This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Ein neuer Biosyntheseweg für Anthrachinone: Der Einbau von Shikimisäure in 1.2-Dihydroxy-anthrachinon (Alizarin) und

1.2.4-Trihydroxy-anthrachinon (Purpurin) in Rubia tinctorum L. E . L E I S T N E R u n d M . H . Z E N K

Botanisches Institut der Universität München *

Jrdv: A

(Z . Naturforschg. 22 b, 865—868 [1967] ; e ingegangen am I . Februar 1967) The biosynthesis of the anthraquinones, alizarin I and purpurin II, in Rubia tinctorum (madder)

has been investigated. Acetate-[2-14C] proved to be a precursor only of ring C and in part of the keto groups of the quinone ring. While phenylalanine-[U-14C] was not incorporated into I and II, shikimic acid was found to be a good precursor of these compounds. The radioactivity of shikimic acid-[l,2-14C] could be localized only in ring A; shikimic acid-[U-14C] however was incorporated in toto; the ring being transformed into ring A of the anthraquinone, and the carboxyl group of this acid into one of the keto groups of ring B.

These findings demonstrate the existence of a biosynthetic pathway for the formation of anthra-quinones in Nature, which is entirely different from the polyacetate route.

Anthrachinone sind in höheren Pflanzen und Pil-zen weit v e r b r e i t e t W ä h r e n d über die Bildungs-weise dieser Stoffgruppe in Pilzen Klarheit zu herr-schen scheint2, liegen jedoch für höhere Pflanzen keinerlei Angaben vor.

Nach den augenblicklichen Kenntnissen über die Biosynthese der Anthrachinone ist als einziger Bau-stein dieser Verbindungen das Malonyl-CoA zu be-trachten2. B I R C H und D O N O V A N 3 hatten bereits 1955 formuliert, daß das Anthrachinon-Kohlenstoffgerüst durch Kopf-Schwanz-Kondensation von Acetateinhei-ten entstehen soll. Durch entsprechende Versuche mit 14C- und auch 180-markiertem Acetat wurde diese Hypothese bestätigt4; alle Untersuchungen sind jedoch nur mit Pilzen durchgeführt worden.

Ziel der Arbeit war es nun, diesen Biosynthese-weg auch für höhere Pflanzen nachzuweisen. Als Versuchsobjekt diente Krapp (Rubia tinctorum L . ) , der in seinem Wurzelsystem große Mengen des früher für technische Zwecke daraus gewonnenen Alizarins (I ) und Purpurins (II) speichert1. I liegt in der Pflanze als Ruberythrinsäure (Primverose in 2-Stellung)5 vor, während II aller Wahrscheinlich-keit nach durch Decarboxylierung aus dem äußerst labilen Pseudopurpurin (Purpurin-3-Carboxylsäure) hervorgeht6 ; auch Pseudopurpurin liegt glucosidisch

gebunden im Krapp vor. Beide Aglyka lassen sich durch Permanganatoxidation leicht abbauen, wo-durch eine Differenzierung zwischen den Ringen A, B und C des Anthrachinon-Moleküls möglich wird.

Eine Nachprüfung des Polyacetatweges für diese Anthrachinone ergab nun, daß Acetat wohl in den Ring C und teilweise in die Ketogruppen des chinoiden Ringes (B) eingebaut wird, nicht aber in den Ring A, der völlig aus Shikimisäure aufgebaut wird. .

0H !

0 R I: R = H=Alizar in

II: R = OH = Purpurin

Methode

Anzucht und Fütterung der Pflanzen

Rubia tinctorum-Püanzen wurden aus Samen in Töpfen herangezogen. Die Anzucht erfolgte im Ge-wächshaus bei 20° ohne Zusatzbeleuchtung. 1 — jährige Pflanzen mit voll entwickeltem Wurzelsystem gelangten zur Untersuchung. Der sorgfältig von der Erde befreiten Wurzel einer Pflanze (Gewicht: ca. 12 g)

* 8 München 19, Menzinger Straße 67. 1 R. H. THOMSON, Naturally occuring quinones, London, But-

terworths 1 9 5 7 ; W. K A R R E R , Konstitution und Vorkommen der organischen Pflanzenstoffe, Birkhäuser-Verlag, Basel 1 9 5 8 .

2 R. H. THOMSON, in: Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments (Herausg.: T. W. GOODWIN) . Academic Press, London 1965, S. 309 ff.

3 A. J . BIRCH U. F . W . DONOVAN, Austral. J . Chem. 8 , 5 2 9 [ 1 9 5 5 ] .

4 S. GATENBECK, Acta chem. scand. 14, 2 9 6 [ I 9 6 0 ] . 5 R . H I L L U. D . RICHTER, Nature [London] 138, 3 8 [ 1 9 3 6 ] . 6 R . H I L L U. D . RICHTER, J . chem. Soc. [London] 1 9 3 6 , 1 7 1 4 .

wurde am Wurzelhals ein ca. 0,3 ml fassendes koni-sches Glashäubchen aufgesetzt und der Zwischenraum zwischen Glas und Wurzel mit einer plastischen Klebe-masse verschlossen. In dieses Glasröhrchen wurde die zu applizierende wäßrige Lösung eingebracht, und die Wurzel in einem Exsiccator im Dunkeln aufbewahrt. Nach ungefähr 6 — 8 Stdn. hatte die Wurzel die Lösung quantitativ aufgenommen. Daraufhin wurde das Glas mehrmals mit dest. Wasser nachgespült. Nach 30 Stdn. Inkubation wurde der Versuch abgebrochen. Folgende isotopmarkierten Verbindungen wurden verwendet: Na-Acetat-[2-14C] (10 mc/mMol) ; DL-Shikimisäure-[1.2-14C] (10,62 mc/mMol) ; D-Shikimisäure-[U-14C] (3,37 mc/mMol) und L-Phenylalanin-[U-14C] (6,8 mc/mMol) ; die Verbindungen wurden ohne Verdünnung appliziert.

Isolierung und Reinigung der Pigmente

Die Wurzel wurde nach Versuchsende rasch in ca. 1 mm breite Scheiben zerschnitten und sofort in 80-proz. Äthanol 15 min am Rückfluß extrahiert. Meist wurde sie 9-mal bis zur Farblosigkeit des Lösungsmittel nach-extrahiert. Die alkoholischen Extrakte wurden nach Fil-tration im Vakuum zur Trockene eingedampft, mit 80-proz. Alkohol wieder aufgenommen und auf etwa 10 Bögen Whatman Nr. 3-Papier aufsteigend chromato-graphiert (Butanol/Eisessig/H20 = 4 : 1 : 5 ; Rubery-thrinsäure: Rf = 0,32; Glucosid A : Rf 0,14). Aus dem Glucosid A * läßt sich nach Hydrolyse unter den unten angegebenen Bedingungen II freisetzen. Die Pigment-banden wurden mit 80-proz. Äthanol aus dem Papier eluiert und die Eluate getrennt rechromatographiert (n-Butanol/Pyridin/H20 = 4 5 : 2 5 : 4 0 ; Ruberythrin-säure: i?/ = 0,70; Glucosid A : Rf 0,52). Die Farbstoff -banden wurden abermals eluiert, auf eine Polyamid-säule (5,5-2 cm; Murethan BK *) gegeben und nach einer Methode von H Ö R H A M M E R 7 mit 80-proz. Methanol entwickelt. Die Ruberythrinsäure-Fraktion wurde im Va-kuum eingedampft, in 5 ml H 2 0 aufgenommen und bis zu einer Endkonzentration von 4-n. mit konz. HCl ver-setzt, 1 Stde. bei 97° hydrolysiert und anschließend auf 4° abgekühlt. Die ausgefallenen Kristalle von I wurden abfiltriert, gewaschen und getrocknet (Ausbeute ca. 15 mg). I wurde in 80-proz. Methanol aufgenommen und weiter dünnschichtchromatographisch gereinigt (MN Cellulose 300 F254 ; Laufmittel: Petroläther (30

bis 70°)/CHC13/HCOOH = 6 4 : 2 7 : 9 ; I: Rf = 0,65). Nach der Eluation von I wurde abermals auf Zelluloseplatten rechromatographiert (Tetrahydrofu-ran/Äthylacetat/H20 = 3 5 : 6 : 4 7 ; I: Rf = 0,55). Die Konstanz der spezifischen Aktivität ist damit er-reicht. Die Konzentration von I wurde spektrophoto-metrisch in 80-proz. Methanol bei 428 und 249 nm

* Anm. i. d. Korr.: Glucosid A konnte inzwischen durch Ver-gleich mit einer authentischen Probe als Galiosin (Pur-purin-3-carboxylsäure-Primverosid) identifiziert werden. Prof. R . H I L L , Cambridge, danken wir herzlich für die Überlassung der Substanz.

(£428 = 5,5 • 106 c m 2 / M o l ; E2i9 = 2,97 • 107 cm2/Mol) ermittelt.

Das Polyamideluat, das Glucosid A enthält, wurde im Vakuum eingedampft und durch präparative Dünn-schichtchromatographie auf Kieselgel H-Platten in 60-proz. Methanol weiter gereinigt (Glucosid A : Rf = 0,7). Das Glucosid wurde mit 80-proz. Äthanol eluiert, eingedampft, in H 2 0 aufgenommen und mit konz. HCl bis zu einer Endkonzentration von 2-n. ver-setzt und 1 Stde. bei 97° hydrolysiert. Nach dem Ab-kühlen auf 4° wurden die Kristalle von II abfiltriert, gewaschen und getrocknet (Ausbeute ca. 4,5 mg).

Abbau der Pigmente

I und II konnten demselben chemischen Abbau unterworfen werden. Dazu wurden die Pigmente mit nichtmarkiertem Träger I oder II auf 100 ,t/Mol er-gänzt, in 2 ml 0,5-rc. KOH gelöst, mit 150 mg KMn04 versetzt und 50 min zum Sieden erhitzt. Nach dem Ab-kühlen wurde mit 2-n. H 2S0 4 angesäuert, mit NaHS03 entfärbt und die Phthalsäure mit Äther extrahiert. Der Rückstand des Ätherextraktes wurde im System Iso-propanol/NH3/H20 = 8 : 1 : 1 (Phthalsäure: Rf = 0,1) wiederholt aufsteigend chromatographiert. Die Phthalsäurebande wurde mit Methanol eluiert und die Konzentration spektrophotometrisch bei 285 nm be-stimmt (Ausbeute an Phthalsäure 70 Prozent). Die Phthalsäurelösung wurde mit nichtmarkierter Phthal-säure auf 100 ^Mol gebracht, das Lösungsmittel ver-dampft und der Rückstand mit 5 ml Chinolin und 50 mg Kupferchromit versetzt. Die Decarboxylierung erfolgte bei 225 °C während 2 Stunden. Das ent-stehende C0 2 (Ausbeute ca. 70%) wurde mit einem kräftigen Stickstoffstrom in eine Ba(OH)2-Lösung ein-geleitet und das entstehende BaC03 gravimetrisch be-stimmt. Aus dem Carbonat wurde das C0 2 durch Säure wieder freigesetzt und mit einem N2-Strom in 10 ml eines Methanol/Äthanolamin-Gemisches (88:12)8 über-getrieben.

Messung der Radioaktivität

Die Substanzen wurden nach der modifizierten Me-thode von S C H Ö N I N G E R 8 verbrannt. Das C0 2 wurde in 15 ml des Methanol/Äthanolamin-Gemisches absorbiert, ein Aliquot von 10 ml mit 10 ml eines Scintillatorgemi-sches 8 versetzt, und die Radioaktivität in einem Flüssig-keitsscintillations-Spektrometer Unilux der Fa. Nuclear Chicago bestimmt. Die Zählausbeute für 14C betrug ca. 60 Prozent. Anfallendes freies CO, wurde, wie oben beschrieben, absorbiert und gemessen. Als interner Standard diente Toluol-[U-14C].

** Den Farbenfabriken Bayer danken wir für die Überlassung des Polyamidpulvers.

7 L. H Ö R H A M M E R , in: Methods in Polyphenol Chemistry, Pergamon Press, Oxford 1964, S. 89.

8 F. K A L B E R E R U . J. RUTSCHMANN, Helv. chim. Acta 14, 1956 [1961],

Ergebnisse

Um die Möglichkeit zu prüfen, ob audi in höhe-ren Pflanzen Anthrachinone nach dem Polyacetat-weg aufgebaut werden, wurde zunächst Acetat-[2-1 4C] Krapp-Wurzeln appliziert. Wie aus Tab. 1 zu ersehen ist, wird Acetat in I eingebaut, was zu-nächst mit der Theorie übereinstimmte. Der Abbau dieser Verbindung zeigte jedoch erstaunlicherweise (Tab. 2 ) , daß Radioaktivität nur im Ring C, sowie in den Carboxylgruppen der Phthalsäure zu finden war. Der Benzolring (Ring A ) des Alizarins war frei von Radioaktivität. Bereits dieser Befund zeigt eindeutig, daß in der Krappwurzel die Bio-synthese der Anthrachinone nicht nach dem Poly-acetatweg verlaufen kann, denn sonst hätte eine gleiche Verteilung der gesamten Radio-aktivität im Molekül gefunden werden müssen, wie es nach Art der Kopf-Schwanz-Kondensation zu erwarten wäre. Auf der weiteren Suche nach Vor-stufen für den Ring A von I wurde Phenylalanin-[U-1 4C] (Tab. 1) den Pflanzen angeboten. Diese Verbindung wurde jedoch überhaupt nicht einge-baut, was wohl auch aromatische C6 — Cj-Verbindun-gen als Vorstufen ausschließt9. So wurde als nächste Möglichkeit der Einbau von Shikimisäure überprüft, nachdem bekannt ist, daß diese Säure auch in höhe-

Aktivität Alizarin Vorstufe appliziert spez. Aktivit. Einbaurate

L«c] [dpm/mMol] [%] Acetat-[2-14C] 100 114000 0,0035 L-Phenylalanin-

[U-14C] 25 0 0 DL-Shikimisäure-

[1.2-14C] 10 2405000 0,774 D-Shikimisäure-

[U-14C] 2 825000 0,123 Tab. 1. Einbau verschiedener Vorstufen in Alizarin durch

R. tinctorum.

ren Pflanzen die Vorstufe für viele aromatische Sy-steme ist1 0 . Der Inkorporationsversuch wurde zu-nächst mit 1.2-14C-markierter Shikimisäure durch-geführt, wobei sich herausstellte, daß diese Verbin-dung gut in I eingebaut wird (Tab. 1 ) . Der Abbau von I (Tab. 2 ) , wie auch der von II (Tab. 3) ergab, daß diese Säure mit ihren zwei benachbart markier-ten 14C-Atomen in den A-Ring der beiden Anthra-chinone eingeht. Es blieb jedoch noch die zwar recht unwahrscheinliche Möglichkeit, daß Shikimisäure in den Chinoiden-(B)-Ring der Anthrachinone inkor-poriert wird, wobei die beiden markierten C-Atome, also die C-Atome 1 und 2 der Shikimisäure, die C-Atome 11 und 12 des Anthrachinons, die sich so-wohl in den A- wie auch in den B-Ring teilen, stel-len. Um diese Möglichkeit auszuschließen, wurde U-14C-markierte Shikimisäure den Krapp-Pflanzen gefüttert (Tab. 1 ) . Der Abbau des auf diese Weise markierten I (Tab. 2) zeigt, daß nicht nur der A-Ring (also die C-Atome 5, 6, 7, 8, 11, 12) von den Ring-Atomen der Shikimisäure aufgebaut wird, sondern daß die Shikimisäure in toto, d. h. mit der Carboxylgruppe eingebaut wird. Die Decarboxylie-rung der Phthalsäure ergab, daß die beiden Carb-oxylgruppen zusammen 14,5% der Gesamtaktivität der Phthalsäure enthalten, das entspricht sehr genau der Aktivität, die in der Carboxylgruppe der uni-form markierten Shikimisäure ( = 4/7 der Gesamt-aktivität) enthalten ist1 1 . Ein sehr ähnliches Ergeb-nis wurde beim Abbau von II erhalten (Tab. 3 ) . Diese Befunde unterstützen das Ergebnis, das durch den Nichteinbau von Phenylalanin gewonnen wurde, und zeigen, daß das Gesamtmolekül der Shikimi-säure in das Kohlenstoffgerüst des Anthrachinons eingeht.

Einen Nachweis, in welche der beiden Ketogrup-pen des chinoiden B-Ringes (C-Atome 9 und 10)

Alizarin Phthalsäure CO2 aus Phthalsäure Vorstufe spez. Aktivität spez. Aktivität spez. Aktivität Prozent von

Phthalsäure [dpm/mMol] [dpm/mMol] [dpm/mMol] [2C02]

Acetat-[2-14C] 63900 8700 4300 99 DL-Shikimisäure-[l,2-14C] 25630 25450 0 0 D-Shikimisäure-[U-14C] 38850 37800 2750 14,5

Tab. 2. Verteilung der Radioaktivität in Alizarin nach Einbau verschiedener Vorstufen.

9 M . H. ZENK, in: Biosynthesis of aromatic compounds (Her-ausg.: G. BILLEK) . Pergamon Press, Oxford 1966, S . 45.

10 A. C . NEISH, in: Biochemistry of phenolic compounds (Her-ausg.: J. B. HARBORNE). Academic Press, London 1964, S . 295.

1 1 P . O . LARSEN, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 1 1 5 , 529 [1966].

Vorstufe Einbaurate [%]

Purpurin spez. Aktivität

verdünnt [dpm/mMol]

Phthalsäure spez. Aktivität

[dpm/mMol]

spez.

[dp

CO2 aus Phthalsäure Aktivität Prozent von

Phthalsäure m/mMol] [2C02]

DL-Shikimisäure-[1.2-14C] D-Shikimisäure-[U-14C]

0,123 0,211

9250 27200

8980 26900

0 1485

0 11

Tab. 3. Verteilung der Radioaktivität in Purpurin nach Einbau verschieden markierter Shikimisäuren.

die Carboxylgruppe der Shikimisäure eingebaut wird, konnte noch nicht geführt werden. In Analogie zu den von uns bei der Untersuchung der Juglon-biosynthese gewonnenen Ergebnisse 12 dürfte jedoch zu erwarten sein, daß die Carboxylgruppe der Shi-kimisäure zu je 50% in C9 und C1 0 des Anthra-chinons eingebaut wird. Dies setzt allerdings voraus, daß bei der Biosynthese von I und II eine symmetri-sche Zwischßnverbindung, wie z. B. die eines 1.4-Naphthochinons, durchlaufen wird. Die rest-lichen Atome des Anthrachinonmoleküls dürften, wie aus Tab. 2 hervorgeht, aus dem AcetatstoffWech-sel stammen.

Ob dieser neu aufgefundene Biosynthesemechanis-mus audi für den Aufbau von Anthrachinonen des Emodin-Types in höheren Pflanzen Gültigkeit be-sitzt oder nur für die Gruppe2 der Rubiaceae-Anthrachinone, ist noch nicht bekannt. Diese Fra-gen werden untersucht.

Herrn Prof. Dr. H. S I M O N und Frl. P F L A U M E R danken wir herzlich für die Unterweisung in der „S c h ö n i n -g e r"-Technik. Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s -g e m e i n s c h a f t gilt unser Dank für die groß-zügige Unterstützung.

1 2 M . H . Z E N K U . E . LEISTNER, in Vorbereitung.

Carotinoide der Vaucheriales Vaucheria und Botrydium (Xanthophyceae) H A N S K L E I N I G u n d K U R T E G G E R

Botanisches Institut der Universität Heidelberg

( Z . Natur forschg . 22 b , 8 6 8 — 8 7 2 [ 1 9 6 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 27 . Januar 1967)

The carotenoids of the Vaucheriales Vaucheria and Botrydium have been investigated. Both con-tain the same pigments /^-carotene, cryptoxanthinepoxid (traces), zeaxanthin (traces), anthera-xanthin, a new xanthophyll named vaucheriaxanthin with three esterified hydroxyls and another unknown pigment. The carotenoids of the Vaucheriales seem to be not identical with the caro-tenoids of the other Xanthophyceae investigated by T H O M A S and GOODWIN 8. The identity of pigment composition of Vaucheria and Botrydium underlies their close relationship in the algal system. The significance of these pigments is discussed. Diatoxanthin, a pigment of diatoms, is identical with antheraxanthin.

Vaucheria gehört zu den bekanntesten heimischen Algengattungen, deren Vertreter an feuchten, schatti-gen Stellen wie auch submers häufig anzutreffen sind. Ihre systematische Stellung war lange umstritten, heute wird sie in die Nähe von Botrydium (Xanthophyceae, Chromophyta; System nach C H R I S T E N S E N 1 ) gestellt.

Die Piastidenpigmente der Xanthophyceen haben immer wieder das Interesse auf sich gezogen 2 - 7 . Es zeigte sich jedoch, daß in diesen Arbeiten keine gülti-

1 T. CHRISTENSEN, Botanik, Bd. II, Systematik Botanik, Nr. 2 Alger, Munksgaard, Copenhagen 1962.

2 R. K U H N U . H. BROCKMANN, Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 213, 192 [1932].

3 P. W . C A R T E R , I . M . HEILBRONN U. B . LYTHGOE, Proc. Roy. Soc. [London] Ser. B 1 2 8 , 82 [ 1 9 4 0 ] .

4 I . M. HEILBRONN, J . chem. Soc. [London] 1 9 4 2 , 79.

gen Resultate über die Xanthophyceen-Farbstoffe er-bracht worden sind. In einer neueren Arbeit, die sich allerdings nicht auf Vaucheriales bezieht, werden neun Xanthophyceen untersucht8 (Vischeria spec., Hetero-coccus fuorensis, Bumilliopsis brevis, Ophiocytum majus, Chlorocoster engaginalis, Heterotrix debilis, Tri-bonema aequale, Chloridella neclecta, Botyrdiopsis al-pina). In allen Algen sollen ß-Carotin, Antheraxanthin, Luteinepoxid, ein dem Neoxanthin ähnliches Pigment

5 H . H . S T R A I N , W . M . M A N N I N G U. G . J . H A R D I N G , Biol. Bull. 86. 169 [1944],

6 H . H . S T R A I N , 3 2 N D Ann. Priesley Lectures, Penn. State Univ. (1958).

7 M . B . A L L E N , T . W . G O O D W I N , L . F R I E S U. D . M . THOMAS, J . gen. Microbiol. 34, 259 [1964].

8 D. M. T H O M A S U . T . W. G O O D W I N , J. Phycol. 1, 118 [1965].