UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

NÚCLEO DE PESQUISAS EM ONCOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ONCOLOGIA E CIÊNCIAS MÉDICAS

BELÉM-PA

2016

ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE BIOMARCADORES DO

ENVELHECIMENTO (TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) COM

A CAPACIDADE FUNCIONAL DE IDOSOS

Esdras Edgar Batista Pereira

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

NÚCLEO DE PESQUISAS EM ONCOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ONCOLOGIA E CIÊNCIAS MÉDICAS

BELÉM-PA

2016

ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE BIOMARCADORES DO

ENVELHECIMENTO (TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) COM

A CAPACIDADE FUNCIONAL DE IDOSOS

Autor: Esdras Edgar Batista Pereira

Orientador: Prof. Dr. Sidney Emanuel Batista dos Santos

Orientador: Prof. Dr. Ney Pereira Carneiro dos Santos

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Oncologia e Ciências Médicas, área de

concentração: Medicina I, do Núcleo de Pesquisas em

Oncologia, da Universidade Federal do Pará como

requisito para obtenção do título de Mestre em

Oncologia e Ciências Médicas.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

Biblioteca do Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB/UFPA)

Pereira, Esdras Edgar Batista, 1988 -

Associação de polimorfismos de biomarcadores do envelhecimento (TP53, MDM2,

UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) com a capacidade funcional de idosos / Esdras Edgar

Batista Pereira; Orientador, Profº. Drº. Sidney Emanuel Batista dos Santos; Co-orientador:

Profº. Drº. Ney Pereira Carneiro dos Santos. — 2016.

Dissertação (Mestrado) — Universidade Federal do Pará, Núcleo de Pesquisa em

Oncologia, Programa de Pós-Graduação em Oncologia e Ciências Médicas, Belém,

2016.

1. Polimorfismo Genético. 2. Biomarcador. 3. Envelhecimento. 4. Idoso Fragilizado. I.

Título.

CDD - 23. ed. 576.54

FOLHA DE APROVAÇÃO

Esdras Edgar Batista Pereira

Associação de Polimorfismos de Biomarcadores do Envelhecimento (TP53, MDM2, UCP2,

HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) com a Capacidade Funcional de Idosos.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Oncologia e Ciências Médicas, área de

concentração: Medicina I, do Núcleo de Pesquisas em

Oncologia, da Universidade Federal do Pará como

requisito para obtenção do titulo de Mestre em

Oncologia e Ciências Médicas.

Defesa: 30/05/2016

Banca Examinadora

Prof. Dr. Sidney Emanuel Batista dos Santos

Instituição: Universidade Federal do Pará Assinatura:_________________________

Profa. Dra. Márcia Consentino Kronka Sosthenes

Instituição: Universidade Federal do Pará Assinatura:_________________________

Profa. Dra. Luciana Gonçalves Quintana

Instituição: Universidade Federal do Pará Assinatura:_________________________

Prof. Dr. Erik Arthur Cortinhas Alves

Instituição: Universidade do Estado do Pará Assinatura:_________________________

Dedico esse trabalho aos meus pais, Milton

Miranda Pereira e Edna Eliana da Silva

Batista, que sempre estiveram ao meu lado.

Não mediram esforços para minha educação.

Esdras Edgar Batista Pereira

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus, que me permitiu chegar até aqui, me concedendo

força e sabedoria para continuar, guiando-me segundo a Sua vontade, que sempre é boa e

agradável.

À minha família, que sempre me incentivou, lutando, dia após dia. Principalmente aos

meus pais, meu porto seguro, que não mediram esforços na minha educação. Meus heróis.

À Kleyce Belo, pelo amor, amizade, fidelidade, cumplicidade e apoio incondicional.

Pelas Palavras no momento certo, que sempre me deram ânimo e discernimento em dias

difíceis. Um presente de Deus. Obrigado por me fazer presente em suas orações.

Aos meus orientadores Prof. Dr. Sidney Santos e Prof. Dr. Ney Santos, por terem

assumido esse compromisso pedagógico. Pela compreensão com as minhas dificuldades e

pelos desafios lançados objetivando meu crescimento profissional. Serei eternamente grato.

Aos meus amigos do NPO, Antonio Modesto, Renato Pamplona, Darlen Carvalho,

Gabriela Esteves, Roberta Borges, Karla Cereja, João Carvalho, Marianne Fernandes, Diego

Ferreira, Ellen Moreno, Luciana Colares, Juliana Carla. Vocês foram fundamentais nesse

processo. Sou grato a cada um por todo apoio. A trajetória foi mais leve com vocês por perto.

Ao Hospital Universitário João de Barros Barreto, pelo apoio a pesquisa.

Principalmente a toda equipe no Laboratório, em especial a Eloisa Ribeiro, pelo apoio e

dedicação para auxiliar no desenvolvimento da pesquisa. Deus te abençoe Elo.

Ao Laboratório de Exercício Resistido e Saúde da UEPA, pelo apoio ao

desenvolvimento do estudo, em especial ao Prof. Ms. Evitom Sousa, ao Prof. Dr. Vanderson

Nascimento, Prof. Dr. Cesar, Jayme e Marcio. O apoio de vocês foi fundamental.

Aos alunos de Biomedicina da UFPA: Elias Saldanha e Eliene Putira, obrigado

meninos, cada ajuda de vocês foi fundamental. Obrigado pela disponibilidade e confiança na

nossa pesquisa.

Ao Núcleo de Pesquisa em Oncologia e ao Laboratório de Genética Humana e

Médica, por toda estrutura disponibilizada para o desenvolvimento da pesquisa.

Agradecimento especial ao Marcos Amador e Pablo Pinto, pelos ensinamentos e pela

compreensão com as minhas dificuldades.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para esse trabalho.

INSTITUIÇÕES E FONTES FINANCIADORAS

A pesquisa foi realizada no Hospital Universitário João de Barros Barreto, no Núcleo

de Pesquisa em Oncologia e no Laboratório de Genética Humana e Médica do Instituto de

Ciências Biológicas, todos da Universidade Federal do Pará.

A pesquisa contou com o apoio do Laboratório de Exercício Resistido e Saúde da

Universidade do Estado do Pará.

O aluno recebeu bolsa de estudos concedida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior.

Mas os que esperam no Senhor renovam as suas

forças, subirão com asas como águias, correrão e

não se cansarão, caminharão e não se fadigarão.

(Isaias 40:31)

RESUMO

INTRODUÇAO: A capacidade funcional ou funcionalidade global do idoso é definida como

a capacidade de gerir a própria vida ou cuidar de si mesmo, que é influenciada pelo grau de

autonomia e independência do indivíduo. Na busca da compreensão dos mecanismos

envolvidos no envelhecimento saudável e na manutenção da independência funcional, vários

estudos tentam identificar genes candidatos que possam estabelecer a associação dos

genótipos pesquisados com o fenótipo da aptidão física e com o declínio e perda da

independência na vida adulta. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi investigar a

possível associação entre a variabilidade dos polimorfismos presentes em biomarcadores do

envelhecimento (TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) com a capacidade

funcional do idoso. MATERIAL E MÉTODOS: Trata-se de um estudo transversal analítico

comparativo, desenvolvido a partir da avaliação clínico-funcional e análise dos polimorfismos

presentes em biomarcadores do envelhecimento. A análise clínica e funcional contou com

uma avaliação das capacidades funcionais: atividade básica de vida diária (ABVD), atividades

instrumentais de vida diária (AIVD), atividades avançadas de vida diária (AAVD), e o status

funcional (PS-ECOG), sistemas funcionais: cognição (MEEM), humor (GDS-15), mobilidade

(TUG) e risco de quedas (TT), Estado Nutricional (MAN) e Risco de Sarcopenia (PP). Foram

incluídos oito polimorfismos (dois do TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1),

que foram genotipados por uma reação de PCR multiplex seguida de uma eletroforese capilar.

A análise dos amplicons de PCR foi realizada por eletroforese usando o sequenciador ABI

Prism 3130 e o software GeneMapper ID v.3.2. RESULTADOS: Foram avaliados 228

idosos, na sua maioria mulheres (62%), com aproximadamente 70 anos de idade em média,

com índice de comorbidade médio de 4,48 (±2,44) pontos, sedentários (53%), com histórico

de tabagismo (58%) e possuidores de uma ancestralidade predominantemente européia.

Identificou-se que os polimorfismos dos genes TP53, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1

apresentaram diferenças significativas em algumas variáveis funcionais entre os genótipos. As

variáveis que mais diferiram entre os genótipos foram o status funcional (PS-ECOG),

mobilidade (TUG), risco de quedas (TT) e o risco de sarcopenia (PP). Isso sugeriu possível

associação desses polimorfismos com fatores de risco ou proteção, que na sua maioria não

foram significativos. O polimorfismo do gene NFkB1 (rs28362491) foi o único biomarcador

que demonstrou resultado de associação significante. O genótipo II desse polimorfismo

apresentou associação com risco de sarcopenia (PP). Os idosos que possuíam esse genótipo

apresentaram uma susceptibilidade três vezes maior para perda de massa muscular

relacionada ao envelhecimento, quando comparado aos outros genótipos do mesmo gene.

CONCLUSÃO: Assim, considerando os resultados do presente estudo, acredita-se que o uso

de biomarcadores do envelhecimento, como um teste de rastreio populacional, pode favorecer

a identificação de idosos com maior susceptibilidade ao desenvolvimento de modificações

orgânicas e incapacidades funcionais. A identificação desse risco possibilitará o

direcionamento de estratégias de prevenção, controle e tratamento de incapacidades físicas

ligadas ao envelhecimento fisiológico ou patológico.

Palavras-Chave: Polimorfismo Genético; Biomarcador; Envelhecimento; Idoso Fragilizado.

ABSTRACT

INTRODUCTION: The functional capacity and overall functionality of the elderly is

defined as the capacity to manage their lives or take care of yourself, which is influenced by

the degree of autonomy and independence of the individual. In search of understanding of the

mechanisms involved in healthy aging and maintenance of functional independence, several

studies try to identify candidate genes that may establish the association of genotype with

phenotype studied physical fitness and the decline and loss of independence in adulthood.

OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the possible association between

the variability of polymorphisms on biomarkers of aging (TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-

1a, IL-4 and NFkB1) with the functional capacity of the elderly. MATERIAL AND

METHODS: This is a comparative analytical cross-sectional study, developed from the

clinical and functional evaluation and analysis of polymorphisms on biomarkers of aging. The

clinical and functional analysis included an assessment of functional capabilities: basic

activity of daily living (ABVD), instrumental activities of daily living (AIVD), advanced

activities of daily living (AAVD) and functional status (PS-ECOG) functional systems:

cognition (MEEM), humor (GDS-15), mobility (TUG) and risk of falls (TT), Nutritional

Status (MAN) and Sarcopenia risk (PP). Eight polymorphisms were included (two TP53,

MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 and NFkB1) were genotyped by a multiplex PCR reaction

followed by capillary electrophoresis. Analysis of PCR amplicons was performed by

electrophoresis using the ABI Prism sequencer 3130 and GeneMapper ID v.3.2 software.

RESULTS: A total of 228 elderly, mostly women (62%), with about 70 years old on average,

with an average comorbidity index of 4.48 (± 2.44) points, sedentary (53%), with a history

smoking (58%) and possessing a predominantly European ancestry. It was found that

polymorphisms of the TP53 gene, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 and NFkB1 significant

differences in functional variables between genotypes. The variables that most differed

between genotypes were functional status (PS-ECOG), mobility (TUG), risk of falls (TT) and

the risk of sarcopenia (PP). This suggested a possible association of these polymorphisms

with risk factors or protection, which in most cases were not significant. The NFkB1 gene

polymorphism (rs28362491) was the only biomarkers that demonstrated significant

association results. The II genotype of this polymorphism was associated with risk of

sarcopenia (PP). The elderly who had this genotype showed a three-fold greater susceptibility

to muscle loss related to aging, when compared to other genotypes of the same gene.

CONCLUSION: Therefore, considering the results of this study, it is believed that the use of

biomarkers of aging, as a population screening test may favor the identification of elderly

patients with increased susceptibility to the development of organic modifications and

functional disabilities. The identification of this risk allows the targeting of strategies for

prevention, control and treatment of disabilities linked to physiological or pathological aging.

Keywords: Genetic Polymorphism; Biomarker; Aging; Frail Elderly.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Hallmarks do Envelhecimento. ................................................................................ 19

Figura 2. Conexão molecular, fisiológica e clinica da funcionalidade.................................... 21

Figura 3. Manutenção da Capacidade Funcional ao longo da vida. ........................................ 21

Figura 4. Polimorfismos do Gene TP53. ................................................................................. 23

Figura 5. Polimorfismos do Gene MDM2. .............................................................................. 24

Figura 6. Polimorfismo do Gene UCP2. ................................................................................. 26

Figura 7. Polimorfismo do Gene HLA-G ................................................................................ 27

Figura 8. Esquema de interação do Polimorfismo INDEL do gene IL-1a e miRNA. ............. 28

Figura 9. Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878). .............................................................. 29

Figura 10. Estrutura da Proteína p105. .................................................................................... 30

Figura 11. Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491). ....................................................... 31

Figura 12. Extração do DNA genômico. ................................................................................. 41

Figura 13. Sequência de possíveis relações estabelecidas entre os biomarcadores do

envelhecimento com os sistemas orgânico, manifestações clínicas e limitação funcional. ..... 62

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Variação do perímetro da panturrilha entre os idosos com o Genótipo II, segundo o

sedentarismo. ............................................................................................................................ 58

Gráfico 2. Correlação do genótipo do NFkB1 com a Mobilidade de Idosos. .......................... 59

Gráfico 3. Correlação a mobilidade prejudicada com a Capacidade Funcional dos idosos. ... 60

Gráfico 4. Correlação do desempenho no Teste Timed up and go (TUG) com a Capacidade

Funcional dos idosos para as Atividades de Vida Diária. ........................................................ 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Característica demográfica e clínica da amostra de idosos investigados (n=228). .. 43

Tabela 2. Características Funcionais e Nutricionais da amostra de idosos investigados

(n=228). .................................................................................................................................... 44

Tabela 3. Estatísticas da frequência de cada genótipo dos idosos investigados (n=228). ....... 45

Tabela 4. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene TP53 (rs17878362) dos idosos investigados (n=228). ............................................... 46

Tabela 5. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene TP53 (rs17880560) dos idosos investigados (n=228). ............................................... 47

Tabela 6. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene MDM2 (rs3730485) dos idosos investigados (n=228). .............................................. 49

Tabela 7. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene UCP2 (45pb INDEL) dos idosos investigados (n=228). ........................................... 51

Tabela 8. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene HLA-G (rs371194629) dos idosos investigados (n=228). .......................................... 53

Tabela 9. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo

do Gene IL-1a (rs3783553) dos idosos investigados (n=228). ................................................. 54

Tabela 10. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do

Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878) dos idosos investigados (n=228). .......................... 55

Tabela 11. Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do

Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491) dos idosos investigados (n=228). ..................... 57

Tabela 12. Fatores associados ao Genótipo II do NFkB1 e o risco para sarcopenia em idosos

(n=59). ...................................................................................................................................... 58

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AAVD – Atividades Avançadas de Vida Diária

ABVD – Atividades Básicas de Vida Diária

AGA – Avaliação Geriátrica Ampla

AIVD – Atividades Instrumentais de Vida Diária

DAA – Digital Ageing Atlas

DHEAS – Deidroepiandrosterona

DNA – Ácido Dexorribonucleico

GDS 15 – Escala de Depressão Geriátrica 15

GEMIN – Gem-Associated Protein

HAGR – Human Ageing Genomic Resources

HLA-G – Human Leukocyte Antigen G

HUJBB – Hospital Universitário João de Barros Barreto

HWE – Equilíbrio de Hardy-Weinberg

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

ICC – Índice de Comorbidades de Charlson

IGF-1 – Insulin Growth Factor 1

IkB – Inhibitor of NFkB

IKK – Kinase IkB

IL-1a – Interleucina 1 alfa

IL-6 – Interleucina 6

INDEL – Inserção/Deleção

KB – Kilopares de Base

kDa – Kilo Dalton

LERES – Laboratório de Exercício Resistido e Saúde

MAN – Miniavaliação Nutricional

MDM2 – Murine Doble Minute 2

MEEM – Mini-Exame do Estado Mental

MHC – Major Histocompatibility Complex

miRNA – Micro RNA

NFkB – Nuclear Factor Kappa B

NPO – Núcleo de Pesquisa em Oncologia

NTR – Nontranslated Regions

ONU – Organização das Nações Unidas

ORF – Open Reading Frame

PB – Pares de Base

PCR – Proteína C Reativa

PCR – Reação de Cadeia da Polomerase

PP – Perímetro da Panturrilha

PS-ECOG – Performance Status of Eastern Cooperative Oncology Group

RISC – RNA Induced Silencing Complex

RNA – Ácido Ribonucleico

RNAm – RNA mensageiro

ROS – Espécies Reativas de Oxigênio

SNP – Single Nucleotide Polymorphism

TCLE – Termo de Consentimento Livre

TT – Teste de Tinetti

TUG – Timed Up and Go

UCP2 – Uncoupling Proteins 2

UEPA – Universidade do Estado do Pará

UFPA – Universidade Federal do Pará

UN – Nations Unies

UNFPA – United Nations Fund for Population Activities

VNTR – Variable Number Tandem Repeats

WHO – World Health Organization

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................................................ 16

1.2 ENVELHECIMENTO DA POPULAÇÃO ........................................................................ 17

1.3 ENVELHECIMENTO BIOLÓGICO................................................................................. 18

1.4 FENÓTIPO DO ENVELHECIMENTO E CAPACIDADE FUNCIONAL ...................... 19

1.5 PAINEL DE BIOMARCADORES DO ENVELHECIMENTO ....................................... 22

1.5.1 Genes do Controle do Ciclo Celular ................................................................................ 22

1.5.1.1 Gene TP53 .................................................................................................................... 22

1.5.1.1.1 Polimorfismo no Gene TP53 (rs17878362 e rs17880560) ........................................ 23

1.5.1.2 Gene MDM2 ................................................................................................................. 24

1.5.1.2.1 Polimorfismo Gene MDM2 (rs3730485) ................................................................... 24

1.5.2 Gene do Controle do Metabolismo .................................................................................. 25

1.5.2.1 Gene UCP2 ................................................................................................................... 25

1.5.2.1.1 Polimorfismo do Gene UCP2 .................................................................................... 25

1.5.3 Genes do Controle Imunológico ...................................................................................... 26

1.5.3.1 Gene HLA-G ................................................................................................................. 26

1.5.3.1.1 Polimorfismo do Gene HLA-G (rs371194629) ......................................................... 26

1.5.3.2 Gene IL-1a .................................................................................................................... 27

1.5.3.2.1 Polimorfismo do Gene IL-1a (rs3783553) ................................................................ 28

1.5.3.3 Gene IL-4 ...................................................................................................................... 28

1.5.3.3.1 Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878) ................................................................ 29

1.5.3.4 Gene NFkB1 ................................................................................................................. 30

1.5.3.4.1 Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491) ............................................................ 31

2 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 32

3 APLICABILIDADE ............................................................................................................ 33

4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 35

4.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 35

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 35

5 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 36

5.1 TIPO DE ESTUDO ............................................................................................................ 36

5.2 AMOSTRA ......................................................................................................................... 36

5.3 COLETA DE DADOS ....................................................................................................... 37

5.3.1 Avaliação Clínica e Funcional ......................................................................................... 37

5.3.1.1 Avaliação Sociodemográficos ...................................................................................... 37

5.3.1.2 Avaliação Clínica e Epidemiológica ............................................................................ 37

5.3.1.3 Avaliação da Capacidade Funcional............................................................................. 38

5.3.1.4 Avaliação dos Sistemas Funcionais .............................................................................. 39

5.3.1.5 Avaliação do Estado Nutricional .................................................................................. 39

5.3.2 Coleta do Sangue Total ................................................................................................... 40

5.3.3 Extração, Quantificação e Diluição do DNA .................................................................. 40

5.3.4 Determinação da Ancestralidade ..................................................................................... 41

5.3.5 Analise dos Polimorfismos .............................................................................................. 41

5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 42

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 43

7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 63

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 65

APÊNDICE I ........................................................................................................................... 82

ANEXO I ................................................................................................................................. 83

ANEXO II ................................................................................................................................ 84

ANEXO III .............................................................................................................................. 85

ANEXO IV .............................................................................................................................. 86

ANEXO V ................................................................................................................................ 89

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS

Nas últimas décadas cresce o número de idosos na população mundial. Estima-se que

atualmente existam cerca de 893 milhões de pessoas acima de 60 anos no mundo e que em

2050 esse número suba para 2,4 bilhões. Esse aumento acelerado é considerado uma

conquista da humanidade, mediante as melhorias nas áreas da saúde, educação e economia,

entre outros fatores que contribuem para uma maior longevidade (ONU, 2011; WHO, 2012).

Essa realidade também é evidente no Brasil, onde pesquisas apontam que entre 2013 e

2060 a população idosa irá quadruplicar, atingindo 58,4 milhões de pessoas, o que

representará aproximadamente 27% do total da população brasileira. Nesse mesmo período,

estima-se ocorrer um aumento da expectativa de vida de 75 anos para 81 anos (IBGE, 2013).

O aumento da expectativa de vida ocorre juntamente com o aumento da prevalência de

doenças crônico degenerativas, que se acentuam a partir dos 60 anos e incluem as doenças

osteoarticulares, cardiovasculares, endocrinometabólicas, respiratórias crônicas,

cerebrovasculares e o câncer, que geralmente estão correlacionadas com comprometimento da

funcionalidade global do idoso (HANSEN et al., 2011; CAMPOLINA et al., 2013).

A funcionalidade global é o ponto de partida para a avaliação da saúde do idoso, que é

mensurada pela capacidade funcional, definida como a capacidade de gerir a própria vida ou

cuidar de si mesmo (MORAES, 2012). Essa investigação inclui a aplicação da Avaliação

Geriátrica Ampla (AGA), uma ferramenta de avaliação multidimensional composta por

diversas escalas de rastreio clínico e funcional onde os vários problemas dos idosos são

identificados, descritos e explicados, permitindo um plano de assistência coordenado e

direcionado para os problemas apresentados (KARNAKIS, GIGLIO, 2012).

A avaliação da capacidade funcional permite a investigação do processo de

envelhecimento de forma heterogênea e individual, levando em consideração a redução

progressiva da reserva funcional dos vários sistemas de órgãos. Estudos recentes sugerem que

uma avaliação biológica, com biomarcadores de envelhecimento, pode auxiliar a investigação

da perda da reserva funcional do idoso, o que facilita a estimativa de sobrevida global e de

incapacidades físicas, o direcionamento de intervenções clínicas específicas para o idoso para

o alcance de melhores resultados nas terapias e melhor qualidade de vida (THOMPSON,

VOSS, 2009; FALANDRY, GILSONC, RUDOLPHE, 2013).

17

1.2 ENVELHECIMENTO DA POPULAÇÃO

O envelhecimento da população mundial é uma significativa tendência do século XXI.

Um fenômeno que ocorrer em vários países, com graus variados de desenvolvimento. As

pessoas vivem mais em razão das melhorias na nutrição, nas condições sanitárias, nos avanços

da medicina, nos cuidados com a saúde, no ensino e no bem-estar econômico. No entanto,

surgem desafios sociais, econômicos e culturais para indivíduos, famílias, sociedades e para a

comunidade global (UNFPA, 2012).

Esse processo é resultante da diminuição da mortalidade e do declínio da fertilidade,

levando a uma redução relativa na proporção de crianças e um aumento na proporção de

adultos e idosos na população (UN, 2013). Estima-se que entre 2000 e 2050, a proporção da

população mundial com mais de 60 anos dobrará de 11% para 22%. O número absoluto de

pessoas com 60 anos era de 605 milhões em 2000, de 841 milhões em 2013 e deverá

aumentar para dois bilhões em 2050 (WHO, 2012).

Atualmente, cerca de dois terços das pessoas idosas do mundo vivem em países em

desenvolvimento. Nesses paises, a população idosa tem aumentado com maior rapidez, pois

esses partem de uma expectativa de vida mais baixa, quando comparada as dos países

desenvolvidos, com menos espaço para crescimento (UNFPA, 2011). Por exemplo, a França

levou mais de 100 anos para dobrar sua população idosa, enquanto países como Brasil e

China irão levar menos de 25 anos para atingir o mesmo crescimento (WHO, 2012). Em

2050, oito em cada dez idosos viverão em regiões em desenvolvimento (UN, 2013).

No geral, nos próximos anos a expectativa de vida deverá aumentar nos países

desenvolvidos e em desenvolvimento. Estima-se um aumento na expectativa de vida de 69

anos em 2010 para 76 anos em 2050 e de 82 anos em 2100. Até o final do século, as pessoas

nos países desenvolvidos poderão viver, em média, em torno de 89 anos, em comparação com

81 anos, em países em desenvolvimento (UN, 2013).

A população brasileira acompanha essas estimativas. Segundo o Instituto Brasileiro de

Geografia e Estatística (IBGE) o Brasil segue com um acelerado processo de envelhecimento.

A população idosa era de 14,9 milhões (7,4%) em 2013 e passará para 58,4 milhões (26,7%)

em 2060. No mesmo período, a expectativa média de vida do brasileiro deverá aumentar dos

75 anos para 81 anos, havendo diferenças entre os gêneros, 84,4 anos para as mulheres contra

78,03 para os homens (IBGE, 2013).

Entre as regiões brasileiras, as regiões sul e a sudeste são as que apresentam maior

proporção de idosos, seguidas das regiões centro-oeste e nordeste. A região norte é a que

18

apresenta menor proporção. Estima-se que todas apresentem aumento em suas proporções no

período de 2000 a 2060, sendo mais significativo na região sul e menos na região norte

(IBGE, 2013).

No estado do Pará, a população idosa cresceu cerca de 50% entre os anos de 2000 e

2010. Em 2000 representava cerca 5,5% da população paraense, passando para 6,9% em

2010. Nesse mesmo período essa população cresceu aproximadamente 46% em Belém e

passou a representar 9,10% (129.929) da população em 2010. Estima-se que em 2030 os

idosos representarão um pouco mais de 12% da população paraense (IBGE, 2014).

1.3 ENVELHECIMENTO BIOLÓGICO

O envelhecimento é um fenômeno universal, individual e inevitável, que se inicia no

nascimento e continua até a morte, capaz de conduzir o organismo a múltiplas reações

moleculares e disfunções celulares, afetando a homeostase, comprometendo a capacidade

funcional e favorecendo o aparecimento de doenças (TEIXEIRA, GUARIENTO, 2010;

GIGLIO, KARNAKS, TODARO, 2012; PALLIS et al., 2014).

Na busca do entendimento do processo de envelhecimento, postularam-se diversas

teorias biológicas, classificadas em evolutiva, celular-molecular e sistêmica. Os mecanismos

biológicos envolvidos em cada grupo de teorias explicam o fenótipo da senescência humana,

revelando a complementaridade entre as teorias e a complexidade do entendimento da

etiologia do envelhecer (TEIXEIRA, GUARIENTO, 2010; JIN, 2010).

Com a evolução do conhecimento das bases moleculares e celulares da vida e das

doenças, o envelhecimento vem sendo submetido à intensa investigação. Isso inclui o

entendimento de mecanismos intrínsecos, eventos acidentais, sinais genéticos programados,

mutações ou danos no DNA nuclear ou mitocondrial, proteínas danificadas e anormais,

ligação cruzada, glicação, formação de radicais livres, e componentes celulares específicos,

como gene, cromossomo, mitocôndrias, ou telômeros (CEFALU, 2011).

Recentemente postularam-se os chamados hallmarks do envelhecimento, constituídos

de características que determinam o fenótipo do envelhecimento: instabilidade genômica,

redução do telômero, alterações epigenéticas, perda de proteases, desequilíbrio de nutrientes,

disfunção mitocondrial, senescência celular, esgotamento de células tronco e comunicação

intercelular alterada (Figura 1). Essas marcas se manifestam durante o envelhecimento

19

normal, o seu agravamento experimental acelera o envelhecimento e a sua melhoria

experimental retarda o processo de envelhecimento normal (LOPEZ-OTIN et al., 2013).

Os fenômenos bioquímicos envolvidos na senescência favorecem o aparecimento de

doenças crônicas (GIGLIO, KARNAKS, TODARO, 2012). No envelhecimento, com o passar

do tempo ocorre acúmulo de células com diferentes aberrações moleculares e também

alterações substanciais na homeostase interna. Isso aumenta a susceptibilidade a agentes

lesivos a célula, a senescência e a redução dos mecanismos de proteção a doenças

(FALANDRY et al., 2014; PALLIS et al., 2014).

Figura 1. Hallmarks do Envelhecimento.

Fonte: adaptado de Lopez-Otin et al. (2013).

1.4 FENÓTIPO DO ENVELHECIMENTO E CAPACIDADE FUNCIONAL

O fenótipo do envelhecimento implica em um declínio progressivo das reservas

funcionais e perda da homeostase. Este processo é altamente individualizado e influenciado

por vários fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. A individualização e a diversidade de

fatores que influenciam o envelhecimento resultam em uma significativa heterogeneidade,

que representa um grande desafio na prática clínica (PALLIS, 2014).

20

Os sistemas de órgãos possuem a capacidade de resistir a perturbações e retornar à

homeostase, o que alguns autores denominam de reserva funcional. Esta reserva diminui com

a idade e pode explicar a deterioração funcional dos idosos. As atividades funcionais tornam-

se cada vez mais difíceis, comprometendo a qualidade de vida do idoso. Sendo assim, a

capacidade funcional começa a ser vista como um indicativo de saúde e qualidade de vida

(MARCHON, CORDEIRO, NAKANO, 2010).

A capacidade funcional ou funcionalidade global do idoso é definida como a

capacidade de gerir a própria vida ou cuidar de si mesmo, que é influenciada pelo grau de

autonomia e independência do indivíduo. Tais critérios englobam a integração harmoniosa

das atividades de vida diárias com a cognição, humor, mobilidade e comunicação, que

permitem dizer se o idoso é saudável, ou seja, funcionalmente capaz, mesmo na existência de

doenças crônicas (MOREIRA, BOAS, 2011; MORAES, 2012).

A investigação desses domínios da saúde identifica precocemente problemas de

natureza biopsicossocial, através de escalas e instrumentos padronizados, que auxiliam na

elaboração e gestão de planos de cuidados mais eficazes, eficientes e seguros, diminuindo as

possíveis iatrogenias, que podem potencializar o comprometimento funcional do idoso

(WELSH, GORDON, GLADMAN, 2013).

O comprometimento funcional pode estar relacionado a alterações moleculares e

fisiológicas, comuns no processo de senescência. As modificações moleculares, associadas a

variabilidade genética, podem explicar o declínio funcional, pois correlacionam-se com o

debilidade de um ou mais sistemas fisiológicos, que promovem a desregulação de muitos

domínios clínicos, o que favorece o surgimento de comorbidades e incapacidades (Figura 2 e

3) (WALSTON et al., 2006, GIL, COELHO, 2012).

As alterações moleculares, causadoras da desregulação dos sistemas homeostáticos,

são determinadas principalmente pela hereditariedade, hábitos de vida e doenças. Esses são

capazes de comprometer o funcionamento harmonioso do organismo, gerando perda da

autonomia e independência, hospitalização, institucionalização e óbito (MORAES, 2008;

GUIMARÃES, CAMARGOS, 2011).

Na busca da compreensão dos mecanismos envolvidos no envelhecimento saudável e

na manutenção da independência funcional, vários estudos tentam identificar genes

candidatos que possam estabelecer a associação dos genótipos pesquisados com o fenótipo da

aptidão física e com o declínio e perda da independência na vida adulta (GARATACHEA,

LUCIA, 2013).

21

Figura 2. Conexão molecular, fisiológica e clinica da funcionalidade.

Fonte: adaptado de Gil e Coelho (2012).

Figura 3. Manutenção da Capacidade Funcional ao longo da vida.

Fonte: adaptado de OMS (2008).

Vários biomarcadores estão em discussão, tais como os marcadores inflamatórios,

hormônios, marcadores de estresse oxidativo e o encurtamento dos telômeros, mas nem

sempre são realmente comprovados em humanos. Somente um biomarcador não explica a

idade biológica real, que é individual e diversificada, para a redução da capacidade funcional

de sistemas de órgãos distintos (SIMM, JOHNSON, 2010).

22

1.5 PAINEL DE BIOMARCADORES DO ENVELHECIMENTO

O processo natural de envelhecimento envolve o surgimento de doenças crônicas e

degenerativas e a perda de funcionalidade dos diversos sistemas, o que acarreta um

crescimento exponencial dos gastos com saúde. Assim, o uso de biomarcadores do

envelhecimento é necessário para investigar o estado de saúde do idoso, direcionando

possíveis intervenções terapêuticas (DAVINELLI et al., 2012).

Existem vários genes indicados como prováveis biomarcadores do envelhecimento, no

entanto nenhum desses ainda serviu como único marcador para determinar a idade biológica.

Um marcador biológico é considerado relacionado ao envelhecimento quando se manifesta no

envelhecimento normal; quando seu agravo acelera o envelhecimento; quando sua melhora

experimental retarda o processo; e quando pode ser testado repetidamente (LOPEZ-OTIN et

al., 2013; BÜRKLE et al., 2015).

A complexidade do entendimento dos fatores envolvidos no envelhecimento biológico

e sua aplicabilidade na saúde do idoso exige uma integração multidisciplinar. Nesse contexto,

nos últimos anos sugiram as bases de dados de pesquisas voltadas ao envelhecimento. Entre

essas bases podemos citar o centro de informações JenAge, a base de dados do Human Ageing

Genomic Resources (HAGR) e plataforma de integração Digital Ageing Atlas (DAA), que

facilitam o direcionamento de pesquisas voltadas na área (TACUTU et al., 2012; HUHNE,

THALHEIM, SUHNEL, 2013; CRAIG et al., 2015).

Alguns dos genes citados a seguir já estão catalogados no LongevityMap, uma

ferramenta do HAGR, o primeiro catálogo de variações genéticas humanas associadas com a

longevidade (BUDOVSKY et al., 2013). Esses genes e seus polimorfismos compõem um

painel de 20 biomarcadores, que de maneira geral podem estar ligados a três diferentes

eventos associados as teorias do envelhecimento: celular, metabólica e imunológica.

1.5.1 Genes do Controle do Ciclo Celular

1.5.1.1 Gene TP53

O gene TP53 possui sua localização citogenética no cromossomo 17 (região 17p13.1).

Esse gene é responsável pela codificação da proteína p53, uma proteína com função de fator

de transcrição, que responde a modificações celulares, desencadeando a regulação de genes

que induzem a parada do ciclo celular, apoptose, senescência, reparação de DNA e as

alterações no metabolismo. Em células normais, a atividade da p53 é baixa, mas quando

23

ocorre, por exemplo, danos no DNA os níveis dessa proteína aumentam, impedindo que

células anormais se proliferem (KIM, ZHANG, LOZANO, 2016; KAMP, WANG, HWANG,

2016).

Devido sua capacidade de regulação do ciclo celular, a p53 também passou a ser

observada como uma proteína que regula o envelhecimento. Sua ação pode conduzir à

apoptose excessiva, que leva a atrofia tecidual, degeneração e perda da capacidade

regenerativa. No entanto, a mesma pode ter efeitos que favorecem a longevidade, pois

eliminam células danificadas ou disfuncionais, impedindo sua proliferação (KEIZER,

LABERGE, CAMPISI, 2010).

Estudos apontam que existem mais de 45 mil mutações somáticas e germinativas e

pelo menos 100 polimorfismos no gene TP53. O entendimento da heterogeneidade dessas

mutações e polimorfismos, que causam alterações estruturais e funcionais, é necessário para a

compreensão dos papéis desse gene em células normais e em processos patológicos

(PETITJEAN et al., 2007; SAGNE et al., 2013; LEROY, ANDERSON, SOUSSI, 2014).

1.5.1.1.1 Polimorfismo no Gene TP53 (rs17878362 e rs17880560)

O gene TP53 apresenta polimorfismos que podem induzir alterações da expressão do

gene e, consequentemente, a perda do controle homeostático da célula. Dois polimorfismos

desse gene são observados na Figura 4, a inserção de 6pb na região 3' flanqueadora

(rs17880560) e a inserção de 16pb no íntron 3 (rs17878362). Esse último é um polimorfismo

bastante comum, que pode provocar a redução do nível de transcrição da proteína p53,

sugerindo que este polimorfismo provoca uma alteração no processamento do RNAm da

proteína, justificando sua associação com o desenvolvimento de doenças crônicas (SAGNE et

al., 2013; WU et al., 2013; SAGNE et al., 2014; VYMETALKOVA et al., 2015).

Figura 4. Polimorfismos do Gene TP53.

Fonte: adaptado de Sagne et al. (2014).

24

1.5.1.2 Gene MDM2

O MDM2 é um gene que possui localização citogenética no cromossomo 12 (região

12q15), composto por 12 éxons e medindo cerca de 25kb. Esse gene expressa a proteína

MDM2, uma ubiquitina ligase E3, que tem como alvo a proteína p53, que formando o

complexo MDM2-p53 conduz a p53 para a degradação proteossômica. Além disso, a MDM2

inibe diretamente a transcrição da p53 através da ligação ao seu domínio de transativação.

Ambos os mecanismos favorecem a progressão do ciclo celular, pela regulação negativa da

p53 (SASAKI et al., 2011; LESLIE, ZHANG, 2016). Em condições normais, a MDM2 é

regulada pela p53, uma espécie de feedback negativo associado com modulação de ambas as

proteínas. Por tanto, a proteína MDM2 regula proteínas essenciais para o monitoramento,

sinalização e reparo de danos no DNA (LUSHNIKOV et al., 2012; BURGESS et al., 2016).

A manutenção da homeostase garantida pelo equilíbrio entre MDM2 e p53 auxilia no

desenvolvimento e cicatrização de tecidos. Além disso, a MDM2 tem efeitos independentes

da p53 na ativação da proteína NFkB, favorecendo o processo inflamatório na sua ativação e

anti-inflamatório na sua inibição (EBRAHIM et al., 2015). Por tanto, MDM2 regula através

de múltiplas vias de sinalização os níveis de p53, influenciando sobre a proliferação, morte e

senescência celular (WANG, LI, 2010).

1.5.1.2.1 Polimorfismo Gene MDM2 (rs3730485)

O gene MDM2 possui dois promotores, um basal (P1) localizada na região próxima ao

éxon 1 e um alternativo (P2), que é localizado no íntron 1. O P1 regula a expressão de MDM2

em condição sem estresse, enquanto que o P2 regula os níveis de MDM2 em células sobre

estresse celular. Vários polimorfismos no gene MDM2 foram identificados em regiões

promotoras. Entre esses, encontra-se o polimorfismo de inserção/deleção de 40pb no P1 do

gene MDM2 (rs3730485, del1518), Figura 5, que confere risco ao desenvolvimento do câncer

por alteração do nível de expressão do gene (SALIMI et al., 2015; GANSMO et al., 2016).

Figura 5. Polimorfismos do Gene MDM2.

Fonte: adaptado de Gansmo et al. (2016).

25

1.5.2 Gene do Controle do Metabolismo

1.5.2.1 Gene UCP2

O gene UCP2 está localizado no cromossomo 11 (região q13.4), composto por 8

éxons, abrangendo cerca de 8kb. É responsável pela expressão da proteína UCP2, uma

proteína transportadora mitocondrial, que desacopla a fosforilação oxidativa da produção de

ATP, pela dissipação do gradiente de prótons gerados na membrana interna mitocondrial,

reduzindo a produção de ATP pela cadeia respiratória mitocondrial. Além de regular a

produção de ATP mitocondrial, a UCP2 regula também a geração de espécies reativas de

oxigênio (ROS) (HASHEMI et al., 2014; TODA, DIANO, 2014).

Essa regulação da geração de ROS, garantida quando ocorre a sobre-expressão da

UCP2, previne o dano oxidativo nos tecidos (HASHEMI et al., 2014). A redução desse

estresse oxidativo é importante na regulação da sobrevivência celular e do envelhecimento

(KIM et al., 2016). No entanto, a desregulação da sua expressão pode contribuir para o

desenvolvimento de doenças metabólicas, neurodegenerativas, aterosclerose e o câncer. A

hiperexpressão da UCP2 tem sido observada como um mecanismo de regulação positiva para

a carcinogênese, o que promove a redução do estresse oxidativo e o crescimento celular

(ROBBINS, ZHAO, 2011).

1.5.2.1.1 Polimorfismo do Gene UCP2

Estudos revelam que o gene UCP2 possui um polimorfismo caracterizado pela

inserção/deleção de 45bp na região 3’UTR do éxon 8 (Figura 6). Estudos afirmam que uma

das variações desse polimorfismo pode influenciar na quantidade da proteína UCP2, devido as

alterações na estabilidade do RNAm ou nas taxas de tradução (YANOVSKI et al., 2000;

MERCER et al., 2007).

Essas alterações permitem estabelecer a associação desse polimorfismo com o

comprometimento metabólico, aumento do peso e a obesidade. Esses fatores podem promover

o aumento do estresse oxidativo, aumentando o risco do desenvolvimento de doenças crônicas

e degenerativas (HEIDEMA et al., 2010; HASHEMI et al., 2014; MUTOMBO, YAMASAKI,

SHIWAKU, 2013).

26

Figura 6. Polimorfismo do Gene UCP2.

Fonte: adaptado Hashemi et al. (2014).

1.5.3 Genes do Controle Imunológico

1.5.3.1 Gene HLA-G

O gene HLA-G está localizado no cromossomo 6 (região 6p22.1), composto por oito

éxons que abrangem um tamanho de 4kb. Esse gene pode ser transcrito a partir de sete

splicing alternativos, que gera, a partir de um único RNAm, 7 isoformas de proteínas

distintas: quatro isoformas ligadas a membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4); e

três isoformas solúveis (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7). É um gene do sistema Antígeno

Leucocitário Humano (Human Leukocite Antigen) e faz parte do Complexo Principal de

Histocompatibilidade - MHC (HYLENIUS et al., 2004; BOUTEILLER, 2015).

As principais funções das isoformas da HLA-G relacionam-se a indução da inibição

imunitária (tolerância imunológica), que pode ser benéfica na proteção de rejeições (gestação

e transplante), ou deletéria quando expresso por um tumor, protegendo-o da ação antitumoral.

É uma molécula de verificação, em que sua regulação, função e mecanismos de ação possuem

grande importância patológica, pois normalmente sua expressão é restrita em alguns tecidos.

No entanto, existem condições que conduzem ao aumento da expressão da HLA-G, como em

doenças inflamatórias e infecções virais (BRENOL et al., 2012; CAROSELLA et al., 2015).

1.5.3.1.1 Polimorfismo do Gene HLA-G (rs371194629)

Existem diversos polimorfismos no gene HLA-G descritos na literatura, presentes em

íntrons e éxons, o que influência na função da proteína a ser expressa. Essas variações podem

27

ser classificadas de quatro formas: variação na região reguladora 5'; variação na região de

codificação; variação na região 3’UTR; e variação de alelos completos (CAROSELLA et al.,

2015).

Na região 3’ UTR já foram identificadas 19 variações, incluindo o INDEL de 14 bp

(rs371194629 ou rs66554220), que ocorre no éxon 8 (Figura 7). Esse polimorfismo envolve a

estabilidade e a expressão do RNAm, onde o alelo deleção tem sido visto como promotor de

maior estabilidade ao RNAm e consequentemente maior expressão da HLA-G, efeitos

contrários da sua inserção (BRENOL et al., 2012; BORTOLOTI et al., 2014; CASTELLI et

al., 2014a; CASTELLI et al., 2014b).

Figura 7. Polimorfismo do Gene HLA-G.

Fonte: adaptado de Hylenius et al. (2004).

1.5.3.2 Gene IL-1a

O gene IL-1a localiza-se no cromossomo 2 (região 2q14.1), composto por 7 éxons que

abrangem aproximadamente 10kb. Expressa uma das isoformas da IL-1, que é sintetizada em

vários tipos de células como macrófagos, queratinócitos, linfócitos B e fibroblastos. Essa é

multifuncional e está relacionada a comunicação celular (autocrina e paracrina), envolvida no

processo inflamatório, na resposta imunológica e na hematopoiese. A IL-1a é produzida como

uma proteína longa, retida na célula, que sofre clivagem pela proteína calpaína, tornado-a

mais curta e madura. Essa então é secretada pelas células do sistema imunitário para

influenciar as funções de outras células (WERMAN et al., 2004; HUANG et al., 2015).

Estudos apontam que a IL-1a desempenha um papel importante na regulação da

resposta imunitária na promoção ou bloqueio dos processos de tumorigênese, proliferação

celular, angiogênese, invasão e metástase. Esses achados conflitantes justificam-se pela

variabilidade genética, que pode afetar a resposta imune e inflamatória (WANG et al., 2016).

28

1.5.3.2.1 Polimorfismo do Gene IL-1a (rs3783553)

Esse polimorfismo caracteriza-se por ser uma inserção/deleção de 4pb na região

3’UTR. Essa região é o local de ligação de microRNAs (miR-122 e miR-378) responsáveis

pela regulação da expressão da proteína IL-1a. Na existência de um polimorfismo nessa

região, a força de ligação do microRNA com o RNAm é alterada, comprometendo a

regulação da expressão protéica (HUANG et al., 2015; YAN et al., 2015)

Essa falha de regulação tem sido associada a diferentes níveis de expressão da IL-1a,

relacionada ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer e com a osteoartrite (YANG et

al., 2015; MA, ZHOU, 2016). Estudos sugerem que essa variação dentro da região 3’UTR

pode ter duas consequências: a variação pode afetar o local de regulação, alterando a

estabilidade do microRNA no RNAm; ou pode criar um local alvo de um outro microRNA,

conforme exposto na Figura 8 (SLABY et al., 2012)

Figura 8. Esquema de interação do Polimorfismo INDEL do gene IL-1a e miRNA.

Fonte: adaptado de Slaby et al. (2012).

1.5.3.3 Gene IL-4

O gene IL-4 está localizado no cromossomo 5 (região 5q31.1), composto por 4 éxons e

3 íntrons que abrangem cerca 10kb. Este gene é responsável pela expressão da glicoproteína

IL-4, uma citocina anti-inflamatória de 18kDa que regula o equilíbrio de citocinas Th1/Th2,

29

expressa principalmente pelos basófilos, mastocitos, eosinófilos, linfócitos Th2, células

epiteliais, células endoteliais e fibroblasto. Esta molécula esta envolvida na proliferação

celular, expressão gênica e prevenção da apoptose de varias células (UI-HAQ, NAZ,

MESAIK, 2016; ZANG et al., 2016).

A IL-4 desempenhar um papel significativo na progressão de vários distúrbios

imunológicos, ressaltando-se as alergias e doenças autoimunes. Além disso, tem-se observado

o seu envolvimento com o processo de carcinogênese, na asma, nas doenças do sistema

nervoso central e nas doenças infecciosas (ZHU et al., 2013; UI-HAQ, NAZ, MESAIK,

2016). Estudos sugerem que a idade e a existência de polimorfismos estão entre os fatores que

podem influenciar na expressão e função da IL-4, conduzindo a uma resposta imune alterada,

que aumenta a suscetibilidade de doenças inflamatórias (PLACKETT et al., 2004; WU et al.,

2015).

1.5.3.3.1 Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878)

Esse polimorfismo se caracteriza por uma variação do número de repetições em

tandem (VNTR) de 70pb no íntron 3 (Figura 9), com três diferentes alelos (com 1, 2 e 3

repetições), que podem alterar o nível de expressão da citocina (PINTO et al., 2015;

AMADOR et al., 2016). Estudos apontam que alelos desse polimorfismo podem estar

associados à diversas doenças inflamatórias, à gravidade da artrite reumatoide, ao prognóstico

de alguns tipos de câncer e à suscetibilidade para síndrome da fragilidade em idosos (BUCHS

et al., 2000; GENEVAY et al., 2002; PÉREZ-SUAREZ et al., 2015; AMADOR et al., 2016).

Figura 9. Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878).

Fonte: adaptado de Gonzáles et al. (2001).

30

1.5.3.4 Gene NFkB1

O gene NFkB1 está localizado no cromossomo 4 (região 4q24), composto por 25

éxons que abrangem um tamanho de aproximadamente 156kb. Esse gene é responsável pela

expressão das proteínas p105 e p50. A proteína p50 é originada da remoção da sequência C-

terminal, mediada pelo proteassoma 26S, da proteína p105 (Figura 10). A p50 é um fator de

transcrição importante em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo a proliferação

e diferenciação celular, resposta inflamatória e imunitária, apoptose, sobrevivência celular,

reações ao estresse celular e ao desenvolvimento de câncer (YU, MAN, HUANG, 2009;

YANG et al., 2014; LI et al., 2015).

Figura 10. Estrutura da Proteína p105.

Fonte: adaptado de Pereira e Oakley (2008).

Em geral o complexo da NFKB1 encontra-se inativado no citoplasma, ligado a

proteínas inibidoras de NFkB, chamadas de IkBs. Existem várias vias que conduzem à

ativação da NFkB1, por estímulos intra e extracelulares, resultantes da exposição celular a

citocinas inflamatórias, exposição à luz ultravioleta, hipóxia, aumento das espécies reativas de

oxigênio e produtos bacterianos e virais. Esses estímulos ativam o complexo cinase IkB

(IKK), que promove a remoção da sequencia C-terminal, ativando a subunidade p50. Essa por

sua vez desloca-se para o núcleo e regula a expressão de genes das mais variadas funções

biológicas (YAMINI, 2015; CARTWRIGHT, PERKINS, WILSON, 2016).

Entre as proteinas reguladas pela NFkB1 estão as mediadoras da resposta inflamatória,

que convergem com a proliferação celular, apoptose e angiogenese. O papel da p50 na

resposta aos danos no DNA revela que esta subunidade é necessária para a manutenção do

genoma e que sua perda resulta no comprometimento da longevidade e o desenvolvimento de

doença crônica e do câncer (KOLOVOU et al., 2014; YAMINI, 2015; ZHANG et al., 2015;

CARTWRIGHT, PERKINS, WILSON, 2016).

31

1.5.3.4.1 Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491)

O gene NFkB1 possui um polimorfismo funcional entre duas regiões promotoras,

caracterizado pela inserção/deleção de 4pb (-94ins/del ATTG, rs28362491), como observado

na Figura 11. Com a presença da deleção de 4pb se observou uma perda da ligação de

proteínas nucleares, levando a redução significativa da atividade do promotor e,

consequentemente, a níveis mais baixos de proteína p50. Assim, este polimorfismo parece

estar associado a várias doenças, tais como câncer e doenças inflamatórias (YANG et al.,

2014; CHEN, CAI, LIANG, 2015; LAI et al., 2015; WANG et al., 2015).

Figura 11. Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491).

Fonte: Yang et al., 2014.

32

2 JUSTIFICATIVA

O envelhecimento populacional é um fenômeno mundial. Estudos apontam que em

2050 a população idosa será de cerca de 2,4 bilhões. Estas estimativas estão relacionadas ao

aumento da expectativa de vida, frequente tanto nos países desenvolvidos quanto em países

em desenvolvimento. O aumento da expectativa de vida tem sido associado ao aumento da

prevalência de doenças crônicas degenerativas, que geralmente estão associadas ao

comprometimento da capacidade funcional do idoso e aos custos aumentados com saúde

(HANSEN et al., 2011; UNFPA, 2012; CAMPOLINA et al., 2013; ONU, 2013).

O processo de envelhecimento é um conjunto de modificações morfofuncionais,

fisiológicas, bioquímicas e psicológicas, que ocorrem de maneira sequencial, individual e

acumulativa, direcionando para uma perda progressiva da capacidade de adaptação do

indivíduo ao meio ambiente e de manutenção da homeostase, com resultados distintos nas

funções do organismo (FERREIRA et al., 2010; CHAGAS, ROCHA, 2012).

Na tentativa de esclarecer os processos biológicos da saúde do idoso, bem como as

doenças relacionadas à idade, surge o conceito de biomarcadores do envelhecimento, sinais

biológicos que podem refletir a taxa de envelhecimento, permitindo avaliar os efeitos da

longevidade sobre a idade fisiológica. Com o auxílio dessa ferramenta, podem-se predizer as

funções coerentes com a idade individual (SPROTT, 2010).

Com o avanço da biologia molecular, diversas moléculas têm sido descritas como

biomarcadores do envelhecimento, tais como: marcadores inflamatórios, hormônios,

marcadores de estresse oxidativo, encurtamento dos telômeros, entre outros. No entanto, nem

sempre são realmente comprovados em humanos, pois se trata de um fenômeno complexo,

onde somente um biomarcador não explica a idade biológica individual, que é heterogênea

para redução da capacidade funcional de sistemas fisiológicos (SIMM, JOHNSON, 2010).

Esse comprometimento funcional resulta nas síndromes geriátricas, que são condições

clínicas que envolvem múltiplos sistemas, podendo ter uma fisiopatologia comum, apesar de

suas diferentes apresentações, incapacidade cognitiva, instabilidade postural, incontinência,

imobilidade, etc. Logo, o conhecimento das particularidades do envelhecimento é necessário

para intervenções que priorizem a saúde do idoso (MORAES, MARINO, SANTOS, 2010;

LIMPAWATTANA et al., 2011).

33

3 APLICABILIDADE

A avaliação da capacidade funcional é um instrumento de investigação utilizado por

geriatras e gerontólogos para avaliar o estado geral de saúde do idoso. É um dos pilares de

cuidados geriátricos, por fazer parte de um processo de diagnóstico interdisciplinar e

multidimensional, a fim de desenvolver um plano coordenado e integrado de tratamento e

acompanhamento em longo prazo, identificando os déficits de saúde (ELLIS et al., 2011;

PARKS et al., 2012; MOHILE, MAGNUSON, 2013).

Essa ferramenta de avaliação inclui informações sobre o estado clínico-funcional da

pessoa idosa, na busca de problemas que podem gerar situações complexas, para auxiliar na

elaboração de um plano terapêutico adequado (SANCHEZ, MOTA, 2009). Essas informações

abordam a funcionalidade global, a existência de comorbidades, as condições

socioeconômicas, a presença de síndromes geriátricas, a revisão de medicamentos, estado

nutricional, entre outras (KARNAKIS, GIGLIO, 2012).

A aplicação desse instrumento facilita a identificação precoce de problemas de

natureza biopsicossocial, através de testes e escalas padronizadas, que auxíliam o

planejamento de cuidados mais eficazes, eficientes e seguros. Essa abordagem reduz a

ocorrência de possíveis iatrogenias e limita o agravo do comprometimento funcional do idoso

(WELSH, GORDON, GLADMAN, 2013).

Estudos apontam para os benefícios relacionados à avaliação da funcionalidade nos

serviços de assistência ao idoso (hospital, hospital-dia, ambulatório e domicílio),

evidenciando que essa prática associa-se com menores gastos com saúde, redução do número

e tempo de internações, redução das institucionalizações, melhora da qualidade de vida,

menor frequência de polifarmácia, melhora no desempenho nas atividades de vida diárias e

redução dos índices de mortalidade (NISHINAGA, 2007).

A utilização dessa abordagem em diferentes grupos de idosos permite a investigação

de complicações relacionadas à saúde dessa população. Com suas escalas de rastreio, a

identificação da funcionalidade global pode ser quantificada, permitindo a comparação entre

os fatores de riscos relacionados ao envelhecimento fisiológico e patológico. Além disso,

mostra-se eficiente como um instrumento de acompanhamento de intervenção clínica, seja

dentro de estratégias de prevenção ou de tratamento.

Os múltiplos aspectos que envolvem o envelhecimento obrigam a geração de

pesquisas que possam entender as alterações progressivas não patológicas, biológicas e

fisiológicas que influenciam na capacidade funcional do idoso. A realização desses estudos

busca o envelhecer bem sucedido, com qualidade de vida, que só pode ser compreendido na

34

sua totalidade através de estudos interdisciplinares, com a integração das áreas biológicas,

clínicas e sociais (NETTO, 2011).

Essa integração da área clínica com a biológica é o método de estudo das

investigações translacionais, que em geriatria da origem ao termo gerontologia biomédica ou

biogerontologia. Tal abordagem busca explicações para o processo de envelhecimento a nível

molecular ou celular, bem como das doenças relacionadas ao mesmo e o seu reflexo sobre as

condições clínicas dos pacientes (NETTO, 2011, BOLLHEIMER et al., 2013).

Os parâmetros obtidos na avaliação clínica e funcional podem ser associados aos

potenciais biomarcadores, permitindo a visualização global do processo de envelhecimento,

desde as alterações moleculares até os reflexos sobre a capacidade funcional, que interferem

sobre a qualidade de vida dos idosos. A aproximação entre esses parâmetros facilitam a

identificação de problemas remediáveis que implicam na prevenção, tratamento, prognóstico

e na reabilitação em saúde do idoso.

Assim, a proposta do presente estudo é aplicável por buscar entender a associação

entre processo de envelhecimento e a capacidade funcional, considerando os polimorfismos

de biomarcadores do envelhecimento, identificados no sangue periférico, e os instrumentos de

domínio clínico-funcional. Esse conhecimento esclarece a compreensão da suscetibilidade ao

desenvolvimento de incapacidades no envelhecimento.

A análise desses biomarcadores baseia-se na perspectiva de utilizá-los como um teste

de rastreio populacional, o que facilitará um diagnóstico precoce das possíveis incapacidades.

Assim, a identificação de associações desses polimorfismos com incapacidades funcionais

poderá permitir, futuramente, o rastreio de idosos com maior suscetibilidade de desenvolver

as mesmas, permitindo instituir o monitoramento e o tratamento precoce, diminuindo o risco

da morbimortalidade e, consequentemente, os custos com saúde.

O ensaio utilizado para investigação desses biomarcadores possui características ideais

para um screening populacional: metodologia minimamente invasiva, com aplicabilidade

relativamente fácil e rápida, de baixo custo e que exige pouca quantidade de DNA do

paciente. Sua aplicação na rotina clínica poderá auxíliar a predizer a saúde do idoso de forma

interdisciplinar, embasar estratégias de prevenção, facilitar a gestão e a elaboração de futuros

planos de cuidados.

35

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo do presente estudo foi investigar a possível associação entre a variabilidade

dos polimorfismos presentes em biomarcadores do envelhecimento (TP53, MDM2, UCP2,

HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFkB1) e a capacidade funcional do idoso.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Demonstrar o perfil clínico e funcional de 228 idosos.

Identificar o perfil de ancestralidade genética de 228 idosos.

Investigar a frequência dos polimorfismos dos genes TP53, MDM2, UCP2, HLA-G,

IL-1a, IL-4 e NFkB1 de 228 idosos.

Analisar o risco de variantes dos polimorfismos dos genes TP53, MDM2, UCP2, HLA-

G, IL-1a, IL-4 e NFkB1 para a capacidade funcional de 228 idosos.

36

5 MATERIAIS E MÉTODOS

O estudo foi realizado a partir do aceite do Orientador (Anexo I), do Coorientador, da

aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Núcleo de Pesquisa em Oncologia –

NPO/UFPA (Anexo II), Hospital Universitário João de Barros Barreto – HUJBB/UFPA

(Anexo III), a autorização do Laboratório de Exercício Resistido em Saúde – LERES/UEPA

como instituição coparticipante e da autorização dos voluntários a partir da assinatura do

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE (Apêndice I), após os mesmos terem

sido informados dos riscos e benefícios da avaliação ao qual foram submetidos, de acordo

com a Resolução do Conselho Nacional de Saúde (CNS) 466/2012, que consta de todas as

informações acerca da pesquisa.

5.1 TIPO DE ESTUDO

Trata-se de um estudo transversal analítico comparativo, desenvolvido a partir da

avaliação clínico-funcional e análise dos polimorfismos presentes em biomarcadores do

envelhecimento (TP53, MDM2, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFKB1).

5.2 AMOSTRA

A amostra foi composta por 235 idosos, sendo 113 do LERES/UEPA e 122 do

HUJBB/UFPA. Foram aceitos no estudo, indivíduos de ambos os gêneros, com idade igual ou

superior a 60 anos, oriundos das duas instituições listadas acima, que demonstrassem interesse

na participação voluntária no estudo, através da assinatura do TCLE. Em casos de

analfabetismo ou incapacidade motora para escrever, os indivíduos que contribuíram com o

estudo foram acompanhados por seu representante legal e convidados a assinar o TCLE ou

deixar sua impressão digital, após a explicação detalhada do presente estudo.

Foram excluídos do estudo, sete indivíduos por não possuírem informações completas

dos seus dados sobre o polimorfismo dos biomarcadores, totalizando somente 228 idosos para

análise do estudo. Além desse critério de exclusão foram citados outros: indivíduos que

apresentaram dificuldade para responder os questionários e/ou impossibilitados de realizar os

testes da funcionalidade, os que no momento da aplicação da avaliação apresentar sinais de

instabilidade hemodinâmica ou impossibilidade de realizar a coleta de sangue periférico.

37

5.3 COLETA DE DADOS

A coleta de dados da pesquisa foi realizada em cinco etapas: aplicação da avaliação

clínica e funcional, coleta de sangue total, extração e quantificação do DNA, genotipagem

para determinação da ancestralidade individual e para investigação dos polimorfismos de

biomarcadores do envelhecimento, ambos de leucócitos do sangue periférico.

5.3.1 Avaliação Clínica e Funcional

A avaliação clínica e funcional caracterizou-se por ser um instrumento interdisciplinar,

baseada em escalas e testes quantitativos, permitindo uma visão global da saúde dos pacientes

(Anexo IV). Foi subdividida em: Avaliação Sociodemográfica, Clínica e Epidemiológica e da

Funcionalidade.

5.3.1.1 Avaliação Sociodemográficos

A avaliação sociodemográfica coletou dados que facilitaram a caracterização da

amostra, incluindo: identificação, gênero, idade, cor da pele, estado civil, escolaridade,

profissão e ocupação atual.

5.3.1.2 Avaliação Clínica e Epidemiológica

Esse item destinou-se a investigar as possíveis doenças diagnosticadas, as queixas de

saúde, os hábitos de vida (etilismo, tabagismo e sedentarismo) e as comorbidades presente.

Para o histórico de etilismo o idoso foi classificado como: não etilista, etilista, ex-etilista. Para

o histórico de tabagismo foi classificado como: não tabagista, tabagista, ex-tabagista. No que

se refere ao sedentarismo o idoso foi classificado como: ativo (pratica exercício físico

regularmente, pelo menos duas vezes por semana) e sedentário (não faz nenhum tipo de

exercicio físico regular).

A presença de comorbidades foi avaliada através do Índice de Comorbidades de

Charlson (ICC). O ICC é um instrumento que considera o número e a severidade das

comorbidades, inclui 19 condições clínicas, com pesos de valores 0 a 6 (0 para aquelas

condições fora as 19 presentes na escala), atribuídos mediante o risco de mortalidade, sendo

38

posteriormente somados, com uma pontuação que varia de 0 a 43 pontos, ajustado pela idade

(HALL et al., 2004; PERKINSA et al., 2004; MARCHENA-GOMEZ et al., 2009).

5.3.1.3 Avaliação da Capacidade Funcional

A avaliação da capacidade funcional incluiu a aplicação da Escala de Katz (Atividades

Básicas de Vida Diária - ABVD), a Escala de Lawton (Atividades Instrumentais de Vida

Diária - AIVD), Escala de Avaliação das Atividades Avançadas de Vida Diária (AAVD),

Escala Performance Status do Eastern Cooperative Oncology Group (PS-ECOG), a avaliação

dos sistemas funcionais e avaliação funcional nutricional.

A Escala de Katz avaliou as ABVD, referentes às tarefas necessárias para o cuidado

com corpo ou autopreservação, foi composta por 6 domínios, com um escore total que varia

de 6 a 18 pontos, permitindo classificar o idoso como independente (6 pontos),

semidependente (7 a 16 pontos) e dependente (acima de 16 pontos) (QUARESMA, 2008;

AFONSO et al., 2013; JUNG et al., 2013).

A Escala de Lawton avaliou as AIVD, referentes às tarefas necessárias para o cuidado

com o domicílio ou atividades domésticas, foi composta por 9 domínios, com um escore total

que varia de 9 a 27 pontos, permitindo classificar o idoso como dependente (9 pontos),

semidependente (10 a 18 pontos) e independente (19 a 27 pontos) (NOGUEIRA, GARCIA,

2008; MELO, SAINTRAIN, 2009; FLORIANÓPOLIS, 2011).

A Escala para avaliação das AAVD, referente às atividades produtivas, recreativas e

sociais, foi composta de 12 perguntas, com um escore total que varia de 12 a 36 pontos,

quanto maior a pontuação melhor a funcionalidade do idoso. Os idosos foram classificados

também segundo a quantidade de atividades realizadas: mais ativos, os que realizavam quatro

ou mais atividades; menos ativos, os que realizavam três ou menos atividades (RODRIGUES,

NERI, 2012; FIGUEIREDO et al., 2013; OLIVEIRA, NERI, D’ELBOUX, 2013; OLIVEIRA

et al., 2015).

A Escala PS-ECOG, avaliou como a doença afeta as habilidades de vida diária do

paciente, com um escore que varia de 0 a 5 pontos, permitindo classificar o paciente com o

índice 0 (atividade normal), 1 (sintomas da doença, mas deambula e leva seu dia a dia

normal), 2 (fora do leito por mais de 50% do tempo), 3 (no leito mais de 50% do tempo,

carente de cuidados mais intensivos), 4 (preso no leito) e 5 (morto) (ECOG, 2006; CORREA

et al., 2012).

39

5.3.1.4 Avaliação dos Sistemas Funcionais

A avaliação dos sistemas funcionais incluiu testes apropriados para a análise da

cognição (Escala Mini-Exame do Estado Mental – MEEM), humor (Escala de Depressão

Geriátrica de Yesavage – GDS 15) e mobilidade (Teste Timed Up and Go – TUG; Escala de

Mobilidade e Equilíbrio Tinetti – TT), indicada pela sua simplicidade, rapidez, portabilidade,

fidedignidade e pela sua utilidade como indicadora da presença de incapacidades (MORAES,

2012).

A função cognitiva foi avaliada através do MEEM, composto por 11 domínios, com o

escore total que varia de 0 a 30 pontos. É um teste de rastreio que possibilita classificar o

idoso como normal ou com possível demência, considerando sua escolaridade, com escore de

normalidade de 13 pontos para analfabetos, 18 pontos para aqueles entre 1 e 8 anos de estudo

e 26 pontos para aqueles com mais de 8 anos de estudo (LENARDT et al., 2013; RAZALI et

al., 2014).

O humor foi avaliado pela GDS-15, composta por 15 perguntas, com escore total que

varia de 0 a 15 pontos. Através dessa escala pode-se obter o resultado dentro da normalidade

(0 a 5 pontos), com depressão (6 a 10 pontos) ou com depressão grave (11 a 15 pontos)

(FERRARI, DALACORTE, 2007; PRATA et al., 2011).

A mobilidade foi analisada através do TUG e do TT. No TUG o idoso foi submetido a

um trajeto de 3 metros de ida e volta, sendo devidamente cronometrado e classificado

conforme o tempo de desempenho: mobilidade normal (<10s); boa mobilidade (11-20s);

mobilidade regular (21-30s) e mobilidade prejudicada (>30s) (MARTINS, MAIA, PEREIRA,

2007; BRETAN et al., 2013).

O TT avaliou a mobilidade levando em consideração o risco de queda, subdivido em

16 domínios, de 1 a 9 (avalia o equilíbrio) e de 10 a 16 (avalia a marcha). Possui um escore

que varia de 0 a 28 pontos, permitindo classificar o idoso com alto risco de queda (<19

pontos), risco moderado de queda (19 a 24 pontos) e baixo risco de queda (>24 pontos)

(SILVA et al., 2008; KARUKA, SILVA, NAVEGA, 2011).

5.3.1.5 Avaliação do Estado Nutricional

A avaliação funcional nutricional foi realizada através da mensuração do peso, altura,

índice de massa corpórea, perímetro da panturrilha e na aplicação da Miniavaliação

Nutricional (MAN), um instrumento rápido e fácil de ser aplicado, com o poder de detectar o

40

risco elevado de desnutrição. Composta por 18 itens divididos em Triagem e Avaliação

Global, com um escore que varia de 0 a 30 pontos, permitindo classificar o idoso com estado

nutricional normal (27 a 30 pontos), sob risco de desnutrição (17 a 23,5 pontos) e desnutrido

(<17 pontos) (CALVO et al., 2012; URREA, MESEGUER, 2013).

Como subitem da MAN, foi avaliado o Perímetro da Panturrilha (PP), que é o

perímetro máximo no plano perpendicular à linha longitudinal da panturrilha, uma medida

sensível para avaliação da massa muscular, onde a redução indica a diminuição da força da

musculatura. As medidas menores que 31 cm indicam redução da massa muscular

(sarcopenia) e estão associadas ao maior risco de quedas, diminuição da força muscular e

dependência funcional. As medidas entre 31 e 34 cm podem significar uma tendência à

sarcopenia. E as medidas acima de 35 cm estão dentro da normalidade (CRUZ-JENTOFT et

al., 2010; AMORIM, PESSOA, 2014).

5.3.2 Coleta do Sangue Total

A investigação de polimorfismos de biomarcadores do envelhecimento foi realizada

utilizando uma amostra do sangue total (4ml) do paciente, coletado no LERES e no HUJBB,

em tubo EDTA utilizando métodos bem estabelecidos e por profissionais devidamente

capacitados, evitando possíveis complicações provenientes dessa etapa da pesquisa.

Esse material foi devidamente armazenado, congelado a -20°C, no Núcleo de Pesquisa

em Oncologia, para posterior análise relacionada exclusivamente ao presente estudo. Após a

análise, o material biológico será devidamente descartado, conforme normas vigentes de

órgãos técnicos competentes, respeitando-se a confidencialidade e a autonomia do sujeito da

pesquisa.

5.3.3 Extração, Quantificação e Diluição do DNA

Para analise dos polimorfismos foi necessária a extração do DNA genômico de

leucócitos do sangue periférico, usando o Kit Mini Spin Plus (P.250, Biopur, Biometrix,

Brasil). O kit abrange as seguintes etapas: lise da amostra, ligação do DNA genômico à

membrana do tubo, lavagem da membrana e eliminação do etanol e eluição do DNA

genômico (Figura 12), seguindo o protocolo para extração do sangue total de humanos

(ANEXO VI).

41

A quantificação do DNA foi realizada no Espectrofotômetro NanoDrop 1000 (Thermo

Scientific NanoDrop 1000; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Depois de

quantificada a mostra foi diluída para uma concentração de 10ng/ul.

Figura 12. Extração do DNA genômico.

Fonte: Biopur, 2014.

5.3.4 Determinação da Ancestralidade

A análise da ancestralidade das amostras foi realizada de acordo com Santos et al.

(2010), utilizando 48 marcadores informativos de ancestralidade autossômica (AIMS). Foram

realizadas três reações de PCR multiplex, cada uma com 16 marcadores. Os amplicons de

PCR foram analisados por eletroforese usando o sequenciador ABI Prism 3130 e o software

GeneMapper ID v.3.2. As proporções individuais de ancestralidade genética Europeia,

Africana e Ameríndia foram estimadas usando o software Structure V.2.3.3, assumindo três

populações parentais (europeia, africana e ameríndia) (CARVALHO et al., 2015).

5.3.5 Analise dos Polimorfismos

Os 8 polimorfismos do estudo foram genotipados (Quadro 1) por uma reação de PCR

multiplex seguida de uma eletroforese capilar. Para as amplificações foram utilizados 0,5 µL

do kit QIAGEN Multiplex PCR (QIAGEN, Alemanha), 1,0 µL de Q-solution, 1,0 µL de

Primer Mix, 2,0 µL de água e 20 ng de DNA. A PCR foi realizada seguindo o protocolo a

seguir: uma desnaturação inicial a 95οC por 15 minutos, 35 ciclos a 94

οC por 45 segundos,

60οC por 90 segundos e 72

οC por 60 segundos, seguidos de uma extensão final de 70

οC por

30 minutos. A análise dos amplicons de PCR foi realizada a partir de uma eletroforese usando

o sequenciador ABI Prism 3130 e o software GeneMapper ID v.3.2.

42

Quadro 1. Caracterização Técnica dos Polimorfismos INDEL Investigados.

Gene Identificação Tipo Comp. Iniciadores Amplificação

TP53 rs17878362 INDEL 16 pb F-5'GGGACTGACTTTCTGCTCTTGT3'

148-164 pb R-5'GGGACTGTAGATGGGTGAAAAG3'

TP53 rs17880560 INDEL 6 pb F-5'TCCATTCATAACTCAGGAACCA3'

135-141 pb R-5'TTAAATCCCGTAATCCTTGGTG3'

MDM2 rs3730485 INDEL 40 pb F-5'GGAAGTTTCCTTTCTGGTAGGC3'

192-232 pb R-5'TTTGATGCGGTCTCATAAATTG3'

UCP2 - INDEL 45 pb F-5'CCCACACTGTCAAATGTCAACT3'

119-164 pb R-5'CCATGCTTTCCTTTTCTTCCT3'

HLA-G rs371194629 INDEL 14 pb F-5’CTGTTTAAAGTGTCACCCCTCAC3’

192-206 pb R-5’CAGTTCAGCATGAGGAAGAGG3’

IL-1a rs3783553 INDEL 4 pb F-5’TGGTCCAAGTTGTGCTTATCC3’

230-234 pb R-5’ACAGTGGTCTCATGGTTGTCA3’

IL-4 rs79071878 VNTR 70 pb F-5’AGGGTCAGTCTGGCTACTGTGT3’ 147/217/287

pb R-5’CAAATCTGTTCACCTCAACTGC3’

NFKB1 rs28362491 INDEL 4 pb F-5'TATGGACCGCATGACTCTATCA3'

366-370 pb R-5'GGCTCTGGCATCCTAGCAG3'

5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Foi realizada uma análise descritiva dos dados referentes à caracterização da amostra,

utilizando a frequência absoluta, porcentagens, média e desvio padrão. As variáveis

quantitativas foram primeiramente submetidas ao teste Kolmogorov-Smirnov para análise da

distribuição de normalidade.

As frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos foram determinadas por

contagem direta dos alelos, e em seguida foi calculado o equilíbrio de Hardy-Weinberg

(HWE) utilizando o software Alerquein 3.5.1.2. As proporções individuais das ancestralidades

genéticas europeia, africana e ameríndia foram estimadas através do software Structure 2.3.3.

Para analisar a associação dos polimorfismos estudados com as variáveis da

capacidade funcional, foi realizada uma análise de variância entre os grupos de genótipos de

cada polimorfismos, através do testes de Kruskal-Wallis e o Mann Whitney. Os mesmos

testes foram aplicados para fazer análise comparativa da variância das categorias da

capacidade funcional. Para análise de risco dos polimorfismos sobre as variáveis da

capacidade funcional, foi realizada uma Regressão Logística controlada pelas covariáveis:

gênero, idade, comorbidade e sedentarismo.

Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o pacote estatístico do software

SPSS 20.0, respeitando o nível de significância de 5% (p-valor ≤ 0,05).

43

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram avaliados 228 idosos, na sua maioria mulheres (62%), com aproximadamente

70 anos de idade em média, com índice de comorbidade médio de 4,48 (±2,44) pontos,

sedentários (53%), com histórico de tabagismo (58%) e possuidores de uma ancestralidade

predominantemente europeia. A descrição completa das características demográficas e

clinicas da amostra estão expostas na Tabela 1.

Tabela 1: Característica demográfica e clínica da amostra de idosos investigados (n=228).

Variáveis ≤70 anos (n=125) >70 anos (n=103) Total (n=228)

Gênero

Masculino 47 (0.38) 40 (0.39) 87 (0.38)

Feminino 78 (0.62) 63 (0.61) 141 (0.62)

Idade

Média (dp) 64.59 ± 3.45 77.82 ± 5.65 70.57 ± 8.02

Comorbidades (ICC)

Média (dp) 3.79 ± 2.24 5.32 ± 2.43 4.48 ± 2.44

Sedentarismo

Sim 60 (0.48) 60 (0.58) 120 (0.53)

Não 65 (0.52) 43 (0.42) 108 (0.47)

Etilismo

Sim 70 (0.56) 43 (0.42) 113 (0.49)

Não 55 (0.44) 60 (0.58) 115 (0.51)

Tabagismo

Sim 77 (0.62) 55 (0.53) 132 (0.58)

Não 48 (0.38) 48 (0.47) 96 (0.42)

Ancestralidade

Europeu 0.446 ± 0.166 0.463 ± 0.184 0.453 ± 0.174

Ameríndio 0.310 ± 0.145 0.293 ± 0.154 0.302 ± 0.149

Africano 0.243 ± 0.141 0.243 ± 0.142 0.243 ±0.142

ICC: Índice de Comorbidade de Charlson.

No que se refere às características da capacidade funcional dos idosos incluídos no

estudo, observou-se que 33% deles apresentava algum grau de limitação funcional

(semidependentes ou dependentes) para as atividades básicas e instrumentais de vida diária.

Aproximadamente 50% dessa população foi considerada menos ativa na realização das

atividades avançadas de vida diária. No que se refere à dependência funcional, a partir na

análise do PS-ECOG, observou-se que 54% dos idosos possuíam um escore maior que zero.

Nas escalas de rastreio para as síndromes ligadas aos sistemas funcionais, identificou-

se que em média, os idosos possuíam sua autonomia preservada, com a cognição e o humor

44

dentro dos padrões de normalidade. No que se refere à independência, na mobilidade

observou-se alteração em 36% dos idosos, o que pode ter refletido sobre o risco que queda,

onde apresentaram alto risco para o evento queda, pelo escore médio do agrupamento total.

No estado nutrição, a condição de desnutrição foi frequente em apenas 14% dos

idosos. No que se refere a sarcopenia, em média os idosos apresentaram uma tendência do

desenvolvimento da mesma, com perímetro da panturrilha entre 31 e 34 cm. No entanto, 33%

deles possuíam indicativos de sarcopenia, pelos mesmos métodos de triagem.

Tabela 2: Características Funcionais e Nutricionais da amostra de idosos investigados (n=228).

Variáveis ≤70 anos (n=125) >70 anos (n=103) Total (n=228)

Capacidade Funcional

Atividades Básicas – ABVD 8.21 ± 3.50 9.34 ± 4.43 8.73 ± 3.98

Atividades Instrumentais – AIVD 21.85 ± 6.93 18.37 ± 7.61 20.27 ± 7.44

Atividades Avançadas – AAVD 25.47 ± 4.98 23.85 ± 4.78 24.73 ± 4.95

Performace Status - PS-ECOG 1.17 ± 1.50 1.70 ± 1.64 1.41 ± 1.58

Sistemas Funcionais

Cognição – MEEM 22.20 ± 4.69 19.59 ± 5.50 21.02 ± 5.23

Humor - GDS-15 1.61 ± 2.13 1.89 ± 2.23 1.74 ± 2.18

Mobilidade – TUG 15.73 ± 9.99 19.86 ± 9.87 17.61 ± 10.13

Risco de Quedas – TT 20.59 ± 9.94 16.99 ± 10.59 18.95 ± 10.37

Estado Nutricional

Mini-Avaliação Nutricional - MAN 24.23 ± 6.15 20.82 ± 7.89 22.69 ± 7.18

Sarcopenia

Perímetro da Panturrilha (cm) 33.13 ± 4.14 30.85 ± 3.56 32.10 ± 4.05

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades

Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM:

Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT:

Teste de Tinetti; MAN: Mini-Avaliação Nutricional.

A avaliação clínica incluiu no estudo inicialmente 235 idosos, no entanto o acesso às

amostras de DNA só foram obtidos com sucesso em 228 idosos, o que configurou a exclusão

de sete indivíduos devido à ausência de dados genéticos que pudessem ser relacionados com

as variáveis clínicas e funcionais pesquisadas. Dos 228 idosos inclusos, foi realizada a

estatística para as frequências dos genótipos de cada polimorfismos, onde foi evidenciado que

todos os polimorfismos apresentavam-se em HWE, como exposto na Tabela 3.

45

Tabela 3. Estatísticas da frequência de cada genótipo dos idosos investigados (n=228).

Biomarcadores Identificação Genótipo Frequência Equilíbrio de Hardy-Weimberg

(p-valor)

TP53 rs17878362

DD 172 (0.75)

0.0583 DI 53 (0.23)

II 3 (0.01)

TP53 rs17880560

DD 148 (0.65)

0.8345 DI 72 (0.32)

II 8 (0.04)

MDM2 rs3730485

DD 12 (0.05)

0.7724 DI 84 (0.37)

II 132 (0.58)

UCP2 -

DD 100 (0.44)

0.1547 DI 109 (0.48)

II 19 (0.08)

HLA-G rs371194629

DD 83 (0.36)

0.2459 DI 102 (0.45)

II 43 (0.19)

IL-1a rs3783553

DD 37 (0.16)

0.2476 DI 120 (0.53)

II 71 (0.31)

IL-4 rs79071878

DD 35 (0.15)

0.2957 DI 99 (0.43)

II 94 (0.41)

NFKB1 rs28362491

DD 54 (0.24)

0.9412 DI 115 (0.50)

II 59 (0.26)

DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

A análise dos polimorfismos dos biomarcadores pela variância da funcionalidade, dos

sistemas funcionais, do estado nutricional e da sarcopenia, contou com a determinação das

frequências genotípicas, bem como o desempenho médio de cada variável. O aprofundamento

dessas análises utilizou a investigação do risco dos genótipos sobre as variáveis funcionais.

Na investigação da associação do polimorfismo do TP53 (rs17878362), foi possível

identificar que os idosos detentores do alelo D apresentaram um melhor desempenho

significativo nas ABVDs, nas AAVDs, no PS-ECOG, no MEEM, no GDS-15 e no TUG.

Melhor estado nutricional (MAN) e perímetro da panturrilha maior. Esses dados sugerem que

o alelo D seria um fator de proteção para a funcionalidade do idoso, fato esse não observado

de forma significativa, como exposto na Tabela 4. No outro polimorfismo do TP53

(rs17880560) se observou que os idosos com alelo I possuíam um perímetro da panturrilha em

média maior, sugerindo um fator de proteção, que não foi significante (Tabela 5).

46

Tabela 4: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene TP53 (rs17878362) dos idosos investigados (n=228).

TP53 (rs17878362) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=3) DI (n=53) DD (n=172) DI+DD (n=225) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 15.67 ± 4.04 8.23 ± 3.05 8.75 ± 4.14 8.63 ± 3.91 0.028 0.007 0.161 0.10 (0.00 - 2.46)

AIVD 14.00 ± 8.66 20.40 ± 7.37 20.34 ± 7.44 20.35 ± 7.40 0.224 0.088 0.389 0.33 (0.02 - 4.11)

AAVD 18.33 ± 1.15 24.46 ± 4.22 24.93 ± 5.13 24.82 ± 4.92 0.057 0.020 0.999 0.00 (0.00 - 0.00)

PS-ECOG 3.33 ± 1.15 1.34 ± 1.45 1.40 ± 1.61 1.38 ± 1.57 0.115 0.037 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 15.33 ± 2.88 20.88 ± 5.84 21.16 ± 5.02 21.10 ± 5.21 0.132 0.045 0.999 0.00 (0.00 - 0.00)

GDS-15 4.67 ± 0.57 1.85 ± 2.49 1.65 ± 2.06 1.70 ± 2.16 0.056 0.017 0.771 1.02 (1.00 - 1.05)

TUG 31.00 ± 0.00 18.33 ± 9.47 17.14 ± 10.26 17.42 ± 10.07 0.070 0.035 0.999 0.00 (0.00 - 0.00)

TT 7.33 ± 9.23 19.73 ± 9.29 18.92 ± 10.63 19.11 ± 10.31 0.165 0.058 0.999 0.00 (0.00 - 0.00)

Estado Nutricional

MAN 13.50 ± 3.04 23.30 ± 6.54 22.66 ± 7.32 22.81 ± 7.14 0.113 0.037 0.777 0.70 (0.06 - 8.09)

Sarcopenia

PP (cm) 27.66 ± 1.52 32.06 ± 4.28 32.20 ± 3.97 32.16 ± 4.04 0.081 0.027 0.999 0.00 (0.00 - 0.00)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

47

Tabela 5: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene TP53 (rs17880560) dos idosos investigados (n=228).

TP53 (rs17880560) IIvsDIvsDD II+DIvsDD Presença do Alelo I

II (n=8) DI (n=72) DD (n=148) II+DI (n=80) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 8.25 ± 2.65 8.18 ± 3.48 9.00 ± 4.24 8.19 ± 3.38 0.752 0.484 0.132 0.33 (0.08 - 1.38)

AIVD 18.75 ± 7.64 21.46 ± 7.01 19.80 ± 7.59 21.17 ± 7.07 0.268 0.164 0.481 0.71 (0.28 - 1.81)

AAVD 23.50 ± 3.58 24.87 ± 4.75 24.74 ± 5.11 24.72 ± 4.64 0.784 0.950 0.521 0.70 (0.24 - 2.05)

PS-ECOG 2.00 ± 1.51 1.16 ± 1.49 1.49 ± 1.62 1.25 ± 1.50 0.223 0.321 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 21.75 ± 5.06 21.61 ± 5.21 20.70 ± 5.25 21.63 ± 5.16 0.385 0.167 0.829 1.07 (0.57 - 1.97)

GDS-15 1.00 ± 1.06 1.39 ± 1.78 1.94 ± 2.36 1.35 ± 1.72 0.382 0.167 0.369 0.38 (0.04 - 3.34)

TUG 19.13 ± 8.45 15.94 ± 9.66 18.29 ± 10.38 16.28 ± 9.54 0.279 0.290 0.135 0.51 (0.21 - 1.23)

TT 17.50 ± 10.83 20.13 ± 10.03 18.49 ± 10.52 19.85 ± 10.07 0.445 0.419 0.401 0.68 (0.27 - 1.66)

Estado Nutricional

MAN 21.81 ± 6.82 24.17 ± 6.45 22.04 ± 7.45 23.92 ± 6.48 0.166 0.097 0.085 0.41 (0.15 - 1.13)

Sarcopenia

PP (cm) 31.50 ± 3.33 33.41 ± 4.35 31.52 ± 3.81 33.21 ± 4.28 0.008 0.005 0.415 0.73 (0.35 - 1.53)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

48

A proteína p53 possui uma função chave na regulação e resposta ao dano célular ao

longo da vida. Dependendo das suas isoformas, a proteína é responsável por diversas funções:

controle do ciclo celular, senescência, envelhecimento e a neurodegeneração. A desregulação

dessa proteína, causada, por exemplo, por polimorfismos germinativos, pode levar ao

desenvolvimento de doenças crônicas e ao envelhecimento precoce. Entre as alterações

comuns no gene TP53 as inserções e deleções representam 9% do total. Estudos apontam que

polimorfismos nesse gene podem estar fortemente associados à síndrome da fragilidade em

idosos e a sua expectativa de vida (CHUNG et al., 2010; MUSTAFINA et al., 2012;

RICHARDSON, 2013; JORUIZ, BOURDON, 2016).

Os polimorfismos rs17878362 e rs17880560 do TP53 alteram a expressão da p53, o

que pode diminui a expressão da proteína (MORTEN et al., 2016). Esses polimorfismos

abordados no presente estudo, não apresentaram risco significativo para o desenvolvimento de

incapacidades funcionais. No entanto, ao comparar os grupos com os diferentes

polimorfismos foram observadas diferenças no desempenho funcional, sugerindo que o alelo

D (rs17878362) e o alelo I (rs17880560) conferem um fator de proteção, com desempenho

melhores para todas as variáveis rastreadas e proteção para sarcopenia.

Estudos apontam que esse gene pode estar relacionado à atrofia do músculo

esquelético comum no envelhecimento, à caquexia e à sarcopenia, mas os mecanismos

envolvidos ainda não são totalmente compreendidos. No entanto, Renzo et al. (2014)

investigam a associação de outro polimorfismo no TP53 (G>C, no éxon 4, códon 72) com o

risco significativo para sarcopenia, evidênciando que a genotipagem desse e de outros

polimorfismos do gene TP53 são úteis para avaliar o risco sarcopenia.

A relação entre os polimorfismos do TP53 e o envelhecimento possui mecanismos

complexos, que envolve diferentes vias de sinalização, regulação e metabolização. Como a

regulação exercida pelo feedback da proteína MDM2. Em um estudo realizado com modelo

animal, foi observado que mutações ou alterações no sítio de ligação entre a p53 e a MDM2

comprometeria a capacidade de regulação exercida pela MDM2, o que favoreceria um

aumento da apoptose, levando a um envelhecimento acelerado (GANNON et al., 2011).

No presente estudo, na análise geral do polimorfismo do gene MDM2 (rs3730485), as

frequências genotípicas foram 132, 84 e 12 para II, DI e DD, respectivamente. Não houve

diferenças significativas entre a variância do desempenho dos itens pesquisados. O mesmo

resultado se estende à estimativa dos possíveis riscos para funcionalidade do idoso associados

à presença do alelo D. Esses dados podem ser mais bem observados na Tabela 6.

49

Tabela 6: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene MDM2 (rs3730485) dos idosos investigados (n=228).

MDM2 (rs3730485) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=132) DI (n=84) DD (n=12) DI+DD (n=96) p-valora p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 8.61 ± 3.86 9.03 ± 4.35 8.00 ± 2.66 8.89 ± 4.17 0.984 0.880 0.981 1.01 (0.33 - 3.08)

AIVD 20.18 ± 7.36 20.42 ± 7.69 20.17 ± 7.13 20.38 ± 7.58 0.906 0.658 0.257 1.63 (0.69 - 3.83)

AAVD 24.95 ± 4.89 24.19 ± 4.86 25.92 ± 6.08 24.42 ± 5.04 0.365 0.432 0.052 1.96 (0.67 - 5.71)

PS-ECOG 1.37 ± 1.55 1.46 ± 1.64 1.50 ± 1.62 1.47 ± 1.63 0.942 0.744

Sistemas Funcionais

MEEM 21.07 ± 4.70 20.84 ± 6.15 21.58 ± 4.48 20.94 ± 5.94 0.910 0.718 0.907 0.96 (0.52 - 1.75)

GDS-15 1.74 ± 2.07 1.77 ± 2.43 1.50 ± 1.62 1.74 ± 2.34 0.966 0.793 0.827 0.81 (0.12 - 5.44)

TUG 17.63 ± 10.19 17.62 ± 10.19 17.25 ± 9.81 17.57 ± 10.09 0.997 0.999 0.350 0.67 (0.29 - 1.53)

TT 18.87 ± 10.27 19.01 ± 10.71 19.42 ± 10.04 19.07 ± 10.57 0.975 0.826 0.133 0.52 (0.22 - 1.21)

Estado Nutricional

MAN 22.79 ± 7.18 22.32 ± 7.30 23.95 ± 5.54 22.54 ± 7.08 0.879 0.768 0.993 0.99 (0.42 - 2.31)

Sarcopenia

PP (cm) 32.30 ± 4.04 31.75 ± 3.67 32.16 ± 6.22 31.80 ± 4.06 0.729 0.475 0.728 0.88 (0.44 - 1.76)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

50

Além das vias de controle do ciclo celular, que envolvem o complexo p53-MDM2, o

envelhecimento ligado às alterações metabólicas é objeto de diversos estudos. Sabe-se que no

envelhecimento a demanda de energia aumenta para a manutenção das funções,

principalmente com o declínio da saúde. Isso inclui o entendimento dos genes das proteínas

desacopladoras (UCPs), que modificam o metabolismo mitocondrial, protegendo a célula

contra o estresse oxidativo (KIM et al., 2016).

O estresse oxidativo é visto como uma das causas do envelhecimento humano,

associado tanto com a produção como com o acúmulo de dados oxidativos, quanto com a

capacidade de prevenção e reparo desse dano.

No presente estudo, o polimorfismo do gene UCP2 (45pb INDEL) apresentou a

frequência 19, 109, 100 para II, DI e DD, respectivamente. A análise comparativa entre os

genótipos que possuíam a inserção (II+DI) e o que possuía somente a deleção (DD) revelou

resultados significativos sobre o PS-ECOG, mobilidade (TUG) e estado nutricional dos

idosos. Os detentores do alelo I apresentaram em média maior comprometimento funcional,

redução da mobilidade e risco nutricional, indicando que possivelmente esse alelo seria um

fator de risco para essas variáveis. No entanto, ao testar a associação alélica como fator de

risco, não se observou resultados significativos para essas e outras variáveis (Tabela 7).

Resultados similares foram encontrados no estudo de Dato et al. (2014), que avaliaram

os efeitos de 311 polimorfismos (SNPs) de 38 genes, relacionados ao estresse oxidativo, sobre

o estado funcional de 1089 nonagenários dinamarqueses. Inclui as variáveis: atividades

básicas de vida diária (Escala de Katz), velocidade da marcha, força de preensão manual e

estado cognitivo (MEEM). Dessas variáveis, o polimorfismo do UCP2 (rs659366) foi

associado com a velocidade da marcha dos idosos (p=0.032).

Outro estudo similar, desenvolvido por Keogh et al. (2015) testou as variantes

polimórficas do gene UCP2 (G866A) associando-as com variáveis da capacidade funcional de

idosos (velocidade da marcha – TUG, teste da caminhada de 6 minutos e teste de preensão

palmar), identificando que indivíduos com GG possuíam uma velocidade da marcha

significativamente maior, quando comparadas aos outros genótipos (AA e AG).

Esses resultados, mesmo tratando de diferentes polimorfismos, evidenciam que

polimorfismos ligados ao gene UCP2, estão relacionados ao estresse oxidativo e podem

modular o desempenho físico de idosos. Estudos apontam que a manutenção do estresse

oxidativo provoca a elevação de células senescentes do sistema imunológico (GHATREH-

SAMANI et al., 2016).

51

Tabela 7: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene UCP2 (45pb INDEL) dos idosos investigados (n=228).

UCP2 (45pd INDEL) IIvsDIvsDD II+DIvsDD Presença do Alelo I

II (n=19) DI (n=109) DD (n=100) II+DI (n=128) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 8.72 ± 4.59 8.99 ± 4.14 8.43 ± 3.70 8.95 ± 4.19 0.781 0.770 0.562 1.42 (0.43 - 4.68)

AIVD 21.83 ± 7.33 19.04 ± 7.50 21.33 ± 7.23 19.44 ± 7.51 0.078 0.100 0.084 0.45 (0.18 - 1.11)

AAVD 25.61 ± 5.22 24.41 ± 4.83 24.93 ± 5.04 24.58 ± 4.89 0.557 0.634 0.869 1.09 (0.38 - 3.11)

PS-ECOG 1.16 ± 1.67 1.66 ± 1.57 1.18 ± 1.54 1.59 ± 1.59 0.040 0.035 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 20.50 ± 4.79 20.60 ± 5.44 21.58 ± 5.06 20.59 ± 5.33 0.347 0.155 0.283 0.71 (0.39 - 1.31)

GDS-15 2.00 ± 2.00 1.53 ± 2.11 1.92 ± 2.28 1.60 ± 2.09 0.259 0.358 0.250 0.37 (0.06 - 2.10)

TUG 17.78 ± 9.61 18.92 ± 10.22 16.13 ± 10.02 18.75 ± 10.10 0.109 0.037 0.601 0.79 (0.33 - 1.89)

TT 19.67 ± 10.23 17.92 ± 10.44 19.96 ± 10.32 18.17 ± 1.59 0.236 0.094 0.246 0.58 (0.23 - 1.44)

Estado Nutricional

MAN 23.30 ± 7.35 21.69 ± 7.22 23.68 ± 7.01 21.92 ± 7.23 0.065 0.036 0.697 0.84 (0.36 - 1.98)

Sarcopenia

PP (cm) 31.72 ± 3.28 31.98 ± 4.29 32.31 ± 3.92 31.94 ± 4.15 0.539 0.315 0.496 0.78 (0.38 - 1.58)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

52

Esse envelhecimento imunológico é caracterizado por mudanças, que comprometem a

saúde de idosos, o que tem sido associado com aumento da morbidade e mortalidade. Além

disso, o processo de envelhecimento tem sido visto como um oxidante crônico, que associado

ao estresse inflamatório, provoca danos nos componentes celulares, o que leva ao declínio das

funções fisiológicas do idoso (BAUER, FUENTE, 2016).

No presente estudo investigou-se quatro genes relacionados ao sistema imunológico:

HLA-G, IL-1a, IL-4 e NFKB1. Observou-se que não houve associações significantes entre os

polimorfismos dos genes HLA-G, IL-1a e IL-4 com a capacidade funcional, sistemas

funcionais, estado nutricional e risco de sarcopenia nos idosos investigados. As diferenças

encontradas, que sugeriam risco ou proteção para as variáveis estudadas, quando controladas

pelas variáveis: gênero, idade, sedentarismo e comorbidades não revelaram significância

estatística, como descrita a seguir.

No polimorfismo do gene HLA-G (rs371194629) identificou-se diferenças

significativas na mobilidade e no risco de quedas entre idosos detentores do alelo D (DD+DI)

e dos detentores apenas do alelo I (II). Evidentemente os idosos com alelo D, possuíam

melhor desempenho no TUG e no TT. No entanto, essa associação de proteção não foi

significativa para ambas as variáveis (Tabela 8).

Para o polimorfismo do gene IL-1a (rs3783553) identificou-se significativa diferença

entre os idosos que possuíam o alelo D e os que não o possuíam. Essas diferenças foram

observadas do desempenho médio nos testes da AIVD, PS-ECOG e no Teste de Tinetti (TT).

Os idosos que apresentaram o alelo D, pela média dos testes, possuíam condições melhores de

saúde funcional. No entanto, não se pode afirmar que esse alelo confere risco ou proteção ao

desenvolvimento de incapacidades, visto que nessa análise não foram obtidos resultados

significantes (Tabela 9).

A variação do polimorfismo do gene IL-4 (rs79071878) apresentou a frequência de 94,

99, 35, para os genótipos II, DI, DD, respectivamente. Na análise desse polimorfismo, foram

observadas diferenças significativas sobre as AAVDs e sobre a cognição (MEEM), entre os

genótipos que apresentavam a presença do alelo D (DI+DD) e os que não apresentavam (II).

Os que apresentavam o alelo D possuíam um desempenho menor para as AAVDs e para a

cognição quando comparados com os que não possuíam esse alelo. Isso indica que a presença

do alelo D pode ser um fator de risco para dependência para as AAVDs e para um

comprometimento cognitivo. No entanto, a análise de risco não revelou resultados

significativos, como mostra a Tabela 10.

53

Tabela 8: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene HLA-G (rs371194629) dos idosos investigados

(n=228).

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

HLA-G (rs371194629) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=43) DI (n=102) DD (n=83) DI+DD (n=185) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 9.40 ± 4.03 8.40 ± 3.83 8.77 ± 4.15 8.56 ± 3.96 0.229 0.095 0.332 2.04 (0.48 - 8.73)

AIVD 18.65 ± 7.54 20.55 ± 7.35 20.78 ± 7.46 20.65 ± 7.38 0.344 0.153 0.959 0.97 (0.36 - 2.59)

AAVD 24.12 ± 4.43 24.91 ± 5.09 24.85 ± 5.07 24.88 ± 5.06 0.704 0.402 0.980 1.01 (0.28 - 3.61)

PS-ECOG 1.67 ± 1.64 1.26 ± 1.50 1.46 ± 1.64 1.35 ± 1.56 0.348 0.178 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 20.23 ± 5.17 21.52 ± 5.23 20.84 ± 5.25 21.21 ± 5.24 0.309 0.249 0.823 1.08 (0.52 - 2.27)

GDS-15 2.05 ± 2.12 1.56 ± 2.27 1.80 ± 2.09 1.66 ± 2.19 0.201 0.191 0.380 0.46 (0.08 - 2.64)

TUG 20.47 ± 10.42 16.70 ± 9.99 17.20 ± 9.98 16.92 ± 9.96 0.091 0.030 0.426 0.66 (0.24 - 1.82)

TT 15.86 ± 11.09 19.77 ± 9.95 19.59 ± 10.31 19.69 ± 10.08 0.083 0.026 0.727 0.52 (0.18 - 1.50)

Estado Nutricional

MAN 21.73 ± 7.10 23.21 ± 7.01 22.57 ± 7.44 22.92 ± 7.19 0.636 0.403 0.818 1.12 (0.42 - 2.98)

Sarcopenia

PP (cm) 31.81 ± 4.37 32.30 ± 3.77 32.02 ± 4.23 32.17 ± 3.97 0.715 0.439 0.669 0.85 (0.37 - 1.93)

54

Tabela 9: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene IL-1a (rs3783553) dos idosos investigados (n=228).

IL-1a (rs3783553) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=71) DI (n=120) DD (n=37) DI+DD (n=157) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 9.19 ± 4.06 8.67 ± 4.01 8.00 ± 3.71 8.51 ± 3.94 0.115 0.058 0.563 0.71 (0.22 - 2.52)

AIVD 18.46 ± 7.56 20.86 ± 7.37 21.86 ± 6.90 21.10 ± 7.25 0.056 0.019 0.354 0.67 (0.28 - 1.56)

AAVD 24.51 ± 4.50 24.78 ± 5.22 25.00 ± 4.99 24.84 ± 5.15 0.898 0.676 0.900 0.93 (0.31 - 2.76)

PS-ECOG 1.69 ± 1.58 1.34 ± 1.58 1.08 ± 1.53 1.28 ± 1.57 0.085 0.042 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 20.54 ± 5.14 21.04 ± 5.20 21.86 ± 5.52 21.24 ± 5.27 0.272 0.203 0.494 1.25 (0.65 - 2.37)

GDS-15 1.70 ± 2.06 1.82 ± 2.36 1.56 ± 1.79 1.76 ± 2.24 0.983 0.906 0.903 0.91 (0.16 - 5.13)

TUG 19.46 ± 10.44 16.96 ± 10.13 16.11 ± 9.22 16.76 ± 9.90 0.240 0.092 0.360 0.66 (0.27 - 1.59)

TT 17.24 ± 10.39 19.09 ± 10.47 21.83 ± 9.58 19.74 ± 10.30 0.023 0.038 0.245 0.58 (0.24 - 1.44)

Estado Nutricional

MAN 21.59 ± 7.27 23.20 ± 7.21 23.18 ± 6.84 23.19 ± 7.10 0.284 0.126 0.713 0.85 (0.36 - 1.99)

Sarcopenia

PP (cm) 32.12 ± 3.66 32.27 ± 4.23 31.52 ± 4.20 32.09 ± 4.22 0.794 0.791 0.674 1.16 (0.57 - 2.38)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

c Regressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

55

Tabela 10: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene IL-4 (rs79071878) dos idosos investigados (n=228).

IL-4 (rs79071878) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=94) DI (n=99) DD (n=35) DI+DD (n=135) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 8.15 ± 3.53 9.58 ± 4.28 7.91 ± 3.92 9.13 ± 4.24 0.012 0.118 0.177 2.73 (0.77 - 9.65)

AIVD 20.75 ± 7.40 19.12 ± 7.79 22.11 ± 6.10 19.92 ± 7.47 0.217 0.332 0.758 1.14 (0.48 - 2.70)

AAVD 25.58 ± 4.83 24.03 ± 4.85 24.43 ± 5.33 24.14 ± 4.96 0.072 0.024 0.331 0.57 (0.19 - 1.74)

PS-ECOG 1.26 ± 1.51 1.65 ± 1.66 1.11 ± 1.47 1.51 ± 1.62 0.197 0.301 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 22.01 ± 4.62 19.74 ± 5.95 21.83 ± 3.90 20.31 ± 5.53 0.031 0.041 0.082 1.72 (0.93 - 3.17)

GDS-15 1.77 ± 2.18 1.62 ± 2.00 1.97 ± 2.64 1.72 ± 2.18 0.821 0.559 0.666 0.70 (0.13 - 3.55)

TUG 17.01 ± 9.95 18.51 ± 10.59 16.74 ± 9.37 18.03 ± 10.27 0.797 0.596 0.566 0.77 (0.32 - 1.83)

TT 19.90 ± 10.03 17.38 ± 10.87 20.71 ± 9.52 18.28 ± 10.59 0.285 0.266 0.647 1.22 (0.51 - 2.87)

Estado Nutricional

MAN 23.78 ± 6.92 21.43 ± 7.42 23.21 ± 6.84 21.91 ± 7.28 0.087 0.055 0.302 1.59 (0.65 - 3.89)

Sarcopenia

PP (cm) 31.82 ± 4.00 32.52 ± 4.30 31.71 ± 3.43 32.30 ± 4.09 0.496 0.440 0.577 0.81 (0.40 - 1.65)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; IMC: Índice de Massa Corpórea; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção.

OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

c Regressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e

sedentarismo.

56

Entre os biomarcadores investigados, o polimorfismo do gene NFkB1 (rs28362491)

foi o que demonstrou resultados mais relevantes. A NFkB1 regula a resposta apoptótica a

danos no DNA, atuando na saúde fisiológica do organismo. Nos últimos anos mostra-se como

um elemento central na modulação do envelhecimento humano. Estudos com modelos

experimentais sugerem que a redução ou ausência da NFkB1, favorece o surgimento de

doenças relacionadas com a idade, devido o aumento da senescência celular e redução da

apoptose, o que levaria a um envelhecimento precoce (BERNAL et al., 2014; YAMINI,

2015).

Esse polimorfismo tem sido associado a várias doenças do envelhecimento, tais como

câncer e doenças inflamatórias, acreditando-se que esse polimorfismo também influencie na

longevidade (YANG et al., 2014; CHEN, CAI, LIANG, 2015; LAI et al., 2015; WANG et al.,

2015). No entanto, um estudo realizado por Kolovou et al. (2014) com 202 idosos

nonagenários e centenários não observou relação desse polimorfismo com a longevidade.

No presente estudo, o polimorfismo do NFkB1 (rs28362491) apresentou as

frequências de 59, 115 e 54, para o genótipo II, DI e DD, respectivamente. Ao testar a

diferença dos desempenhos funcionais entre os grupos de genótipos, se identificou que os

idosos com o alelo D apresentaram melhor desempenho para as AAVD quando comparados

ao grupo de homozigoto II. Além disso, também foi observado que os que possuíam o

genótipo DD e DI apresentavam um perímetro da panturrilha maior que os que o grupo com

II. Isso indica que o genótipo II pode conferir um potencial risco para sarcopenia, hipótese

confirmada de forma significante (p-valor: 0.006; OR: 3.056; IC 95%: 1.381 - 6.765), como

exposto na Tabela 11.

Segundo Ghosh et al. (2014) a inflamação crônica sistêmica é comum no processo de

envelhecimento normal. Estudos anteriores comprovaram que no músculo de idosos há um

aumento da sinalização inflamatória através do NFkB, associada a perda da massa muscular

(sarcopenia) e a síndrome da fragilidade (THALACKER-MERCER et al., 2010, BUFORD et

al., 2010).

Nesse contexto foi observado que no grupo de indivíduos com genótipo II o fator

sedentarismo aumentou o risco para a sarcopenia (p-valor: 1.13E-4

; OR: 31.477), como

observado na Tabela 12. Evidenciou-se que indivíduos com o genótipo II que não praticavam

nenhum tipo de exercício físico regular, possuíam um perímetro da panturrilha menor que

aqueles que praticavam (Gráfico 1).

57

Tabela 11: Análise do desempenho das Capacidades Funcionais e a Variação do Polimorfismo do Gene NFkB1 (rs28362491) dos idosos investigados

(n=228).

NFkB1 (rs28362491) IIvsDIvsDD IIvsDI+DD Presença do Alelo D

II (n=59) DI (n=115) DD (n=54) DI+DD (n=169) p-valor

a p-valor

b p-valor

c OR (95% IC)

Funcionalidade

ABVD 9.26 ± 4.57 8.28 ± 3.40 9.13 ± 4.40 8.55 ± 3.75 0.557 0.512 0.161 0.43 (0.13 - 1.39)

AIVD 18.38 ± 7.63 21.27 ± 7.28 20.10 ± 7.28 20.90 ± 7.28 0.035 0.018 0.143 0.50 (0.20 - 1.25)

AAVD 23.98 ± 5.19 25.35 ± 4.70 24.19 ± 5.13 24.98 ± 4.85 0.124 0.162 0.838 0.88 (0.28 - 0.27)

PS-ECOG 1.42 ± 1.58 1.20 ± 1.50 1.57 ± 1.58 1.32 ± 1.53 0.106 0.165 - -

Sistemas Funcionais

MEEM 20.45 ± 4.70 21.57 ± 5.47 20.57 ± 5.27 21.25 ± 5.41 0.130 0.200 0.285 0.66 (0.36 - 1.34)

GDS-15 1.86 ± 2.12 1.60 ± 2.23 1.87 ± 2.17 1.69 ± 2.21 0.607 0.682 0.589 1.80 (0.20 - 15.77)

TUG 18.66 ± 10.06 16.44 ± 10.07 19.08 ± 10.24 17.28 ± 10.17 0.137 0.344 0.573 1.30 (0.52 - 3.25)

TT 17.83 ± 10.91 19.92 ± 9.81 17.96 ± 10.93 19.29 ± 10.19 0.486 0.369 0.647 1.04 (0.41 - 2.64)

Estado Nutricional

MAN 20.83 ± 8.45 23.78 ± 6.31 22.41 ± 7.09 23.35 ± 6.58 0.091 0.069 0.055 0.42 (0.17 - 1.02)

Sarcopenia

PP (cm) 31.01 ± 4.26 32.65 ± 4.18 32.09 ± 3.24 32.47 ± 3.91 0.033 0.012 0.006 0.32 (0.14 - 0.72)

ABVD: Atividade Básica de Vida Diária; AIVD: Atividades Instrumentais de Vida Diária; AAVD: Atividades Avançadas de Vida Diária; PS-ECOG: Performance Status do

Eastern Cooperative Oncology Group. MEEM: Mini-Exame do Estado Mental; GDS-15: Escala de Depressão Geriátrica 15; TUG: Teste Time Up and Go; TT: Teste de

Tinetti; PP: Perímetro da Panturrilha; MAN: Mini-Avaliação Nutricional. DD: Deleção/Deleção; DI: Deleção/Inserção; II: Inserção/Inserção. OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo

de Confiança. aTeste de Kruskal-Wallis.

bTeste de Mann-Whitney.

cRegressão Logística ajustada pela idade, gênero, comorbidade e sedentarismo. Dominante II: p-valor:

0.006; 3.057 (1.381 – 6.765).

58

Tabela 12. Fatores associados ao Genótipo II do NFkB1 e o risco para sarcopenia em idosos (n=59).

Genótipo II do NFkB1

Variáveis Normal (n=30) Sarcopenia (n=29) p-valor* OR (95% IC)

Gênero Feminino 22 (0.72) 14 (0.48) 0.854 1.152 (0.255 - 5.204)

Idade 68.82 ± 8.45 73.86 ± 8.79 0.586 1.026 (0.937 - 1.123)

Comorbidades 3.51 ± 1.52 5.17 ± 2.13 0.370 1.209 (0.798 - 1.831)

Tabagismo 20 (0.65) 14 (0.48) 0.114 3.700 (0.731 - 18.723)

Etilismo 14 (0.48) 14 (0.48) 0.345 2.219 (0.425 - 11.584)

Sedentarismo

Sim 7 (0.24) 27 (0.93) 1.13E-4

31.477 (5.467 - 181.247)

Não 23 (0.76) 2 (0.07) 1.13E-4

0.032 (0.060 - 0.183)

Ancestralidade

Europeia 0.498 ± 0.160 0.471 ± 0.173 0.633 0.328 (0.003 - 31.806)

Ameríndia 0.268 ± 0.135 0.312 ± 0.135 0.345 18.284 (0.044 - 20.236)

Africana 0.233 ± 0.131 0.216 ± 0.103 0.694 0.280 (0.000 - 58.829)

II: Inserção/Inserção. OR: Oddis Ratio; IC: Intervalo de Confiança. *Regressão Logística ajustada pelo

sedentarismo.

Gráfico 1: Variação do perímetro da

panturrilha entre os idosos com o Genótipo

II, segundo o sedentarismo.

Teste de Mann-Whitney.

Esses achados corroboram com a literatura, onde se tem observado que o exercício

físico regular induz à mudanças adaptativas no músculo esquelético através de alterações na

expressão genética metabólica, como uma terapia anti-inflamatória, reduzindo a sinalização

através da via de sinalização de NFkB (OLIVEIRA et al., 2011; WOODS et al., 2012;

NIMMO et al., 2013).

p=3.05E-7

59

O reflexo da sarcopenia sobre a mobilidade foi testada ao comparar o desempenho no

teste Timed Up and Go (TUG), entre indivíduos com e sem sarcopenia, onde evidenciou-se o

que se esperarava, que idosos com sarcopenia possuiam uma mobilidade menor do que

aqueles sem sarcopenia (p=2.39E-12

) (Gráfico 2).

Gráfico 2: Correlação do genótipo do NFkB1 com a Mobilidade de Idosos. (A) Associação entre o

Genótipo do NFkB1 e o Perímetro da Panturrilha, parâmetro utilizado para identificar o risco de

sarcopenia em idosos. Teste de Mann-Whitney; (B) Comparação da mobilidade (Teste Timed up and

go – TUG) entre idosos com e sem sarcopenia. Teste de Mann-Whitney.

Esses resultados assemelham-se ao observado no estudo experimental de Bar-shai et

al. (2005), em que observou a influência da NFkB na atrofia muscular, em animais jovens e

velhos imobilizados. Nesse experimento a ativação do NFkB já era identificada nos

momentos iniciais da imobilidade, tanto em animais velhos quanto jovens. E nos momentos

finais, a via NFkB1 foi a mais predominante, principalmente nos mais velhos. Isso evidencia

que a mobilidade prejudicada estar relacionada com as vias de sinalização da NFkB1 e que a

sarcopenia e a atrofia muscular estão associadas nesse processo.

Clinicamente esse fenômeno pode ser bem visualizado, pois idosos são comumente

hospitalizados por trauma ou por doenças crônicas e degenerativas, e são submetidos a

períodos longos de imobilidade no leito. Em consequência disso, há uma significativa perda

de massa muscular, já nos primeiros 10 dias, enquanto nos jovens tais efeitos só são

A B p=0.012 p=2.39E-12

60

observados após 28 dias. Evidenciando que os idosos são mais susceptíveis a sarcopenia

(MALAFARINA et al., 2012).

Essa alteração da mobilidade pode ter refletido sobre a capacidade funcional dos

idosos, onde se evidenciou que indivíduos com a mobilidade prejudicada apresentaram maior

risco de quedas (p=5.90E-35

), pior status funcional - PS-ECOG (p<0.05), maior dependência

para as atividades básicas (p<0.05) e instrumentais (p<0.05) de vida diária e são menos ativos

(p=6.56E-28

) (Gráficos 3 e 4).

O comprometimento da mobilidade relacionado a sarcopenia, está certamente

relacionado a mecanismos genéticos e ambientais, que são manifestados em um fenótipo

final, caracterizado pela atrofia, redução da resistência e perda da força muscular, que

culminam na síndrome da fragilidade e incapacidades funcionais. Isso ocorre porque o

movimento articular necessita da força muscular preservada, para que se possam manter o

status funcional, como durante a marcha, nos movimentos dos membros e em ações contra a

gravidade, como o sentar e levantar, necessários para a realização das atividades de vida

diária, das mais básicas até as mais complexas e avançadas (DI-IOIRIO et al., 2006; ABATE

et al., 2007; DIETZEL, 2015).

Gráfico 3: Correlação a Mobilidade Prejudicada com a Capacidade Funcional dos idosos. (A)

Comparação da Mobilidade Prejudicada com o Risco de Quedas (Teste de Tinetti). Teste de Mann-

Whitney; (B) Analise da variação da mobilidade (Teste de Timed up and go – TUG) nos diferentes

status funcionais (Performance Status – PS-ECOG). *p-valor < 0.05,Teste de Mann-Whitney tendo

como referência o grupo 0.

*

*

*

p=5.90E-35

A B

61

Gráfico 4: Correlação do desempenho no Teste Timed up and go (TUG) com a Capacidade Funcional dos idosos para as Atividades de Vida Diária. (A)

Comparação do desempenho no Teste Timed up and go (TUG) entre o nível de dependência para as Atividades Básicas de Vida Diária (ABVD). *p-valor ≤

0.05,Teste de Mann-Whitney tendo como referência o grupo independente; (B) Comparação do desempenho no Teste Timed up and go (TUG) entre o nível de

dependência para as Atividades Instrumentais de Vida Diária (AIVD). *p-valor ≤ 0.05,Teste de Mann-Whitney tendo como referência o grupo independente;

(C) Comparação do desempenho no Teste Timed up and go (TUG) entre o nível de dependência para as Atividades Avançadas de Vida Diária (AAVD). Teste

de Mann-Whitney.

* *

* *

* p=6.56E

-28

A B C

62

Assim, foi observado que de todos os biomarcadores do envelhecimento utilizados no

estudo, o polimorfismo do NFkB1 foi o mais relevante, visto que a presença o genótipo II,

apresentou risco para o desenvolvimento da sarcopenia em idosos. A sarcopenia inclui-se nas

alterações do sistema orgânico muscular, que se associa ao aumento do comprometimento da

mobilidade, levando a manifestação de um fenótipo de aumento do risco de quedas e de

incapacidades físicas, para todos os níveis de atividades de vida diárias (Figura 13).

Figura 13. Sequência de possíveis relações estabelecidas entre os

biomarcadores do envelhecimento com os sistemas orgânico,

manifestações clínicas e limitação funcional.

A partir desta análise pode-se dizer que a utilização do biomarcador NFkB1 poderá

favorecer a identificação de idosos com a maior susceptibilidade à sarcopenia e

consequentemente a limitações da capacidade funcional. É importante ressaltar as alterações

polimórficas desse biomarcador associadas a hábitos de vida, como o sedentarismo, pode

estar relacionada ao agravo do desenvolvimento de incapacidades físicas, frequentes no

envelhecimento normal, mas muito mais acentuadas no envelhecimento patológico.

A não identificação de outros biomarcadores associados às alterações funcionais pode

estar relacionada às limitações do estudo. Em alguns grupos genotípicos, a frequência foi

pouco representativa, o que não permitiu resultados conclusivos, seja na análise comparativa

entre os grupos ou na análise de risco de susceptibilidade às incapacidades. Outro fator

importante de limitação foi a heterogeneidade amostral, que exigiu um controle mais rigoroso

das covariáveis, provavelmente por terem sido incluído idosos de diferentes serviços. Assim,

acredita-se que o aperfeiçoamento do estudo, poderá ocorrer com o aumento do número

amostral, e a seleção de uma amostra mais homogênea, dentro de uma faixa etária mais

específica.

63

7 CONCLUSÃO

Neste estudo, a investigação clínica identificou idosos predominantemente no gênero

feminino, na sétima década de vida, com histórico de doenças crônicas e degenerativas,

apresentando risco para o desenvolvimento de sarcopenia, a maioria com histórico de

sedentarismo e tabagismo. A caracterização da funcionalidade evidênciou que esses possuíam

a autonomia presenvada, mas sua independência era relativamente comprometida, pois apesar

da boa mobilidade, os mesmos apresentaram risco alto para quedas, o que se associa à

capacidade fuincional, visto que eram semidependentes para as atividades de vida diária.

A análise da ancestralidade da população do estudo, necessária para a garantia do

controle genómico nas análises polimórficas dos genes marcadores do envelhecimento,

evidenciou uma contribuição ancestral predominatemente européia (45%), seguida da

ameríndia (30%) e africana (24%).

Identificou-se que os polimorfismos dos genes TP53, UCP2, HLA-G, IL-1a, IL-4 e

NFkB1 apresentaram diferenças significativas em algumas variáveis funcionais entre os

genótipos. As variáveis que mais diferiram entre os genótipos foram o status funcional (PS-

ECOG), mobilidade (TUG), risco de quedas (TT) e o risco de sarcopenia (PP). Sugerindo

possível associação desses com fatores de risco ou proteção, que na sua maioria não foram

significativos.

O polimorfismo do gene NFkB1 (rs28362491) foi o único biomarcador utilizado neste

estudo que demonstrou resultado de associação significante. O genótipo II desse

polimorfismo apresentou associação com risco de sarcopenia (PP). Os idosos que possuíam

esse genótipo apresentaram uma susceptibilidade três vezes maior para o desenvolvimento

para perda de massa muscular relacionada ao envelhecimento, quando comparado aos outros

genótipos do mesmo gene.

Não se observou relação direta desse polimorfismo do gene NFkB1 com as

manifestações de limitação funcional. No entanto, foi observada uma significante diferença da

mobilidade entre idosos que possuíam ou não sarcopenia, indicando que a perda de massa

muscular pode estar relacionada aos prejuízos na mobilidade, menor velocidade da marcha e

maior risco de quedas, que conduz a limitação para as atividades de vida diária.

É importante ressaltar que foi observado que hábitos de vida, como a prática regular

de exercício físico, pode promove uma proteção ao desenvolvimento de sarcopenia em idosos

que possuem o genótipo II do NFkB1. Isso porque o exercício físico pode induz à mudanças

adaptativas no músculo esquelético, como uma terapia anti-inflamatória, que reduz a

sinalização relacionada a NFkB1.

64

Assim, considerando os resultados do presente estudo, acredita-se que o uso de

biomarcadores do envelhecimento, como um teste de rastreio populacional, pode favorecer a

identificação de idosos com maior susceptibilidade ao desenvolvimento de modificações

orgânicas e incapacidades funcionais. A identificação desse risco possibilitará o

direcionamento de estratégias de prevenção, controle e tratamento de incapacidades físicas

ligadas ao envelhecimento fisiológico ou patológico.

65

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APÊNDICE I TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

CORRELAÇÃO ENTRE A CAPACIDADE FUNCIONAL E BIOMARCADORES

DO ENVELHECIMENTO EM IDOSOS COM CÂNCER

I) Você está sendo convidado(a) a participar da pesquisa intitulada “Correlação entre a Capacidade Funcional e

Biomarcadores do Envelhecimento em Idosos com Câncer”, que será realizado no Hospital Universitário João de

Barros Barreto, no período de janeiro de 2015 a maio de 2015. O objetivo do estudo é identificar a associação entre a

capacidade funcional e biomarcadores do envelhecimento em idosos com câncer. O estudo auxiliará a predizer a saúde

do idoso de forma ampla, embasar estratégias de prevenção, facilitar a gestão e a elaboração de futuros planos de

cuidados necessários ao envelhecimento natural ou por doenças.

II) Para alcançar os objetivos do estudo, será aplicada uma ficha de avaliação, a avaliação geriatria ampla, que analisa

as características da capacidade funcional do idoso. Além disso, será realizada a coleta de sangue periférico, para medir

os marcadores do envelhecimento em seu material genético. Essas informações estão sendo fornecidas para sua

participação voluntária neste estudo e você tem a garantia do recebimento de uma via deste documento.

III) A presente pesquisa implica em riscos para os participantes, os quais podem ter danos morais e éticos, em virtude

de algumas informações requeridas no protocolo de pesquisa. Para impedir tal ocorrência os questionários serão

identificados por números e não por nomes, pois as informações relatadas no protocolo serão de uso exclusivamente

científico.

IV) Na coleta do sangue periférico, podendo causar uma leve dor na hora e uma pequena mancha roxa que desaparecerá

após alguns dias da coleta, mas espera-se que nada disso aconteça. Para evitá-los a realização dessa etapa será realizada

por um profissional treinado, que tomará as devidas medidas de segurança. Esse material será devidamente armazenado

no Núcleo de Pesquisa em Oncologia, para posterior análise relacionada exclusivamente ao presente estudo. Após a

análise, o material restante será devidamente descartado, conforme normas vigentes de órgãos técnicos competentes,

respeitando-se a confidencialidade dos voluntários da pesquisa.

V) Os resultados desta pesquisa trarão benefícios para os participantes, pois irão melhorar a qualidade de vida destes a

partir do conhecimento sobre a capacidade funcional, podendo melhor conduzir o possível problema encontrado.

VI) Você tem garantida a liberdade de retirada de consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo,

sem qualquer prejuízo à continuidade da sua assistência na instituição.

VII) Os voluntários da pesquisa terão o direito de serem mantidos atualizados sobre os resultados parciais da pesquisa,

que sejam de conhecimento dos pesquisadores.

VIII) Despesas e compensações: não há despesas pessoais para o voluntário em qualquer fase do estudo, incluindo

exames e consultas. Também não há compensação financeira relacionada a sua participação. Se existir qualquer despesa

adicional, ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa.

IX) Em caso de qualquer dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos propostos neste estudo (nexo causal

comprovado), o participante tem direito a tratamento médico, bem como as indenizações legalmente estabelecidas.

X) Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li e/ou que foram lidas para mim,

descrevendo a pesquisa intitulada “Correlação entre a Capacidade Funcional e Biomarcadores do Envelhecimento em

Idosos com Câncer”. Eu, discuti com Esdras Edgar Batista Pereira, sobre minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais

são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus riscos, as garantias de confidencialidade e de

esclarecimento permanente.

Belém, ______/______/________

Assinatura do Sujeito/representante responsável

Belém, ______/______/_________

Assinatura do sujeito que colheu o TCLE

(Somente para o responsável do projeto)

Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou

representante legal para a participação neste estudo.

ASSINATURA DO PESQUISADOR RESPONSÁVEL

Nome: Esdras Edgar Batista Pereira

End: Conj. Cidade Nova 8 we 43B nº 742

Telefone: (91) 8300-4629 / (91) 3287-8642

CREFITO: 4271.1 LTF

_________________________________________________________________________________________________________

Comitê de Ética em Pesquisa do Núcleo de Pesquisa em Oncologia

End: Hospital Universitário João de Barros Barreto, 2º Piso da UNACOM, Rua dos Mundurucus, nº 4487, Guam, Belém-PA.

CEP: 66073-005. Telefones: 3201-6776 / 3201-6778. E-mail: npo.ufpa@gmail.com

83

ANEXO I

84

ANEXO II

85

ANEXO III

86

ANEXO IV

87

88

89

ANEXO V

PROTOCOLO PARA EXTRAÇÃO DO DNA