmole) sont faibles en valeur
absolue.
Les explants cultivés avec de l'AIA (fig. 9): la teneur en
glutamine des explants du Sota 50 diminue de 75%. A l'excep¬
tion de la proline, de la lysine et de l'arginine qui s'accu¬
mulent légèrement, nous assistons à une baisse de la teneur
des autres acides aminés. Chez la variété résistante la te¬
neur de tous les acides aminés diminue (glutamine 50%), à
l'exception de la glycine qui s'accumule.
Conclusion
La teneur en acides aminés solubles totaux des explants, ob¬
tenue par cette méthode, correspond aux résultats de Kasper¬
bauer et Hamilton (1977), avec en plus l'avantage d'une
meilleure séparation des acides aminés serine, thréonine,
asparagine et glutamine. La concentration en acides aminés
des explants correspond aussi à celle mesurée dans les tiges
de divers Nicotiana par une méthode classique (Dumas et al.,
1981).
Les racines et les explants possèdent chacun un spectre
d'acides aminés caractéristique. Les acides aminés dont la
teneur est la plus élevée dans les tissus sains diminue le
plus fortement dans les tissus parasités (cf. proline dans
les racines ou glutamine dans les explants). Malgré les di¬
vergences entre les racines et les explants, la diminution
de la teneur en glutamine et en asparagine est toujours plus
marquée chez la variété sensible Sota 50 que chez la variété
résistante Kentucky 170.
Page 48
- 42 -
Influence du C. elegans sur la teneur en acides
aminés des racines (10 jours après l'inoculation)
-10
30
S 20
II I
SOTA 50 -sensible¬
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ASP THR SER GLU PRO GLY ALA VAL ILE LEU IYR LYS HIS ARG
Page 49
- 43 -
Influence du C. elegans sur la teneur en acides
aminés des explants cultivés avec du 2,4-D
(2,4-D 4,52.uM et kinétine 4,64.uM, 10 jours
après l'inoculation).
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SOTA 50 -SENSIBLE-
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Page 50
- 44 -
Influence du C. elegans sur la teneur en ac
aminés des explants cultivés avec de l'AIA
(AIA 5,7,uM et kinétine 4,64-uM, 10 jours
après l'inoculation).
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KENTUCKY 170 -résistant-
[393 5MN °
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Page 51
- 45 -
3.6. Composés phenoliques
3.6.1. Chromatographie liquide sous haute pression(HPLC) des extraits bruts
3.6.1.1. Identification des composés phenoliques
Les racines et les explants sains des deux variétés de tabac
contiennent surtout de l'acide chlorogénique (acide caféyl-3
quinique), de la scopoline (7-glucose 6-méthoxy-coumarine)
et deux phénols partiellement identifiés (pics no.2 et no.4;
cf. fig. 10 et 11 ).
Les explants cultivés avec de l'AIA ou du 2,4-D contiennent
les mêmes phénols que les racines. Mais comparés aux racines,
ils contiennent moins d'acide chlorogénique et plus de scopo¬
line et des substances no.2 et 4. Les chromatogrammes des ex¬
traits bruts des explants sont semblables; pour cette raison,
seuls ceux d'expiants cultivés avec de l'AIA sont représentés
(fig. 11). Dans les racines et les explants parasités, on ne
détecte pas de nouveaux composés phenoliques qui ne puissent
être décelés, même en quantité infime, dans les tissus sains.
En HPLC, l'injection de la substances no.2 ou no.4 donne tou¬
jours deux pics de surface équivalente éluant aux temps de
rétention des substances no.2 et 4. Ces substances, récoltées
à la sortie de la colonne et rechromatographiées sur couche
mince (tab. 4 et 6) donnent chacune deux taches de surface
équivalente. Les substances no.2 et no.4 chromatographiées
sur papier avec 2% d'acide acétique ont un Rf de 0,85; chro¬
matographiées avec un mélange butanol/acide acétique/eau,
la substance no.2 a un Rf de 0,52 et la substance no.4 un Rf
de 0,72. Il s'agit probablement d'une seule substance qui
s'isomérise facilement en formes cis et trans comme cela peut
être le cas pour les acides hydroxycinnamiques. Les spectres
en UV des substances no.2 et 4, récoltées à la sortie de la
colonne, sont proches de ceux des acides cis et trans feru¬
liques (fig. 12 et 13). Cependant, les temps de rétention ne
concordent pas avec les isomères de l'acide férulique.
Page 52
- 46 -
Sur couche mince, les substances no. 2 et no.4 prennent ra¬
pidement une couleur jaune au contact de l'air comme cela est
le cas pour les acides cafeiques ou feruliques. Cette réac¬
tion les distingue de l'acide paracoumarique. La pulvérisa¬
tion de différents réactifs sur les chromatogrammes (tab. 5
et 6), nous révèle que ces deux substances sont des composés
phenoliques. Les substances no.2 et 4, récoltées à la sortie
de la colonne (HPLC), sont inchangées après une hydrolyse
acide (2 h à 110 °C). Une hydrolyse alcaline (2 h à tempéra¬
ture ambiante) supprime la substance no.2 au profit de la
substance no.4.
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- 47 -
Fig. 10: Chromatogrammes (HPLC) d'extraits bruts des racines
(15 jours après l'inoculation par le C. elegans).
- SOTA 50 -
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^w lVwAvv j4 <lyL^Colonne C1Q u Bondpak 10/um (3,9 x 300 mm), gradient de A
(16% MeOH; 0,1M KH2P04) à B (40% MeOH; 0,1M KH2P04) en 20
min, flux 1 ml/min, détection 330 nm. Pics: no.1 acide
caféyl-3 quinique, no.2 substance no.2, no.3 7-glucose-
6-méthoxycoumarine, no.4 substance no.4.
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- 48 -
Fig. 11: Chromatogrammes (HPLC) d'extraits bruts d'expiants
cultivés avec 5,7 .uM d'AIA (kinétine 4.64,uM;
10 jours après l'inoculation par le C. elegans).
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(16% MeOH; 0,1M KH2P04) à B (40% MeOH; 0,1M KH2P04) en 20
min, flux 1 ml/min, détection 330 nm. Pics: no.1 acide
caféyl-3 quinique, no.2 substance no.2, no. 3 7-glucose-
6-méthoxycoumarine, no.4 substance no.4.
Page 55
- 49 -
Spectres d'absorption en UV de la substance no.2
et de l'acide cis-férulique relevés à la sortie
de la colonne C (HPLC).
A211
,204
acide: cis-ferjjque
substance n:.2
2ÏC
273
252
300
297
250 30C [N"J
Spectres d'absorption en UV de la substance no.4
et de l'acide trans-férulique relevés à la sortie
de la colonne C18 (HPLC).
313.L.
216I
217
29229c,
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259
ACIDE T"ANS-FERUliOiE
S'SSTA\CE ho. 4
250 'OC U«]
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- 50 -
Tab. 4: Valeurs Rf de quelques phénols sur gel de silice 60,
Phase mobile: BuOH/ HoAc/ HO; 4/ 1/ 1
Acides cinnamiques
cinnamique
Degré de substitution
:[^C00H3
Rf
0,76
p-coumarique 4=OH 0,77
caféique 3=OH 4=OH 0,72
férulique 3=OCH3 4=OH 0,74
sinapique 3=OCH3 4=OH 5=OCH3 0,70
caféyl-quiniques
i^V"^^coo COOH
—-P-0H
0,28
I T 3J.
0H
coumarines
coumarine
umbelliferone
esculétine
esculine
scopolétine
scopoline
6=OH
6=OH
6=OCH.
6=OCH.
7=OH
7=OH
7=glucose
7=OH
7=glucose
0,70
0,74
0,59
0,52
0,68
0,40
flavonol
rutine -rutinoside-3-quercétine- 0,36
substance (pic) no.2
substance (pic) no.4
0,29
0,33
Page 57
flavonoides
HC1
vanilline
-flavonoides
A1C1
-sucres
anisaldéhyde
-
aminés
phénols
Bsolide
bleu
de
Sel
aminés
Ehrlich
--
mauve
mauve
mauve-pâle
mauve
aminés
aminés
ac.
ninhydrine
brun-pâle
-brun-rouille
brun-jaune
brun-rouille
jaune
brun-
phénol
diazotée
p-nitroaniline
bleu
bleu
bleu
bleu
bleu
bleu
phénol
Ciocalteau
Folin-
esculétine
chlorogénique
férulique
caféique
p-coumarique
no.4
et
no.2
coumarine
hydroxycinnamiques
acides
substance
PURES
SUBSTANCES
REVELATION
REACTIF
60
silice
de
gel
de
mince
couche
sur
phénoliques
composés
de
Révélation
5:
Tab.
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- 52 -
Tab. 6: Valeurs Rf de composés phenoliques sur couche
mince de gel de silice G.
Phase mobile: benzène, acide acétique: 9/1
Phénols Rf Réaction colorée à la
p-nitro-aniline diazotée
ac. caféique 0,09 rose
ac. p-coumarique 0,25 brun
ac. férulique 0,42 brun
méthylférulate 0,45 brun-clair
éthylférulate 0,47 brun-clair
butylférulate 0,51 brun-clair
ac. isoférulique 0,33 orange
alcool coniférylique 0,18 brun-clair
scopolétine 0,16 -
scopoline 0,14 -
ac. chlorogénique 0,00 brun
substance no. 2 0,55 brun
substance no. 4 0,50 brun
Page 59
- 53 -
3.7. Evolution de la teneur en phénols solubles
au cours de l'infection
3.7.1. Les racines
3.7.1.1. Les phénols solubles totaux
La teneur en phénols solubles totaux des racines des deux
variétés de tabac s'élève à environ 15,ug/mg MS d'équivalents
d'acide férulique lors du transfert des plantules du quartz
dans le papier buvard (fig. 14). Cette teneur diminue de moi¬
tié dans les racines saines du Kentucky 170, au cours des
cinq jours suivants. Dix jours après le transfert, ces ra¬
cines retrouvent une teneur en phénols solubles légèrement
supérieure (17,7.ug/mg MS) à celle mesurée lors du transfert.
En présence du pathogène, les racines du Kentucky 170 ont des
teneurs en phénols solubles toujours inférieures à celles des
racines saines. Cette différence est faible à cinq jours,
puis augmente dix et quinze jours après l'inoculation. La
teneur en phénols solubles est moins élevée chez le Sota 50
que chez le Kentucky 170. Les racines malades du Sota 50 ont
une teneur en phénols beaucoup plus faible que celle du Ken¬
tucky 170, dix et quinze jours après l'inoculation.
Il est à remarquer que les colonies du C. elegans, cultivées
(10 jours à 25 °C) en milieu liquide (PDB) ou sur 2% d'ex¬
trait de malt gélose, extraites et analysées comme les tissus
végétaux, ne contiennent pas de phénols solubles.
3.7.1.2. L'acide chlorogénique
La teneur en acide chlorogénique constitue la majeur partie
de la teneur en phénols solubles totaux des racines. Ces
teneurs évoluent de façon semblable au cours de l'essai
(fig. 15). Au moment du transfert, les racines des deux va¬
riétés contiennent environ 10,ug/mg MS d'acide chlorogénique
et cinq jours plus tard, elles en sont dépourvues. Cette te¬
neur est à nouveau élevée dans toutes les racines, dix et
quinze jours après le transfert, à l'exception des racines
malades du Sota 50 qui n'en contiennent que des traces.
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- 54 -
Teneur en phénols solubles totaux des racines
saines et inoculées par le C. elegans.
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Teneur en acide chlorogénique des racines saines
et inoculées par le C. elegans.
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SAIN
SOTA 50 -o-
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JOURS APRES L'INOCULATION
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- 55 -
3.7.1.3. La scopoline
Au moment du transfert, la teneur en scopoline ne constitue
qu'une faible partie de la teneur en phénols solubles totaux.
La teneur en scopoline des racines saines du Kentucky 170 ne
diminue pas après le transfert, mais au contraire augmente
régulièrement jusqu'au quinzième jour (fig. 16). En présence
du pathogène, la teneur en scopoline des racines du Ken¬
tucky 170 est légèrement inférieure à celle des racines
saines, cinq jours après l'inoculation et bien supérieure,
dix et quinze jours après. Les teneurs en scopoline des ra¬
cines saines et malades du Sota 50 sont comparables et ne
varient guère pendant l'essai; elles sont fortement infé¬
rieures à celles des racines saines du Kentucky 170.
Fig. 16: Teneur en scopoline des racines saines
et inoculées par le C. elegans.
0.75
0.50
0.25
KENTUCKY 170 -a-
S0TA 50 -O-
SAIN
INOCULÉ
0 5 10
JOURS APRES L'INOCULATIC
15
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- 56 -
3.7.1.4. Substances no.2 et no.4
Au moment du transfert, la teneur des racines en substances
no.2 et 4 est faible et elle est nulle cinq jours après
(fig. 17 et 18). La teneur en substances no.2 et 4 du Ken¬
tucky 170 augmente dès le cinquième jour après le transfert
et diminue à partir du dixième jour. En présence du patho¬
gène, les racines du Kentucky 170 ont des teneurs fortes en
substances no. 2 et 4, dix et quinze jours après l'inocula¬
tion.
Si l'on admet que ces substances contiennent de l'acide féru¬
lique, on peut estimer que les valeurs maximales ne dépassent
pas l'ordre du ,ug/mg MS.
Les racines saines du Sota 50 contiennent toujours un peu
moins de substance no.2 que celles du Kentucky 170, alors que
les teneurs en substance no. 4 sont semblables jusqu'au dix¬
ième jour après le transfert. Dans les racines malades du
Fig. 17: Teneur en substance no.2 des racines saines et
inoculées par le C. elegans.
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0 5
JOURS APRES
10
L'INOCULATION
15
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- 57 -
Sota 50, la teneur en substance no.2 est très faible, dès le
cinquième jour après l'inoculation. La teneur en substance
no.4 de ces racines est élevée dix jours après l'inoculation
mais n'atteint pas les concentrations mesurées dans les ra¬
cines du Kentucky 170 en présence du pathogène.
Fig. 18: Teneur en substance no.4 des racines saines et
inoculées par le C. elegans.
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KENTUCKY 170 -a-
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INOCULÉ
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JOURS
5 10 15
APRES L'INOCULATION
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- 58 -
Récapitulation
Le transfert des plantules du quartz dans le papier buvard
provoque une diminution de la teneur en phénols solubles to¬
taux des racines. Parmi les phénols analysés, seule la teneur
en scopoline des racines saines du Kentucky 170 ne diminue
pas après le transfert (fig. 16).
En présence du pathogène, les racines de la variété ré¬
sistante Kentucky 170 contiennent moins de phénols solubles
totaux et d'acide chlorogénique que les saines. Par contre,
elles augmentent plus fortement et plus rapidement leur
teneur en scopoline et en substances no.2 et 4 que les ra¬
cines saines à partir du cinquième jour après l'inoculation.
Les racines saines de la variété sensible Sota 50 ont, en gé¬
néral, des teneurs en phénols inférieures à celles de la va¬
riété résistante. La teneur en divers phénols des racines ma¬
lades du Sota 50 n'augmente guère, après l'inoculation, à
l'exception de la teneur en substance no.4 qui cependant
n'atteint pas des valeurs aussi élevées que celles du Ken¬
tucky 170.
Page 65
- 59 -
3.7.2. Les explants cultivés avec du 2,4-D
3.7.2.1. Les phénols solubles totaux
Les explants des deux variétés de tabac contiennent moins de
phénols solubles totaux que les racines (cf. fig. 14 et 19).
Les explants sains du Kentucky 170 ont des teneurs en phé¬
nols solubles totaux assez constantes au cours de l'essai
(fig. 19). Les explants parasités du Kentucky 170 sont plus
riches en phénols que' les sains, mais ces différences ne sont
assurées statistiquement qu'à partir du septième jour après
l'inoculation. Les explants du Sota 50 ont eux aussi une te¬
neur en phénols solubles très constante au cours de l'essai,
mais inférieure à celle du Kentucky 170. La teneur en phénols
des explants parasités du Sota 50 diminue progressivement au
cours de l'essai et dix jours après l'inoculation, ils n'en
contiennent que le 19% des explants sains.
Fig. 19: Influence du C. elegans sur la teneur en phénols
solubles totaux des explants cultivés avec 4,5,uM
de 2,4-D (kinétine 4,64 uM).
—i 1 1 r——
KENTUCKY 1/0 -a-
t SOTA 50 -O-
SAIN
INOCULE
J I I L.
0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULAT 1 UN
Page 66
- 60 -
3.7.2.2. L'acide chlorogénique
Les explants, cultivés avec du 2,4-D (fig. 20), ont des
teneurs en acide chlorogénique inférieures à celles des
racines (cf. fig. 15 et 20). Les explants du Kentucky 170
(5,5.ug/mg MS) contiennent plus du double d'acide chlorogé¬
nique que ceux du Sota 50 (2,ug/mg MS) au moment de l'inocu¬
lation (fig. 20). Dans les explants sains du Kentucky 170,
cette teneur diminue avec l'âge. Dans les explants parasités
du Kentucky 170, cette diminution est plus rapide que dans
les explants sains du Sota 50, jusqu'au quatrième jour après
l'inoculation. La teneur en acide chlorogénique des explants
sains du Sota 50 diminue faiblement avec l'âge. Les explants
parasités du Sota 50 ont toujours moins d'acide chlorogénique
que les sains et n'en contiennent plus que des quantités in¬
fimes, dix jours après l'inoculation.
Fig. 20: Influence du C. elegans sur la teneur en acide
chlorogénique des explants cultivés avec 4,5,uM
de 2,4-D (kinétine 4,64.uM)./
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KENTUCKY
SOTA 50
SAIN
INOCULÉ
170 -A-
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4 7 10
APRES L'INOCULATION
Page 67
- 61 -
3.7.2.3. La scopoline
Les explants du Kentucky 170 sont environ 13 fois plus pour¬
vus en scopoline que les racines et ceux du Sota 50 environ
8 fois plus (cf. fig. 16 et 21). Les explants sains du Ken¬
tucky 170 ont une teneur en scopoline constante au cours de
l'essai; elle est toujours supérieure à celle du Sota 50
(fig. 21). Les explants parasités du Kentucky 170 réduisent
leur teneur en scopoline jusqu'au septième jour après
l'inoculation. Les explants sains du Sota 50 ont une teneur
en scopoline beaucoup plus faible que ceux du Kentucky 170
et celle-ci diminue très légèrement avec l'âge. Les explants
parasités du Sota 50 contiennent moins de scopoline que les
sains et ils en sont dépourvus, dix jours après l'inocula¬
tion.
Fig. 21 : Influence du C. elegans sur la teneur en scopo¬
line des explants cultivés avec 4,5.uM de 2,4-D
(kinétine 4,64.uM)./
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JOURS
4 7
APRES L'INOCULATION
10
Page 68
- 62 -
3.7.2.4. Substances no.2 et no.4
Les explants du Kentucky 170 contiennent environ trois fois
plus de substance no.2 que les racines, alors que la teneur
des explants du Sota 50 est semblable à celle des racines
(cf. fig. 17 et 22). Les explants sains des deux variétés
ont une teneur en substance no.2 assez constante au cours de
l'essai (fig. 22). Les explants du Kentucky 170 sont plus
riches en substance no.2 que ceux du Sota 50. La teneur en
substance no.2 des explants parasités du Kentucky 170 dé¬
passe celle des explants sains dès le quatrième jour après
l'inoculation. Cette accumulation est suivie d'une baisse au
septième jour et d'une deuxième augmentation au dixième jour
après l'inoculation. La teneur en substance no.2 des explants
parasités du Sota 50 augmente légèrement jusqu'au quatrième
jour après l'inoculation, puis diminue et cette substance
n'est plus décelable au septième jour.
Fig. 22: Influence du C. elegans sur la teneur en substance
no.2 des explants cultivés avec 4,5,uM de 2,4-D
(kinétine 4,64,uM).
•—i 1 1 1
KENTUCKY 170 -a- SOTA 50 -o-
SAIN
INOCULÉ
0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
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- 63 -
La teneur en substance no.4 des explants est supérieure à
celle des racines saines et augmente légèrement avec l'âge
(cf. fig. 18 et 23). La teneur en substance no.4 des explants
sains et parasités suit la même évolution que celle de la
substance no.2 (cf. fig. 22 et 23).
Fig* 23î Influence du C. elegans sur la teneur en substance
no.4 des explants cultivés avec 4,5.uM de 2,4-D
(kinétine 4,64.uM)./
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170 -A-
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0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
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- 64 -
Récapitulation: les explants cultivés avec du 2,4-D.
Les explants de la variété résistante Kentucky 170 ont tou¬
jours plus de phénols solubles totaux que ceux de la variété
sensible Sota 50. Dans les explants parasités de la variété
résistante la teneur en phénols augmente au cours de l'in¬
fection, alors que dans ceux de la variété sensible elle
diminue.
La teneur en acide chlorogénique diminue avec l'âge des
explants. Cette diminution est plus forte dans les explants
parasités que dans les sains.
Les explants de la variété résistante contiennent plus de
scopoline que ceux de la variété sensible. La teneur en sco¬
poline diminue dans les explants parasités au cours de l'in¬
fection.
La teneur en substances no.2 et 4 augmente dans les explants
parasités de la variété résistante et diminue dans ceux de la
variété sensible dès le quatrième jour après l'inoculation.
Page 71
- 65 -
3.7.3. Les explants cultivés avec de l'AIA
3.7.3.1. Les phénols solubles totaux
La teneur en phénols solubles totaux des explants du Ken¬
tucky 170 augmente avec l'âge (fig. 24). Au moment de l'in¬
oculation, ils en contiennent moins que les racines saines
(cf. fig. 12 et 24). Les explants parasités du Kentucky 170
sont toujours plus riches en phénols que les sains, mais
cette différence devient nette seulement au dixième jour
après l'inoculation. Les explants sains du Sota 50 contien¬
nent plus de phénols que leurs racines saines (cf. fig. 12
et 24) ou les explants sains du Kentucky 170 au début de
l'essai. La teneur en phénols solubles des explants sains du
Sota 50 diminue jusqu'au septième jour après l'inoculation;
elle augmente par la suite, mais reste toujours inférieure à
celle des explants du Kentucky 170. Les explants parasités du
Sota 50 ont toujours plus de phénols solubles totaux que les
sains, mais la concentration reste inférieure à celle des ex¬
plants sains du Kentucky 170. La teneur en phénols des ex¬
plants parasités du Sota 50 diminue de moitié au quatrième
jour après l'inoculation; par la suite, elle augmente légère¬
ment jusqu'au dixième jour.
Page 72
- 66 -
Fig. 24: Influence du C. elegans sur la teneur en phénols
solubles totaux des explants cultivés avec 5,7.uM
d'AIA (kinétine 4,64.uM)./
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0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
Page 73
- 67 -
3.7.3.2. L'acide chlorogénique
La concentration en acide chlorogénique des explants est
assez proche de celle des racines, au moment de l'inoculation
(cf. fig. 13 et 25). Dans les explants sains du Kentucky 170,
la teneur en acide chlorogénique reste assez constante au
cours de l'essai (fig. 25). Dans les explants parasités du
Kentucky 170, elle diminue fortement jusqu'au quatrième jour
après l'inoculation, puis reste assez constante (fig. 25).
Ce dernier type de courbe est observé dans les explants sains
et parasités du Sota 50. Les explants parasités des deux
variétés de tabac ont moins d'acide chlorogénique que les ex¬
plants sains.
Fig. 25: Influence du C. elegans sur la teneur en acide
chlorogénique des explants cultivés avec 5,7 .uM
d'AIA (kinétine 4,64.uM)./
12
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APRES L'INOCULATION
10
Page 74
- 68 -
3.7.3.3. La scopoline
La teneur en scopoline est 40 fois plus élevée dans les ex¬
plants du Kentucky 170 que dans les racines, alors que dans
le Sota 50, cette différence est de l'ordre de 23 fois seule¬
ment (cf. fig. 16 et 26). Dans les explants sains du Ken¬
tucky 170, la teneur en scopoline augmente au cours des
quatre premiers jours, puis diminue jusqu'au dixième jour et
atteint une valeur légèrement supérieure à celle mesurée au
début de l'essai. La teneur en scopoline des explants para¬
sités du Kentucky 170 augmente au cours de l'infection,
celle-ci est inférieure à celle des explants sains au qua¬
trième et au septième jour après l'inoculation. Ce n'est
qu'au dixième jour, que les explants parasités du Ken¬
tucky 170 ont une teneur en scopoline plus élevée que les ex¬
plants sains. Les explants sains du Sota 50 ont une teneur en
scopoline très inférieure à celle du Kentucky 170. Les ex¬
plants parasités du Sota 50 ont très légèrement moins de
scopoline que les explants sains.
Fig. 26: Influence du C. elegans sur la teneur en scopoline
des explants cultivés avec 5,7,uM d'AIA (kinétine
4,64-uM) .
/
CD
<
O
x
O
oo
KENTUCKY 170 -a
SOTA 50 -o
0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
Page 75
L'INOCULATIONAPRESJOURS
10
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A
A
A
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INOCULÉ
SAIN
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-800
o
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4,64,uM).(kinétine
d'AIA5,7.uMaveccultivésexplantsdesno.2
substanceenteneurlasurelegansC.duInfluence27:Fig.
170.Kentuckyduparasitésexplantsdescelleà
inférieurereste2no.substanceenteneurlatoutefoisjour;
septièmejusqu'aucecietl'inoculationdèsaugmenteelle
50Sotaduparasitésexplantsleschezaugmentepuisjour,
septièmejusqu'aulégèrementdiminue50Sotadusainsplants
ex¬desno.2substanceenteneurLal'inoculation.dèsforte
plusestaugmentationcetteparasités,explantslesDans
l'inoculation.aprèsjourquatrièmedupartiràaugmente,
no.2substanceenteneurla170,Kentuckydusainsplants
ex¬lesDansl'essai.dedébutau50Sotaducelleàblable
sem¬no.2substanceenteneuruneont170Kentuckydusains
explantsLes27).et2217,fig.(cf.2,4-Dduavectivés
cul¬explantslesetracineslesqueélevéeplusno.2stance
sub¬enteneuruneontl'AIAdeaveccultivésexplantsLes
no.2Substance3.7.3.4.
-69-
Page 76
- 70 -
3.7.3.5. Substance no.4
Les explants sains du Kentucky 170 contiennent très peu de
substance no. 4 et sa teneur augmente faiblement avec l'âge
au cours de l'essai (fig. 28). La teneur en substance no.4
augmente très rapidement dans les explants parasités du
Kentucky 170 jusqu'au septième jour après l'inoculation.
La teneur en substance no.4 est plus élevée chez le Sota 50
que chez le Kentucky 170 et reste stable jusqu'au septième
jour, puis elle augmente. Dans les explants parasités, la te¬
neur en substance no. 4 augmente jusqu'au septième jour après
l'inoculation chez les deux variétés. Cependant, les ex¬
plants parasités du Sota 50 contiennent moins de substance
no.4 que ceux du Kentucky 170.
Fig. 28: Influence du C. elegans sur la teneur en substance
no.4 des explants cultivés avec 5,7 ,um d'AIA
(kinétine 4,64,um).r
CD
T.
on
CD
z
o
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CD
OZ
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500
300
100
KENTUCKY 170 -A-
SOTA 50 -O-
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INOCULÉ
A-"
A/ T
/ /
JOURS
4 7 -
APRES L'INOCULAT I
10
Page 77
- 71 -
Récapitulation: les explants cultivés avec de l'AIA.
Les explants parasités ont une teneur en phénols solubles to¬
taux légèrement supérieure à celle des explants sains et la
variété résistante Kentucky 170 en contient plus que la va¬
riété sensible Sota 50.
La concentration en acide chlorogénique des explants sains de
la variété résistante varie peu avec l'âge, alors qu'elle
diminue fortement chez ceux de la variété sensible. Elle di¬
minue rapidement et fortement dans les explants parasités.
La teneur en scopoline des explants parasités de la variété
résistante est supérieure à celle des explants sains seule¬
ment à partir du septième jour après l'inoculation. Elle est
très faible dans les explants de la variété sensible.
La teneur en substance no.2 augmente plus rapidement dans les
explants sains de la variété résistante que dans ceux de la
variété sensible. Les explants parasités contiennent plus de
substance no.2 que les sains au cours de l'infection.
La teneur en substance no.4 augmente modérément dans les ex¬
plants sains avec l'âge et ceux de la variété sensible en
contiennent plus que ceux de la variété résistante. Par
contre, la teneur en substance no.4 augmente rapidement dans
les explants parasités. Mais les explants de la variété ré¬
sistante en contiennent plus que ceux de la variété sensible
seulement à partir du septième jour après l'inoculation.
Page 78
- 72 -
Récapitulation générale
Les racines et les explants sains de la variété résistante
Kentucky 170 contiennent toujours plus de phénols solubles
que ceux de la variété sensible Sota 50. Les racines con¬
tiennent surtout de l'acide chlorogénique, tandis que les
explants ont une teneur plus élevée en scopoline et en
substances no.2 et 4.
En présence du pathogène, les racines de la variété ré¬
sistante contiennent toujours plus d'acide chlorogénique, de
scopoline et des substances no.2 et 4, que les racines de la
variété sensible.
Dans les explants parasités, cultivés en présence de 2,4-D ou
d'AIA, la concentration en acide chlorogénique diminue et
celle de la scopoline reste relativement stable au cours de
1'infection.
Les explants parasités de la variété résistante, cultivés
avec du 2,4-D, se distinguent par une teneur en substances
no.2 et 4 croissante au cours de l'infection pendant qu'elles
disparaissent dans ceux de la variété sensible. Les explants
parasités de la variété résistante, cultivés avec de l'AIA,
contiennent plus de substance no.2 que ceux de la variété
sensible. L'accumulation en substance no.4 est semblable dans
les deux variétés.
Page 79
- 73 -
3.7.4. Influence du C. elegans sur la teneur en phénolsdes différentes couches de tissus des explants.
3.7.4.1. Les explants cultivés avec du 2,4-D
Nous avons analysé, au chapitre précédent, l'influence du
C. elegans sur la teneur en phénols des tissus superficiels
des explants. Dans ce chapitre, nous considérons les rela¬
tions entre la teneur en phénols des couches sous-jacentes
et celle des couches superficielles. Les couches de tissus
sous-jacentes ont 2 mm d'épaisseur. Elles sont d'aspect sain,
dépourvues d'hyphes et situées en dessous des couches super¬
ficielles aux tissus bruns et parasités. Les couches superfi¬
cielles des témoins du Sota 50 ont moins de phénols solubles
totaux, d'acide chlorogénique et de scopoline que les sous-
jacentes (fig. 29). Les couches sous-jacentes d'expiants ino¬
culés du Sota 50 ont moins de phénols solubles totaux, de
scopoline, de substance no. 4 et plus d'acide chlorogénique
que celles des témoins. Elles ont une teneur semblable en
substances no. 2 et 4. Les couches superficielles des témoins
du Kentucky 170 ont moins de phénols solubles totaux, d'acide
chlorogénique et de scopoline que les sous-jacentes et une
teneur semblable en substances no.2 et 4. Les couches sous-
jacentes d'expiants inoculés du Kentucky 170 ont la même te¬
neur en phénols que celles des témoins. Il semble donc que le
C. elegans influence très peu la teneur en phénols des
couches sous-jacentes des explants cultivés avec du 2,4-D.
Page 80
Z)
z
(ïl
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DSAIN
170
KENTUCKY
50
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KENTUCKY
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KENTUCKY
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KENTUCKY
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170
KENTUCKY
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50
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CHLOROGÉNIQUE
ACIDE
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PHENOLS
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»-.
aIL
3
CD
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4,64.uM,
(kinétine
2,4-D
de
4,52.uM
avec
cultivés
d'expiants
(B)
sous-jacents
et
l'inoculation).
après
jours
10
(A)
superficiels
tissus
des
phénols
en
teneur
la
sur
elegans
C.
du
Influence
29:
Fig.
Page 81
- 75 -
3.7.4.2. Les explants cultivés avec de l'AIA
Les couches superficielles et sous-jacentes des explants du
Sota 50 ont la même teneur en phénols solubles totaux et en
scopoline (fig. 30). La teneur en acide chlorogénique du
Sota 50 est plus élevée dans les couches sous-jacentes que
dans les superficielles, alors que la teneur en substances
no. 2 et 4 est plus élevée dans les couches superficielles.
La teneur en phénols solubles totaux, en scopoline et en
substances no. 2 et 4 est plus élevée dans les couches sous-
jacentes des explants inoculés du Sota 50 que dans celles des
témoins; la teneur en acide chlorogénique y est par contre
plus faible.
Les couches superficielles et sous-jacentes des explants du
Kentucky 170 ont la même teneur en phénols solubles totaux.
Dans les explants du Kentucky 170, la teneur en acide chloro¬
génique, en scopoline et en substances no.2 est plus élevée
dans les couches superficielles que dans les sous-jacentes.
Par contre, la teneur en substance no.4 est moins élevée dans
les couches superficielles que dans les sous-jacentes.
Dans les couches sous-jacentes d'expiants inoculés du Ken¬
tucky 170, la teneur en acide chlorogénique et en scopoline
est plus élevée que dans les témoins, tandis que la teneur en
substances no. 2 et 4 y est plus faible. La teneur en scopo¬
line est maximale dans les couches sous-jacentes d'expiants
inoculés du Kentucky 170 et celle des substances no.2 et 4
est maximale dans les couches superficielles.
Dans les explants cultivés avec de l'AIA, au contraire de
ceux cultivés avec du 2,4-D, le C. elegans influence forte¬
ment la teneur en différents phénols des couches sous-
jacentes du Sota 50 et du Kentucky 170. Le C. elegans influ¬
ence la teneur en divers phénols de la même manière dans
les couches superficielles du Kentucky 170 que dans les sous-
jacentes du Sota 50. Ceci indiquerait que les cellules du
Kentucky 170 réagissent plus rapidement au C. elegans que
celles du Sota 50.
Page 82
- 76 -
Encore une remarque au sujet de la répartition des phénols
solubles entre les couches superficielles et sous-jacentes.
Les couches sous-jacentes des explants cultivés du 2,4-D ont
une teneur en divers phénols, comme en phénols totaux, plus
élevée que les superficielles. Dans les explants cultivés
avec de l'AIA, les teneurs en phénols totaux sont semblables,
mais la répartition des teneurs en divers phénols y est plus
hétérogène. Les couches superficielles de ces explants sont
plus riches en acide chlorogénique, en scopoline et en
substances no.2 et 4 que les sous-jacentes.
Page 83
jn
170
KENTUCKY
fl
INOCULÉ
DSAIN
50
SOTA
NO.4
SUBSTANCE
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2.5
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170
KENTUCKY
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INOCULÉ
DSAIN
50
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170
KENTUCKY
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KENTUCKY
11+1
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INOCULÉ
DSAIN
-6
50
SOTA
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170
KENTUCKY
BINOCULÉ
DSAIN
50
SOTA
O3
10
20
CD
_J
-V.
—
X.
OCD
3
CHL0R0GÉNQ1UE
ACIDE
TOTAUX
SOLUBLES
PHENOLS
4,64.uM,
(kinétine
d'AIA
5,7.uM
avec
cultivés
d'expiants
(B)
sous-jacents
et
l'inoculation).
après
jours
10
(A)
superficiels
tissus
des
phénols
en
teneur
la
sur
elegans
C.
du
Influence
30:
Fig.
Page 84
- 78 -
3.8. Biotests
3.8.1. Inhibition du Cladosporium cucumerinum
sur couche mince
La croissance du C. cucumerinum ne pose aucun problème sur
les couches minces des chromatogrammes. Elle n'est pas in¬
hibée par l'acide chlorogénique à la concentration de 50.ug,
ni par la scopoline à la concentration de 10.ug. La scopolé¬
tine, son aglycone, l'inhibe à partir de 2,5,ug (diamètre de
la zone d'inhibition pour 2,5.ug 3.75 + 0,6 mm; pour 10,ug
6,0 + 0,4 mm). Le C. elegans ne croît pas sur couche mince
malgré l'adjonction de gélose.
3.8.2. Inhibition de la germination des
endoconidies du C. elegans
Le pourcentage de germination des endoconidies est faible et
variable sur les milieux nutritifs géloses usuels. En milieu
liquide, les résultats deviennent encore plus difficiles à
répéter, car soit les hyphes restent courtes et s'enroulent
autour de 1'endoconidie, soit elles sont très fines et
atteignent jusqu'à 10 fois la longueur de la conidie. Seule
l'adjonction de jus de carotte à la gélose permet d'obtenir
des pourcentages de germination élevés et réguliers.
L'acide chlorogénique n'exerce aucune influence sur la ger¬
mination des endoconidies; par contre la scopoline et la
scopolétine sont toxiques (fig. 31). La scopolétine est plus
toxique que la scopoline puisque 5.ug ne permettent la ger¬
mination que de 32% des endoconidies pour la première et de
84% pour la seconde. Il faut 30,ug du mélange des trois
substances (1:1:1) pour inhiber la germination à 100%.
Page 85
- 79 -
Germination des endoconidies du C. elegans en pré¬
sence d'acide chlorogénique (a), de scopoline (b),
de scopolétine (c) et du mélange des trois composés
a la concentration de 1:1:1 (d).
0 2.5 5 7.5 10 15 30 Lug]
Page 86
- 80 -
3.8.2.1. Influence des extraits phenoliques bruts sur la
germination des endoconidies du C. elegans
Les extraits phenoliques bruts des racines: au moment de
l'inoculation, les extraits des racines sont toxiques; ceux
de la variété résistante Kentucky 170 ont le même degré de
toxicité que ceux de la variété sensible Sota 50 (tab. 7). La
toxicité provient probablement d'une réaction des racines aux
blessures causées lors de leur transfert du quartz dans le
papier buvard. Quinze jours après l'inoculation, les extraits
des racines infectées du Sota 50 sont plus toxiques que ceux
des racines saines. On ne décèle pas de différences signi¬
ficatives entre les extraits des racines saines et ceux des
parasitées des deux variétés.
Tab. 7: Germination des endoconidies (%) du C. elegans en
présence des extraits bruts des racines (2 mg MS,
germination sur jus de carotte = 100%)
Jours
après1'inocu¬
lation
KENTUCKY 170
Inocule
SOTA 50
Inoculé
0 65,0 + 2,8
5 94,3 + 5,5 85,6 + 5,8
10 72,6 + 13,3 80,6 +11,3
15 75,3 + 25,0 73,0 + 12,3
49,3 + 22,4
92,0 + 6,9 85,0 + 17,3
80,6 +11,9 71,0 + 16,8
86,5 + 0,7 65,0 + 4,2
Les extraits phenoliques bruts des explants: les extraits
provenant d'expiants sains cultivés avec de l'AIA ou du
2,4-D, n'influencent pas la germination des endoconidies. Les
extraits bruts des explants parasités du Sota 50, cultivés
avec de l'AIA, inhibent toujours plus la germination des en¬
doconidies que ceux du Kentucky 170 (fig. 32). Cette inhi¬
bition augmente en fonction du temps écoulé après l'inocula¬
tion.
Page 87
- 81 -
Les extraits bruts d'expiants parasités du Sota 50, cultivés
avec du 2,4-D, n'inhibent presque pas la germination des en¬
doconidies (fig. 32), tandis que les extraits bruts du Ken¬
tucky 170 l'inhibe. Cette inhibition augmente jusqu'au sept¬
ième jour après l'inoculation des explants, puis reste con¬
stante jusqu'au dixième jour, mais n'est jamais aussi forte
que pour les extraits provenant d'expiants parasités du Sota
50, cultivés avec de l'AIA. Les fortes variations, entre les
répétitions, ne sont pas dues à un défaut méthodologique du
test de germination comme l'indiquent les résultats détaillés
d'un essai (tab. 8).
Fig. 32: Germination des endoconidies du C. elegans en pré¬
sence des extraits bruts d'expiants cultivés avec:
A: 5,7,uM d'AIA, B: 4,52,uM de 2,4-D (kinétine
4,64,uM, 0,4 mg MS). Les extraits bruts d'expiants
sains n'influencent pas la germination.
100
rb_. A: AIA
50
0
100
50
SOTA 50 DKENTUCKY 170
B: 2.4-0
ifirti rh
0 4 7 10
JOURS APRES L'INOCULATION
Page 88
- 82 -
Tab. 8: Germination des endoconidies (%) du C. elegans en
présence d'extraits bruts des racines. Résultats
d'un essai (kinétine 4,64.uM, 0,4 mg MS, expl. cf,
fig. 32).r
KENTUCKY 170 SOTA 50
Jours
après1'inocu¬ Inoculé Inocule
lation * + mm +
0 54 61 61 _ _ _ 58 69 62 mm. mm __.
4 99 94 96 91 92 99 97 99 98 94 93 85
7 96 83 90 91 96 84 85 88 91 86 90 95
10 95 95 73 78 79 68 96 95 96 82 80 93
Récapitulation
L'acide chlorogénique n'a aucune influence sur la germination
des endoconidies. La scopoline est peu toxique pour la germi¬
nation des endoconidies et la scopolétine est très toxique.
Les extraits phenoliques bruts des racines et des explants
sont en général peu toxiques et contiennent surtout de la
scopoline et seulement des traces de scopolétine. Le pourcen¬
tage de germination des endoconidies ne concorde pas avec la
teneur en phénols solubles totaux ou individuels des extraits
des racines ou des explants. Cependant, les extraits bruts
sont très toxiques dans certains cas; par exemple au moment
de l'inoculation des racines ou dans les explants parasités
de la variété sensible Sota 50 (cultivés avec de l'AIA). Pour
comprendre la toxicité de ces extraits, il faut envisager
l'action d'autres molécules fongitoxiques qui n'ont pas été
dédectées. Les deux exemples qui suivent montrent que la te¬
neur de ces molécules doit varier différemment de celle des
Page 89
- 83 -
phénols. La teneur en phénols solubles totaux des racines
saines est à peu près semblable au jour de l'inoculation et
au quinzième jour, mais les premiers extraits sont plus
toxiques que les seconds. Les extraits d'expiants parasités
de la variété Sota 50 (cultivés sur de l'AIA) sont dépourvus
de phénols solubles au dixième jour après l'inoculation,
alors que leur toxicité est maximale.
Page 90
- 84 -
4. DISCUSSION
4.1. Déroulement de l'infection et de la
colonisation des racines
Le déroulement de l'infection observée dans ce travail est
semblable a. celui décrit pour différentes espèces de plantes
sensibles au C. elegans (Stover, 1950 a; Christou, 1962; Tsao
et Van Gundys, 1962; Marthe et al., 1966 b; Wick et Moore,
1983). La variété résistante Kentucky 170 est faiblement co¬
lonisée par le C. elegans et a perdu l'immunité que possède
un de ses géniteurs, le N. debneyi, comme le constataient
Litton et Stokes (1966). Les racines de la variété sensible
ou résistante sont colonisées de la même façon. La seule dif¬
férence entre ces deux variétés est d'ordre quantitatif. Le
mycélium de surface, parfois très développé sur les racines
nues, n'a jamais été observé sur les racines inoculées en
terre et n'est peut-être qu'un artefact. Mais l'influence des
facteurs climatiques et trophiques sur l'émission d'exudats
et la prolifération de ce parasite de faiblesse à la surface
de la racine est mal connue. Il est donc difficile, pour
l'instant, d'estimer le rôle joué par ce mycélium de surface
dans la pathogénèse de la pourriture noire.
4.2. La résistance dans les cals
Une résistance monogénique et polygenique s'exprime en
culture de tissus non seulement contre le Phytophthora
parasitica var. nicotianae (Deaton et al., 1982; Helgeson et
al., 1972 a), mais ausssi contre le C. elegans. Les trois
principaux facteurs qui influencent le degré de maladie des
cals parasités par le C. elegans sont: le degré d'agrégation
celluaire, la taille des cals et la dose d'inoculum. Les ré¬
sultats de ce travail confirment que les deux premiers fac¬
teurs peuvent, entre autre, être influencés par la balance
hormonale du milieu nutritif et que la variété utilisée joue
aussi un rôle (Linsmaier et Skoog, 1965; Upper et al., 1970;
Helgeson et Upper, 1969).
Page 91
- 85 -
L'expression d'une résistance monogénique au C. elegans dans
les cals dépend, comme dans le cas d'une résistance monogé¬
nique au P. parasitica, du type d'auxine utilisée (Haberlach
et al., 1978). Cependant, on n'observe pas, dans les cals
inoculés par le C. elegans, une perte subite de la résistance
lorsque le rapport des concentrations en cytokinine et en
2,4-D dépasse l'unité. L'écart entre les indices de maladie
des deux variétés de tabac parasitées par le C. elegans varie
peu, malgré l'utilisation de concentrations croissantes de
2,4-D. L'influence d'un type d'auxine sur l'expression de la
résistance au C. elegans est indirecte, car les cals cultivés
avec de l'ANA sont très rapidement colonisés parce qu'ils
sont spongieux. Par contre l'ANA n'empêche pas l'expression
d'une résistance polygenique au P. parasitica (Deaton et al.,
1982). Le degré d'agrégation cellulaire des cals joue proba¬
blement un rôle moins important pour le développement du
Phytophtora qui forme des haustoria (Coffey et Wilson, 1983),
alors que le C. elegans, un saprophyte plus adaptable aux
conditions trophiques de son milieu, ne doit pas rapidement
pénétrer dans la cellule pour survivre. Le peu d'influence
qu'excercent les diverses concentrations hormonales sur l'ex¬
pression d'une résistance monogénique au C. elegans s'expli¬
que peut-être aussi par le fait que le champignon colonise
toute la racine et que l'on n'observe pas de différences
suivant des zones morphologiques et physiologiques détermi¬
nées. Or, l'existence de gradients hormonaux dans le végétal
est admise et le premier millimètre des racines du haricot
contient 43 fois plus de cytokinines libres que la partie
proximale (Short et Torrey, 1972).
Page 92
- 86 -
4.3. Les acides aminés
Les teneurs en acides aminés des explants correspondent à
celles mesurées dans les tiges de divers Nicotiana âgés de
3 mois (Dumas et al., 1981) et à celles mesurées dans les
cals de deux autres variétés du Kentucky (Kasperbauer et
Hamilton, 1977).
Les acides aminés qui sont plus toxiques pour les variétés
sensibles que pour les variétés résistantes au C. elegans,
lorsqu'ils sont appliqués aux plantules (Steinberg, 1951), ne
jouent pas de rôle dans la résistance à ce parasite. Leurs
teneurs peuvent varier très fortement entre les racines et
les explants sans que la résistance de ces tissus soit alté¬
rée. L'asparagine inhibe parfois la formation des chlamydo¬
spores in vitro (Stover, 1956), mais il n'y pas de relation
entre la teneur en asparagine d'un tissu et son indice de
maladie. La diminution de la teneur en asparagine et en glu¬
tamine des explants est plus importante chez la variété sen¬
sible que la résistante. Mais cette diminution n'a pas de
signification particulière pour la sensibilité d'un tissu au
C. elegans. La glutamine ne stimule pas la formation des
chlamydospores (Stover, 1956).
A l'exception des acides aminés aromatiques, qui ont été dé¬
tectés en quantité insuffisante pour autoriser une interpré¬
tation fondée des résultats, il ne semble pas que les acides
aminés jouent un rôle dans la résistance au C. elegans.
Page 93
- 87 -
4.4. Les phénols
Les stimuli comme le transfert des racines, de la terre au
papier buvard, ou l'inoculation des racines et des explants
par le C. elegans influencent la teneur en phénols de ces
tissus. Ces résultats confirment ceux obtenus avec le même
ou d'autres parasites du tabac (Gayed et Rosa, 1975; Ravisé
et Tanguy, 1973; Fritig et al., 1972). Les changements de la
teneur en acide chlorogénique et en scopoline, observés dans
les racines de la variété résistante inoculées par le C. ele¬
gans, correspondent à ceux décrits par Fritig et al. (1972)
dans les feuilles de tabac inoculées et résistantes au TMV.
Cependant, le transfert des racines provoque une diminution
importante de la teneur en acide chlorogénique durant les
cinq jours qui suivent l'inoculation et masque peut-être le
catabolisme observé dans les feuilles inoculées par le TMV.
Les racines et surtout les cals contiennent parfois à forte
concentration deux composés phenoliques (substances no.2 et
4) aux caractéristiques très proches de celles d'un ester
de l'acide férulique. Des molécules semblables ont déjà été
identifiées chez d'autres variétés de tabac (Ravisé et
Tanguy, 1973; Fritig et al., 1970) et les parois primaires
des Graminées et des Dicotylédones contiennent de l'acide
férulique lié aux saccharides. L'acide férulique rendrait la
paroi primaire plus rigide et diminuerait sa teneur en eau,
ce qui limiterait l'accès des glucanases pariétales aux
substrats (Fry, 1979, 1982).
La diminution de la teneur en acide chlorogénique et l'accu¬
mulation rapide de scopoline et des substances no.2 et 4 dans
les racines inoculées de la variété résistante pourrait être
le signe d'une lignification accélérée des parois. L'accumu¬
lation de scopoline dans les feuilles de tabacs inoculées par
le TMV conduit à une lignification des parois qui empêche la
propagation du virus (Massala 1981).
Dans les cals, la teneur en scopoline est, comparée à celle
des racines, très élevée et diminue après l'inoculation par
le C. elegans, alors que la teneur en substances no.2 et 4
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- 88 -
augmente. Cette diminution, qui est toujours plus importante
chez la variété résistante que chez la variété sensible,
pourrait aussi être la conséquence de son utilisation pour
la lignification des parois. Ces variations des teneurs en
scopoline et en substances no.2 et 4, entre les racines et
les explants, reflètent peut-être simplement des alternatives
possibles parmi les différentes voies de synthèse des phényl-
propanoides qui aboutissent à une lignification des parois
(voir Legrand, 1983; Alibert et al., 1977).
Dans les tissus sous-jacents sains, d'expiants cultivés avec
de l'AIA et inoculés par le C. elegans, la synthèse des
phénols est fortement stimulée comme dans les cellules in¬
tactes des feuilles inoculées par le TMV (Legrand et al.,
1975). Cette stimulation de la synthèse des phénols est moins
prononcée dans les explants cultivés avec du 2,4-D. Le fait
que les explants cultivés avec du 2,4-D sont plus compacts et
constitués de cellules plus petites que ceux cultivés avec de
l'AIA joue certainement un rôle lors de la propagation du
C. elegans et de la stimulation de la synthèse des phénols.
Mais il est toutefois difficile d'en estimer l'importance.
La toxicité de la scopoline et de la scopolétine in vitro
serait un argument en faveur d'un mécanisme de résistance
chimique. Mais ces deux phénols sont inclus dans des vacuoles
et un contact direct entre 1'hyphe de pénétration et ces com¬
posés fongitoxiques, dans les cellules stimulées, rend leur
action inefficace et improbable dans une première phase de
l'infection (Clarke, 1973). D'ailleurs la toxicité des ex¬
traits bruts ne concorde pas avec leur teneur en phénols,
comme le constataient Ravisé et Tanguy (1973), et d'autres
substances fongitoxiques s'accumulent plus rapidement dans
les explants de la variété sensible cultivés avec de l'AIA
que dans ceux de la variété résistante. La fongitoxicité de
la scopoline, la scopolétine est quasi absente de la fraction
soluble, n'a qu'une importance secondaire dans la résistance
au C. elegans. Son accumulation doit correspondre à une lig¬
nification accélérée des cellules encore saines et stimulées
par le parasite.
Page 95
- 89 -
5. RESUME
Le Chalara elegans (Nag Raji et Kendrick) provoque la pourri¬
ture noire des racines du tabac et cause les mêmes symptômes,
mais avec des intensités fortement différentes,, sur deux
variétés du N. tabacum, l'une sensible (Sota 50) et l'autre
résistante (Kentucky 170).
La résistance ou la sensibilité de ces deux variétés s'ex¬
prime dans les explants et les transplants (cals). Le genre
d'auxine £ l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D),
l'acide indolylacétique (AIA) et l'acide naphtalèneacétique
(ANA)J, influence le degré d'agrégation cellulaire et le
degré de maladie des cals. Cependant, à l'exception des
tissus cultivés en présence d'ANA, la variété résistante est
toujours moins parasitée que la variété sensible pour une
concentration d'auxine donnée.
La teneur en acides aminés libres totaux est moins élevée
dans les racines que dans les explants. Le spectre des acides
aminés ne change pas de la même façon dans les racines et
les explants, 10 jours après l'inoculation. Il n'y a pas de
relation entre la teneur en acides aminés d'un tissu,
à
l'exception des acides aminés aromatiques, et sa résistance
au C. elegans.
La variété résistante contient plus de phénols solubles, dans
les racines et les explants, que la variété sensible. La va¬
riété résistante se distingue de la variété sensible par une
plus forte accumulation de phénols ou une perte plus faible
après l'infection. Les mêmes phénols ont été détectés dans
les racines et les explants. Il s'agit de: l'acide chlorogé¬
nique, la scopoline et deux substances (no.2 et 4), probable¬
ment des esters de l'acide férulique.
L'infection des couches de tissus superficiels des explants
influence la teneur en phénols des couches de tissus sous-
jacents sains. Cette influence est faible pour les explants
cultivés avec du 2,4-D et forte pour ceux cultivés avec de
l'AIA. Dans ces couches sous-jacentes, la teneur en phénols
change toujours plus rapidement chez la variété résistante
que chez la variété sensible.
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- 90 -
Les extraits phenoliques bruts sont fongitoxiques. Cependant,
le degré de toxicité des extraits ne concorde pas avec leur
teneur en phénols solubles totaux ou avec celle des autres
phénols détectés.
Les concentrations en phénols des tissus infectés par le
C. elegans indiquent que leur métabolisme est plus rapidement
stimulé chez la variété résistante que chez la variété sen¬
sible. Cette stimulation refléterait un mécanisme de ré¬
sistance postinfectionnel qui, par une lignification accélé¬
rée des parois, restreindrait la progression du C. elegans.
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- 91 -
ZUSAMMENFASSUNG
Resistenz von Tabak-Gewebekulturen und -Wurzeln gegen Chalara
elegans: Bedeutung von Aminosâuren und Phenylpropanoiden.
Chalara elegans (Nag Raji und Kendrick), Verursacher der Ta-
bakwurzelfâule, ruft bei Pflanzen der resistenten N. tabacum-
Sorte Kentucky 170 die gleichen Symptôme in stark reduzierter
Ausbildung hervor, wie bei Pflanzen der anfalligen Sorte Sota
50. In den Gewebekulturen von Pflanzen beider Sorten finden
sich parallèle Resistenzverhâltnisse. Der im Kulturmedium
verwendete Auxintyp Q 2,4-Dichlorphenoxyessigsâure (2,4-D),
3-Indolessigsâure (IES) oder Naphthylessigsâure (NES)] beein-
flusst den Grad der zellulâren Aggregation und den Resistenz-
grad der Kalli. Gewebekulturen der resistenten Sorte waren,
ausgenommen NES-Kulturen, schwâcher befallen als Kalli der
anfalligen Sorte, wenn jeweils dieselben Auxinkonzentrationen
verwendet wurden.
Die Konzentration der freien Aminosâuren ist in den Kalli hô-
her als in Wurzeln von Pflanzen; die Aminosâure-Spektren ver-
ândern sich bis zum 10. Tag nach der Inokulation in den bei-
den Geweben verschieden. Zwischen der Konzentration an freien
Aminosâuren, ausgenommen Aminosâuren mit aromatischer Stru-
ktur und der Resistenz eines Gewebes gegen C. elegans besteht
keine Korrelation.
In Wurzeln und Kalli von Pflanzen der resistenten Sorte lâsst
sich eine hôhere Konzentration von lôslichen Phenolen nach-
weisen als in Geweben von Pflanzen der anfalligen Sorte, wo-
bei in Wurzelgewebe und Kallus die gleichen Stoffe nachgewie-
sen wurden: Chlorogensâure, Scopolin und die Substanzen 2 und
4, bei denen es sich um veresterte Ferulasâuren handeln
diïrfte.
Die Infektion der âussersten Gewebeschicht beeinflusst die
Phenolkonzentration der inneren, noch unbefallenen Schichten.
In Kulturen auf 2,4-D-Medien ist dieser Effekt nur schwach,
hingegen bei Kulturen auf IES-Medien stark ausgeprâgt; wobei
sich der Phenolgehalt von resistenten Kalli schneller verân-
dert als jener von Kalli der anfalligen Sorte.
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- 92 -
Die Fungitoxizitat der phenolischen Rohextrakte ist nicht mit
ihrem jeweiligen Gesamtphenolgehalt oder mit der Konzentra¬
tion eines der untersuchten Phenole korreliert. Die hôhere
Phenolkonzentration in den von C. elegans infizierten Geweben
resistenter Pflanzen deutet auf eine beschleunigte Stimula¬
tion des Phenolmetabolismus hin. Der erhôhte Phenolstoffwech-
sel kônnte zu einer beschleunigten Zellwandlignifizierung
fuhren, welche die Ausbreitung des Parasiten durch das Gewebe
begrenzt.
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RESISTANCE OF TOBACCO ROOTS AND CALLI TO CHALARA ELEGANS:
ROLE OF AMINOACIDS AND PHENYLPROPANOIDS
ABSTRACT
Chalara elegans (Nag Raji and Kendrick) causes root rot of
tobacco with the same symptoms but différent intensities on
two cultivars of N. tabacum, one sensible (Sota 50) and the
other résistant (Kentucky 170).
Résistance or sensibility of the cultivars is expressed in
calli. The type of auxins (2,4-D, AIA, NAA) influence the
disease rate of the calli. However, calli from the résistant
cultivar are less attacked than those from the sensible cul¬
tivar when grown with the same concentration of 2,4-D or AIA,
but not with NAA.
The concentration of soluble aminoacids is higher in calli
than in roots, there is no corrélation between the amount of
aminoacids in the tissue, except for the aromatic ones, and
the résistance of the tissue to C. elegans.
The résistant cultivar contains more soluble phenolic com-
pounds in roots and calli than the sensible cultivar. After
infection, the résistant cultivar accumulâtes more phenolic
compounds, or looses less, than the sensible cultivar. The
same major phenylpropanoids (chlorogenic acid, scopolin and
two substances, probable esters of ferulic acid) are found in
roots and calli.
Superficially infected calli cells grown with AIA influence
the phenylpropanoids concentration of the underlying healthy
cells. Phenylpropanoids concentration changes more rapidly in
healthy cells of the résistant cultivar than in those of the
sensible cultivars.
Crude phenolic extracts are fungitoxic. However, their toxi-
city is not correlated with the concentration of any phenyl-
propanoid.
The rapid postinfectional phenylpropanoid accumulation found
only in the résistant cultivar could represent a résistance
mechanism to C. elegans, as an increased lignification of the
cell wall may restrict the spread of the pathogen.
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Van Andel, O.M., 1966: Amino acids and plant diseases. Ann.
Rev. Phytopath. £, 349-363.
Wegen, H.W. et C. Glase, 1981: Untersuchungen uber Tumorent-
wicklung an einer Tabakhybride (Nicotiana clevelandii
Gray x Nicotiana glutinosa L.). Phytopath. Z. 102, 60-77.
Wender, S.H., 1970: Effects of sortie environmental stress
factors on certain phenolic compounds in tobacco. Rec.
Advan. Phytochem. 3^, 1-29.
Wick, R.L. et D.L. Moore, 1983: Histopathology of root di¬
sease incited by Thielaviopsis basicola in Ilex crenata.
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Wightman, F., 1962: Metabolism and biosynthesis of 3-indol-
acetic acid and related indole compounds in plants.
Can. J. Bot. 40, 689-718.
Page 108
REMERCIEMENTS
C'est avec plaisir que je tiens à remercier monsieur le
professeur Kern de m'avoir donné la possibilité d'accomplir
cette thèse à l'institut de Phytomédecine du Polytechnicum.
Je tiens aussi à remercier madame Défago qui a proposé le
sujet de cette étude et m'a aidé de ces critiques à l'heure
des bilans. Ce travail n'eût été pensable sans la contri¬
bution généreuse de monsieur Corbaz qui a non seulement
fourni les indispensables semences du tabac et la souche du
champignon, mais a aussi volontier accepté d'examiner cette
thèse; qu'il soit vivement remercié pour son aide précieuse.
Enfin, je dois toute ma reconnaissance à madame Rosenberger
pour la dactylographie du texte et ses heureuses suggestions
quant à la mise en page.
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CURRICULUM VITAE
Poitry Robert, de Coppet VD et Vandoeuvres GE.
Né le 12 mai 1953 à Zurich.
1960 - 1969 Ecole primaire et secondaire à Neuchâtel
1969 - 197 2 Gymnase cantonal de Neuchâtel,
Maturité fédérale type C
1972 - 1977 Etudes d'agronomie, direction production
végétale, à l'EPFZ
1977 - 1980 Assistant des Professeurs H. Kern et
G. Bocquet à l'Institut de botanique
spéciale de l'EPFZ
1980 - 1984 Préparation d'une thèse à l'Institut de
Phytomédecine de l'EPFZ sous la direction
du Professeur H. Kern
depuis l'automne
1983 Chargé du lectorat en physiologie végétale
au Brevet d'enseignement secondaire de
l'Université de Berne.
