Effect of Anticonvulsant Drugs on the Rate of Folate Catabolism in Mice

8/10/2019 Effect of Anticonvulsant Drugs on the Rate of Folate Catabolism in Mice

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E f f e c t o f A n t i c o n v u l s a n tD r u g s on t h e

R a t e o f F o l a t e C a t a b o l i s mi n M i c e

DEIR DREK E L LY,DONALDW E I R ,BERENICER E E D , a n dJOHN S C O T T , D e p a r t m e n t s o fC l i n i c a l M e d i c i n eand B i o c h e m i s t r y ,T r i n i t yC o l l e g e , D u b l i n2 , I r e l a n d

A B ST R A C T An i n c r e a s e i n f o l a t ec a t a b o l i s mh a sb e e n s u g g e s t e da s t h ec a u s e o ft h ef o l a t ed e f i c i e n c yo b s e r v e d i n m a n y c l i n i c a lc o n d i t i o n s ,i n c l u d i n gc h r o n i ca n t i c o n v u l s a n tt h e r a p y .

P r e v i o u s s t u d i e sh a v e s h o w nt h a tt h e r a d i o a c t i v ec a t a b o l i t e s ,e x c r e t e da f t e ra n e q u i l i b r a t i o np e r i o d o f3 d , c o n s i s t e d e x c l u s i v e l yo f f o l a t e st h a th a d b e e nc l e a v e dt op r o d u c ep t e r i d i n e sa n dp - a m i n o b e n z o y l g l u -t a m a t e , m o s to fw h i c hw a s e x c r e t e da s a c e t a m i d o b e n -z o y l g l u t a m a t e .We h a v e d e v e l o p e da n e x p e r i m e n t a la n i m a lm o d e lu s i n gm i c et od e t e r m i n et h e r a t eo f c a t a b -o l i s m o f [ 3 H ] p t e r o y l g l u t a m a t e( f o l i ca c i d )b y t h eq u a n -t i t a t i v ee s t i m a t i o n o f [ 3 H ]p - a m i n o b e n z o y l g l u t a m a t ea n d [ 3 H ] a c e t a m i d o b e n z o y l g l u t a m a t ei n u r i n e .A d m i n -i s t r a t i o no f d i p h e n y l h y d a n t o i na t t h r e e d i f f e r e n td o s e s( 0 . 5 ,2 0 ,a n d 5 0 m g / k g )s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h er a t e

o f c a t a b o l i s ma s m e a s u r e db y a n i n c r e a s e i n b o t h t h em e a n d a i l ye x c r e t i o na n d t h ec u m u l a t i v ee x c r e t i o no ft h e s e c a t a b o l i t e s .A d m i n i s t r a t i o n o f i n t r a m u s c u l a rp h e n o b a r b i t o n eo n t h eo t h e rh a n d , d i d n o t a f f e c tt h er a t eo f c a t a b o l i s m ,w h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o l s .

INTRODUCTION

W h e r e a sf o l a t ed e f i c i e n c yi s a w e l l - r e c o g n i z e df e a t u r eo f c h r o n i c a n t i c o n v u l s a n tt h e r a p y( 1 - 3 ) ,t h e m e c h a -n i s m b y w h i c ht h i sh a p p e n si s s t i l lc o n t r o v e r s i a l .M a l -a b s o r p t i o no f f o l a t eh a sb e e n r e p o r t e dt o o c c u r ( 4 - 6 )b u t h a s n o t b e e n c o n f i r m e d( 7 - 1 1 ) .

T h e f a c tt h a ta n t i c o n v u l s a n td r u g s a r ek n o w nt o i n -d u c e h e p a t i ce n z y m e s( 1 2 ,1 3 )h a s l e d t o a f u r t h e rs e r i e so f h y p o t h e s e s .F i r s t ,R i c h e n sa n d W a t e r s ( 1 4 )h a v e s u g g e s t e dt h a tf o l a t ed e f i c i e n c yma y a r i s eb y i n -d u c t i o no ft h e e n z y m e si n v o l v e di n f o l a t em e t a b o l i s m .S e c o n d ,M a x w e l le t a l .( 1 5 )p r o p o s e dt h a ti t m i g h tb ea r e s u l to f a n i n c r e a s e i n t h e d e m a n df o rt h e f o l a t e

T h i s w o r kw as p r e s e n t e di n p a r t a t t h e XVII C o n g r e s so f t h eI n t e m a t i o n a lS o c i e t y o f H a e m a t o l o g y ,P a r i s ,F r a n c e ,2 3 - 2 9J u l y1 9 7 8 .

R e c e i v e df o r p u b l i c a t i o n2 8 J u l y1 9 7 8a n d i n r e v i s e df o r m2 7 A p r i l1 9 7 9 .

c o e n z y m e sr e q u i r e d ,e i t h e rf o ra n t i c o n v u l s a n td r u g h y -d r o x y l a t i o no r f o ro t h e r h e pa t i ce n z y m e si n d u c e d b yt h e s e d r u g s .

I n c r e a s e d c a t a b o l i s mo f f o l a t eh a s a l s ob e e n s u g -

g e s t e d a s t h e c a u s e o f t h e f o l a t ed e f i c i e n c yo b s e r v e di n m a n y o t h e r c l i n i c a lc o n d i t i o n s ,s u c h a s p r e g n a n c y ,m a l i g n a n c y ,h e m o l y t i ca n a e m i a ,a n d i n f l a m m a t o r yd i s -e a s e ( 1 6 ) .

U n t i lr e c e n t l y t h em e c h a n i s mo f f o l a t ec a t a b o l i s mw a s n o t k n o w n ,a n d i t w a s t h e r e f o r en o t po s s i b let oc o n f i r mo r r e f u t et h e a b o v e - m e n t i o n e dh y p o t h e s i s .An u m b e ro f s t u d i e si n r a t sh a v es h o w nt h a ta t r a c e rd o s eo f h i g h s p e c i f i ca c t i v i t y[ 3 H ] p t e r o y l g l u t a m a t e( P t e G l u ) 1b e c o m e sf u l l ye q u i l i b r a t e di n t ot h e t i s s u e f o l a t ep o l y -g l u t a m a t ep o o l s a f t e rp e r i o ds o f2 o r3 d ( 1 7 ) .W i t hs u c ha t r a c e rd o s e t o l a b e lt h e e n d o g e n o u sp o o l s w e h a v e

r e c e n t l ye l u c i d a t e dt h e m e c h a n i s mo f f o l a t ec a t a b o l i s mi n t h e r a t ( 1 8 ) ,a n d h a v e s h o w nt h a ti t p r o c e e d sv i ac l e a v a g eo f t h e C 9 - N 1 0b o n do f t h e m o l e c u l et o y i e l dp t e r i d i n e s ,w h i c ha r er e t a i n e db y t h e l i v e ra n d r e l e a s e ds l o w l y ( 1 9 ) ,a n d p - a m i n o b e n z o y l g l u t a m a t e( p A B G l u ) ,m o s to f w h i c hi s f i r s ta c e t y l a t e dt o p r o d u c ea c e t a m i d o -b e n z o y l g l u t a m a t e( A p A B G l u )a n d t h e n r a p i d l ye x -c r e t e di n t h eu r i n e ( 1 8 ) .I n t h e 1 s t3 d a f t e ra d m i n i s -t r a t i o no fl a b e l e dP t e G l u ,i . e . ,d u r i n g t h ee q u i l i b r a t i o no ft h et r a c e rd o s e ,a c o m p l e xm i x t u r eo ff o l a t ed e r i v a -t i v e si s f o u n di n t h e u r i n e ( 1 8 ,2 0 - 2 5 ) . A f t e rt h i st i m e ,h o w e v e r ,o n l y c l e a v e df o l a t ec a t a b o l i t e sa r ef o u n di n

t h e u r i n e ( 2 0 ) .T h u s , b e c a u s ea f t e re q u i l i b r a t i o ne a c hm o l e c u l eo f [ 3 H ] P t e G l ut h a ti s c a t a b o l i z e dp r o d u c e sa m o l e c u l eo f e i t h e r[ 3 H ] p A B G l uo r [ 3 H ] A p A B G l u ,i ts e e m sr e a s o n a b l et o s u g g e s t t h a tt h e m e a s u r e m e n to ft h e s e t w or a d i o a c t i v ec a t a b o l i t e sw o u l db e p r o p o r t i o n a lt o t h e r a t eo f c a t a b o l i s m .T h e s ec a t a b o l i t e sc a n o n l y b eq u a n t i t a t i v e l ym e a s u r e dw h e n h y d r o l y z e dt o p - a m i n o -b e n z o i ca c i d ( p A B )( 2 6 ) .W i t h t h i st e c h n i q u e ,w e h a v ed e v e l o p e da n e x p e r i m e n t a la n i m a l m o d e lt o m e a s u r e

I A b b r e v i a t i o n su s e d i n t h i sp a p e r : A p A B G l u ,a c e t a m i d o -b e n z o y l g l u t a m a t e ;p A B , p - a m i n o b e n z o i ca c i d ;p A B G l u ,p-a m i n o b e n z o y l g l u t a m a t e ;P t e G l u ,p t e r o y l g l u t a m a t e .

J . C l i n .I n v e s t . T h eAmer ican S o c i e t yf o r C l i n i c a lI n v e s t i g a t i o n , I n c . 0 0 2 1 - 9 7 3 8 1 7 9 / 1 0 / 1 0 8 9 / 0 8 1 . 0 0 1089Vo l u m e6 4 O c t o b e r1 9 7 9 1 0 8 9 - 1 0 9 6


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t h e r a t eo f f o l a t ec a t a b o l i s mb y t h e q u a n t i t a t i v e e s t i m a -t i o n o f t h e s e t wo c a t a b o l i t e si n u r i n e . T h i s m o d e lw a st h e n u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t so f a n t i c o n v u l s a n tt h e r a p y o n t h e c a t a b o l i cr a t e .

N IE T HOD S

R a d i o c h e m i c a l s . 3 , 5 , 9 (t l) [ 3 H ] F o l i ca c i d ( P t e G l u )w a ss u p p l i e db y T h eR a d i o c h e m i c a lC e n t r e ,A m e r s h a m ,U . K .S p e -c i f i ca c t i v i t yv a r i e df r o m9 3 t o 1 1 0m C i / m gd e p e n d i n go n t h eb a t c h u s e d .[ 3 H ] p A B ( 1 0 0p u r e ) w a s p r e p a r e db y t h e s a m ec o m p a n yb y t r i t i u mg a se x c h a n g ew i t h h a l o g e n a t e dp AB a n dh a d a s p e c i f i ca c t i v i t y2 0 m C i / m g .[ 3 H ] H e x a d e c a n ew i t h a2 . 1 7, t C i / m gs p a c ta n d c h r o m i u m[ 5 t C r ] E D TAw i t h a 7 0 0, C i / m gs p a c to fc h r o m i u mw e r e a l s os u p p l i e d b y t h eR a d i o -c h e m i c a lC e n t r e . [ 2 - 1 4 C ] P t e G l up o t a s s i u ms a l t ,1 3 0, C i / m gs pa c t ,w a sa l s os u p p l i e db y T h eR a d i o c h e m i c a lC e n t r e .p - A m i n o1 4 [ C O 2 H ] b e n z o i ca c i d ,0 . 3m C i / m gs p a c t ,w a s p u r c h a s e df r o mIC N P h a r m a c e u t i c a l s ,I s o t o p e a n d N u c l e a rD i v i s i o n ,I r v i n e ,C a l i f .

A n t i c o , w v u l s a n td r u g s .D i p h e n y l h y d a n t o i n( p h e n y t o i n )s u i t a b l ef o ri n j e c t i o nw a s s u p p l i e d b y P a r k e ,D a v i s C o . ,P o n t y p o o l ,U .K . ,a n d p h e n o b a r b i t o n es o d i u mw a s s u p p l i e db y M a y a n d B a k e rL t d . ,D a g e n h a m ,U . K .

A n i m l a l sa n d t r e a t i n e t n t .N M a l ea n d lf e ma le L a c am i c e t h a tw e i g h e d_ 20 g w e r eg i v e na s i n g l e i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o no f4 , u C io f [ 3 H ] P t e G l ua n d 5 n C i o f [ 5 1 C r I E D TA .I n a n y p a r -t i c u l a re x p e r i m e n te i t h e ra l lm a l e so ra l lf e m a l e sw e r e u s e d .A f t e ra d m i n i s t r a t i o no f t h er a d i o a c t i v ed o s e ,m i c e w e r e r a n -d o m l ya s s i g n e dt o m e t a b o l i cc a g e s i n g r o u p so ff i v e ,a n d t h e i ru r i n e sw e r ec o l l e c t e dd a i l yf o r1 0 o r 1 4 d . E a c hg r o u po fm i c et h e n r e c e i v e da d a i l yi n j e c t i o nf o r1 0 o r 1 4 d . C o n t r o l m i c er e c e i v e d 1 0 0 A lo f s a l i n ei n t r a m i i u s c u l a r l yf o rt h e l e n g t ho ft h ee x p e r i m e n t .

( a ) G r o u pA c o n s i s t e d o f t w o c a g e s o f f i v em i c e i n e a c hg r o u p . T r e a t e d m i c e r e c e i v e d0 . 0 1m g / m o u s e( - 0 . 5 m g / k g )d i p h e n y l h v d a n t o i n

i n t r a m u s c u l a r l yf o r1 4d . ( b )G r o u pB c o n -

s i s t e do fo n e c a g e o f f i v em i c e i n e a c h g r o u p .T r e a t e dm i c er e c e i v e d0 . 4m g / m o u s e( _ 2 0 m g / k g )d i p h e n y l h y d a n t o i np e rm o u s ei n t r a p e r i t o n e a l l vf o r1 0 d . T h i s i s c o n s i d e r e da t h e r a -p e u t i c a n t i c o n v u l s a n td o s a g ef o rm i c e ( 27 ) . ( c )G r o u pC c o n -s i s t e do ft w o c a g e s o f f i v em i c e i n e a c h g r o u p . D i p h e n y l h y -d a n t o i n - t r e a t e dm i c er e c e i v e d l1 . 0m g / m o u s e( - 5 0 m g / k g )i n -t r a m u s c u l a r l yf o r1 0 d ;p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c er e c e i v e d0 . 6m g / m o u s e( _ 3 0 i n g / k g )i n t r a m u s c u l a r l yf o r 1 0 d . A l li n -j e c t i o n sw e r e a d m i n i s t e r e di n s t e r i l es a l i n i ee x c e p tf o rp h e n o -b a r b i t o n ew h i c hw a s a dm i ni s t e re di nd i s t i l l e dw a t e r . No o t h e rc a r r i e r sw e r e a d d e d . A l lg r o u p so f m i c ew e r e k e p ti n s i m i l a rc o n d i t i o n sa n d f e di d e n t i c a lf o l a t e - r e p l e t ed i e t sa d l i b i t u m .

E s t i m a t i o no f [ 5 1 C r ] E DT A .U r i n a r y e x c r e t i o no f [ 5 1 C r ] -E T w a s e s t im at e do n 1d a y s1 a n d 2 b y d i r e c tc o u n t i n go fu r i n e i n a N u c l e a r - C h i c a g oa u t o m a t i cg a m i m i l l ac o u n t e r ( Nu -c l e a r - C h i c a g oC o r p . ,D e s P l a i n e s ,I l l . ) .B e c a u s e9 0 o f t h ea d m i n i s t e r e d[ 5 1 C r ] E D TAi s e x c r e t e dw i t h i n 2 4 h i n h u m a n s( 2 8 ) ,i t w a s f e l tt h a tm e a s u r e m e n to f t h i si s o t o p ew o u l dm o n -i t o rt h e c o m p l e t e n e s so f b o t h i n j e c t i o na n dc o l l e c t i o nt e c h -n i q u e s .In a c o n t r o ls e r i e so f e x p e r i m e n t s ,u r i n a r yr e c o v e r yo f i n t r a p e r i t o n e a l l ya d m i n i s t e r e d[ 5 1 C r ] E D TAw a s 7 7 - 8 2 ;t h i sr a n g e w a s u s e d f o rr e f e r e n c e .

D e v e l o p m e n to f a m e t h o df o r e s t i m a t i o n io f [ 3 H ] p A B G 1 ua n d [ 3 H ] A p A B G l u .A m e t h o df o rt h eh y d r o l y s i so fa l lf o l a t ed e r i v a t i v e st o p AB a n d i t s s u b s e q u e n te s t i m a t i o nh a s b e e nd e v i s e c l( 2 6 ) .A f t e rh y d r o l y s i si n 1 0 M o f KOH f o r9 0 m n a t1 2 0 Ca n d 1 5 l b / i n 2 ,1 0 0 o f t h e f o l a t ed e r i v a t i v e sw e r e c o n -v e r t e d t o p AB w h e n a n a l y z e db y c h r o m a t o g r a p h yo n QAEA2 5 S e p h a d e x( P h ar ma c i a F i n eC h e m i c a l s ,I n c . ,P i s c a t a w a y ,N . J . )a n c lt h e B ra t t o na n d M a r s h a l lt e c h n i q l u e( 2 9 ) .T h e pAB

w a s t h e ne x t r a c t e dw i t h d i e t h y l e t h e ri n w h i c hi t w a s h i g h l ys o l u b l e a t p H 3 . 7 5 .E a c h s a m p l ew a s e x t r a c t e dt h r e e t i m e sw i t h 5 m l o f d i e t h y l e t h e r ,t h e e th e r e v a p o r a t e dt o d r y n e s s ,a n d t h e n t h e s a m p l ew a s r e c o n s t i t u t e dw i t h 1 m l o f d i s t i l l e dw a t e r a n d 1 0 m l t o l u e n e T r i t o n X - 1 0 0( R o h ma n d H a a s C o . ,P h i l a d e l p h i a ,P a . ) .T h ee f f i c i e n c yo f t h i sp r o c e d u r ew a s f o u n dt o b e b e t w e e n8 5 a n d 87 w i t h [ 1 4 C ] p A Bi n r e c o v e r ye x p e r i -m e n t s( 2 6 ) .W h e n t h i st e c h n i q u ew a s r e p e a t e dw i t h [ 3 H ] p A B ,o n l y 2 3 - 3 0 o f t h e a d d e dr a d i o a c t i v i t yw a s r e t r i e v e d .I t w a sf e l tt h a tt h i si m p l i e da d s o r p t i o n o f t r i t i u ml a b e lt o t h e g l a s sv i a l sd u r i n g e v a p o r a t i o n ,w i t h c o n s e q u e n td e c r e a s e dc o u n t -i n ge f f i c i e n c y ,r a t h e rt h a n f a i l u r et o e x t r a c ta d d e d [ 3 H ] p A B .P r e l i m i n a r ya t t e m p t st op r e v e n ta d s o r p t i o no f t r i t i u m b y u s i n gp l a s t i cv i a l s ,a n d b y e v a p o r a t i n gt h e d i e t h y l e t h e ro v e r d i s -t i l l e dw a t e rw e r eu n s u c c e s s f u l .H o w e v e r ,r e p r o d u c i b l er e s u l t sw e r e o b t a i n e dwhen t h ed i e t h y l e t h e rw a s a d d e dd i r e c t l yt ot h es c i n t i l l a t i o nf l u i d .I n a c o n t r o ls e r i e so fe x p e r i m e n t s ,a d d i -t i o no f 5 m l o f d i e t h y l e t h e rt o 1 0 m l o f t o l u e n e : 2 , 5 - d i p h e no x a z o l es c i n t i l l a t i o nf l u i dc a u s e dr a d i o a c t i v eq u e n c h i n go f 6 -1 8 . W h e n t h ed i e t h y l e t h e rw a s a l l o w e dt o e v a p o r a t e f r o mt h ef l u i db e f o r e e s t i m a t i o n ,( q u e n c h i n gw a s r e d u c e d t o 0 . 5 -7 . 0 . U s i n gt h i sp r o c e d u r et oe x t r a c tk n o w nq u a n t i t i e so f [ 3 H ] -p AB f r o m u r i n e ,t h e m e a n e f f i c i e n c yw a s 7 6 , q u e n c h i n gb e i n ga s se s s e d w i t h[ 3 H ] h e x a d e c a n ea s t h e i n t e r n a ls t a n d a r d .

A f u r t h e rt e s to f t h i sm e t h o dw a s p e r f o r m e d .K n o w nq u a n -t i t i e so f[ 3 H ] P t e G l uw e r e a d d e dt o u r i n e ,h y d r o l y z e d ,a n d t h es u b s e q u e n t[ 3 H ] p A Bw a s e x t r a c t e da s d e s c r i b e d . Q u e n c h i n gi n c o n t r o la n d le x t r a c t e ds a m p l e sw a s e s t i m a t e d w i t h[ 3 H ] h e x a -( l e c a n i ea s a n li n t e r n a ls t a n d a r d .A t o t a lo f3 6 e x t r a c t i o n sw e r ep e r f o r m e di n b a t c h e s o f s i x . F o r e a c h b a t c h e x a m i n e d ,t h em e a np e r c e n t a g eo f r a d i o a c t i v i t vr e t r i e v e dv a r i e d f r o m2 5 t o3 1 w i t h a n o v e r a l lm e a no f 2 7 . 6 4 . 1( S E M ) .I n t h eb a t c ho f [ 3 H ] P t e G l uu s e d ,3 5 o ft h e t r i t i u ml a b e l e dt h e 3 , 5 - p o s i -t i o n sa n d w a s t h e r e f o r e a v a i l a b l ea s[ 3 H ] p A B( 3 0 ) .T h i s i m p l i e dt h a ta m e a no f 7 9 o f t h e a v a i l a b l e[ 3 H ] p A Bw a s e x t r a c t e d .

I t w a s i m p o r t a n tt o e n s u r e t h a t[ 3 H ] p t e r i d i n e sc l e a v e dd u r -i n ga l k a l i n eh y d r o l y s i sw e r en o ta l s oe s t i m a t e db y t h i sm e t h o d( F i g .1 ) .S a m i i p l e so f u r i n e t h a tc o n t a i n e dk n o w nq u a n t i t i e so f [ 2 - 1 4 C ] P t e G l ul ab e le d o n t h e2 - p o s i t i o no f t h e m o l e c u l e( F i g .1 ) w e r e h y d r o l y z e da n d e x t r a c t e da s d e s c r i b e d . T h er a d i o a c t i v i t vr e t r i e v e dw a s a t b a c k g r o u n dl e v e l ,r e p r e s e n t i n g0 . 3 o f t h e a d d l e c d[ 2 - 4 C ] P t e G l u .C l e a r l y ,t h ep t e r i d l i n em o i e t yw a s n o te s t i m i i a t e d lb y t h i sm e t h o d .

E x p e r i m t i e n i t a lp r o c e d l u r e .Q u a d r u p l i c a t es a m p l e so fu r i n ew e r eh yd r o l y z e di n 1 0 N 1K OHf o r9 0 m i na t 1 2 0 Ca n d 1 5 l b / i n 2 .S a m i i p l e sw e r e t h e n a c l j u s t e ( lt o p H 3 . 7 5 w it h c o n c e n t r a t e dH C I , a n d c lt h e [ ' H ] p A Bp r e s e n i tw a s e x t r a c t e da s d e s c r i b e d .T h e r a d i o a c t i v i t yp r e s e n tw a s e s t i m a t e d ,a n d q u e n e h i n gw a sa s s e s s e d w i t h [ 3 H l h e x a d e c a n ea s a n i n t e r n a ls t a n d a r d .Toa s s e s s r e p r o d u l c i b i l i t yo f t h ep r o c e d u r e ,t w o c o n t r o ls a m p l e sw h i c h c o n i t a i n i e dk n o w n ( q u a n t i t i e so f [ 3 H ] P t e G l uw e r e a s -s a y e d \ v i t he a c h b a t c h o f e x p e r i m e n t a ls a m p l e s .

E s t i m z a t i o no f t o t a lr a l d i o a c t i v i t i J .To t a le x c r e t e dr a d i o a c -t i v i t vw a s d e t e r m i i i n e db y ( l i r e c te s t i m a t i o no f 1 0 0A lo f u r i n e

1 0INoH _NH-CH

HN ~~~XWCH Wt

2 N N H

4 PTFRIDTNF 4 1 p A M) 0 B E I 1 7 n T -ACID > GLUJTAMICACID 0 ,

F I G U R E S t r t u c t u r eo f P t e G l I us h o w, v i n gt h e p o s i t i o n sl a b e l e dw i t h * 4 C ( l * 3 H .

1 0 9 0 D . K e l l t I ,D . We i r ,B . R e e d ,a n d ] iJ . S c o t t


3/8

i n t o l u e n e : T r i t o nX - 1 0 0s c i n t i l l a t i o nf l u i d( 3 1 )w i t h a P a c k a r dl i q u i ds c i n t i l l a t i o nc o u n t e r( P a c k a r dI n s t r u m e n tC o . ,D o w n e r sG r o v e ,I l l . ) .

C o l u m nc h r o m a t o g r a p h y .A n a l y s i so f t h ef o l a t ec a t a b o -l i t e si n m o u s eu r i n e w a s p e r f o rm e do n QAE.A25 a n i o n e x -c h a n g er e s i n( P h a r m a c i aI n c . ,U p p s a l a ,S w e d e n )a sp r e v i o u s l yd e s c r i b e d( 1 8 ,2 0 ) .

S t a t i s t i c a lm e t h o d s . T h es i g n i f i c a n c eo f t h e d i f f e r e n c eb e -t w e e nmean d a i l y e x c r e t i o na n d c u m u l a t i v ee x c r e t i o no f [ 3 H ] -p AB c a t a b o l i t e si n c o n t r o la n d t r e a t e dg r o u p s w a s de -t e r m i n e d( 3 2 ) .

R E S U LT S

A n i m a l s . T h e r e w a s a n i n i t i a lw e i g h t l o s so f 1 - 2g / m o u s ei n a l l g r o u p s w h e n t h e y w e r e p l a c e d i n t h em e t a b o l i cc a g e s .T h i s s t a b i l i z e do n c e t h e yb e c a m ea d -j u s t e d .T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei n d i e t a r ya n d f l u i di n t a k e ,o r u r i n a r y o u t p u t o r w e i g h t l o s sd e -t e c t e di n a n y o f t h e g r o u p s .

E x c r e t i o no f [ 5 ' C r ] E D TA . E x c r e t i o no f [ 5 ' C r ] E D T A

i n a t y p i c a le x p e r i m e n tw a s 7 2 o v e r 2 4 h i n t h e c o n -t r o lg r o u p ; 68 i n d i p h e n y l h y d a n t o i ng r o u p A ; 7 8i n g r o u p B ; 7 0 i n g r o u p C ; a n d 7 4 i n t h ep h e n o -b a r b i t o n eg r o u p , w h i c hi m p l i e st h a ti n j e c t i o na n d c o l -l e c t i o nt e c h n i q u e sw e r e c o m p a r a b l ei n a l lg r o u p s .

E f f e c to f u r i n a r y m e t a b o l i t e s .T o e n s u r e t h a tt h eu r i n a r y m e t a b o l i t e so f d i p h e n y l h y d a n t o i n( 5 - [ p - h y -d r o x y p h e n y l ] - 5 - p h e n y l h y d a n t o i n )o r m e t a b o l i t e s o fp h e n o b a r b i t o n e ( p- h y dr ox y - ph e n o b a rb i t o n e )d i d n o ti n t e r f e r ew i t h t h ee x t r a c t i o np r o c e d u r e ,k n o w nq u a n -t i t i e so f[ 3 H ] P t e G l uw e r e a d d e d t o u r i n e f r o m g r o u p so fc o n t r o la n d a n t i c o n v u l s a n t - t r e a t e dm i c e . S a m p l e sw e r eh y d r o l y z e d ,a n d t h es u b s e q u e n t[ 3 H ] p A Bw a se x -t r a c t e da s d e s c r i b e d .No d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e p e r -c e n t a g eo f r a d i o a c t i v i t yr e t r i e v e di n t h e t h r e eg r o u p sw a s d e t e c t a b l e .

C o m p a r i s o no f t o t a le x c r e t e d r a d i o a c t i v i t yo n ad a i l yb a s i si nc o n t r o l ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - ,a n d p h e n o -b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e . T o t a le x c r e t e dr a d i o a c t i v i t yw a s h i g h e s ti n t h e 1 s t3 d i n a l l g r o u p s , s t a b i l i z i n ga f t e rt h i st i m e t o a n a l m o s tc o n s t a n t ,a l t h o u g hs l i g h t l yd i m i n i s h i n g ,l e v e l .I n a t y p i c a le x p e r i m e n tt h e r e w a sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nd i p h e n y l h y d a n t o i n -t r e a t e dg r o u p s a n d c o n t r o l so r p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c ei n t h e1 s t3 d ( T a b l eI ) .H o w e v e r ,o n e a c hs u b s e -q u e n td a y t h e r ew a sa s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ed i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e dm i c e a n d t h ec o n t r o l sa n d p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e .

F u r t h e ra n a l y s i so ft h i sd a t aw a s p e r f o r m e dt o p r o -d u c e a c o m p a r i s o no ft h em e a n d a i l ye x c r e t i o na f t e rd a y 3 . M e a n d a i l ye x c r e t i o n f o r e a c h o f t h e g r o u p sa f t e rd a y 3 w a s : g r o u p A : c o n t r o l s :6 . 0 + 0 . 3 x 1 0 4 cpm( S E M ) ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e d :7 . 3 + 0 . 4x 1 0 4c p m( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;g r o u p B : c o n t r o l s :5 . 1 0 . 1x 1 0 4c p m ( S E M ) ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e d7 . 5 + 0 . 2x 1 0 4c pm ( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;g r o u p C : c o n t r o l s :1 0 0 . 2

X 1 0 4c p m( S E M ) ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e d :1 7 + 0 . 3

TA B L E IE f f e c to f A n t i c o n v u l s a n tT h e r a p yi n a Ty p i c a l E x p e r i m e n t

o n T o t a lE x c r e t e dR a d i o a c t i v i t ya f t e rA d m i n i s t r a t i o no f 4 , u C i[ 3 H ] P t e G l u

T o t a lr a d i o a c t i v i t ye x c r e t e d *

T r e a t e dw i t h T r e a t e d wi t h

0 . 6m g o f 1 . 0m g o fD a y C o n t r o l m i c e p h e n o h a r b i t o n e d i p h e n y l h y d a n t o i n

c p m

1 3 0 . 1 + 0 . 3x 1 0 5 t 2 3 + 0 . 2x 1 0 , 5 3 8 + 0 . 1x 1 0 5 t2 3 . 5 + 0 . 2x 1 0 5 t 3 . 8 0 . 1x 1 0 5 t 3 . 2 0 . 1x 1 0 5 t3 2 . 2 + 0 . 4 x 1 0 5 t 2 5 1x 1 0 5 4 3 . 2 0 . 2x 1 0 5 t4 1 . 4 + 0 . 3x 1 0 5 1 . 2 0 . 2x 1 0 5 2 . 2 0 . 2x 1 0 5 15 1 . 3 + 0 . 1x 1 0 5 1 . 1 + 0 . 1x 1 0 5 2 . 1 + 0 . 2x 1 0 5 16 1 . 1 + 0 . 1 5x 1 0 5 1 . 1 + 0 . 2x 1 0 5 5 2 . 7 0 . 1x 1 0 5 17 0 . 9 + 0 . 0 5x 1 0 5 0 . 9 + 0 . 1 5x 1 0 5 2 . 5 0 . 2x 1 0 5 18 0 . 8 5 0 . 0 5x 1 0 5 0 . 8 + 0 . 1 x 1 0 5 1 . 9 + 0 . 2x 1 0 5 19 0 . 9 2 0 . 1x 1 0 5 0 . 5 0 . 1x 1 0 5 5 1 . 9 0 . 2x 1 0 5 1

1 0 0 . 8 0 + 0 . 2x

1 0 5 0 . 4 + 0 . 0 5x

1 0 5 1 . 6 0 . 2x

1 0 5 1

D a t a p o o l e df r o mt w o c a g e s o ff i v em i c e i n e a c h g r o u p .* M e a n + S E M .t P > 1 . 0s i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h em e a n s i n a l lt h r e eg r o u p s . P > 1 . 0s i g n i f i c a n c eb e t w e e nc o n t r o la n d p h e n o b a r b i t o n e -t r e a t e dg r o u p s .

P< 0 . 0 0 1 s i g n i f i c a n c eo f t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e i n -d i v i d u a ld a i l ym e a n si n t h ed i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e dg r o u pa n d c o n t r o l sa n d p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e da n i m a l s .

X 1 0 4c pm ( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e d :8 . 4 + 0 . 2x 1 0 4c p m( S E M )( P > 1 . 0 ) .

T h e v a r i a t i o ni n e x c r e t i o n b e t w e e nt h e d i f f e r e n tg r o u p s i s b e c a u s et h ep r o p o r t i o n o f t h e t r i t i u ml a b e lo n t h e p AB p a r to f t h e m o l e c u l ew h i c h d i f f e r sb e -t w e e nt h eb a t c h e so f[ 3 H ] P t e G l uu s e d .H o w e v e r ,t h es a m eb a t c hw a su s e df o rb o t hc o n t r o la n dt r e a t e dg r o u p si n e a c h s t u d y .

C o m p a r i s o no f [ 3 H ] p A B - e x c r e t e dr a d i o a c t i v i t yo n ad a i l yb a s i si n c o n t r o l ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - ,a n dp h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e . E s t i m a t i o n o f t h e s ec a t a b o l i t e si n t h e 1 s t 3 d w a s s i m i l a ri n a l l t r e a t e dg r o u p s w h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o l sa n d p h e n o -b a r b i t o n e - t r e a t e dg r o u p s ( F i g .2 ) .A f t e r t h e4 t hd h o w -e v e r ,r a d i o a c t i v ee x c r e t i o n s e t t l e dt o a n a l m o s t c o n -s t a n tl e v e l .T h e r e w a s a d e f i n i t ei n c r e a s e i n e x -c r e t i o n o f t h e s e c a t a b o l i t e si n a l l t r e a t e dg r o u p sw h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o l so r p h e n o b a r b i t o n e -t r e a t e da n i m a l s( F i g .2 ) .M e a n d a i l ye x c r e t i o n i n t h ev a r i o u s g r o u p s w a s : g r o u p A : c o n t r o l s :1 . 4 0 . 2x 1 0 4c p m ( S E M ) ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e d :1 . 9 + 0 . 2x 1 0 4c p m ( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;g r o u p B : c o n t r o l s :1 . 5 0 . 3x 1 0 4c p m( S E M ) ,d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e d2 . 7 0 . 3x 1 0 4c p m( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;g r o u p C : c o n t r o l s :2 . 0 5 0 . 4 x 1 0 4c p m ( S E M ) , d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a3 . 9 8 0 . 6x 1 0 4c p m ( S E M )( P < 0 . 0 0 1 ) ;p h e n o b a r b i -

t o n e - t r e a t e d :2 . 0 4 0 . 3x 1 0 4c p m( S E M )( P > 1 . 0 ) .

E f f e c to f A n t i c o n v u l s a n t so n F o l a t e C a t a b o l i s m 1 0 9 1


4/8

X

7 - 0 - I

2 0 B

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~ ~ FIUE2Teefc fteatcnusn r g ihnl

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1 ~~~~~~~~~~~~~~~~1 ~~~~ 40 5 1 0 1 4

T i m ei n d a y s6 1 0 3

4 x 1 5 10T i m e in d a y s

CF I G U R E2 T h e e f f e c to ft h ea n t i c o n v u l s a n td r u g sd i p h e n y l -h y d a n t o i na n d p h e n o b a r b i t o n eo n t h er a t eo f f o l a t ec a t a b o l i s mi n m i c e . T h e c a t a b o l i cr a t ew a s d e t e r m i n e di n e a c h i n s t a n c eb y h y d r o l y z i n gt h e v a r i o u s f o l a t ec a t a b o l i t e se x c r e t e d e a c hd a y i n t h eu r i n e t o p r o d u c ep AB w h i c hw a s t h e n e x t r a c t e da n d e s t i m a t e d .E a c hm o u s ew a s g i v e n 4 , u C i[ 3 H ] P t e G l uf o l -

l o w e db y d a i l yi n j e c t i o n so fa n t i c o n v u l s a n td r u g s .( A )G r o u pQ l | o n s i s t e do f t w o c a g e s o f f i v em i c e i n e a c hg r o u p : ( 0 ) ,c o n - 2 , 5 t r o lm i c e , 1 0 0, u lo fs a l i n ei . m .d a i l yf o r1 0 d ; ( V ) ,t r e a t e dm i c e ,

0 . 0 1m g o f d i p h e n y l h y d a n t o i ni . m .d a i l yf o r1 4 d . ( B )G r o u pB c o n s i s t e do fo n e c a g e o f f i v em i c e i n e a c h g r o u p : ( - ) ,c o n -

> t r o l ;( V ) ,0 . 4m g o fd i p h e n y l h y d a n t o i ni . p .d a i l yf o r1 0 d . ( C )O \ \ G r o u pC c o n s i s t e do f t w o c a g e s o f f i v em i c e i n e a c h g r o u p :. 2 ( 0 ) ,c o n t r o l ;( V ) ,1 . 0m g o fd i p h e n y l h y d a n t o i ni . m .d a i l yf o rc t i \ L ; ( V ) ,0 . 6m g o f p h e n o b a r b i t o n ei . m .d a i l yf o r 1 0d . * P

z c 5< 0 . 0 1a n d * * P< 0 . 0 0 1 s i g n i f i c a n c eo f d i f f e r e n c eb e t w e e nd a i l ym e a n so fd i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e dm i c e a n d c o n t r o lo rp h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e .

T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ed a i l ym e a n e x c r e t i o no f [ 3 H ] p A Bc a t a b o l i t e sw h e n c a l -

2 1 0 4 c u l a t e d i n d i v i d u a l l yf o re a c h d a y i n g r o u p A . I t w a s n o tp o s s i b l et oc a l c u l a t et h i sd i f f e r e n c ef o rg r o u pB b e c a u s et h e r e w e r eo n l yt w o s a m pl e sf o rc o m p a r i s o n .H o w e v e r ,t h e s i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e i n d i v i du a l d a i l ym e a n s

l______ i n g r o u p C v a r i e d f r o mP < 0 . 0 1 t o < 0 . 0 0 1w h e n c o m -0 5 1 0 p a re d w i t hc o n t r o l sa n d p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dg r o u p s

T i m e i nd a y s ( F i g .2 C ) .

1 0 9 2 D . K e l l y ,D . We i r , B . R e e d ,a n dJ . S c o t t


5/8

C o m p a r i s o no f c u m u l a t i v ee x c r e t i o n o f b o t h t o t a la n d [ 3 H ] p A Br a d i o a c t i v i t yi n c o n t r o l s ,d i p h e n y l -h y d a n t o i n - , a n d p h e n o b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e . C u -m u l a t i v ee x c r e t i o no f b o t h t o t a la n d [ 3 H ] p A Br a d i o -a c t i v i t yw a s c a l c u l a t e df o rt h e 1 s t3 d a n d t h e n f o rt h es u b s e q u e n td a y s o ft h ee x p e r i m e n tf o re a c h g r o u p .

T h e r e w a s n os t a t i s t i c a ld i f f e r e n c eb e t w e e nt h ec u m u l a t i v ee x c r e t i o ni n e i t h e rt o t a lo r [ 3 H ] p A Br a d i o -

a c t i v i t yi n t h e 1 s t3 d i n a n y o f t h e t r e a t e dg r o u p sw h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o l o rp h e n o b a r b i t o n e -t r e a t e da n i m a l s( Ta b l e I I ) .H o w e v e r ,t h e r ew a s a s t a -t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n t h e c u m u l a t i v ee x c r e -t i o no fb o t h t o t a la n d [ 3 H ] pA Br a d i o a c t i v i t yn o t e df r o md u r i n g d a y 4 - 1 4 i n g r o u pA a n d 4 - 1 0 i n g r o u p sB a n dC ( Ta b l e I I ) i n a l l d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e dg r o u p swhen c o m p a r e dw i t h c o n t r o l sa n d p h e n o b a r b i t o n e -t r e a t e da n i m a l s( Ta b l e I I ) .

To r e l a t et h e s e r e s u l t st ot h et o t a ld o s e o f [ 3 H ] P t e G l ua d m i n i s t e r e d ,t h em e a n p e r c e n t a g eo fe x c r e t e dd o s ew a s c a l c u l a t e da n d i s g i v e n i n Ta b l e I I .

C h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i so f m o u s e u r i n e s .T h er e s u l t sc l e a r l yi n d i c a t et h a td i p h e n y l h y d a n t o i nc a u s e sa n i n c r e a s ei n t o t a lr a d i o a c t i v ee x c r e t i o na f t e rd a y3 ( Ta b l e I ) a n d a l s ot h a tt h i si s a r e s u l to f [ 3 H ] p A B -c o n t a i n i n gm e t a b o l i t e s( F i g .2 ) .T o p r e c l u d et h ep o s s i -b i l i t yt h a tt h e s e i n c r e a s e sw e r e n o t i n f a c ta r e s u l to fi n c r e a s e dc a t a b o l i s mb u t t o d i p h e n y l h y d a n t o i n - m e d i -a t e d r e l e a s eo f i n t a c tf o l a t e s ,a s e r i e so f c h r o m a t o -g r a p h i c s t u d i e sw e r e u n d e r t a k e n .U r i n e s f ro m b o t hc o n t r o la n d d i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e da n i m a l sw e r e

a n a l y z e db y c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya sp r e v i o u s l yde -s c r i b e d( 1 8 , 2 0 ) .A s p r e v i o u s l yr e p o r t e d i n t h e r a t ,u r i n e s f r o m t h e i n i t i a l3 d s h o w e dt h e p r e s e n c e o fi n t a c tf o l a t e s ,w h i l e a f t e r t h a tt i m e o n l yr a d i o a c t i v ep t e r i d i n e so r [ 3 H ] A p A B G l uo r [ 3 H ] p A B G l uc o u l d b ed e t e c t e di n e i t h e rc o n t r o l so rt r e a t e da n i m a l s .

D I S C U S S I O N

F o l a t e c a t a b o l i t e sa r ee x c r e t e di n t h e u r i n e i n t r a c ea m o u n t sw h i c ha r eu n d e t e c t a b l eb y a n y f o r mo f c h e m i -c a la s s a y .B e c a u s et h e e x c r e t e df o l a t e sa r e i n a c t i v e ,t h e y c a n n o tb e d e t e rm i ne d b ym i c r o b i o l o g i c a la s s a y .H o w e v e r ,b y u s i n g P t e G l uo f s u f f i c i e n t l yh i g h s p e c i f i ca c t i v i t y ,i t i s p o s s i b l et o f o l l o wt h er a t eo f c a t a b o l i s mw i t h o u td i s t u r b i n gt h ef o l a t eb a l a n c ew i t h i nt h e a n i m a l( 1 7 ,1 8 ) .D u r i n g t h e c o u r s e o f c a t a bo l i s mt h e f o l a t em o l e c u l e sa r ec l e a v e di n t op t e r i d i n e sa n d p A B G l u .T h e s y n t h e s i so f h i g h s p e c i f i ca c t i v i t y[ 3 H ] P t e G l ui ss u c h t h a ti t d i s t r i b u t e st h e r a d i o a c t i v i t yw i t h i n t h e

o r i g i n a lm o l e c u l ei ns u c ha w a yt h a tb o t hs e t so f c a t a b o -l i t e sa r el a b e l e da f t e rc l e a v a g e( 1 8 ,3 0 )( F i g .1 ) .I n a d d i -t i o n ,i t h a s n o w b e c o m ea p p a r e n tt h a ti n i t i a le s t i m a t e ss h o w i n gt h a to n l ya s m a l lp r o p o r t i o no f 3 Hw a sa t t a c h e dt o t h e p t e r i d i n ew e r e i n a c c u r a t e( 3 0 )a n d t h a ta sm u c ha s 2 5 o f t he l a b e lr e s i d e sa t C 7 . P r e v i o u ss t u d i e si nt h i sl a b o r a t o r yh a v e q u a l i t a t i v e l ya n a l y z e dt h e d a i l ye x c r e t e df o l a t e s a f t e ri n j e c t i o no f [ 3 H ] P t e G l ui n r a t s( 2 0 ) .T h ep t e r i d i n ec a t a b o l i t e sa r er e t a i n e db y t h el i v e ra n d e x c r e t e ds l o w l y w h e r e a sm o s t o f t h e p A B G l ui s

TABLE I IE f f e c to f A n t i c o n v u l s a n tT h e r a p yo n C u m u l a t i v eE x c r e t i o no f R a d i o a c t i v i t ya f t e rA d m i n i s t r a t i o no f 4 i t C i[ 3 H ] P t e G l u *

0- 3 d 4 - 1 4 d ( A )a n d 4 - 1 0d ( B + C )

T o t a l T o t a lr a d i o a c t i v i t y [ 3 H ] p A B r a d i o a c t i v i t y [ 3 H ] p A B

R a d i o a c t i v i t yc p m x 1 0 5

G r o u pAC o n t r o l 3 9 + 0 . 1( 5 9 ) t 8 . 6 + 0 . 1( 1 3 ) 6 . 0 + 0 . 1( 9 ) 1 . 3 + 0 . 2( 1 . 9 )D i p h e n y l h y d a n t o i n( 0 . 0 1m g ) 3 7 + 0 . 1( 5 7 ) 9 . 8 + 0 . 1( 1 5 ) 7 . 4+ 0 .1 ( 11 ) 2 . 1+ 0 . 1( 2 . 7 ) 5

G r o u pBC o n t r o l 3 9 + 0 . 1( 4 6 ) 1 3 + 0 . 6( 2 0 ) 3 . 6 + 0 . 1( 6 ) 0 . 9 9 0 . 5( 1 . 5 )D i p h e n y l h y d a n t o i n( 0 . 4m g ) 2 8 0 . 1( 4 2 ) 1 1 0 . 3( 1 7 ) 5 . 8 0 . 2( 9 ) 1 . 8 0 . 3( 2 . 8 ) 5

G r o u pCC o n t r o l 3 6 0 . 2( 4 3 ) 6 . 3 0 . 4( 6 . 3 ) 7 . 2 0 . 2( 9 ) 1 . 4 0 . 1( 1 . 7 )D i p h e n y l h y d a n t o i n( 1 . 0m g ) 4 4 0 . 2( 5 3 ) 7 . 1 0 . 2( 7 . 1 ) 1 2 . 0 0 . 2( 1 8 ) 2 . 7 0 . 2( 3 . 3 ) P h e n o b a r b i t o n e( 0 . 6m g ) 2 9 0 . 1( 3 5 ) 5 . 0 0 . 3( 6 . 1 ) 6 . 1 0 . 2( 7 ) 1 . 4 0 . 2( 1 . 6 )

G r o u p sA a n d C r e p r e s e n t t w o c a g e s o f f i v em i c e i n e a c h g r o u p . G r o u pB r e p r e s e n t s o n e c a g e o f f i v em i c eo n l yi n e a c h g r o u p .* M e a n S E M .t T h e p e r c e n t a g e so f d o s e a d m i n i s t e r e dar e s h o w ni n p a r e n t h e s e s . P < 0 . 0 0 1 s i g n i f i c a n c eo f t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nd i p h e n y l h y d a n t o i n - t r e a t e dm i c e a n d c o n t r o lo r p h e n o -b a r b i t o n e - t r e a t e dm i c e .



6/8

a c e t y l a t e dt o f o r m ApABGluw h i c h i s t h e n e x c r e t e dr a p i d l y( 1 9 ) .T h u s , b e c a u s eo ft h e g r e a t l yv a r y i n g r e -t e n t i o no f t h ed i f f e r e n tr a d i o a c t i v ef o l a t ec a t a b o L i t e si t i sn o t p o s s i b l et o s i m p l y m e a s u r et o t a lr a d i o a c t i v ee x c r e t i o n a s a n i n d e x o f c a t a b o l i cr a t e .Q u a l i t a t i v ea n a l y s i so f r a t u r i n e h a s s h o w nt h a tw h e r e a st h e r ei s

i n i t i a le x c r e t i o no f b o t h i n t a c ta n d c l e a v e df o l a t e s ,a f t e rt h e 3 r d d , o n l y [ 3 H ] p t e r i d i n e s ,[ 3 H ] p A B G l u ,a n d [ 3 H ] -ApABGlua r ef o u n d( 2 0 ) .T h ea n a l y s i sp e r f o r m e di nt h i ss t u d yh a s c o n f i r m e dt h a tt h ep a t t e r no f e x c r e t i o n i nm o u s eu r i n e i s e s s e n t i a l l ys i m i l a r .

I t t h e r e f o r es e e m s re a s o n ab l et o s u g g e s t t h a tm e a s -u r e m e n to f [ 3 H ] p A B G l ua n d [ 3 H ] A p A B G l uf r o m t h e4 t hd o n w a r dc o u l db e u s e d t o e s t i m a t e t h ec a t a b o l i cr a t e .

B y u s i n g c o n t r o l e d c o n d i t i o n sw e h a v e d e v i s e d ac h e m i c a lp r o c e d u r ew h e r e b yt h ev a r i o u s f o l a t ec a t a b -o l i t e sa r et r e a t e ds o a s t o g i v e o n e m o l e c u l eo f p AB

f o re a c h m o l e c u l eo f c a t a b o l i z e df o l a t ep r e s e n t .T h ep AB s o p r o d u c e di s t h e n e x t r a c t e di n t oa n o r g a n i cs o l v e n t ,c o n c e n t r a t e d ,a n d e s t i m a t e d .C o n t r o le x p e r i -m e n t s w i t h s a m p l e s o f t h eo r i g i n a l l yi n j e c t e d[ 3 H ] -P t e G l ua r ec a r r i e do u t s i m u l t a n e o u s l yt o e n s u r er e p r o -d u c i b i l i t y .T h e c o m p l e t e n e s so f t h ei n j e c t i o na n d c o l -l e c t i o np r o c e d u r e sw a s m o n i t o r e dw i t h [ 5 ' C r ] E D TA .

E s t i m a t i o n so fb o t h t o t a lr a d i o a c t i v i t ya n d [ 3 H ] p A Bw e r e h i g h e s ti n t h e1 s t3 d i n a l le x p e r i m e n t s .R a d i o -a c t i v i t yd i m i n i s h e ds t e a d i l ya f t e rt h i st i m e t oa n a l m o s tc o n s t a n t ,a l t h o u g hs l i g h t l yr e d u c i n g ,l e v e lo v e rt h en e x t1 0 d ( Ta b l e I ; F i g .2 ) .I n m o s te x p e r i m e n t s ,c o u n t sw e r et o o l o w a f t e r

t h e1 0 t hd f o r a c c u r a t e e s t i m a t i o n o f

[ 3 H ] p A B ,a n d t h e e x p e r i m e n t sw e r e d i s c o n t i n u e d .T h e r a p i de x c r e t i o no f u r i n a r y r a d i o a c t i v i t yi n t h e

1 s t3 d c o i n c i d e sw i t h t h ec o m p l e xp a t t e r no f i n t a c ta n dc l e a v e df o l a t e sr e p o r t e db y m a n y s t u d i e s( 1 8 ,2 0 - 2 5 ) .I t a l s oc o i n c i d e sw i t h t h e m a n ys t u d i e st h a th a v es h o w nt h a ta p r o p o r t i o no fa t r a c e rd o s e o fh i g hs p e c i f i ca c t i v i t y[ 3 H ] P t e G l ub e c o m e sf u l l ye q u i l i b r a t e di n t ot i s s u e p o l y -g l u t a m a t e so v e rt h es a m ep e r i o d( 1 7 ) .F o rt h e s er e a s o n si t i s l i k e l yt h a tt h er a d i o a c t i v i t ym e a s u r e di n t h e1 s t3 dr e p r e s e n t se x c r e t i o no fe x c e s so rp a r t i a l l ym e t a b o l i z e d[ 3 H ] P t e G l ud u r i n g e q u i l i b r a t i o nw i t h t h et i s s u ep o o l .T h i s i sf u r t h e rs u p p o r t e db y t h ef i n d i n gt h a te s t i m a t i o n so f[ 3 H ] p A Bc a t a b o l i t e s ,t o t a lr a d i o a c t i v i t y ,a n d t h e p e r -c e n t a g eo f e x c re t e dd o s e a r es i m i l a ri n a l le x p e r i m e n t sf o rt h i st i m e p e r i o d .

From t h e 3 r d d o n w a r d , h o w e v e r , w h e n o n l yc l e a v e dp r o d u c t s a r ef o u n d i n t h eu r i n e ,t h e u r i n a r yr a d i o a c t i v i t ys t a b i l i z e dt oa n a l m o s tc o n s t a n tl e v e l .T h i sf i n d i n gi sc o m p a t i b l ew i t h t h e t h e o r yt h a ti t i sa r e s u l to fr e g u l a re x c r e t i o no f s m a l l a m o u n t so f c a t a b o l i z e d[ 3 H ] -P t e G l u .Th e e x t r a c t i o nm e t h o dd e s c r i b e da b o v em e a s -u r e s o n l y [ 3 H ] p A B - c o n t a i n i n gc a t a b o l i t e s ;r a d i o a c t i v ep t e r i d i n e s ,w h i c hw i l lb e p r e s e n t i n v a r i a b l ea n d s u b -s t a n t i a la m o u n t s( 2 0 ) ,w i l ln o t b e e s t i m a t e d .W h e r e a se s t i m a t i o n s u p t o t h e 3 r d d w i l li n c l u d e m o l e c u l e s

o f i n t a c t a sw e l l a s c l e a v e d f o l a t e ,a f t e rt h i s t i m e ,a s o n l y c l e a v e dp r o d u c t s a r ep r e s e n t ( 2 0 ) ,i t w i l lo n l ym e a s u r ee i t h e r[ 3 H ] p A B G l uo r[ 3 H ] A p A B G l u .B e c a u s ee a c h o f t h e s e c a t a b o l i t e sr e p r e s e n t s a m o l e c u l eo fc l e a v e df o l a t e ,t h e i rc o m b i n e d m e a s u re m e n tg i v e s aq u a n t i t a t i v ee s t i m at i o n o f t h eu ri na ry e x c r e t io n o fr a -

d i o a c t i v ef o l a t ec a t a b o l i t e s .We f e e lt h a te s t i ma t io n o f[ 3 H ] p A B ,d e r i v e d f r o m u r i n a r y [ 3 H ] p A B G l ua n d [ 3 H ] -ApABGlu f r o m d a y 4 o n r e p r e s e n t s m e a s u r e m e n to fc a t a b o l i s m .

T h e s ed a t a a r ec o m p a t i b l ew i t h e a r l i e rs t u d i e sw h i c hs u g g e s t e dt h a tt h e r ei s m o r e t h a n o n e p o o l o f b o d yf o l a t e( 3 3 - 3 5 ) :a n e w l ya b s o r b e d p o o l w h i c hh a s as h o r tb i o l o g i c a lh a l f - l i f ea n d a t i s s u ep o o l w h i c hh a s al o n g e r h a l f - l i f e .

T h ee f f e c to fd i p h e n y l h y d a n t o i nw a s i n v e s t i g a t e da tt h r e e d i f f e r e n td o s e s :a v e r y l o wd o s e ,w h i c hw a s c o n -s i d e r a b l yl e s st h a n t h et h e r a p e u t i cd o s e ( 1 / 4 0 ) ;a t h e r a -

p e u t i c d o s e ;a n d a h i gh e r t h a nt h e r a p e u t i cd o s e ( 2 7 ) .I t i s p r o b a b l yn o t p o s s i b l et o c o m p a r et h e s e d o s a g e sw i t h h u m a n d o s e r e g i m e s b y m e r e l y c o r r e c t i n g f o rw e i g h t a n d v o l u m eb e c a u s et h e s p e c i e s d i f f e r e n c ema y b e i m p o r t a n t .N e v e r t h e l e s s ,t h e e f f e c to f d i ph e n y l -h y d a n t o i n w a so b s e r v e da t a l l t h r e e d o s e s ,e v e n t h ee x c e p t i o n a l l yl o w d o s e .T h e r e w a s n o e f f e c to n t h er a p i du ri n a r y e x c re t i o no f r a d i o a c t i v i t yi n t h e 1 s t3 d .From t h e4 t hd o n w a r d ,t h e r ew a s a d e f i n i t ei n c r e a s ei n b o t h d a i l y( Ta b l e I ) a n d c u m u l a t i v ee x c r e t i o n o ft o t a lr a d i o a c t i v i t y( Ta b l e I I ) a n d o f [ 3 H ] p A B( F i g .2 ;Ta b l eI I ) ,w h i c hw a sm o s to b v i o u sa tt h e h i g h e s td o s a g e

o f d i p h e n y l h y d a n t o i n .I t i s i n t e r e s t i n gt o n o t e t h a tt h i si n c r e a s e de x c r e t i o no f f o l a t ec a t a b o l i t e sw a s o n l y o b s e r v e da t a t i m e w h e nc l e a v e d p r o d u c t sw e r e m a x i m a li n t h e u r i n e .T h i sw o u l ds u g g e s t t h a td i p h e n y l h y d a n t o i ni n c r e a s e dt h eq u a n t i t yo fc a t a b o l i t e se x c r e t e df r o mt h e s e c o n df o l a t em e t a b o l i cp o o l .I t i s u n l i k e l yt h a tt h i sa l t e r a t i o ni n e x -c r e t i o nc o u l db e c a u s e db y c h a n g e si n d i e ta l o n e b e -c a u s e b o t h c o n t r o la n d t r e a t e da n i m a l s w e r e m a i n -t a i n e do n i d e n t i c a ld i e t su n d e rs i m i l a rc o n d i t i o n s .I t i sa l s oi m p r o b a b l et h a ti t i s s i m p l ya r e s u l to f i n c r e a s e de x c r e t i o n o f i n t a c tf o l a t e ,b e c a u s e , i n t h i sc a s e o n ew o u l de x p e c ta n

e f f e c ti n

t h e1 s t3 d

a s w e l l .F u r t h e r -

m o r e ,t h eq u a l i t a t i v e a n a l y s i so ft h e u r i n e s h o w e dt h a tt h e r ew a s n o d i f f e r e n c ei n t h e p a t t e r no f c a t a b o l i t e se x c r e t e di n t r e a t e da n d c o n t r o lm i c e ,b o t h u r i n e s c o n -t a i n i n gc l e a v e dp r o d u c t sf r o mt h e 3 r d d o n w a r d s .A f u r -t h e ra l t e r n a t i v ei s t h a td i p h e n y l h y d a n t o i nm i g h t i n -d u c e r a p i dc e l l u l a ro r r e n a lc l e a r a nc e o ft h e m e t a b o -l i t e s .H o w e v e r ,i t h a s b e e n o u r e x p e r i e n c ei n o t h e rs t u d i e si n v o l v i n g t h em e a s u r e m e n to f a c e t y l a t i o no fpABGlut h a tt h i sc o m p o u n da n d i t sa c e t y la t e d c o u n t e r -p a r ta re e x c re t e d w i t h ina m a t t e r o f h o u r s .T h i s i s i na c c o rd a n c e w i t ha l a r g eb o d yo f l i t e r a t u r es h o w i n gs i m -i l a rc l e a r a n c er a t e sf o rs i m i l a rc o m p o u n d s( 3 6 ) .F u r t h e r -m o r e ,i fa n y a l t e r a t i o ni nc l e a r a n c er a t ed i d o c c u ro n a n



7/8

h o u r l yo rd a i l yb a s i st h e n i t s e e m sl i k e l yt h a ti t w o u l db e c o r r e c t e df o rw h e n t h ea c c u m u l a t e dr e s u l t so f s e v -e r a ld a y s w e r e c o n s i d e r e d . I t i s c l e a rf r o m T a b l e I It h a tw h e n t h e c u m u l a t i v ee x c r e t i o n so f d a y s 4 - 1 0w e r ec o n s i d e r e df o re a c hg r o u pt h a t as t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n e x c r e t i o no f c a t a b o l i t e sw a s s e e n i n t h ed i p h e n y l h y d a n t o i ng r o u p s w h e n c o m p a r e dw i t h c o n -t r o lo rp h e n o b a r b i t o n eg r o u p s .

T o p r o v e t h a tt h i sa l t e r a t i o ni n c a t a b o l i cr a t ew a s n o ta t r a n s i e n to n e ,e f f o r t sw e r em a d et op r o l o n gt h e l e n g t ho f t h e e x p e r i m e n t .T h i s w a s n o t p o s s i b l ei n e x p e r i -m e n t si n v o l v i n gg r o u p s B a n d C b e c a u s et h e r ew a s i n -s u f f i c i e n tr a d i o a c t i v i t yi n t h eu r i n e a f t e rt h e 1 0 t hd f o ra c c u r a t ee s t i m a t i o n .H o w e v e r ,i n g r o u pA i t w a s p o s s i -b l et o c o n t i n u ef o r1 4 d a n d t h ee f f e c to fd i p h e n y l h y -d a n t o i n w a s m a i n t a i n e df o rt h i sl e n g t ho f t i m e .I t w a sn o t p o s s i b l e t o c a l c u l a t et h e e f f e c tt h i si n c r e a s e de x -c r e t i o no ff o l a t ec a t a b o l i t e sm i g h th a v eh a d o n t h e t o t a lb o d y f o l a t es t o r e se x c e p t t o c o m m e n t t h a ta l l d o s e so f d i p h e n y l h y d a n t o i nc a u s e da n 8 0 -100 i n c r e a s e i ne x c r e t i o nw h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o la n d p h e n o b a r -b i t o n e - t r e a t e da n i m a l s .I t s e e m sl i k e l y ,c o n s i d e r i n gt h es u g g e s t e dl o n g h a l f - l i f eo ft h e t i s s u ef o l a t epo o l ( 3 3 -3 5 ) ,t h a ts u c h i n c r e a s e dt u r n o v e rm i g h tl e a dt o t h ei n -c re a s e d i n c id e n c eo f f o l a t ed e f i c i e n c yo b s e r v e di n p a -t i e n t so n l o n g - t e r md i p h e n y l h y d a n t o i nt r e a t m e n t( 1 - 3 ) .

A d m i n i s t r a t i o no f p h e n o b a r b i t o n eh a d n o s i g n i f i c a n te f f e c to n t h e r a t eo f f o l a t ec a t a b o l i s mw h e n c o m p a r e dw i t h c o n t r o l s .T h i s o b s e r v a t i o nc o n c u r sw i t h t h e c l i n i -c a li m p r e s s i o nt h a tf o l a t ed e f i c i e n c yi s m o r ec o m m o nd u r i n g t h e r a p y w i t h d i p h e n y l h y d a n t o i nt h a n w i t hp h e n o b a r b i t o n e( 1 ,3 7 ) .

T h e m e c h a n i s mf o r d i p h e n y l h y d a n t o i n - i n d u c e dc a t a b o l i s m ,h o w e v e r ,i s n o t c l e a r .B e c a u s eb o t h t h ea n t i c o n v u l s a n td r u g s i n v e s t i g a t e di n d u c e h e p a t i ce n -z y m e se q u i v a l e n t l y( 1 2 ,1 3 )t h i sa p p e a r s u n l i k e l yt o b et h em e c h a n i s ma s p r e v i o u s l ys u g g e s t e d( 1 4 ,1 5 ) .I t i s ,o fc o u r s e ,p o s s i b l et h a td i p h e n y l h y d a n t o i ni n d u c e sas p e c i f i ce n z y m e ,e i t h e rf o l a t ed e p e n d e n to rn o n s p e c i f i -c a l l yr e l a t e d ,t h a tp h e n o b a r b i t o n ed o e s n o t .A l t e r n a -t i v e l y ,i t i s p o s s i b l et h a tt h e y h a v e e n t i r e l yd i f f e r e n tm e c h a n i s m so f a c t i o na s d e m o n s t r a t e di n t h e i re f f e c t so n c a l c i u ma n d v i t a m i n D m e t a b o l i s m( 3 8 ) .P e r h a p sa m o r ea t t r a c t i v ee x p l a n a t i o nl i e si n t h e k n o w n c h e m i -c a l i n s t a b i l i t yo f t h e f o l a t ec o e n z y m e s .I t i s e a s y t oi m a g i n ea w i d e r a n g e o f p o s s i b i l i t i e sf r o m a l t e r a t i o no f t h e e n v i r o n m e n tw i t h i n c e l l st o a c c u m u l a t i o no fm o r el a b i l ef o r m s ,w h i c hc o u l dr e a d i l yl e a dt o m a r k e di n c r e a s e s a n d t h e i rd e s t r u c t i o n .

T h e s er e s u l t sc o n f l i c tw i t h t h o s e o f K r u m d i e c ke t a l .( 3 5 ) .W h i l ew o r k i n gw i t h a s i n g l ep a t i e n tt h e yf o u n dd i p h e n y l h y d a n t o i ni n c r e a s e d e x c r e t i o n o f n e w l ya b -s o r b e dP t e G l ub u t d i d n o t i n c r e a s e c a t a b o l i s m .H o w -e v e r ,t h e s e w o r k e r s u s e d [ 2 - 1 4 C ] P t e G l uw h i c h u p o nc a t a b o l i s mp r o d u c e sa l a b e l e d p t e r i d i n eo n l y ,w h i c hh a s b e e n f o u n dt o b e f u r t h e rm e t a b o l i z e dt o p r o d u c e

s e v e r a ld i f f e r e n tp t e r i d i n e sw h i c ha r er e t a i n e db y t h el i v e rf o rp r o l o n g e dp e r i o d s ( 1 9 ) .T h i s r e t e n t i o nma yo b s c u r et h ec l e a ri n c r e a s ei n t h e c a t a b o l i cr a t ee f f e c t e db y d i p h e n y l h y d a n t o i n( F i g .2 ) w h i c h w a s o b s e r v e dw h e n t h e r a p i d l ye x c r e t e dc a t a b o l i t e sApABGlua n dpABGlu w e r e m e a s u r e d .

ACKNOWLE DGM ENTS

We w o u l dl i k et o t h a n k M r s . E l i z a b e t hW i l s o nf o rh e r t e c h -n i c a la s s i s t a n c e ;D r .M i c h a e lS t u a r tf o rh i ss t a t i s t i c a la d v i c e ;a n d t h eB i o m e d i c a lTr u s t a n d t h eL a b o r a t o r yD e v e l o p m e n tF u n df o rt h e i r f i na n c i a ls u p p o r t .

REFERENCES

1 . H a w k i n s ,C . F . , a n d M . J . M e y n e l l .1 9 5 8 .M a c r o c y t o s i sa n d m a c r o c y t i ca n a e m i a c a us e db y a n t i c o n v u l s a n td r u g s .Q . J . M e d .2 7 :4 5 - 6 3 .

2 . K l i p s t e i n ,F .A . 1 9 6 4 .S u b n o rm a l s e r u mf o l a t ea n d m a c r o -

c y t o s i sa s s o c i a t e dw i t h a n t i c o n v u l s a n t

t h e r a p y .B l o o d .

2 3 :6 8 - 8 6 .3 . R e y n o l d s ,E . H . 1 9 7 5 .C h r o n i ca n t i - e p i l e p t i ct o x i c i t y

a r e v i e w. E p i l e p s i a .1 6 :3 1 9 - 3 5 2 .4 . H o f f b r a n d ,A .V . ,a n d T . F . N e c h e l e s .1 9 6 9 .M e c h a n i s m

o f f o l a t ed e f i c i e n c yi n p a t i e n t sr e c e i v i n gp h e n y t o i n .L a n -c e t .I I : 5 2 8 - 5 3 0 .

5 . R o s e n b e r g ,I . H . ,H . A .G o d w i n ,R . R .S t r e i f f ,a n d W . B .C a s t l e . 1 9 6 8 .I m p a i r m e n to fi n t e s t i n a ld e c o n j u g a t i o no fd i e t a r yf o l a t e :a p o s s i b l ee x p l a n a t i o no f m e g a l o b l a s t i ca n a e m i aa s s o c i a t e dw i t h p h e n y t o i nt h e r a p y .L a n c e t . I I :5 3 0 - 5 3 2 .

6 . G e r s o n ,C . D . ,G . W . H e p n e r , N . B r o w n ,N . C o h e n ,V .H e r b e r t , a n d H . D . J a n o w i t z .1 9 7 2 .I n h i b i t i o nb y d i -p h e n y l h y d a n t o i no ff o l i ca c i da b s o r p t i o ni n m a n .G a s t r o -

e n t e r o l o g y .6 3 :2 4 6 - 2 5 1 .7 . B a u g h ,C . M . ,a n d C .L .K r u m d i e c k .1 9 6 9 .E f f e c to f p h e n y t -o i n o n f o l i ca c i dc o n j u g a s e si n m a n .L a n c e t . I I : 5 1 9 - 5 2 1 .

8 . B e r n s t e i n ,L . H . ,S . G u t s t e i n , S . W e i n e r ,a n d G . E f r o n .1 9 7 0 .T h e a b s o r p t i o na n d m a l a b s o r p t i o no f f o l i ca c i da n di t sp o l y g l u t a m a t e s .A m .J . M e d .4 8 :5 7 0 - 5 7 9 .

9 . H o u l i h a n ,C .M . ,J . M . S c o t t ,P . H . B o y l e ,a n d D . G . We i r .1 9 7 2 T h e e f f e c to fp h e n y t o i no n t h e a bs or p t i o n o fs y n -t h e t i cf o l i ca c i dp o l y g l u t a m a t e .G u t . 1 3 :1 8 9 - 1 9 0 .

1 0 . P e r r y ,J . , a n d I . C h a n a r i n . 1 9 7 2 .O b s e r v a t i o n so n f o l a t ea b s o r p t i o nw i t h p a r t i c u l a rr e f e r e n c et o f o l a t ep o l y g l u t a -m a t e sa n d p o s s i b l ei n h i b i t o r st o i t sa b s o r p t i o n .G u t . 1 3 :5 4 4 - 5 5 0 .

1 1 . F e h l i n g ,C . , M . J a g e r s t a d ,N I .L i n d s t r a n d ,a n d A . K .W e s t e s s o n .1 9 7 3 .T h e e f f e c to f a n t i c o n v u l s a n tt h e r a p yu p o n t h ea b s o r p t i o no f f o l a t e s .C l i n .S c i .M o l . M e d . 4 4 :5 9 5 - 6 0 0 .

1 2 . C o n n e y ,A .H . 1 9 6 7 .P h a r m a c o l o g i c a li m p l i c a t i o n so f m i -c r o s o m a le n z y m ei n d u c t i o n .P h a r m a c o l .R e v. 1 9 :3 1 7 -3 6 6 .

1 3 . L a t h a m ,A . N . ,L .M i l l b a n k ,A .R i c h e n s ,a n d D . J . F .R o w e .1 9 7 3 .L i v e r e n z y m ei n d u c t i o nb y a n t i c o n v u l s a n td r u g sa n d i t s r e l a t i o n s h i pt o d i s t u rb e d c a l c i u ma n d f o l i ca c i dm e t a b o l i s m .J . C l i n .P h a r m a c o l .1 3 :3 3 7 - 3 4 2 .

1 4 . R i c h e n s ,A . ,a n d A . H . Wa t e r s . 1 9 7 1 .An a c u t e e f f e c to fp h e n y t o i no n s e r u mf o l a t ec o n c e n t r a t i o n .B r .J . P h a r m a -c o l .4 1 : 4 1 4 - 4 1 5 P .

1 5 . M a x w e l l ,J . D . ,J . H u n t e r , D . A . S t e w a r t ,S . A r d e m a n ,a n d R . W i l l i a m s .1 9 7 2 . F o l a t e d e f i c i e n c ya f t e ra n t i c o n -v u l s a n t d r u g s :a n e f f e c to f h e p a t i c e n z y m ei n d u c t i o n ?B r .M e d .J . 1 : 2 9 7 - 2 9 9 .



8/8

1 6 . H o f f b r a n d ,A .V . 1 9 7 1 .Th e m e g a l o b l a s t i ca n a e m i a s .I nR e c e n tA d v a n c e si n H a e m a t o l o g y .A . G o l d b e r ga n d N . C .B r i a n ,e d i t o r s .C h u r c h i l l - L i v i n g s t o n e ,L o n d o n .1 - 7 6 .

1 7 . S c o t t ,J . M . , a n d D . G . We i r . 1 9 7 6 F o la t e c o m po s i t i o n ,s y n t h e s i sa n d f u n c t i o n i n n a t u r a lm a t e r i a l s .I V .C l i n i c si n H a e m a t o l o g y .A .V .H o f f b r a n d ,e d i t o r .W . B .S a u n d e r sC o . L t d . ,L o n d o n .5 : 5 4 7 - 5 6 8 .

1 8 . M u r p h y ,M . ,M . K e a t i n g , P . B o y l e ,D . G . W e i r ,a n d J . M .S c o t t .1 9 7 6 .T h e e l u c i d a t i o no f t he m e c h a n i s mo f f o l a t ec a t a b o l i s mi n t h e r a t .B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .7 1 :1 0 1 7 - 1 0 2 4 .

1 9 . R e e d , B . ,D . G . We i r , a n d J . M . S c o t t .1 9 7 8 .Th e o c c u r -r e n c e o f f o l a t e - d e r i v e dp t e r i d i n e si n r a t l i v e r .C l i n .S c i .M o l . M e d .5 4 :3 5 5 - 3 6 0 .

2 0 . M u r p h y ,M . , a n d J . M . S c o t t .1 9 7 9 .T h e t u r n o v e r , c a t a b o -l i s m a n d e x c r e t i o no f f o l a t ea d m i n i s t e r e da tp h y s i o l o g i c a lc o n c e n t r a t i o n si n t h er a t .B i o c h i m . B i o ph y s .A c t a . 5 8 3 ,5 3 5 - 5 3 9 .

2 1 . J o h n s , D . G . ,S . S p e r t i ,a n d A . S . V .B u r g e n . 1 9 6 1 .T h em e t a b o l i s mo ft r i t i a t e df o l i ca c i di n m a n .J . C l i n .I n v e s t .4 0 :1 6 8 4 - 1 6 9 5 .

2 2 . M c L e a n ,A . ,a n d I . C h a n a r i n .1 9 6 6 .U r i n a r ye x c r e t i o n o f5 -

m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t ei n m a n .B l o o d . 3 : 3 8 6 - 3 8 7 .2 3 . C h a n a r i n ,I . , a n d A .M c ; L e a n .1 9 6 7 .O r i g i n o f s e ru m a n du r i n a r ym e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t ei n m a n . C l i n .S c i .( O x f . ) .3 2 :5 7 - 6 7 .

2 4 . B l a i r ,J . A . ,a n d E .D r a n s f i e l d . 1 9 7 1 .T h eu r i n a r y e x c r e t i o no fo r a l l ya d m i n i s t e r e dp t e r o y l - L - g l u t a m i ca c i d b y t h e r a t .B i o c h e m .J . 1 2 3 :9 0 7 - 9 1 4 .

2 5 . B a r f o r d ,P .A . ,J .A .B l a i r ,F .J . S t a f f ,a n d M .A .K .M a l g h a n i .1 9 7 7 .T h e m e t a b o l i s mo ff o l a t e si n t h er a t .S t u d i e sw i t h[ 3 H ]a n d [ 1 4 C ]l a b e l l e df o l i ca c i di n t h e p r e s e n c ea n da b s e n c e o f m e t h o t r e x a t e .B i o c h e m .S o c . T r a n s . 5 :1 3 1 6 -1 3 1 8

2 6 . R e e d ,B . 1 9 7 7 .A s p e c t so f f o l a t ea n d v i t a m i nB 1 2m e t a b o -l i s m .P h . D .T h e s i s ,T r i n i t yC o l l e g e , D u b l i n .

2 7 . B a r n e s ,C . D . ,a n d L .G . E l t h e r i n g t o n .1 9 7 3 .D r u gd o s a g ei n l a b o r a t o r ya n i m a l s :a h a n d b o o k .U n i v e r s i t yo fC a l i f o r n i aP r e s s ,L o n d o n .2 n d e d i t i o n .

2 8 .C h a n t l e r ,C . ,E .S .G a r n e t t ,V . P a r s o n s ,a n d N . Ve a l l .1 9 6 9 .G l o m e r u l a rf i l t r a t i o nr a t em e a s u r e m e n ti n m a n u s i n g t h es i n g l ei n j e c t i o nm e t h o du s i n g [ 5 1 C r ] E D TA .C l i n .S c i .( O x f . ) .3 7 :1 6 9 - 1 8 0 .

2 9 . B r a t t o n ,A .C . ,a n d E .K .M a r s h a l l .1 9 3 9 .A n e w c o u p l i n gc o m p o n e n tf o r s u l p h a n i l i m i d e d e t e r m i n a t i o n .J . B i o l .C h e m .1 2 8 :5 3 7 - 5 5 0 .

3 0 . Z a k r z e w s k i ,S .F . ,E .A .E v a n s ,a n dR .F .P h i l l i p s .1 9 7 0 .Ont h e s p e c i f i c i t yo f l a b e l l i n gi n t r i t i a t e df o l i ca c i d .A n a l .B i o c h e m .3 6 :1 9 7 - 2 0 6 .

3 1 . T u r n e r , J . C . 1 9 6 9 .T r i t i u m c o u n t i n gw i t h T r i t o n X - 1 0 0s c i n t i l l a n t .I n t .J . A p p l . R a d i a t .I s o t .2 0 :4 9 9 - 5 0 5 .

3 2 . S n e d e c o r ,G . W . , a n d W . G . C o c h r a n .1 9 6 7 .S t a t i s t i c a lM e t h o d s .T h e I o w a S t a t eU n i v e r s i t yP r e s s .6 t h e d i t i o n .2 8 5 - 2 8 8 .

3 3 . S h a n e ,B . ,J . E .W a t s o n ,a n d E .L . S t o k s t a d .1 9 7 7 .U p t a k ea n dm e t a b o l i s mo f [ 3 H ] f o l a t eb y n o r m a la n db y v i t a m i nB 1 2d e f i c i e n tr a t s .B i o c h i m .B i o p h y s .A c t a . 4 9 7 : 2 4 1 - 2 5 2 .

3 4 . L a n e , F . , P . G o f f ,R . M c G u f f i n ,F . R .E i c h n e r ,a n d R . S .H i l l m a n .1 9 7 6 .F o l i ca c i d m e t a b o l i s mi nn o r m a l ,f o l a t ede -f i c i e n ta n d a l c o h o l i cm a n .B r .J . H a e m a t o l .3 4 :4 8 9 - 5 0 0 .

3 5 . K r u m d i e c k ,C .L . ,K .F u k u s h i m a ,T .F u k u s h i m a ,T .S h i o t a ,a n d C .E . B u t t e r w o r t h ,J r .1 9 7 8 .A l o n g t e r m s t u dyo ft h ee x c r e t i o no ff o l a t ea n dp t e r i n si na h u m a n s u b j e c ta f t e ri n -g e s t i o no f[ 4 C ] f o l i ca c i d ,w i t h o b se rv a t io n so n t h ee f f e c to fd i p h e n y l h y d a n t o i na d m i n i s t r a t i o n .Am . J . C l i n .N u t r . 3 1 :8 8 - 9 3 .

3 6 . W i l l a m s ,T . 1 9 5 9 .D e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s m s s .C h a p m a na n d H a l l ,L o n d o n .2 n d e d i t i o n .

3 7 . M i l l e r ,D . R . 1 9 6 8 .S e r u mf o l a t ed e f i c i e n c yi n c h i l d r e nr e c e i v i n ga n t i c o n v u l s a n tt h e r a p y .P e d i a t r i c s .4 1 :6 3 0 - 6 3 5 .

3 8 . N e a l e , G . 1 9 7 6 .Enzyme i n d u c i n ga g e n t s a n d t h e i r e f f e c to n v i t a m i n m e t a b o l i s m .I n F r o n t i e r so f G a s t r o -i n t e s t i n a lR e s e a r c h .S . K a r g e r ,B a s e l .2 : 3 2 - 7 0 .


Date post:	02-Jun-2018
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