Eindhoven University of Technology

MASTER

Meetopstelling voor zuurstofbindingscurven van hemoglobine-oplossingen

Moonen, Jan

Award date:1981

Link to publication

DisclaimerThis document contains a student thesis (bachelor's or master's), as authored by a student at Eindhoven University of Technology. Studenttheses are made available in the TU/e repository upon obtaining the required degree. The grade received is not published on the documentas presented in the repository. The required complexity or quality of research of student theses may vary by program, and the requiredminimum study period may vary in duration.

General rightsCopyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright ownersand it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights.

• Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain

Faculteit der Geneeskunde Afdeling Fysiologie Kath. Universiteit Nijmegen

Technische Hogeschool Eindhoven Vakgroep Analyse Fysische Meet­methoden

MEETOPSTELLING VOOR ZUURSTOFBINVINGSCURVEN

VAN HEMOGLOBINE-OPLOSSINGEN

Verslag van het afstudeerwerk, verricht op de afdeling

Fysiologie van de Katholieke Universiteit te Nijmegen

Afstudeerhoogleraar:

Coordinator:

Begeleiding:

Prof. Dr. J.A. Poulis

Dr. ir. H.J. van Ouwerkerk

Dr. P.M. Breepoel

Ir. J.H. de Koning

Op deze plaats wil ik allen bedanken die hun medewerking hebben verleend bij de totstandkoming van dit afstudeerwerk. Met name dank ik Jo Michels voor de prettige samenwerking bij het bouwen van de opstelling.

Nijmegen, april 1981 Jan Moonen

INHOUD

SAMENVATTING ................................................... BLZ.

1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

2. ZUURSTOFBINDINGSCURVE . . .. .. .. . . . . . .. . . . . .. .. . .. .. .. .. . . . .. .. .. . . 2 2.1. Klinisch belang ............................................ 2 2.2. Fysisch-chemische aspecten van hemoglobine. .. .............. 2 2.3. Standaard-dissociatiecurve ................................. 6 2.4. Bestaande apparatuur. ...............................•...... 8

a) Methode van Duvelleroy (1970) ........................... 8 b) Methode van Clerbaux (1975, 1976). ...................... 9 c) Methode van Si ck en Gersonde . .. .. .. .. . .. . . .. .. . . .. .. .. .. 9

2.5. Discussie .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . 11

3. MEETPRINCIPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.1. Meting zuurstofspanning .. ~.. ......... ...... .... .. . . .... .... 12 3.2. Principe saturatiemeting.............. ... .... ...... ... .. ... 13

4. MEETOPSTELL I NG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.1. Meetcel .................................................•.... 15 4.2. Optisch systeem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.3. Electronisch detectiesysteem ................................ 23

4.3.1. po2-meting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4.3.2. Saturatiemeting ...................................... 24

4.4. Totale meetopstelling ....................................... 26

5. IJKINGEN, RESULTATEN ............................................. 28 5.1. IJking p02-electroden ....................................... 28 5.2. Lineariteit fotodiode ....................................... 29 5.3. Zuurstofbindingscurve ....................................... 30 5.4. Oxygenatie en deoxygenatie als functie van [KCl] en [Hb] .... 33

6. DISCUSS IE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 6.1. Meetmethode, meetnauwkeurigheid ............................. - 37 6.2. Randeffecten meetcel, modificaties .......................... 37 6.3. Maximale hemoglobine-concentratie en bijbehorende [Hb02]-

gradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

7. CONCLUSIES, VOORTZETTING VAN HET ONDERZOEK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 APPENDIX A: Invloed van de bandbreedte van de monochromatische lichtbundel op de lineariteit van de fotometer ................... 44

APPENDIX B: Schema saturatiemeter ................................ 47 APPENDIX C: Specificatie apparatuur .............................. 48 REFERENT I ES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

SAMENVATTING

Ter bepaling van zuurstofbindingscurven van hemoglobine-oplossingen

is een meetopstelling ontwikkeld gericht op het gebruik van kleine

monsters in een stilstaande diffusielaag.

De opstelling bevat twee onafhankelijke meetsystemen:

1) o2-detectiesysteem: de meting van de partiele zuurstofspanning

geschiedt met behulp van micro-po2-electroden.

2) Optisch systeem: de zuurstofverzadiging van de hemoglobine wordt

bepaald uit de optische absorptie bij twee golflengten.

In de meetcel (inhoud 6 µl) wordt de hemoglobine-oplossing geoxy­

deerd resp. gedeoxygeneerd. De snelheid van dit proces is een functie

van de diffusie- en reactiesnelheden van zuurstof en hemoglobine. De

zuurstofbindingscurve ontstaat door gelijktijdige en continue re­

gistratie van de zuurstofspanning en de verzadigingsgraad van de hemo­

globi ne.

De meetopstelling is geijkt en er zijn enkele zuurstofbindings­

curves gemeten.

- 1 -

1. INLEIVING

Hemoglobine is een eiwit waaraan reversibel zuurstof kan binden.

Het komt voor in de rode bloedlichaampjes en vervult een belangrijke

functie bij de zuurstofvoorziening van de diverse lichaamsdelen van

de mens. Met name het zuurstoftranspot over lange afstanden, als

convectief transport via de circulatie, steunt op de aanwezigheid

van hemoglobine.

De zuurstofbindingscurve van een hemoglobine-oplossing geeft gra­

fisch het verband tussen de partiele zuurstofspanning in de oplossing

en de verzadigingsgraad van de hemoglobine. De partiele zuurstof­

spanning is recht evenredig met de hoeveelheid fysisch opgeloste

zuurstof (wet van Henry). De verzadigings- of saturatiegraad van hemo­

globine is gedefinieerd als de verhouding tussen het aantal aan hemo­

globine gebonden moleculen zuurstof en het maximum aantal dat gebonden

kan warden.

Het doel van dit afstudeerwerk is het ontwikkelen van apparatuur

om snel en betrouwbaar zuurstofbindingscurven te meten van kleine

monsters (<< 1 ml) bloed of hemoglobine-oplossing. Omdat bestaande

meetapparaten niet aan de door ons te stellen eisen voldoen (zie 2.4.)

is een ander meetsysteem ontworpen, gebouwd en getest (resp. hoofdstuk

3, 4 en5).

Hoewel de meetopstelling nog niet definitief voltooid is, zijn er

reeds metingen verricht aan Hb-oplossingen.

Een uitbreiding van de apparatuur en een aanvulling van dit onder­

zoek is beschreven in hoofdstuk 7.

Dit afstudeerwerk is verricht op de afdeling Fysiologie van de

Medische Faculteit te Nijmegen.

- 2 -

2. ZUURSTOFBINVINGSCURVE

2. 1. IGUnl6c.h be.lang

De zuurstofbindingscurve is een maat voor de zuurstofaffiniteit

van het bloed en indirect een indicatie voor het maximale o2 trans­

port van de longen naar de weefsels.

Reeds in 1966 (Eliot et al.) werd verondersteld dat een abnormale

zuurstofaffiniteit van het bloed een der oorzaken kan zijn van een

hartinfarct; in betreffend onderzoek werd een verlaagde affiniteit

gemeten. Omtrent dit verband bestaat (nog) geen zekerheid omdat in

klinische studies de zuurstofaffiniteit van het bloed v66r het optre-

den van het infarct meestal onbekend is.

Indien inderdaad een relatie tussen de ligging:van de zuurstof-

bindingscurve en het optreden van een hartinfract zou bestaan, zal de

diagnostische betekenis van de meting van deze curve toenemen. Spe­

culerend kan dan zelfs verwacht worden dat de klinische toepassing

onderzocht zal worden van een therapeutische beinvloeding van de ligging

en de vorm van de curve.

Tevens kan het belang blijken van de zuurstofbindingscurve van het

bloed dat gebruikt wordt in een extracorporale circulatie tijdens een

open hartoperatie bij patienten met hartischemie.

In het menselijk bloed wordt zuurstof chemisch gebonden door het

proteine hemoglobine, dat vrijwel alleen in de rode bloedlichaampjes

voorkomt. Een rode bloedcel bevat 280.106 moleculen hemoglobine (in

't vervolg weergegeven met Hb) en het menselijk bloed bevat gemiddeld

- 3 -

5.106 rode bloedcellen per mm3 bloed. Ieder Hb molecuul kan 4 mole­

culen o2 binden. Bij p02 = 10 kPa is menselijk bloed voor meer dan

90 % verzadigd en bevat 9xl0- 3 mol o2 per liter. Er is dan slechts -4 1,lxlO mol o2 fysisch opgelost (Bernards, 1979).

Proteinen bestaan uit lange ketens van aminozuren, de zgn. poly-

petide ketens. Het proteine Hb, met molecuulgewicht van 64500, bevat

vier ingewikkeld opgevouwen polypeptide ketens (globinen) en vier niet­

peptide groepen die elk heemgroep of heem genoemd worden. Het belang­

rijkste bestanddeel van een heem is een ijzerion (zie fig. 2.1.) dat

een molecuul o2 reversibel kan binden en zo voor o2 transport zorg

draagt. De heem is de oorzaak van de rode kleur van het bloed.

Iedere heemgroep is omgeven door een van de vier gevouwen peptide

ketens en wel zodanig dat door deze chemische structuur een reversibele

binding met o2 mogelijk is. Heern alleen kan zuurstof niet reversibel

binden. Hethemoglobinemolecuul is ongeveer bolvormig met afmetingen

64 ~ x 55 ~ x 50 ~. De vier heemgroepen liggen in het Hb-molecuul dicht

bij het oppervlak, waardoor gemakkelijk o2 wordt opgenomen en afge­

staan, afhankelijk van de chemische structuur en het chemisch milieu

waarin het Hb-molecuul zich bevindt. De binding van o2 met Hb noemt

men oxygenatie, in tegenstelling tot oxidatie waarbij o2 atomair zo

sterk gebonden wordt, dat Hb (ferrohemoglobine) door de irreversibele

reactie overgaat in methemoglobine (ferrihemoglobine) dat geen o2 in

moleculaire vorm kan binden en afstaan.

- 4 -

CH3 ·~ CH= CH2

N N

Fe

N N

CH3 CH3

FiguWL Z.1. Structuurformule van een heemgroep (= ijzerporfyrine).

De vier polypeptide ketens blijken twee aan twee gelijk te zijn:

twee a-ketens en twee s-ketens (Perutz, 1968). Verder blijkt de zuur-

stofbinding samen te gaan met een structuurverandering: twee van de

vier ketens, namelijk de s~ketens, bewegen zodanig dat de ruimte tus-

sen de ketens bij o2-opname kleiner wordt en bij o2-afgifte grater.

De saturatiecurve van hemoglobine blijkt S-vormig te zijn (zie fig. 2.2.).

1

s

1 1.~ p02 ( kPa)

Figuur 2.2 Saturatiecurve van runderhemoglobine.

pH=7,4 Hb = 0,015 m mol/I

- 5 -

De saturatie van hemoglobine is gedefinieerd als de verhouding van

het aantal moleculen o2 door de hemoglobine gebonden en het aantal o2 moleculen dat maximaal door de hemoglobine gebonden kan warden. De

S-vorm van de saturatiekromme kan verklaard warden met de hypothese

van Adair dat de reactie van Hb met o2 in 4 trappen verloopt:

Hb 4 + 02 ( > Hb4 o2 Hb 4 o2 + 02 ( ) Hb4(02)2

Hb4(02)2 + 02 ( ) Hb4(02)3

Hb4(02)3 + 02 ( ) Hb4(02)4

We kunnen voor de saturatie dan de volgende uitdrukking opschrijven:

waarin [02] = zuurstofconcentratie

k1 t/m k4 = evenwichtsconstanten voor de vier reactie­

trappen.

Om de S-vorm te verklaren is het oak noodzakelijk dat men aanneemt

dat er een wisselwerking bestaat tussen de heemgroepen van het

Hb-molecuul. Zou de binding van o2 aan de heemgroepen zuiver statis­

tisch verdeeld zijn, dan zou de saturatiekromme immers hyperbolisch zijn.

Een molecuul o2 bindt namelijk gemakkelijker aan een Hb-molecuul

dat al een of meer zuurstofmoleculen gebonden heeft dan aan een Hb-

molecuul dat nag geen o2 bevat. Ook zal een Hb-molecuul dat maar een

molecuul o2 gebonden heeft, dit eerder loslaten dan een Hb-molecuul

dat meerdere o2 moleculen bevat. Door de structuurverandering van het

Hb-molecuul bij de binding van o2 aan een heemgroep verandert dus de

zuurstofaffiniteit van de drie overige heemgroepen.

- 6 -

De reactie van zuurstof met hemoglobine kan als volgt warden

weergegeven:

Oxyhemoglobine is een sterker zuur dan hemoglobine. Uit bovenstaande

evenwichtsreacties blijkt dat het percentage oxyhemoglobine niet alleen

afhankelijk is van de p02, maar tevens van de pH van de oplossing.

Tijdens het meten van de saturatiecurve dient men een buffer te gebrui­

ken, dan wel tevens continu de pH te meten.

Behalve o2 kan ook CO gebonden warden aan het ijzeratoom van de heem­

groep. Deze binding is veel stabieleren laat geen zuurstofopname meer

toe: bij inademing van CO treedt vergiftiging op. Omdat de affiniteit

van Hb voor CO veel grater is dan die voor o2, zijn zeer lage con­

centraties CO al schadelijk voor de zuurstofopname.

Omdat de meeste gezonde mensen eenzelfde soort hemoglobine in hun

bleed hebben, zou verwacht kunnen warden dat de saturatiecurve van de

meeste proefpersonen dezelfde is. Het is echter gebleken dat de zuur­

stofbinding bij bepaalde p02, behalve van het soort hemoglobine ook

nog van andere factoren afhankelijk is; zie onderstaande tabel.

Zuurstofbinding is afhankelijk van:

1) pH

2) temperatuur

3) organische fosfaten: Adenosinetriphosphate (ATP)

Inositol hexaphosphate (IHP)

2,3-Diphosphoglycerate (DPG)

- 7 -

4) pC02

5) co

6) Methemoglobineconcentratie

7) Ionensterkte

8) Medicijnen, chemicalien

9) Anorganische fosfaten

10) Zoutconcentratie.

Van bovenstaande parameters zijn de belangrijkste de pH, pC02, het

DPG-gehalte en de temperatuur. Om een indruk te krijgen van deze fac­

toren, geeft o.a. Woodson (1977) alleen het effect voor de p50 , d.i.

de p02 waarbij de saturatie 50 % is. Voor menselijk bloed is onder

standaardcondities (d.i. pH= 7.4; T = 370 C; pC02 = 5.26 kPa; DPG =

5 mM/l) de p50 ongeveer 3,5 kPa. De invloed van de vier factoren is

in figuur 2.3. weergegeven. Zander opgave van deze fysisch-chemische

condities h~~ft een zuurstofbindingscurve weinig kwantitatieve bete­

kenis.

p50

(kPa)

0 4

7.8 7.6

31 33

Figuur 2.3

8 12

7.!4 7.2

37 39 41

lnvloed van T , pH en

(Woodson, 1977).

16 20 DPG (m. molf i)

pH 7.0

43 T (°C)

DPG op de P50·

- 8 -

2.4. Beiita.ande appaJLa.:tUUJt

a) Methode van Duvelleroy (1970)

Principe: In een gesloten systeem wordt een bekend volume gedeoxy­

geneerd bloed in contact gebracht met een bekend volume zuurstofgas.

De afname van de p02 in het gasvolume en de toename van de fysisch op­

geloste o2 in het bloed wordt met po2 electroden gemeten (zie figuur

2.4.). De toename van de totale hoeveelheid zµurstof in het bloed is

gelijk aan de afname van de hoeveelheid zuurstof in het gas. De ver­

zadiging kan men als volgt berekenen:

S = t-,,V02 gas-t-,,V02 bloed

{t-,, vo2 gas - t-,, vo2 bl oed } max

waarin t::.V02 gas= verandering van de totale hoeveelheid o2 in het gas

en t::.V02 bloed = verandering van de hoeveelheid fysisch opgelost o2

in bloed.

Radiometer (Kopenhagen) heeft tijdelijk een instrument in de handel ge­

bracht dat werkt volgens het principe van Duvelleroy.

Ve ____ __. p02

meter i--------1

gas s

bloed - ....._--'----l p02

meter _________ __..

I I magn.

roerder

Figuur 2.4 Meetprincipe van Duvel leroy.

2.4.b. Methode vdn CleJtbdux (7975, 7976)

Bij deze methode worden T, pH en pC02 nauwkeurig constant gehouden:

T binnen o,oos° C, pC02 binnen o,07 kPa ~n de pH binnen een interval

van 0,002.

Er wordt gebruik gemaakt van een bloedmonster van 10-12 ml. Dit bleed

wordt d.m.v. een peristaltische pomp rondgepompt in een circuit waarin

de po2 polarografisch en de verzadiging S fotometrisch gemeten worden.

Verder is er een gascircuit waarmee gassen van nauwkeurig

bekende samenstelling in contact gebracht kunnen worden met het bloed.

De twee circuits komen bij elkaar in een tonometer waarin de gasopname

door het b 1 oed p 1 aa ts vi ndt. In het b 1 oedci rcu.i t mo gen p02, pC02 en pH

niet veranderen tussen plaatsen waar de p02 en de verzadiging S worden

gemeten. In het gascircuit mogen de gassamenstelling en de gasdruk niet

varieren.

2.4.c. Methode Vdn Si.ck en GeJL6onde

De te onderzoeken hemoglobine-oplossing bevindt zich op de bodem

van een bolvormige diffusiekamer. De diffusiekamer is aan onder- en

bovenzijde afgesloten door plexiglas. Het laagje Hb-oplossing {laag­

dikte: 0,02-0,05 mm) wordt geoxygeneerd en gedeoxygeneerd afhankelijk

van de samenstelling van het gas in de diffusiekamer.

De saturatie (S) van hemoglobine wordt fotometrisch bepaald; de

lichtbundel is gericht in verticale richtjng. De ro2 wordt met een po2~

electrode gemeten in het gas in de diffusiekamer.

- 10 -

2

A=436 nm

FiguuJt Z.4. Schema van de diffusiekamer

1) instromingskanaal voor ijkgas, 2) diffusiecapillair,

3) po2-electrode, 4) Hb-oplossing.

De samenstelling van het gas in de diffusiekamer kan op 2 manieren

gevarieerd warden:

a) instroming via kanaal l;

b) diffusie via dun capillair (kanaal 2).

De meetprocedure is als volgt. Eerst wordt ijkgas door de diffusie­

kamer geleid (in via 1, uit via 2). Na equilibratie in de diffusie-

kamer wordt doorstroomopening 1 gesloten en wordt diffusiegas langs

het capillair geleid. In het capillair, in de diffusiekamer en in de

Hb-oplossing vindt diffusie plaats.

Het diffusieproces in vloeistof verloopt veel langzamer dan het

diffusieproces in gas. Hierdoor is er een relaxatie-effect tussen de

p02 in de vloeistof en het gas (zie ook 4.1.). De saturatiecurve gemeten

tijdens oxygenatie is dan ook verschillend van de curve gemeten tijdens

deoxygenatie.

Aminco (American Instrument Company) heeft een meetapparaat in de

handel gebracht (Hem-o-scan) dat werkt volgens het principe van Sick

en Gersonde.

I

- 11 -

Niet alleen clinische toepassingen, maar voornamelijk het toe­

komstig wetenschappelijk onderzoek aan hemoglobine-oplossingen en

bloed stelt eisen aan onze opstelling:

- Met het oog op onderzoek aan rattebloed en vissehemoglobine dat zeer

kwetsbaar is, is gesteld dat het monster tijdens het experiment moet

stilstaan.

Bij kleine proefdieren is slechts een beperkte hoeveelheid bloed ter

beschikking (< 1 ml).

- Om oak in een later stadium de saturatie van bloed te kunnen meten,

moet de opstelling geschikt zijn voor oplossingen waarvan de [Hb]

3 a 4 x 10-3 mol/liter is; dit is de concentratie in de rode bloed­

lichaampjes.

- De meting van een zuurstofbindingscurve mag maximaal een uur bedragen.

Aan de eerste en tweede eis wordt niet voldaan bij meting volgens

het principe van Duvelleroy (a) of Clerbaux (b). Een meetopstelling

die werkt volgens het principe van Sick en Gersonde (c), de zgn.

Hem-a-scan, is binnen de afdeling Fysiologie gestest, maar gaf geen

reproduceerbare metingen (zie 2.4.c.).

Deze bevindingen gaven aanleiding tot het ontwikkelen van een

nieuwe meetopstelling. Toetsing van de gekozen opstelling aan de

eisen wordt beschreven in hoofdstuk 7: Conclusies.

- 12 -

3. MEETPRINCIPE

Er dienen in principe 2 grootheden in de stilstaande vloeistof

gemeten: de zuurstofspanning (p02) en de verzadigingsgraad (S) van

van de hemoglobine.

De p02 wordt m.b.v. micro-po2-electroden gemeten, die werken vol­

gens het principe van de zgn. Clark-electrode (Kimmich, 1969). Een

Clark-electrode is een bipolaire electrode, d.w.z. kathode en anode

zijn d.m.v. een gas-permeabel membraan gescheiden van de te onderzoeken

oplossing. Tussen de kathode en anode wordt een spanningsverschil aan­

gebracht (-0,7 V) waardoor de bij de kathode aanwezige zuurstof wordt

gereduceerd volgens:

--) 40H

en aan de anode: Ag -~> Ag++ e

Tussen het membraan en de anode en kathode bevindt zich een buffer­

oplossing (NaH2Po4-H 3P04).

De fysisch opgeloste o2 wordt gereduceerd aan de kathode en er ont­

staat een o2-gradient naar het kathode-oppervlak. Het gevolg is dat o2-

moleculen in de richting van het kathode-oppervlak diffunderen. Het

teflon-membraan (dikte 6 µm) beperkt de diffusiesnelheid van de o2-

moleculen en bij een spanningsverschil van-0.7 V wordt alle zuurstof

gereduceerd, die door het teflon-membraan diffundeert; de p02 aan het

kathode-oppervlak is nul. Het aantal moleculen o2 dat door het membraan

diffundeert is recht evenredig met het partieel drukverschil voor o2 over het membraan, en dus evenredig met de p02 in de vloeistof grenzend

- 13 -

aan de buitenzijde van het membraan. Door het gebruik van een mem­

braan is de electrodestroom in principe onafhankelijk van het medium.

De verzadigingsgraad van de hemoglobine wordt bepaald aan de hand

van absorbtiemetingen aanhethemoglobinelaagje. Onder (licht-)ab­

sorptie of extinctie wordt verstaan de logaritoe van de verhouding

tassen de energie na absorptie en de energie v66r absorptie: I

E = log~ Principe van de saturatiemeting berust op

het feit dat Hb en Hb02 een verschillend absorptiespectrum hebben. In

figuur 3.1. is een gedeelte van de absorptiespectra weergegeven.

10

5

0 578 542 A, (nm)

F ,tg Ull!t 3 • 1 • Absorptiespectra van hemoglobine voor 0, 20, 40, 60,

80 en 100 % verzadiging (Wodick, LUbbers, 1973).

- 14 -

De lichtintensiteit wordt gegeven door de wet van Lambert-Beer:

I = Io.10-e.c.d

waarin I = intensiteit na absorptie

I0

= intensiteit voor absoptie

E = extincie Coefficient

c = concentratie

d = laagdikte.

Voor twee kleurstoffen (Hb en Hb02) is de intensiteit:

= 10

. 10{-d(E1[Hb]t.s - E2(1-S)[Hb]t)}

= I .lO{-d[Hb]t(E1S+(l-S)E2)} 0

waarin El' E2 = extinctiecoefficient Hb02 en Hb

S = saturatiegraad

In feite zou men kunnen volstaan met het meten van de absorptie bij

een bepaalde A, die gekozen wordt in een gebied waar de extinctie-

coefficient van Hb en die van Hb02 veel verschillen (met Hb02 wordt

bedoeld de volledig geoxygeneerde vorm van hemoglobine: Hb4(o2)4).

Om te kunnen corrigeren voor eventuele veranderingen in [Hb] en

laagdikte tijdens het experiment wordt tevens de absorptie gemeten

bij een A waarvoor beide extinctiecoefficienten gelijk zijn (E3);

de laatstgenoemde golflengte is de isobestische golflengte \.; de eerst-- I

genoemde duiden we aan met \s(~aturatiemeting).

- 15 -

In het isobestisch punt is de extinctie onafhankelijk van 5:

E = [Hb]t.£3.d

Als we de extinctie voor beide A's op elkaar delen, houden we een

signaal over dat afhankelijk is van een variable 5 en van twee con-

stanten k1 en k2

d [Hb]t (£ 15+(1-5)£2)

d [Hb]t £ 3

Het signaal is dan evenredig met de saturatiegraad (zie ook Appendix A).

4. MEETOPSTELLING

4. 1 • Mee.tc.d

In de meetcel bevindt zich de te onderzoeken oplossing die tijdens

het experiment geleidelijk van de geoxygeneerde toestand overgaat naar

de gedeoxygeneerde toestand en/of omgekeerd.

De meetcel heeft twee gasdoorlatende membranen (teflon), waardoor

zuurstofuitwisseling mogelijk is tussen sample en omgeving. Het zuur­

stoftransport ~n het sample, nodig voor de oxygenatie en deoxygenatie

van de oplossing, vindt plaats door diffusie van o2 en Hb02 (5cholander,

Wittenberg); hierdoor is er een relaxatietijd tussen de p02 in de vloei­

stof en de p02 in het omringende gas. De relaxatietijd neemt kwadratisch

toe met de afstand tot het grensvlak vloeistof-membraan.

In een inhomogeen monster is er gelijktijdige diffusie en chemische

reactie van zuurstof en hemoglobine. De snelheid waarmee deze processen

plaatsvinden bepaalt de totale tijdsduur van een experiment (een curve).

De diffusiecoefficient van o2 en Hb02, resp. D0 en DHbO , zijn afhanke-2 2

- 16 -

kelijk van de hemoglobineconcentratie, [Hb]. Voor [Hb] = 10-3 iiier -5 cm2 -7 2 is Do2 = 1,7.10 ~s~ en DHb = 5.10 cm /s (Kreuzer, 1970). De oxy-

genatie en deoxygenatie van hemoglobine kan sterk vereenvoudigd warden

voorgesteld door de reactie:

waarin k (= reactiesnelheid voor dissociatie)

k1(= reactiesnelheid voor combinatie)

-1 = 42,5 sec 9 ml

= 3· 10 mol.s. (Hoofd, 1970).

De afmetingen van de meetcel in de diffusierichting is dus van invloed

op de meettijd van een curve. Omdat de meetcel slechts twee (evenwijdige)

zuurstofdoorlatende wanden heeft, vindt diffusie van zuurstof en hemo-

globine slechts in een richting plaats, namelijk loodrecht op de per­

meabele wanden (zie 6.2.). In deze richting ontstaat een tijdafhanke­

lijke o2 en Hb02 gradient in de oplossing. Een voorbeeld van berekende

o2 en Hb02 profielen is gegeven in figuur 4.1. ----------·---·--~------~-

-r-----------------.-20

1

s

0.5

0 0

10

0.5

Figuur 4.1 Theoretische o2 en S profielen.

Hb 1 , 5 m mo I I I ( Spaan, 1973) •

p02 (kPa)

- 17 -

In de meetcel wordt de p02 en de saturatie gemeten op de plaats

waar de o2 en Hbo2 gradienten klein zijn, namelijk midden tussen de

permeabele wanden.

De saturatie wordt bepaald met behulp van absorptiemetingen in een

lichtbundel evenwijdig aan de permeabele wanden. Om een smalle licht­

bundel nauwkeurig te localiseren gebruiken we glasvezels als lichttrans­

missiesysteem. De glasvezels liggen alle in een plat vlak evenwijdig

aan het xz-vlak op y = ~ L; zie figuur 4.2. Een rij fibers dient als

lichtgeleiding van de bron naar het monster, de andere rij fibers ge­

leidt een deel van de uittredende bundel naar de detector. We meten dus

de absorptie van een zeer smalle strook (65 µm) precies in het midden

van de meetcel.

Aan een zijde van de meetcel bevinden zich tussen de fibers tevens

drie p02-electroden (platinadraden, ingesmolten in glas; als zwarte

stippen weergegeven in de tekening; de platinadragen fungeren als kathode).

Aan weerszijden van de rij fibers bevindt zich een zilveren plaatje dat

fungeert als anode.

De meetcel is weergegeven in figuur 4.2. De afmetingen zijn ~ x 1 x 12 mm

in resp. y, z en x richting. ~ glasvezels: 65 µm; doorsnede po2-electrode: + - 50 µm; doorsnede platinadraad (kathode): 20 µm.

F~guuJt 4.2.

- 18 -

P°i

Schets van de meetcel. De wanden op y = 0 en y = L

zijn gasdoorlatend.

De rechthoekige meetcel uit figuur 4.2. wordt gevormd door de puntige

uiteinden van 4 beitels tegen elkaar te klemmen zoals in de twee onder­

staande foto1s (en in fig. 4.3.) is afgebeeld. De vier beitels worden in

een kunstofhouder (PVC) geklemd.

- 19 -

, I II' I. II"!" II I" "I'"'/" 1111111/1111I1111 /II II I'''' I'''' I'" 1111111111111111I111 1 'l:S1 2 3 4 5 6 · 7 8

Foto 1. Vier beitels met in het midden de meetcel.

Foto Z. Schets van 3 beitels in de houder. In de houder is aan

boven- en onderkant een canule om de meetcel te vullen

met vloeistof.

I

I

-·;r~ -;.=----+j) ' I \ I

--~---------.:..t--

F.igu.uJt 4. 3. a.

- 20 -

0

0

Links: gaskamer met toe en afvoer

Rechts: beitel met fibers en twee

canulen.

1 2

- - - - -IE ;ll1

~ 0.5mm 1~

02 02 I 1mm I

I I ,~

I I I ,- - - -I

3

4

Figu.U!l. 4. 3. b.

Voorzijde van de vier

beitels in uiteindelijke toe-

stand; in het centrum de diffusie-

kamer.

De vier wiggen zijn niet exact puntvormig, maar hebben een vlakke

zijde aan de voorkant, zodat er een rechthoekige ruimte overblijft als

de wiggen tegen elkaar geklemd zijn, deze ruimte is de meetcel; zie fi-

guur 4.3. Twee wiggen (no 1 en 3 uit fig. 4.3.b.) bevatten aan de voor-

kant, grenzend aan de rechthoekige ruimte, een gaskamer waar voordurend

gas doorheen kan warden geleid; over deze gaskamer is een teflonmembraan

- 21 -

gespannen. De twee andere Wiggen (2 en 4) bevatten glasfibers en een

ervan de p02-electroden. Deze zijn dan ook voorzien van een buffer­

oplossing via twee canulen grenzend aan de rij glasfibers (fig. 4.3.a.).

De glasvezels liggen niet over de volle lengte van de meetcel; dit van-

wege mogelijk ongunstige randeffecten. Dok over deze wig wordt een tef-

lonmembraan gespannen zodat er slechts een zeer dunne vloeistoffilm van

deze bufferoplossing achterblijft tussen membraan en p02-electroden.

Elke wig is aan het andere uiteinde vierkant gemaakt om draaiing om

zijn eigen as te voorkomen. Het rechthoekig meetkanaal wordt aan de twee

uiteinden afgesloten door een rubber dop waardoor via een canule de

vloeistof wordt ingebracht.

4 • 2 • Opw c.h '-' Y'-' :teem

De zuurstofsaturatie van de hemoglobine wordt bepaald aan de hand van

absorptiemetingen, verricht bij twee verschillende golflengten Ai en As.

De waarden van Ai en As zijn niet voor iedere Hb-oplossing dezelfde. In

de opstelling moet de golflengte dus instelbaar zijn. De instelling

voor Ai is tamelijk kritisch: de piek-golflengte moet precies in het

isobestisch (zie 3.2.) punt liggen en de bandbreedte, ~A, moet klein

zijn, zie figuur 4.4.

-/imax 1

0.5

0

I

I I

-1-. I I

F.lguUJt 4. 4. Frequentiekarakteristiek van de doorgelaten lichtbundel.

- 22 -

Met behulp van een monochromator met instelbare spleetbreedte (en

dus bandbreedte) wordt de monochromatische bundel voor A; gerealiseerd.

De bundel behorende bij As wordt verkregen met een interferentiefilter;

tiAs = 1-10 nm. Figuur 4.5. is een schematische weergave van het licht­

systeem.

F~guWL 4.5. Schema van de lichtkanalen.

Als lichtbron gebruiken we een Hg-Xe booglamp (Oriel, model 6158).

De lichtbundel afkomstig van de lamp wordt d.m.v. een glasplaatje ge­

splitst: het grootste deel (90 %) gaat naar de monochromator en slechts

een klein gedeelte naar het interferentiefilter. Seide lichtbundels wor­

den periodiek onderbroken door middel van een roterende vlinder (chopper)

en daarna m.b.v. een lenzenstelsel geconcentreerd op de glasfibers, zodat

de fibers monochromatisch licht doorzenden afwisselend met golflengte Ai

en As. Een fotodiode detecteert de doorgelaten lichtbundel.

Om variaties in de intensiteit van de ingaande monochromatische

bundels te meten, wordt een klein gedeelte (± 10 %) van de bundels d.m.v.

glasplaatjes afgesplitst naar detectoren. Deze leveren referentiesignalen

I0

en 101 op voor beide kanalen. De signalen van de drie detectoren wor­

den naar een electronisch detectiesysteem geleid waar voor beide kleuren

de absorptie bepaald wordt.

- 23 -

4 • 3 • Elecilto YLl6 c.h detectiu y.td.eem

De electrodestroom ie' die ontstaat door reductie van zuurstof aan

de kathode is van de grootte-orde 10-9 ampere. De electrodestroom wordt

in een po2 versterker omgezet in een spanning volgens onderstaand schema:

V= - i R + V e pol.

vpol.

0 0

FigULllL 4.6. Principe schema van de po2-versterker.

De operationele versterker A heeft de volgende eigenschappen:

1. een te verwaarlozen kleine biasstroom (< 10- 14 A);

2. grate signaal-ruis-verhouding; de eigenruis van de versterker is

minder dan 10 µV.

De uitgansspanning van de operationele versterker A is: VA= -ie.R + Vpol'

Na compensatie voor de polarisatiespanning, Vpol' is de uitgangsspanning

(grootte-orde: 1 volt) evenredig met de electrodestroom ie.

- 24 -

4.3.2. Sa.tuJr..a.,tleme-tlng

Het signaal van de fotodiode die het getransmitteerde licht meet,

wordt naar twee fasegevoelige versterkers (ook wel Lock-in-Amplifier

genoemd) geleid. Elke fasegevoelige versterker heeft als referentie­

signaal een blok-spanningssignaal dat afkomstig is van de chopper-unit

en dezelfde frequentie heeft als die waarmee de lichtbundels onder­

broken warden. Het principe van een fasegevoelige versterker is:

1. het ingangssignaal wordt vermenigvuldigd met het referentiesignaal;

2. alleen de gelijkspanningscomponent van dit product wordt versterkt

(laagdoorlaatfilter). In formule

A sin w0 t x [s sin (w0 t + 0) + Ci (sin wit) J

ref. meetsignaal ruis

=~cos 0 + ~ cos(2w0 t + 0) + F(t)

Alleen de gelijkspanningscomponent ~cos 0 passeert het laagdoorlaat­

filter. Het faseverschil 0 is afhankelijk van de positie van de chopper­

schijf t.o.v. de lichtbundel(s) en van de instelbare fasedraaiing van

de fasegevoelige versterker.

De chopperschijf is zodanig gepositioneerd dat de beide meetsignalen

(Ai en As) t.o.v. elkaar ongeveer 90° in fase verschillen; dit is

schematisch weergegeven in figuur 4.7.

- 25 -

-------·---

b Ref. As

a As

a A· I

b Ref. A. I

~t F.lg u.uJt 4 • 7 • a) Meetsignalen voor Ai en As;

b) Referentiesignalen.

Bij elke versterker is de fase van het referentiesignaal z6 ingesteld

dat ~ = 90° voor een van beide meetsignalen. Het resultaat is dat elke

versterker ongevoelig is voor een kleur, en de maximale gevoeligheid

heeft voor de andere kleur. Elke versterker geeft dus de intensiteit

van een golflengte.

We krijgen dus 4 signalen: voor iedere A een referentiesignaal (I0),

gemeten door de referentiediode, en de doorgelaten lichtintensiteit (I).

Van deze 4 signalen wordt de logaritme genomen en daarna warden de twee

signalen behorende bij een A naar een verschilversterker geleid. Aan de

uitgang van deze verschilversterker vinden we dus voor Ai:

IA. 1 =logy:-:-- = E3.[Hb].d

OA. 1

voor As: log IA - log IOA = (E1S+{l-S)E2) [Hbt].d s s

De uitgangssignalen van de verschilversterkers warden op elkaar gedeeld;

het uiteindelijke signaal is evenredig met de verzadiging S (zie 4.4. en

6. 2.).

IR

- 26 -

4 • 4 • T o.:ta.le meeA:o p.6tei.Ung

rn-figuur 4.8. is een schets gegeven van de totale meetopstelling.

De lichtbundel afkomstig van de lamp is een evenwijdige bundel (te re­

aliseren m.b.v. een convergerende lens in het lamphuis). Na een warmte­

filter wordt de bundel gesplitst. De twee evenwijdige bundels worden ge­

convergeerd om nauwkeuriger onderbroken te kunnen worden door de micro­

chopper (0 schijf: 3 cm). Met behulp van een spiegel en een cylindrische

lens worden de bundels op de fibers gericht. Na absorptie en verstrooiing

door het monster wordt een klein gedeelte van de ingaande bundels ge­

detecteerd. Voor de detectie zie 4.3.

M

A-=588

f=50 L

L L

A.=578 nm f=25 f=50 cm

D

Figuur 4.8a. Schematische weergave van de lichtkanalen.

Li = lichtbron M =monochromator

IF = interferentie-filter L = lens

D = fotodiode f = brandpuntafstand

L Cil. = cilindrische lens

IR = infra-rood filter

g = glasvezel

Ch = chopper

M

F

D

Driver

Ei.gu.uJt 4. 8. b.

I OAi

90° L.1.

L. I.

Schema totale meetopstelling

log

log

I

" .......

- 28 -

5. IJK1NGEN, RESULTATEN

De drie micro-electroden van een beitel zijn afzonderlijk geijkt in

water. Na ongeveer 2 uren polariseren heeft de electrodestroom een

stabiele waarde bereikt.

Van de electroden zijn stroom-spanning karakteristieken gemeten

en ijklijnen bepaald. Een ijklijn geeft bij bepaalde polarisatie-

spanning het verband tussen de gemeten electrodestroom ie en de aan­

gelegde zuurstofspanning p02.

De p02

wordt gevarieerd door de samenstelling van het gas in de

beitels te veranderen d.m.v. een gasmengpomp. De electrodestroom ie

wordt gemeten nadat deze een stabiele waarde heeft bereikt. De elec­

tr~destroom ie is recht evenredig met het uitgangssignaal (Ve) van

de p02-versterker (zie 4.4.1.).

In figuur 5.1. is de ijklijn weergegeven van een micro-p02-elec­

trode gemeten bij Vpol = 800 mV. Er blijkt een lineaire relatie tus­

sen ie en p02 te warden gevonden. De getekende rechte is bepaald

m.b.v. lineaire regressie; de correlatiefactor is 0,9996. Het ruis­

niveau van iedere meting is kleiner dan 0,05 kPa en de electroden ver­

tonen een drift van minder dan 0,1 kPa per uur. De electroden hebben

een responstijd (90 % van de eindwaarde) van minder dan 1 sec en zijn

dus voor ans doel (~po2 = 10 kPa in een uur) snel genoeg.

De electrische isolatie van de micro-electroden bleek bij de huidige

constructie van de beitel echter na verloop van tijd slecht te warden,

waardoor er een 11 lek 11 -stroom ontstaat. De po2-meting werd oak instabiel.

Mogelijk is dit te wijten aan de inwerking van chemicalien (fosfaat­

buffer, petroleumether of Trichloorethyleen) of water op de

kunststofbeitel of op de gebruikte lijm. Gebruik van ander materiaal

en/of andere verlijming is voor een stabiele po2-meting noodzakelijk.

- 29 -

p02-IJkingen in Hb-oplossingen zijn nog niet verricht. Het is te ver­

wachten dat de ijkingen onafhankelijk zijn van het monster omdat de elec-

trade altijd in zijn eigen milieu meet: bufferoplossing + membraan; 98 a 99 % van de po

2-gradient staat over het teflonmembraan + bufferoplossing.

-9 . De electrodestroom bedraagt bij p02 = 10 kPa: 2,4.10 A. D1t komt

-15 -overeen met 6.10 mol o2 per sec (4e + o2 + H 20~40H ). De flux door

het laagje Hb-oplossing bedraagt bij (de}oxygenatie van 0,1 mol/l in

-13 30 min: 5.10 mol o2 per sec. De consumptie van zuurstof door de elec-

trode is te verwaarlozen t.o.v. de totale flux,(bij grotere [Hb] neemt

de o2

flux toe; consumptie is dan relatief kleiner).

De lichtintensiteit in homogeen medium wordt gegeven door de wet

van Lambert-Beer:

waarin s = extinctiecoefficient

c = concentratie

d = laagdikte

De absorptie is gedefinieerd als log Io = scd = log I0 - log I. r

Het optisch systeem is geijkt bij twee golflengten: 650 nm en 595 nm.

Het doel hiervan was, controle van het lineair berband tussen de loga-

ritme van het signaal gemeten door de fotodiode (I) en de concentratie (C).

De [Hb] van de afzonderlijke monsters werd bepaald met behulp van

een double beam spectrofotometer (Perkin-Elmer model 124) (0,1 m mol/l

< [Hb] < 3 m mol/l). De intensiteit van de lichtbundel is zowel v66r

(= I ) als na absorptie (= I) gemeten. De intensiteit v66r en na absorptie 0

wordt logaritmisch geconverteerd (zie appendix B). Het resultaat van

- 30 -

de ijking (voor A = 598) is gegeven in figuur 5.2. De gemeten ab­

sorptie is uitgezet tegen de [Hb] van het monster. De rechte lijn

is verkregen met lineaire regressie; correlatiecoefficient: 0,999.

De ijking is oak uitgevoerd voor A = 650 nm; bijbehorende correlatie­

coefficient = 0,998.

De conclusie is dat het absorptiesignaal na logaritmische conversie

inderdaad evenredig is met de concentratie Hb.

Wegens het defect raken van de p02-electroden (zie 5.1.) zijn er

slechts enkele zuurstofbindingscurven gemeten. De eerder vermelde in-

stabil iteit van de p02-electrode is ontstaan voordat het optisch systeem

volledig was ont~ikkeld, d.w.z. de zuurstofbindingscurven zijn gemeten bij 1

golflengte zonder referentiekanaal. We9ens tijdgebrek was het in dit af­

studeeronderzoek niet mogelijk om nieuwe beitels met p02-electroden

te maken.

De curve van figuur 5.3. is gemeten met een stabile p02-electrode,

echter met een onvolledig optisch meetsysteem.

De totale meettijd bedraagt ongeveer 15 minuten. De onnauwkeurig­

heid in de meting van de saturatiecurve wordt hoofdzakelijk bepaald

door de ruis in het saturatiesignaal {alleen ruis in verticale rich­

ting). Het optisch meetsysteem is daarna belangrijk verbeterd (zie 5.4.).

In de literatuur zijn geen zuurstofbindingscurven vermeld die onder

deze condities {fig. 5.3.) gemeten zijn. Wel is de p50 bekend onder

deze condities (Breepoel, 1981), nl. 1,9 kPa. p50 is de p02 waarbij

S = 0,5. De p50 is een indicatie voor de zuurstofaffiniteit van de

hemoglobine en voor de ligging van de zuurstofbindingscurve. Er is

dus goede overeenstemming tussen experiment en literatuur gegegevens.

- 31 -

4 •

0 0 5 10 15 20 p0

2 (kPa)

Figuur 5.1

E

1

0.5

00

IJking micro-po2-electrode.in water. V 1 = 800 mV. po .

T = 20°C. Correlatiefaktor : 0,9996

•

/ / . •

1 2 3 [H~ (m.mol;I.)

Figuur 5.2 Gemeten extinctie als functie van de

hemoglobineconcentratie .. .l= 598 nm . .1.1.= 1 nm.

Correlatiecoefficient : 0,999

1

s

05

1

s

- 32 -

2 4 6 8 10 p02 (kPa)

Figuur 5.3 Saturatiecurve van runderhemoglobine.

Gemeten bij : pH = 6,8 T = 20° C

Hb = 1 m mol/l. s.As = 650 nm.

0.5 - - - - - - -

I I I I I 0.1 - - - - - - - - -1- - ---- - - - -

0 I

0 8 2 t 90 4 6

t (min.)

Figuur 5.5 Oeoxygenatie en oxygenatie van runderhemoglobine.

Hb = 0,078 m mol/1. KCl = 0,5 mol/1. T = 20°c.

- 33 -

Hoewel de getoonde curve onnauwkeurig is, kan geconcludeerd warden,

dat men in principe met deze opstelling zuurstofbindingscurven kan

meten: beide onafhankelijke meetsystemen (p02 en S) zijn tegelijker­

tijd getest en geven (binnen meetonnauwkeurigheid in S) reproduceer­

bare resultaten.

5.4. Oxygena;tle en deoxygena;tie.tijd a1...6 nunc;t,i_e van [KCl] en [Hb]

Na optimalisering van het fotometersysteem zijn er een aantal (de)­

oxygenatie-experimenten verricht.

Bij een Serie experimenten is de invloed van de zoutconcentratie,

[KCl] op de (de)oxygenatietijd gemeten (fig. 5.7.). Bij de tweede serie

is de oxygenatietijd als functie van [Hb] gemeten.

Figuur 5.5. geeft het verloop van de saturatie tijdens een deoxy­

genatie- resp. oxygenatieproces. De saturatie is bepaald uit de ver­

houding van de absorpties bij twee golflengten As en Ai (zie 3.2.:

meetprincipe). Ieder experiment is twee keer verricht; de onderlinge

verschillen in oxygenatie- en deoxygenatietijden is minder dan 2 %.

Uit vergelijking van figuur 5.3. met figuur 5.5. blijkt dat saturatie­

metingen m.b.v. 4 lichtkanalen aanzienlijk nauwkeuriger zijn dan met

1 kanaal; de ruis in betreffende metingen is 4 a 5 % resp. 1 %.

In figuur 5.6. zijn de resultaten vermeld van 5 verschillende ex­

perimenten, nl. met [KCl] is 0 - 0,01 - 0,05 - 0,1 en 0,5 mol per

liter. Verticaal is uitgezet de tijdsduur voor 50 % en 90 % deoxyge­

natie, t 50 en t90 • Horizontaal is p50 uitgezet. Stijgende zoutcon­

centratie verlaagt de zuurstofaffiniteit van hemoglobine en verhoogt

de p50 (Breepoel, 1981). Verlaging van de zuurstofaffiniteit betekent

een snellere deoxygenatie. Kwantitatieve interpretatie is (nog) niet

mogelijk, omdat er geen literatuur gegevens zijn omtrent de relatie

tussen deoxygenatietijd en p50 , zowel theoretisch als experimenteel.

500 t (s)

400

300

200

100

- 34 -

Figuur 5.6 Deoxygenatietijden t 50 en t 90 als functie van de P50 .

0.5

100 200 300 400 t (s)

Figuur 5.7 Oxygenatietijden t 50 en t 90 als functie van de

hemoglobineconcentratie.

- 35 -

In figuur 5.7. is de oxygenatietijd uitgezet tegen de [Hb]. Het

verband tussen oxygenatietijd en [Hb] kan afgeleid warden uit de

advancing front theory (Spaan, 1973). Deze theorie geeft een benade-

ring voor de plaats van het oxygenatiefront in de oplossing. Uit­

gangspunten zijn: een scherpe overgang tussen de volledig geoxyge­

neerde hemoglobine en de hemoglobine met initiele verzadiging S en

een recht o2-profiel; zie figuur 5.4. en figuur 4.2.

Voor een stilstaande laag kan het verband tussen [Hb] en oxygenatie­

tijd als volgt warden afgeleid:

Totale hoeveelheid o2 in de oplossing:

Zuurstofflux door permeable wand is gelijk de toename van de hoeveel-

heid o2 in de oplossing:

-o0 .P0

= x(t).~~(t) O P0

a0 + k.CHb} 2 2

1 d{x(t)}2 = 2 dt {~po aO + k.CHb}

2

CHb = Hb-concentratie

p0

= partiele zuurstofspanning

ao = oplosbaarheidscoefficient 02 2

x(t) = breedte van het o2-profiel.

k.x(t) = afstand van het Hb02 front tot x = 0 (evenredigheidsconst. k).

- 36 -

Uit bovenstaande formule volgt een lineair verband tussen [Hb] en

de tijd waarop het front een bepaalde plaats x(t) bereikt (d.i. een

maat voor de oxygenatietijd).

Uit figuur 5.7. blijkt, vanwege het lineair verband, een goede

overeenkomst tussen experiment en advancing front theory.

1--------~

s

< x(t) ) 0 +-(-----..,:---:-:---~)

k.x(t)

F,i,g. 5. 4. o2 en Hb02 profi e 1 vo 1 gens advancing front theory.

- 37 -

6. V1SCUSSIE

6.1. Mee.tme.:thode, mee;tn.a.uw~eu/Ughe,,i,d

De bepaling van de zuurstofverzadigingsgraad aan de hand van ab­

sorptiemetingen bij 2 golflengten en 4 lichtbundels geeft een belang­

rijke verbetering in de signaal-ruis-verhouding t.o.v. absorptiemetin­

gen bij 1 golflengte en 1 of 2 lichtbundels.

Verstoringen door variaties in de lichtsterkte en de hemoglobine­

concentratie worden geminimaliseerd.

Hoewel de meetopstelling niet gethermostatiseerd is, blijkt zowel

de saturatie als de gemeten zuurstofspanning weinig drift te vertonen

als gevolg van temperatuurveranderingen; voor beide signalen is de

drift in een uur kleiner dan 0,5 %.

De micro-electroden worden na verloop van tijd instabiel, waarschijn-

1 ijk t.g.v. slechte isolatie. Bij goede isolatie voldoen de gebruikte

micro-po2-electroden aan vereiste meetnauwkeurigheid.

Zoals eerder vermeld, bevat de diffusiekamer twee gasdoorlatende

wanden (teflon-membraan). De diffusiekamer, in perspectief weergege­

ven in figuur 6.1. heeft de afmetingen ~ x 1 x 12 mm; de wanden

waardoor gasuitwisseling met de omgeving plaatsvindt, hebben de af­

metingen 1 x 12 mm.

In figuur 6.2. is de voorzijde van een beitel met gaskamer en

van een beitel met glasvezels getekend. In de tekening is te zien dat

de gaskamer (lengte 9,5 mm) wegens constructietechnische redenen

korter is dan de meetcel (lengte 12 mm); in de meetcel zijn er dode

ruimten met betrekking tot de gasuitwisseling met de omgeving.

1 mm

/ /

/ /

/ /

( ) 0.5 mm

- 38 -

/

A B

FiguuJt 6.Z. A: Perspectief-tekening meetcel

B: Voorzijde van een beitel met gaskamer (links)

en van een beitel met p02 electroden en glas­

fibers (rechts).

Hierdoor zou men kunnen verwachten dat de responstijd voor een stap­

vormi ge verandering van de po2 in de gasfase, in het midden van de

meetcel kleiner is dan die aan de randen.

Om het effect van de dode ruimte te kunnen meten, zijn er tussen

de glasvezels op verschillende plaatsen po2-electroden aangebracht.

Bij een stapvormige verandering van de po2 in de gasfase is op Z pla.a.:t.l>en

gelijktijdig het verloop van de p02 in de Hb-oplossing gemeten: in

het midden en op 2,5 mm afstand tot het midden (afstand tussen canule­

buisjes: 7 mm). Bij experimenten met een (de)oxygenatie van 10 minuten

- 39 -

of meer zijn er geen meetbare verschillen gemeten tussen de zuurstof­

spanningen gemeten door beide electroden.

Bij huidige constructie van de meetcel kan de meettijd voor 1

saturatiecurve 1 uur bedragen (sterk afhankelijk van [Hb] en p50 ).

Indien men een saturatiecurve sneller wil meten, zou men de afmetingen

van de meetcel in diffusierichting kunnen verkleinen; d.w.z. de voor­

zijde van de p02-beitels smaller maken. De afstand tussen de o2-permeabele

wanden wordt namelijk bepaald door de beitels met glasvezels.

Een van de eisen aan de meetopstelling is, dat ook van geconcenteer­

de hemoglobine-oplossingen de zuurstofbindingscurve gemeten kan warden.

Naarmate de [Hb] toeneemt, wordt het transmissiesignaal zwakker en

stijgt de diffusietijd voor het laagje Hb-oplossing.

Het meetsignaal van de fotodiode blijkt voor 620 <A< 800 nm ruim

voldoende om nauwkeurig de saturatiegraad te kunnen meten van Hb­

oplossingen met Hb-concentratie van 3 m mol/l.

De p02 en de saturatie warden gemeten waar de gradienten van o2 en

S minimaal zijn, namelijk in het midden van het laagje. De nauwkeurig­

heid van de saturatiemeting wordt mede bepaald door de saturatie­

gradient ter plaatse van de glasvezels. Voor het afschatten van de max.

gradient in S die er tijdens het deoxygenatieproces over de glasvezels

staat, kiezen we als uitgangspunt dat een laagje met [Hb] = 3 m mol/l

in een uur tijd gedeoxygeneerd wordt.

(

- 40 -

0.5mm

65um glasvezel

FiguuJL 6.3. Hb02-gradient in de oplossing.

)

De zone preci es in het midden van de meetce 1 (fig. 6. 3.) wordt

gedeoxygeneerd t.g.v. diffusie van o2 en Hb02. De Hb02 diffusie levert

in deze situatie de belangrijkste bijdrage {advanding front theory).

De deoxygenatie van deze zone wordt bepaald door de Hb02-gradient

langs de rij glasvezels.

Hb02 flux bij de fiberranden is:

JHbO -DHbO d [Hb0 2]

= dx 2 2

-2.10-7. d [Hb02]

( m21 ) = dx cm .s

[Hb] = 3 mM +per cm3: 3.10-6 mol Hb.

Flux per cm2 oppervlak is gelijk aan Hb02-afname per seconde.

afname per sec: 3.10-6 mol Hb per cm3 3600

In volume-element met afmetingen: 70 µm x 1 cm x 1 cm [Hb02] afname:

3.10-6 4 · 70.10- mol Hb per sec. 3600

- 41 -

Dit is gelijk aan 2 x de Hb02-flux:

X 3.70 .

10-10 -7 d [Hb02] mol

2 jO"Q'O" = +2.lO dx 2 cm .s

d [Hb02] -3 + dx = 0,015.10

mol cm4

+ Concentratiegradient: 15.10-6 mol 15.70.10-lO lllO~ over 70 µm cm4 = cm

= 10-7 mo~ over 70 µm cm

= 10-4 ~over 70 µm = 0,1 m mol

over 70 µm

= 0,05 mM over 35 µm.

Op grand van deze ruwe afschatting is er in de zone tussen de fibers

een saturatieverschil van 1 a 2 %.

- 42 -

7. CONCLUSIES, VOORTZETTING VAN HET ONVERZOEK

Met betrekking tot de gestelde eisen heeft de ontwikkelde opstelling

voor meting van zuurstofbindingscurven de volgende eigenschappen:

1. de benodigde monsterhoeveelheid is klein (6 µl);

2. er kan gemeten warden in geconcentreerde hemoglobine-oplossingen

([Hb] = 3 m mol/liter);

3. de meettijd voor een saturatiecurve (deoxygenatie + oxygenatie)

van een oplossing met [Hb] = 3 m mol/l en [KCl] =0,5 mol/l bedraagt

een uur.

Voor lagere Hb-concentraties is de meettijd minder dan een uur. Met

behulp van micro-po2-electroden kan men de p02 in het monster nauwkeurig

(0,05 kPa) meten. De metingen zijn goed reproduceerbaar (relatieve af­

wijking < 1 %). De electrische isolatie van de p02-electroden ver­

slechtert na verloop van tijd; mogelijk is dit te wijten aan de in­

werking van chemicalien op de isolatie.

Absorptiemetingen verricht bij twee golflengten en 4 lichtkanalen

geven een aanzienlijke verbetering in de signaal-ruis-verhouding t.o.v.

metingen verricht aan een of twee lichtkanalen.

Er zijn zuurstofbindingscurven gemeten in een situatie waarin het

optisch systeem slechts gedeeltelijk gebruikt is (een golflengte, zon­

der referentie). Oxygenatie- endeoxygenatie-experimenten tonen aan dat

met de volledige opstelling de meting van de saturatie veel nauwkeuriger

kan.

Dit onderzoek zal verder voortgezet warden binnen de afdeling Fysio­

logie van de Katholieke Universiteit te Nijmegen. De voortzetting zal

in eerste instantie gericht zijn op het (opnieuw) fabriceren van micro-

- 43 -

p02-electroden en het meten van zuurstofbindingscurven.

Suggesties voor andere experimenten zijn:

- Het meten van de invloed van bijvoorbeeld pH, temperatuur, zout­

concentratie, pC02 op de p50 en op de ligging van de zuurstofbindings-

curve.

- Het doen van experimenten waarbij de meetcel slechts een gasdoorlatende

wand heeft. Door het tijdsverloop van p02 en S te meten na stap-

vormige verandering van de P0 aan de gasdoorlatende wand kunnen theo-2

retische zuurstof- en saturatieprofielen (Spaan, 1976) geverifieerd

worden.

In toekomstig onderzoek kan de mogelijkheid bestudeerd worden om

gelijktijdig pH-meting te verrichten en zuurstofbindingscurven van bloed

te meten. Hierdoor kan het meten van zuurstofbindingscurven ook in de

kliniek van toepassing zijn.

- 44 -

APPENVIX A: Invloed van de bandblteeclte van de monochJr.oma..tl6che Li.ch,t-

bu.ndel op de Li.ne.aJU;te,lt van de notomde.Jt

De bandbreedte vanhetmonochromatisch licht uit kanaal met golf­

lengte As is afhankelijk van het interferentiefilter; de gebruikte

interferentiefilters voor A = 578 nm en A = 650 nm hebben een band-

breedte van respectievelijk 3 nm en 6 nm. Omdat het verschil tussen de

extinctiecoefficienten EHb en EHbO afhankelijk is van A, zie figuur A-1, 2

is de extinctie niet exact l ineair met de saturatie S. Onderstaande be-

rekening geeft een schatting van de fout in de meting van S, als men

veronderstelt dat de extinctiecoefficient evenredig is met S.

10 -- -------- £ *

5

0 542 578

A (nm)

Figu.Wt A-7. Absorptiekarakteristiek van hemoglobine met

S = 0, 20, 40, 60, 80 en 100 %.

- 45 -

De totale intensiteit gemeten door de fotodiode is:

(1)

(2)

waarin I0

(A) = emissiespectrum van de lichtbron

g(A) = responskarakteristiek van de fotodiode

c = concentratie

d = laagdikte

E = extinctiecoefficient

Als ~E geen functie is van A, dan is de extinctie evenredig met S:

deze term is onafhankelijk van S

Als ~E = ~E(A), dan vervangen we ~E door de som van een constante term

E* en een correcti~eterm oE: ~E = E* + oE.

Schrijven we h(A) voor I0

(A)9(A), dan wordt formule (2):

I = J h (A)exp(-cdEHb) exp (-cdE*.S)exp(-cdoE.S)dA

~A

= exp(-CdE*.S) f h(A)exp(-CdEHb)exp(-cdoE.S)dA oA

(4)

(5)

- 46 -

£Hb is ongeveer 40.106 cm2/mol Hb (in fig. A.1. is£ in cm2/mol Fe)

6£ is 24.106 cm 2/mol Hb

0£ < 4.106 cm2/mol Hb

eds 0£ < 0,03 voor [Hb] < 0,5 m mol/l.

De laatste e-macht uit formule (4) is te benaderen door:

1 - cdSo£ (fout in benadering: 1 °100).

De formule voor de intensiteit wordt:

I = exp(-cdS£*)J h(A)exp(-cd£Hb) (1-cdSo£}dA 6A

Stel we nemen de maximale waarde voor 0£ (= 4.106 cm2/mol Hb) dan is

cdSo£ = 0,03 s

Stel J h(A)exp(-cd£Hb)dA = i0, dan wordt de intensiteit: 6A

log I = - 0,434 cdS£* - log i0

+ log (1-0,03 ,$)

Een goede benadering voor log (1-0,03;S) is 0,434 (-0,03 S) (fout: 0,5 °/oo).

De gemeten extinctie, log I, blijkt dus in zeer goed benadering even­

redig te zijn met de saturatiegraad S. Voor A = 650 nm geldt een ana­

loge beschouwing.

Ref . .As

-r-------'--__J L. I. r-----:-1 ___ -J log

goo

H20~al0 Hb ~al 1o(-Ecd)

0

L.1. r----------1 log

log

I log a/

0

rY".:=~.ltV:r:~ I I

----..-""L ,......, I I I

logal0 - ECd

I I I

I I -,....~.....:.l_,j~/ I

I I L _________ j

- 48 -

APPENV1X C: SpecA.6iccttie appaJta..tu.u.Jt

Lichtbron:

Monochronometer:

Hg-Xe booglamp, 200 W. Oriel, model 6291;

continu emissie-spectrum: 0,03 W/nm.

Oriel, model 7240

Spleetbreedte

280 µm

120 µm

50 µm

bandbreedte

2 nm

1 nm

0,5 nm

Interferentiefilters: Type: Balzers

Fotodiode:

L.I. Amplifiers:

Chopper:

/.. = 594, 650 nm

United Detector Technology. Type: Pm - lODFP

Lineaire output: 10- 11 W tot 10-3 W

Frequentie respons: 15 MHz

Gevoeligheid: 0,1 µA/µW.

Princeton Applied Research, model 5101

Gevoeligheid: 1 µV - 250 mV

Tijdconst: 1 ms - 30 s

Rofin, type 7510

8-delige chopperschijf; 20 Hz < f < 2 kHz.

- 49 -

REFERENTIES

BERNARDS, J.A., L.N. BOUMAN: Fysiologie van de mens, 3e druk, 1979 Bohn, Scheltema en Hlkema, Utrecht, 1979, Oosthoek's Uitgevers­maatschappij B.V.

BOLDT, M., K. HARBIG, G. WEIDEMANN, D.W. LUBBERS: A sensitive dual wavelength microspectrophotometer for the measurement of tissue fluorescence and reflectance. PflUgers Arch. 385: 167-173, 1980.

BREEPOEL, P.M., F. KREUZER, M. HAZEVOET: Interaction or organic phosphates with bovine hemoglobin. PflUgers Arch. 389: 227-235, 1981.

CLERBAUX, Th.: Methodes pur determiner la courve de dissociation de l'hemo­globine. Bull. europ. Physiopath. resp . ...!£.: 487, 1976.

DOLMAN, D., S.J. GILL: Membrane-covered thin-layer optical cell for gas­reaction studies of hemoglobin. Anal. Biochem. 87: 127-134, 1978.

DUVELLEROY, M.A., R.G. BUCKLES, S. ROSENKAIMER, C. TUNG, M.B. LAVER: An oxyhemoglobin dissociation analyzer. J. Appl. Physiol. 28: 227, 1970.

ELIOT, R.S., H. MIZUKAMI: Oxygen affinity of hemoglobin in persons with acute myocardial infarction and in smokers. Circulation 34: 331-336, 1966.

GOLDSTEIN, S.R., G.I. PETERSON, R.V. FITZGERALD: A miniature fiber optic pH sensor for physiological use. J. Biochem. Engin. 102: 141, 1980.

IMAIZUMI, K., K. IMAI, I. TYUMA: On the validity of the spectrophotometric determination of oxygen saturation of hemoglobin. J. Biochem. 83: 1707-1713, 1978.

KIMMICH, H.P., F. KREUZER: Catheter p02 electrode with low flow dependency and fast response. Respir. Physiol. l= 100-110, 1969.

De KONING, J., G. GIJSBERS: Gefaciliteerd transport van zuurstof door een hemoglobine of myoglobine film. Afstudeerverslag, T.H.E., 1974.

KREUZER, F., L.J.C. HOOFD: Facilitated diffusion of oxygen in the presence of hemoglobin. Respir. Physiol. _!! :280-302, 1970.

KREUZER, F., Z. TUREK: Influence of the position of the oxygen dissociation curve on the oxygen supply to tissues. In: High Altitude Physiology and Medicine, vol. I; W. Breugel and R.A. Zink {eds.), series Topics in Environmental Physiology and Medicine, Springer Verlag, New York, 1981.

- 50 -

LANDSMAN, M.L.J. et al.: A fiberoptic reflection densitometer with cardiac output calculator. PflUgers Arch. 379: 59-69, 1979.

PERUTZ, M.F.: X-Ray analysis of hemoglobin. Science 140: 863-869, 1963.

SCHOLANDER, P.F.: Oxygen transport through hemoglobin solutions. Science 131: 585-590, 1960.

SICK, H., K. GERSONDE: Theory and application of the diffusion technique for measurement and analysis of o2-binding properties of very autoxi­dizable hemoproteins. Anal. Biochem. 47: 46-56, 1972.

SPAAN, J.A.E.: Transfer of oxygen into haemoglobin solution. PflUgers Arch. 342: 289-306, 1973.

SPAAN, J.A.E.: Oxygen transfer inlayers of hemoglobin solution. Dissertatie, T.H.E., 1976.

WEAST, R.C. et al.: Handbook of Chemistry and Physics. The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, U.S.A., 1978/79

WILLARD, MERRIT and DEAN: Instrumental Methods of Analysis. 5th edition. D. van Ostram Company, New York, 1974.

WITTENBERG, J.B.: The molecular mechanism of hemoglobin facilitated oxygen diffusion. J. Biol. Chem. 241: 104-114, 1966.

WOODSON, R.D.: o2 Transport: DPG and Pso· A.T.S. News, 3,. 2, 22, 1977.