ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE REGENERACIÓN IN VITRO DE...

ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE REGENERACIÓN IN VITRO DE CULTIVARES VENEZOLANOS DE ARROZ (Oryza sativa L.)

Establishment of an in Vitro Regeneration System of Venezuelan Cultivars of Rice (Oryza sativa L.)

1RAFAEL FERNÁNDEZ DA SILVA Y ADRIANA CARDONA Laboratorio de Biotecnología, Departamento de Biología, Facultad experimental de Ciencias y

Tecnología, Universidad de Carabobo. Valencia-Estado. Carabobo-Venezuela [email protected]

Fecha de Recepción: 28/05/2009, Fecha de Revisión: 09/06/2010, Fecha de Aceptación: 19/07/2010

Resumen

A partir de semillas maduras, de los cultivares de arroz: Araure-4, Centauro, Venezuela-21 y Cimarrón, se encontraron respuestas diferenciales in vitro, siendo Cimarrón recalcitrante, mientras que el resto presento una frecuencia embriogénica de 3% a 81,2%, siendo mayores a bajas concentraciones de 2,4-D. El cultivar

-1 Venezuela-21, presentó un 81,2% de callos embriogénicos a 1 mg.L de 2,4-D, Centauro un 67,5% en 2 -1 -1 -1 -1 mg.L de 2,4-D y 2 mg.L BA, y Araure-4 un 66% en 1 mg.L de 2-4D y 2 mg.L K. Para la regeneración,

-1 -1con 0,5 mg.L de AIA y 2 mg.L BA, se presentó la mayor frecuencia para Araure (44,4%) y Centauro (44%). Mediante estrés osmótico por desecación se obtuvo un mayor número de plantas, en todos los cultivares a las 24 h, excepto Centauro que fue a las 48 h. Por estudios morfoanatómicos se corroboró que la regeneración de plantas ocurrió por embriogénesis somática indirecta.

Palabras clave: Desecación, Embriogénesis Somática, Oryza sativa, 2,4-D, K, BA.

Abstract

From mature seeds of rice cultivars: Araure-4, Centauro, Venezuela-21 and Cimarron, differential responses were found in vitro, with Cimarron recalcitrant, while the rest presented a frequency embryogenic 3% -81.2 %, being higher with low 2,4-D concentrations. The Venezuelan-21 cultivar

-1showed a 81.2% embryogenic calli at 1 mg.L 2,4-D, for Centauro cultivar a 67.5% was detected at 2 -1 -1 -1 -1mg.L 2,4-D plus 2 mg.L BA, finally Araure-4 showed 66% at 1 mg.L 2,4-D plus 2 mg.L K. For the

-1 -1regeneration system, it was determined that culture media complemented with 0.5 mg L IAA plus 2 mg L BA, yielded a higher frecuency of regeneration in both evaluated cultivars, Araure-4 (44.4%) and Centauro (44%). After 24 h under osmotic stress for desiccation all cultivars, except 48 h for Centauro, showed the highest percentage of regenerated plants. For morphoanatomic studies confirmed that the regeneration occurred through indirect somatic embryogenesis.

Key words: Desiccation, Oryza sativa, 2,4-D, K, BA, Somatic Embryogenesis.

ISSN 1698 - 7418Depósito Legal PP200402CA1617FARAUTE Ciens. y Tec., 5(1): 5-17, 2010

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1. Introducción cuales afectan significativamente la productividad del cultivo tanto en calidad como en cantidad.

El arroz (Oryza sativa L.) es un cultivo de Pyricularia grisea es el patógeno fúngico más gran importancia a nivel mundial, debido a que es devastador del cultivo de arroz en el mundo el segundo cereal en consumo luego del trigo, incluyendo Venezuela, siendo causante del proveyendo más del 50% de las calorías diarias de anublo del arroz, cuya más grave afectación es la más de la mitad de la población mundial (Abreu et dobladura o ruptura de la panícula, lo que al., 1993). Su centro de origen es el sudeste de ocasiona que no se forman los granos. La Asía, específicamente en regiones colindantes capacidad destructiva de este patógeno se con el Río Amarillo de la antigua China fundamenta en el rápido desarrollo de aproximadamente hace 15.000 años (Uno et al., variabilidad genética, haciéndolo adaptable a 2001). De ahí se extiende a toda China, Tailandia, nuevos cultivares y fungicidas específicos Camboya, Vietnam y sur de la India, llegando (Kransz et al., 1978). posteriormente a Siria y al norte de África alrededor del año 800 D.C. A España llega a En arroz se han realizado múltiples estudios través de los moros y posteriormente al resto de para lograr su mejoramiento; así, se han descrito Europa, mientras que a Norteamérica llega en eficientes protocolos de regeneración in vitro, 1604, y al subcontinente latinoamericano en el marcadores moleculares, bancos genéticos y de siglo XVIII (Hill, 1965). En Venezuela en el siglo germoplasma y procedimientos de ingeniería XX se industrializa masivamente la producción, genética. Como sistemas de regeneración, se han procesamiento y comercio del arroz, establecido la organogénesis y la embriogénesis concentrándose su cultivo en los Llanos Centrales somática indirecta, siendo esta última la de mayor (Estado Guárico) y los Occidentales (Estados potencial regenerativo, tanto por la formación de Portuguesa, Cojedes y Barinas), (Abreu et al., embriones somáticos pr imarios como 1993). secundarios (Raemakers et al., 1995). Estos

procesos se han iniciado a partir de diferentes Este cultivo se presenta en casi todos los explantes: embriones sexuales inmaduros

países tropicales y subtropicales de los cinco (Heyser et al., 1983; Ozawa & Komamine, 1989), continentes; el asiático produce el 90% del embriones sexuales maduros (Rueb et al., 1994), cereal, con China como principal productor semillas maduras (Nakano & Maeda, 1979; (32%), seguido de India (22.7%) e Indonesia Siriwardana & Nabors, 1983; Orad & Rutger, (8,6%), mientras que en América, Brazil es el 1988), secciones nodales (Dun-Yi & Krikorian, principal productor con un 1.9%, y Venezuela 1981), hojas (Bhattacharya & Sen, 1980; representa un 0.12%, siendo los estados Guárico y Wernicke et al., 1981), coleoptilos (Sahrawat & Portuguesa los de mayor producción (80%) del Chand, 2001), epicotilos (Khatun & Desamero, país (Danac, 2004). El arroz pertenece a la 2005), raíces (Kawata & Ishihara, 1968; John & Familia Poaceae, género Oryza, siendo Oryza Prathapasenan, 1999), ovarios (Rongbai et al., sativa la especie más importante, con tres grupos: 1998), proembriones cigóticos (Zhao et al., Japónica, Indica y Javánica, los dos últimos son 1999), polen (Bajaj, 1984; Chowdhury & los de mayor rendimiento y comercialización Mandal, 2001; Lee et al., 2003) y anteras (Lee et mundial (85%) (Hill, 1965). al., 2000; Trejo et al., 2002). Asimismo estos

sistemas regenerativos, se han establecido a partir El arroz como todo cultivo es susceptible a de protoplastos (Lee et al., 1989; Lee et al., 1999;

numerosas y diversas plagas y enfermedades, las Tang et al., 2001) y suspensiones celulares

Establecimiento de un Sistema de Regeneración in vitro de Cultivares Venezolanos de Arroz (Oryza Sativa L.)

FARAUTE Ciens. y Tec., 5(1). 2010

(Huang et al., 1995; González-Coronel & Jenes, imperante satisfacer la demanda alimentaria, y 2001). Cabe resaltar que es frecuente que las para ello, es importante obtener cultivares plantas regeneradas a partir de estos sistemas, resistentes a diversas enfermedades y plagas, presenten variaciones somaclonales, referentes a como en el caso de Pyricularia grisea, así como, la altura de la planta, el rendimiento de granos, los el incremento del rendimiento y la calidad días a la floración y el número de tallos entre otros nutricional del grano, para lo cual la utilización de (Zhong et al., 1983; Peng & Hodges, 1989). técnicas de cultivo de tejido y/o ingeniería

genética, es una manera eficaz de seleccionar De estos sistemas de regeneración se han variantes a corto plazo y a bajo costo, omitiéndose

obtenido cultivares tolerantes al estrés salino así los métodos tradicionales de selección de (Belyanskaya et al., 1994; Saleem et al., 2005; linajes en el campo. Para el logro de dicho Raveendar et al., 2008) y conjuntamente con proceso, es necesario contar con un eficiente técnicas de ingeniería genética (electroporación, sistema de regeneración in vitro por biobalística, Agrobacterium tumefaciens o embriogénesis somática, el cual fue el objetivo Agrobacterium rhizogenes) se han logrado de este trabajo. diversos tipos de plantas transgénicas. Así se han obtenido plantas resistentes a: herbicidas con el 2. Materiales y Métodosgen bar (Repellin et al., 2001; Kawahigashi et al., 2007), a hongos con el gen tlp (Repellin et al., Se utilizaron como explantes semillas 2001) o chi.1.1 (Maneewan et al., 2005), a maduras, descascaradas manualmente, de cuatro insectos como Chilo suppressalis y Scirpophaga cultivares venezolanos de arroz (Oryza sativa L.): incertulas mediante el gen Cry de Bacillus Araure-4, Cimarrón, Centauro y Venezuela-21 thuringiensis y al estrés hídrico con la suministrados por el INIA-Portuguesa. El incorporación del gen hvA1 (Repellin et al., protocolo de desinfección se realizó en una 2001). Asimismo, se han obtenido plantas cámara de flujo laminar horizontal y consistió en transgénicas mediante la incorporación del gen lavar las semillas con agua destilada estéril y gfp (proteína verde fluorescente) (Carnoso & jabón líquido (Brisol) durante 15 min. en Yoshida, 2008) y el hgh (factor de crecimiento agitación continua, luego con alcohol isopropílico humano) (Kim et al., 2008). El cultivar (70%) durante 5 min., seguidamente con cloro transgénico de arroz de mayor importancia comercial (Nevex: sin diluir) mas Tween 20 (2 actualmente es el arroz de oro, el cual fue gotas/10mL) por 30 min., y por último se obtenido a través de un arduo trabajo realizaron 6 cambios (3 min. c/u) con agua multidisciplinario encabezado por Indra Vasil, un destilada estéril. Se utilizaron 30 semillas por renombrado biotecnólogo de plantas, el cual se tratamiento (10 por placa de Petri), sembrándose transfirió el gen psy (fitoeno sintetasa) que in vitro, colocando la zona embrional en contacto permitió la síntesis de provitamina A (-caroteno), con el medio, siguiendo un sistema de dos etapas con lo cual los granos de arroz están enriquecidos (inducción y regeneración) típico en cereales de vitamina A, teniendo un mayor valor (Nabors et al., 1983; Vasil, 1987). En la etapa I (4-alimenticio, debido a que previene la ceguera 8 semanas), se indujo la formación del callo, nocturna entre otros aspectos metabólicos utilizando medios con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (Repellin et al., 2001). (2,4-D) sólo o combinado con las citoquininas 6-

Furfuril-aminopurina (K) o 6-Benzil-aminopurina Finalmente, debido al incremento de la (BA). población a nivel mundial en el siglo XXI, es

La etapa II consistió en regenerar plantas a partir de callos con capacidad regenerativa

Rafael Fernández Da Silva y Adriana Cardona

FARAUTE Ciens. y Tec., 5(1). 20106 7

1. Introducción cuales afectan significativamente la productividad del cultivo tanto en calidad como en cantidad.

El arroz (Oryza sativa L.) es un cultivo de Pyricularia grisea es el patógeno fúngico más gran importancia a nivel mundial, debido a que es devastador del cultivo de arroz en el mundo el segundo cereal en consumo luego del trigo, incluyendo Venezuela, siendo causante del proveyendo más del 50% de las calorías diarias de anublo del arroz, cuya más grave afectación es la más de la mitad de la población mundial (Abreu et dobladura o ruptura de la panícula, lo que al., 1993). Su centro de origen es el sudeste de ocasiona que no se forman los granos. La Asía, específicamente en regiones colindantes capacidad destructiva de este patógeno se con el Río Amarillo de la antigua China fundamenta en el rápido desarrollo de aproximadamente hace 15.000 años (Uno et al., variabilidad genética, haciéndolo adaptable a 2001). De ahí se extiende a toda China, Tailandia, nuevos cultivares y fungicidas específicos Camboya, Vietnam y sur de la India, llegando (Kransz et al., 1978). posteriormente a Siria y al norte de África alrededor del año 800 D.C. A España llega a En arroz se han realizado múltiples estudios través de los moros y posteriormente al resto de para lograr su mejoramiento; así, se han descrito Europa, mientras que a Norteamérica llega en eficientes protocolos de regeneración in vitro, 1604, y al subcontinente latinoamericano en el marcadores moleculares, bancos genéticos y de siglo XVIII (Hill, 1965). En Venezuela en el siglo germoplasma y procedimientos de ingeniería XX se industrializa masivamente la producción, genética. Como sistemas de regeneración, se han procesamiento y comercio del arroz, establecido la organogénesis y la embriogénesis concentrándose su cultivo en los Llanos Centrales somática indirecta, siendo esta última la de mayor (Estado Guárico) y los Occidentales (Estados potencial regenerativo, tanto por la formación de Portuguesa, Cojedes y Barinas), (Abreu et al., embriones somáticos pr imarios como 1993). secundarios (Raemakers et al., 1995). Estos

procesos se han iniciado a partir de diferentes Este cultivo se presenta en casi todos los explantes: embriones sexuales inmaduros

países tropicales y subtropicales de los cinco (Heyser et al., 1983; Ozawa & Komamine, 1989), continentes; el asiático produce el 90% del embriones sexuales maduros (Rueb et al., 1994), cereal, con China como principal productor semillas maduras (Nakano & Maeda, 1979; (32%), seguido de India (22.7%) e Indonesia Siriwardana & Nabors, 1983; Orad & Rutger, (8,6%), mientras que en América, Brazil es el 1988), secciones nodales (Dun-Yi & Krikorian, principal productor con un 1.9%, y Venezuela 1981), hojas (Bhattacharya & Sen, 1980; representa un 0.12%, siendo los estados Guárico y Wernicke et al., 1981), coleoptilos (Sahrawat & Portuguesa los de mayor producción (80%) del Chand, 2001), epicotilos (Khatun & Desamero, país (Danac, 2004). El arroz pertenece a la 2005), raíces (Kawata & Ishihara, 1968; John & Familia Poaceae, género Oryza, siendo Oryza Prathapasenan, 1999), ovarios (Rongbai et al., sativa la especie más importante, con tres grupos: 1998), proembriones cigóticos (Zhao et al., Japónica, Indica y Javánica, los dos últimos son 1999), polen (Bajaj, 1984; Chowdhury & los de mayor rendimiento y comercialización Mandal, 2001; Lee et al., 2003) y anteras (Lee et mundial (85%) (Hill, 1965). al., 2000; Trejo et al., 2002). Asimismo estos

sistemas regenerativos, se han establecido a partir El arroz como todo cultivo es susceptible a de protoplastos (Lee et al., 1989; Lee et al., 1999;

numerosas y diversas plagas y enfermedades, las Tang et al., 2001) y suspensiones celulares



(Huang et al., 1995; González-Coronel & Jenes, imperante satisfacer la demanda alimentaria, y 2001). Cabe resaltar que es frecuente que las para ello, es importante obtener cultivares plantas regeneradas a partir de estos sistemas, resistentes a diversas enfermedades y plagas, presenten variaciones somaclonales, referentes a como en el caso de Pyricularia grisea, así como, la altura de la planta, el rendimiento de granos, los el incremento del rendimiento y la calidad días a la floración y el número de tallos entre otros nutricional del grano, para lo cual la utilización de (Zhong et al., 1983; Peng & Hodges, 1989). técnicas de cultivo de tejido y/o ingeniería

genética, es una manera eficaz de seleccionar De estos sistemas de regeneración se han variantes a corto plazo y a bajo costo, omitiéndose

obtenido cultivares tolerantes al estrés salino así los métodos tradicionales de selección de (Belyanskaya et al., 1994; Saleem et al., 2005; linajes en el campo. Para el logro de dicho Raveendar et al., 2008) y conjuntamente con proceso, es necesario contar con un eficiente técnicas de ingeniería genética (electroporación, sistema de regeneración in vitro por biobalística, Agrobacterium tumefaciens o embriogénesis somática, el cual fue el objetivo Agrobacterium rhizogenes) se han logrado de este trabajo. diversos tipos de plantas transgénicas. Así se han obtenido plantas resistentes a: herbicidas con el 2. Materiales y Métodosgen bar (Repellin et al., 2001; Kawahigashi et al., 2007), a hongos con el gen tlp (Repellin et al., Se utilizaron como explantes semillas 2001) o chi.1.1 (Maneewan et al., 2005), a maduras, descascaradas manualmente, de cuatro insectos como Chilo suppressalis y Scirpophaga cultivares venezolanos de arroz (Oryza sativa L.): incertulas mediante el gen Cry de Bacillus Araure-4, Cimarrón, Centauro y Venezuela-21 thuringiensis y al estrés hídrico con la suministrados por el INIA-Portuguesa. El incorporación del gen hvA1 (Repellin et al., protocolo de desinfección se realizó en una 2001). Asimismo, se han obtenido plantas cámara de flujo laminar horizontal y consistió en transgénicas mediante la incorporación del gen lavar las semillas con agua destilada estéril y gfp (proteína verde fluorescente) (Carnoso & jabón líquido (Brisol) durante 15 min. en Yoshida, 2008) y el hgh (factor de crecimiento agitación continua, luego con alcohol isopropílico humano) (Kim et al., 2008). El cultivar (70%) durante 5 min., seguidamente con cloro transgénico de arroz de mayor importancia comercial (Nevex: sin diluir) mas Tween 20 (2 actualmente es el arroz de oro, el cual fue gotas/10mL) por 30 min., y por último se obtenido a través de un arduo trabajo realizaron 6 cambios (3 min. c/u) con agua multidisciplinario encabezado por Indra Vasil, un destilada estéril. Se utilizaron 30 semillas por renombrado biotecnólogo de plantas, el cual se tratamiento (10 por placa de Petri), sembrándose transfirió el gen psy (fitoeno sintetasa) que in vitro, colocando la zona embrional en contacto permitió la síntesis de provitamina A (-caroteno), con el medio, siguiendo un sistema de dos etapas con lo cual los granos de arroz están enriquecidos (inducción y regeneración) típico en cereales de vitamina A, teniendo un mayor valor (Nabors et al., 1983; Vasil, 1987). En la etapa I (4-alimenticio, debido a que previene la ceguera 8 semanas), se indujo la formación del callo, nocturna entre otros aspectos metabólicos utilizando medios con ácido 2,4-diclorofenoxiacético (Repellin et al., 2001). (2,4-D) sólo o combinado con las citoquininas 6-

Furfuril-aminopurina (K) o 6-Benzil-aminopurina Finalmente, debido al incremento de la (BA). población a nivel mundial en el siglo XXI, es

La etapa II consistió en regenerar plantas a partir de callos con capacidad regenerativa



(embriogénicos) inducidos en la primera fase, Posteriormente, se realizaron los estudios remplazándose el 2,4-D por ácido indolacético anatómicos en el Laboratorio de Histología del (AIA), combinado con K o BA. Hospital Oncológico (Valencia-Edo. Carabobo).

Muestras de callo fijadas en etanol al 70%, se Los medios de cultivo, consistían en las incluyeron en parafina, para cortarse mediante

-1 un micrótomo de rotación, siendo los cortes sales de Murashige & Skoog (1962), 2 mg.L de -1 -1 teñidos con Orceína. Los registros fotográficos glicina, 1 mg.L de tiamina-HCl y 0.5 mg.L de

fueron tomados con la lupa Leika DFC 280 y piridoxina-HCl (Zhuang & Jia, 1983), con -1 microscopio de luz Leika DM 1000 (Laboratorio Mioinositol 10 mg.L y sacarosa al 30% para los

de Biotecnología, Universidad de Carabobo). medios de inducción y 50% para los medios de Los análisis estadísticos de los procesos de regeneración (Zaidi et al., 2006). Las hormonas inducción y regeneración, se basaron en la utilizadas en inducción fueron: 2,4-D a 1, 2, 3, 4 y

-1 -1 aplicación del modelo lineal aditivo, junto con el 5 mg.L ; K o BA a 2 mg.L , mientras que en la -1 Análisis de Varianza (ANOVA).regeneración se utilizo AIA a 0.5 mg.L y K o BA

-1a 2 mg.L . Se ajustó el pH a 5,8, se solidificó con 3. Resultados y DiscusiónAgar Powder (1,6%), y se esterilizó a 15 lb y

121°C (15 min). Los cultivos se mantuvieron a El sistema de regeneración por embriogénesis luz continua y a 30°C. A los callos seleccionados

somática en arroz al igual que el resto de los (embriogénicos) para el proceso regenerativo se cereales, depende entre otros actores del genotipo les aplicó un tratamiento de 0, 24, 48 y 72 h de y del medio de cultivo, con dos fases, una de estrés osmótico por desecación (Saharan et al., inducción del callo y la segunda de regeneración 2004), repicando los mismos en placas de Petri de las plantas (Khanna & Raina, 1998). Los estériles con papel (oscuridad y 30ºC); medios de cultivo de inducción están seguidamente los callos fueron subcultivados en suplementados únicamente con 2,4-D, mientras medios de regeneración. que en la etapa de regeneración se utilizan otras auxinas en combinación con citoquininas Luego de cada etapa de cultivo, se (Bannikova & Barabanova, 1990), o adicionalmente calcularon las frecuencias de inducción de callo triptofano (Siriwardana & Nabors, 1983), prolina total, callo embriogénico (E), callo no (Chowdhury et al., 1993) o ABA (Peterson & embriogénico (NE) y callo rizogénico (R), y la Smith, 1991), favoreciendo la formación de frecuencia de regeneración de plantas, empleando brotes al emplear altas concentraciones de BA las fórmulas planteadas por Zaidi et al.(2006) tal (Yang et al., 1999). como se indican a continuación:

Frecuencia de callo total= (# callos /#semillas En este trabajo se evaluaron en la etapa de sembradas)x100 inducción, 15 medios suplementados con 2,4-D Frecuencia de callo E= (# callos E/#semillas sólo o combinado con K o BA, encontrándose sembradas)x100 diferentes frecuencias de inducción de callos para Frecuencia de callo NE= (# callos NE/#semillas las 4 variedades de arroz. Las de callo total y callo sembradas)x100 NE oscilaron de 3-90% y para el callo E se obtuvo Frecuencia de callo R= (# callos R/#semillas de 3-81% (Tablas 1, 2, 3, y 4). Es de resaltar que el sembradas)x100 desarrollo del callo E se evidenció, en gran Frecuencia de regeneración= (#callos regenerados/#callos proporción en todos los cultivares a las menores

-1regenerativos cultivados) x100 concentraciones de la auxina 2,4-D (1-3 mg.L )



sola o combinada con las citoquininas K o BA. Así, para el cultivar Araure-4 se halló un 28% de

-1callo E en 3 mg.L de 2,4-D, 66% en el medio con -1 -12,4-D 1 mg.L + K 2 mg.L y 33% en 2,4-D 1

-1 -1 mg.L + BA 2 mg.L (Tabla 1). Mientras que para -1Cimarrón, se observó un 39% con 2,4-D 1 mg.L ,

-1 -155% en 2,4-D 3 mg.L + K 2 mg.L y 37% en 2,4--1 -1 D 3 mg.L + BA 2 mg.L (Tabla 2). En la variedad

Centauro, se halló un mayor porcentaje de callo E -1 -1 en el medio con 2,4-D 2 mg.L + K 2 mg.L

-1 -1(67%) y en 2,4-D 1 mg.L + BA 2 mg.L , (68%) (Tabla 3). Por último en la variedad Venezuela-21 se determinó que los mayores porcentajes de callo E oscilaban entre 78-81%, con una

-1concentración de 1 y 2 mg.L de 2,4-D (Tabla 4). Estas respuestas presentaron diferencias significativas en la inducción de callo total y de callo embriogénico, evidenciándose que las combinaciones de 2,4-D con K, son las que inducen el mayor crecimiento de callos. En cuanto a la interacción de la combinación de hormonas con respecto a la concentración de 2,4-D, se observó una diferencia significativa en los tratamientos que contienen bajas concentraciones de esta auxina.

Estos resultados coinciden con los reportados por otros investigadores en arroz indica, que señalan el favorecimiento de la embriogénesis somática a bajas dosis de auxinas (Maeda, 1965; Yamada, 1977), que oscilan entre

-11-3 mg. L (Islam et al., 2005; Niroula et al., 2005; Naqvi et al., 2006; Summart et al., 2008). Asimismo, Endress (1994), señala que el 2,4-D

Tabla 2. Frecuencias de inducción del cultivar CimarrónM: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Tabla 3. Frecuencias de inducción del cultivar CentauroM: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Tabla 1. Frecuencias de inducción del cultivar Araure-4 M: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 50 26 38 28

I2 2 17 10 17 20

I3 3 40 28 37 35

I4 4 15 19 23 21

I5 5

-

10 5 10 19

I6 1 80 66 74 34

I7 2 74 54 66 22

I8 3 28 34 32 20

I9 4 45 33 30 24

I10 5

2K

3 3 3 2

I11 1 41 33 40 9

I12 2 40 17 38 3

I13 3 32 23 35 3

I14 4 35 18 10 10

I15 5

2BA

10 5 5 10

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 55 39 70 90

I2 2 50 30 80 88

I3 3 40 31 30 40

I4 4 45 32 26 39 I5 5

-

48 30 37 23

I6 1 70 35 60 73

I7 2 65 22 52 30

I8 3 73 55 65 50

I9 4 64 33 70 55

I10 5

2K

58 25 56 42

I11 1 69 29 68 73

I12 2 80 27 83 53 I13 3 70 37 93 87

I14 4 50 10 97 60

I15 5

2BA

56 3 95 60

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 85 43 60 42

I2 2 70 51 56 38

I3 3 90 56 45 30

I4 4 92 30 53 23

I5 5

-

86 22 60 18

I6 1 70 58 65 68

I7 2 83 67 79 38

I8 3 69 47 67 62

I9 4 63 46 70 50

I10 5

2K

71 30 40 33

I11 1 80 68 70 70

I12 2 83 45 60 40

I13 3 89 13 74 80

I14 4 60 26 54 16

I15 5

2BA

52 24 42 19



(embriogénicos) inducidos en la primera fase, Posteriormente, se realizaron los estudios remplazándose el 2,4-D por ácido indolacético anatómicos en el Laboratorio de Histología del (AIA), combinado con K o BA. Hospital Oncológico (Valencia-Edo. Carabobo).

Muestras de callo fijadas en etanol al 70%, se Los medios de cultivo, consistían en las incluyeron en parafina, para cortarse mediante

-1 un micrótomo de rotación, siendo los cortes sales de Murashige & Skoog (1962), 2 mg.L de -1 -1 teñidos con Orceína. Los registros fotográficos glicina, 1 mg.L de tiamina-HCl y 0.5 mg.L de

fueron tomados con la lupa Leika DFC 280 y piridoxina-HCl (Zhuang & Jia, 1983), con -1 microscopio de luz Leika DM 1000 (Laboratorio Mioinositol 10 mg.L y sacarosa al 30% para los

de Biotecnología, Universidad de Carabobo). medios de inducción y 50% para los medios de Los análisis estadísticos de los procesos de regeneración (Zaidi et al., 2006). Las hormonas inducción y regeneración, se basaron en la utilizadas en inducción fueron: 2,4-D a 1, 2, 3, 4 y

-1 -1 aplicación del modelo lineal aditivo, junto con el 5 mg.L ; K o BA a 2 mg.L , mientras que en la -1 Análisis de Varianza (ANOVA).regeneración se utilizo AIA a 0.5 mg.L y K o BA

-1a 2 mg.L . Se ajustó el pH a 5,8, se solidificó con 3. Resultados y DiscusiónAgar Powder (1,6%), y se esterilizó a 15 lb y

121°C (15 min). Los cultivos se mantuvieron a El sistema de regeneración por embriogénesis luz continua y a 30°C. A los callos seleccionados

somática en arroz al igual que el resto de los (embriogénicos) para el proceso regenerativo se cereales, depende entre otros actores del genotipo les aplicó un tratamiento de 0, 24, 48 y 72 h de y del medio de cultivo, con dos fases, una de estrés osmótico por desecación (Saharan et al., inducción del callo y la segunda de regeneración 2004), repicando los mismos en placas de Petri de las plantas (Khanna & Raina, 1998). Los estériles con papel (oscuridad y 30ºC); medios de cultivo de inducción están seguidamente los callos fueron subcultivados en suplementados únicamente con 2,4-D, mientras medios de regeneración. que en la etapa de regeneración se utilizan otras auxinas en combinación con citoquininas Luego de cada etapa de cultivo, se (Bannikova & Barabanova, 1990), o adicionalmente calcularon las frecuencias de inducción de callo triptofano (Siriwardana & Nabors, 1983), prolina total, callo embriogénico (E), callo no (Chowdhury et al., 1993) o ABA (Peterson & embriogénico (NE) y callo rizogénico (R), y la Smith, 1991), favoreciendo la formación de frecuencia de regeneración de plantas, empleando brotes al emplear altas concentraciones de BA las fórmulas planteadas por Zaidi et al.(2006) tal (Yang et al., 1999). como se indican a continuación:

Frecuencia de callo total= (# callos /#semillas En este trabajo se evaluaron en la etapa de sembradas)x100 inducción, 15 medios suplementados con 2,4-D Frecuencia de callo E= (# callos E/#semillas sólo o combinado con K o BA, encontrándose sembradas)x100 diferentes frecuencias de inducción de callos para Frecuencia de callo NE= (# callos NE/#semillas las 4 variedades de arroz. Las de callo total y callo sembradas)x100 NE oscilaron de 3-90% y para el callo E se obtuvo Frecuencia de callo R= (# callos R/#semillas de 3-81% (Tablas 1, 2, 3, y 4). Es de resaltar que el sembradas)x100 desarrollo del callo E se evidenció, en gran Frecuencia de regeneración= (#callos regenerados/#callos proporción en todos los cultivares a las menores

-1regenerativos cultivados) x100 concentraciones de la auxina 2,4-D (1-3 mg.L )



sola o combinada con las citoquininas K o BA. Así, para el cultivar Araure-4 se halló un 28% de

-1callo E en 3 mg.L de 2,4-D, 66% en el medio con -1 -12,4-D 1 mg.L + K 2 mg.L y 33% en 2,4-D 1

-1 -1 mg.L + BA 2 mg.L (Tabla 1). Mientras que para -1Cimarrón, se observó un 39% con 2,4-D 1 mg.L ,

-1 -155% en 2,4-D 3 mg.L + K 2 mg.L y 37% en 2,4--1 -1 D 3 mg.L + BA 2 mg.L (Tabla 2). En la variedad

Centauro, se halló un mayor porcentaje de callo E -1 -1 en el medio con 2,4-D 2 mg.L + K 2 mg.L

-1 -1(67%) y en 2,4-D 1 mg.L + BA 2 mg.L , (68%) (Tabla 3). Por último en la variedad Venezuela-21 se determinó que los mayores porcentajes de callo E oscilaban entre 78-81%, con una

-1concentración de 1 y 2 mg.L de 2,4-D (Tabla 4). Estas respuestas presentaron diferencias significativas en la inducción de callo total y de callo embriogénico, evidenciándose que las combinaciones de 2,4-D con K, son las que inducen el mayor crecimiento de callos. En cuanto a la interacción de la combinación de hormonas con respecto a la concentración de 2,4-D, se observó una diferencia significativa en los tratamientos que contienen bajas concentraciones de esta auxina.

Estos resultados coinciden con los reportados por otros investigadores en arroz indica, que señalan el favorecimiento de la embriogénesis somática a bajas dosis de auxinas (Maeda, 1965; Yamada, 1977), que oscilan entre

-11-3 mg. L (Islam et al., 2005; Niroula et al., 2005; Naqvi et al., 2006; Summart et al., 2008). Asimismo, Endress (1994), señala que el 2,4-D

Tabla 2. Frecuencias de inducción del cultivar CimarrónM: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Tabla 3. Frecuencias de inducción del cultivar CentauroM: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Tabla 1. Frecuencias de inducción del cultivar Araure-4 M: medio de cultivo; cito: Citoquinina

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 50 26 38 28

I2 2 17 10 17 20

I3 3 40 28 37 35

I4 4 15 19 23 21

I5 5

-

10 5 10 19

I6 1 80 66 74 34

I7 2 74 54 66 22

I8 3 28 34 32 20

I9 4 45 33 30 24

I10 5

2K

3 3 3 2

I11 1 41 33 40 9

I12 2 40 17 38 3

I13 3 32 23 35 3

I14 4 35 18 10 10

I15 5

2BA

10 5 5 10

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 55 39 70 90

I2 2 50 30 80 88

I3 3 40 31 30 40

I4 4 45 32 26 39 I5 5

-

48 30 37 23

I6 1 70 35 60 73

I7 2 65 22 52 30

I8 3 73 55 65 50

I9 4 64 33 70 55

I10 5

2K

58 25 56 42

I11 1 69 29 68 73

I12 2 80 27 83 53 I13 3 70 37 93 87

I14 4 50 10 97 60

I15 5

2BA

56 3 95 60

Hormonas ( mg.L-1)

Frecuencias M

2,4-

D

Cit

o

Total

E

NE

R

I1 1 85 43 60 42

I2 2 70 51 56 38

I3 3 90 56 45 30

I4 4 92 30 53 23

I5 5

-

86 22 60 18

I6 1 70 58 65 68

I7 2 83 67 79 38

I8 3 69 47 67 62

I9 4 63 46 70 50

I10 5

2K

71 30 40 33

I11 1 80 68 70 70

I12 2 83 45 60 40

I13 3 89 13 74 80

I14 4 60 26 54 16

I15 5

2BA

52 24 42 19



favorece la hipermetilación del ADN, y es por ello anatómicamente su superficie estaba constituida que las células se mantienen en alta actividad por células pequeñas de forma alargada, irregular mitótica, estimulando la formación de embriones; y de citoplasma pobre (Fig. 2a). Los callos E es así como el proceso de embriogénesis está encontrados fueron compactos, de apariencia relacionado con el establecimiento de un balance globular, con una coloración blanco-crema, y específico en las hormonas endógenas del una superficie brillante y lisa (Fig. 1b y 1c). Los explante. estudios anatómicos, permitieron distinguir diferentes etapas de desarrollo del embrión, a

Asimismo, estos resultados evidenciaron partir de una masa proembriogénica (Fig. 2d) de que el proceso de embriogénesis somática está origen multicelular, donde se observó una relacionado no solo con la presencia de 2,4-D, epidermis uniestratificada (Fig.2e), centros sino con la combinación de esta auxina con las meristemáticos (Fig. 2f), embriones somáticos citoquininas K o BA, tal como lo señalan aislados de tipo globular (Fig. 2g y 2h) y de mayor numerosos investigadores en cultivo in vitro de desarrollo con suspensor (Fig. 2i y 2j), revelando arroz (Khatun et al., 2003; Abayawickrama & su origen unicelular.Anai, 2006; Beena, 2006). A su vez esta respuesta fue diferencial en cuanto a la formación del callo, También se pudo evidenciar la formación ya que depende de la combinación y la de un cuerpo multiembriogénico o de embriones concentración de hormonas en función del fusionados, indicando la posibilidad de un origen cultivar, tal como lo han descrito Carnoso & multicelular de los embriones (Fig. 2k).Yoshida (2006) y Ge et al. (2006).

Los callos se desarrollaron en la zona embrional de la semilla, específicamente del escutelo, diferenciándose múltiples masas pro embriogénicas que dan origen posteriormente a los embriones, tal como lo indica Mariani et al. (2002). Los tipos de callo encontrados en este estudio fueron No Embriogénicos (NE) y Embriogénicos (E), distinguiéndose también callos organogénicos: Rizogénicos (R) y con brotes (Br), así como las combinaciones de los mismos (Fig. 1a-m). Estos callos ya han sido descritos ampliamente en cereales (Nabors et al., 1983; Vasil, 1987). Las combinaciones de distintos tipos de callos, representan una amplia heterogeneidad morfológica, que puede estar relacionada con la capacidad regenerativa, tal como señaló Kucherenko (1993) al caracterizar 33 tipos distintos de callos de Oryza sativa.

Los callos NE eran friables y de color amarillo, acompañados en su mayoría por callos E, observándose callos mixtos (Fig. 1a);

Fig. 1. Tipos de callos. a. Callo NE. b. Callo formado en la zona embrional de la semilla. c. Callo E. d-e. Callo rizogénico. f. Callo con brotes (Br). g. Callo NE y con raíces (R). h. callo NE con brotes y raíces. i. Callo con brotes (Br) y raíces (R). j. Callo NE y E. k. Callo NE con brotes (Br). m. Callo necrótico.



-1 -1En cereales, incluyendo el arroz se plantea 2001), 2,5 mg.L (Tariq et al., 2008), 5 mg.L que el origen de los embrioides es unicelular, no (Belal et al., 2006)obstante, no se descarta que se presente simultáneamente el origen multicelular de los mismos, tal como lo describimos en este trabajo. Este aspecto es ampliamente descrito por Willians & Maheswaran (1986) y Quiroz et al.(2006), quienes plantean que en general se distinguen los embriones de origen unicelular, por verse unidos al tejido parental por un pie, mientras en los de origen multicelular, los embriones no están unidos por un pie a la masa de callo, sino a través de cuerpos de múltiples embriones fusionados.

Los callos R, exhibieron una apariencia compacta y sus colores variaban desde blancos, pasando por amarillos hasta marrones claros, cuya superficie estaba conformada por raíces alargadas cubiertas totalmente con pelos radiculares (Fig. 1d), observándose un agrupamiento de primordios radiculares (Fig. 2b), formados por células irregulares, distinguiéndose, además, la

En cuanto a los resultados en la fase regenerativa, al evaluar 2 medios de regeneración y el tratamiento de estrés osmótico, también se encontró una respuesta distinta en función del cultivar, evidenciándose la diferenciación de Otro aspecto estudiado en este trabajo, fue plantas entre 10-50%. También se observó que la la influencia del estrés osmótico en la frecuencia mayor frecuencia regenerativa fue en R2 (AIA 0.5 regenerativa, tal como se ha demostrado en arroz

-1 -1mg.L + de BA 2 mg.L ) para todas las indica, al utilizar en el medio de cultivo, manitol variedades: 44% en Araure-4, 50% para Cimarron (Yoshida et al., 1998) sorbitol (Rubi et al., 1999), (Tabla 5), 44% para Centauro y 45% para altas concentraciones de sacarosa, maltosa Venezuela-21 (Tabla 6). Estos resultados (Grewal et al., 2005) o de agar (Lai & Liu, 1988) o corroboran los obtenidos por diversos la desecación (Saharan et al., 2004). En este investigadores, que evidencian altas frecuencias sentido el tratamiento de desecación aplicado de regeneración en cultivares de arroz indica, al favoreció de manera significativa la regeneración emplear medios suplementados con BA: 0.5 en todos los cultivares: Araure-4 (24h:44%) y

-1 -1mg.L (Kabir et al., 2008), 2 mg.L (Jan et al., Cimarrón (24h:50%) (Tabla 5), Centauro

conexión vascular con el tejido parental (Fig. 2c), a través de vasos xilemáticos de engrosamientos reticulares en sus

Fig. 2. Histología de los callos. a. Callo NE. b. Callo R. c. paredes, así como también la formación de Primordio rizogénico, donde se detalla tejido vascular (X). traqueídas (Fig. 2m). d. Callo E. e. Epidermis uniestratificada (Ep) en callo E. f. Nódulos meristemáticos (NM). g-h. Embrión somático globular aislado (EG). i-j. Embrión somático con suspensor (S). k. Cuerpo de embriones fusionados. M. Tejido vascular (X) en callo E.



favorece la hipermetilación del ADN, y es por ello anatómicamente su superficie estaba constituida que las células se mantienen en alta actividad por células pequeñas de forma alargada, irregular mitótica, estimulando la formación de embriones; y de citoplasma pobre (Fig. 2a). Los callos E es así como el proceso de embriogénesis está encontrados fueron compactos, de apariencia relacionado con el establecimiento de un balance globular, con una coloración blanco-crema, y específico en las hormonas endógenas del una superficie brillante y lisa (Fig. 1b y 1c). Los explante. estudios anatómicos, permitieron distinguir diferentes etapas de desarrollo del embrión, a

Asimismo, estos resultados evidenciaron partir de una masa proembriogénica (Fig. 2d) de que el proceso de embriogénesis somática está origen multicelular, donde se observó una relacionado no solo con la presencia de 2,4-D, epidermis uniestratificada (Fig.2e), centros sino con la combinación de esta auxina con las meristemáticos (Fig. 2f), embriones somáticos citoquininas K o BA, tal como lo señalan aislados de tipo globular (Fig. 2g y 2h) y de mayor numerosos investigadores en cultivo in vitro de desarrollo con suspensor (Fig. 2i y 2j), revelando arroz (Khatun et al., 2003; Abayawickrama & su origen unicelular.Anai, 2006; Beena, 2006). A su vez esta respuesta fue diferencial en cuanto a la formación del callo, También se pudo evidenciar la formación ya que depende de la combinación y la de un cuerpo multiembriogénico o de embriones concentración de hormonas en función del fusionados, indicando la posibilidad de un origen cultivar, tal como lo han descrito Carnoso & multicelular de los embriones (Fig. 2k).Yoshida (2006) y Ge et al. (2006).

Los callos se desarrollaron en la zona embrional de la semilla, específicamente del escutelo, diferenciándose múltiples masas pro embriogénicas que dan origen posteriormente a los embriones, tal como lo indica Mariani et al. (2002). Los tipos de callo encontrados en este estudio fueron No Embriogénicos (NE) y Embriogénicos (E), distinguiéndose también callos organogénicos: Rizogénicos (R) y con brotes (Br), así como las combinaciones de los mismos (Fig. 1a-m). Estos callos ya han sido descritos ampliamente en cereales (Nabors et al., 1983; Vasil, 1987). Las combinaciones de distintos tipos de callos, representan una amplia heterogeneidad morfológica, que puede estar relacionada con la capacidad regenerativa, tal como señaló Kucherenko (1993) al caracterizar 33 tipos distintos de callos de Oryza sativa.

Los callos NE eran friables y de color amarillo, acompañados en su mayoría por callos E, observándose callos mixtos (Fig. 1a);

Fig. 1. Tipos de callos. a. Callo NE. b. Callo formado en la zona embrional de la semilla. c. Callo E. d-e. Callo rizogénico. f. Callo con brotes (Br). g. Callo NE y con raíces (R). h. callo NE con brotes y raíces. i. Callo con brotes (Br) y raíces (R). j. Callo NE y E. k. Callo NE con brotes (Br). m. Callo necrótico.



-1 -1En cereales, incluyendo el arroz se plantea 2001), 2,5 mg.L (Tariq et al., 2008), 5 mg.L que el origen de los embrioides es unicelular, no (Belal et al., 2006)obstante, no se descarta que se presente simultáneamente el origen multicelular de los mismos, tal como lo describimos en este trabajo. Este aspecto es ampliamente descrito por Willians & Maheswaran (1986) y Quiroz et al.(2006), quienes plantean que en general se distinguen los embriones de origen unicelular, por verse unidos al tejido parental por un pie, mientras en los de origen multicelular, los embriones no están unidos por un pie a la masa de callo, sino a través de cuerpos de múltiples embriones fusionados.

Los callos R, exhibieron una apariencia compacta y sus colores variaban desde blancos, pasando por amarillos hasta marrones claros, cuya superficie estaba conformada por raíces alargadas cubiertas totalmente con pelos radiculares (Fig. 1d), observándose un agrupamiento de primordios radiculares (Fig. 2b), formados por células irregulares, distinguiéndose, además, la

En cuanto a los resultados en la fase regenerativa, al evaluar 2 medios de regeneración y el tratamiento de estrés osmótico, también se encontró una respuesta distinta en función del cultivar, evidenciándose la diferenciación de Otro aspecto estudiado en este trabajo, fue plantas entre 10-50%. También se observó que la la influencia del estrés osmótico en la frecuencia mayor frecuencia regenerativa fue en R2 (AIA 0.5 regenerativa, tal como se ha demostrado en arroz

-1 -1mg.L + de BA 2 mg.L ) para todas las indica, al utilizar en el medio de cultivo, manitol variedades: 44% en Araure-4, 50% para Cimarron (Yoshida et al., 1998) sorbitol (Rubi et al., 1999), (Tabla 5), 44% para Centauro y 45% para altas concentraciones de sacarosa, maltosa Venezuela-21 (Tabla 6). Estos resultados (Grewal et al., 2005) o de agar (Lai & Liu, 1988) o corroboran los obtenidos por diversos la desecación (Saharan et al., 2004). En este investigadores, que evidencian altas frecuencias sentido el tratamiento de desecación aplicado de regeneración en cultivares de arroz indica, al favoreció de manera significativa la regeneración emplear medios suplementados con BA: 0.5 en todos los cultivares: Araure-4 (24h:44%) y

-1 -1mg.L (Kabir et al., 2008), 2 mg.L (Jan et al., Cimarrón (24h:50%) (Tabla 5), Centauro

conexión vascular con el tejido parental (Fig. 2c), a través de vasos xilemáticos de engrosamientos reticulares en sus

Fig. 2. Histología de los callos. a. Callo NE. b. Callo R. c. paredes, así como también la formación de Primordio rizogénico, donde se detalla tejido vascular (X). traqueídas (Fig. 2m). d. Callo E. e. Epidermis uniestratificada (Ep) en callo E. f. Nódulos meristemáticos (NM). g-h. Embrión somático globular aislado (EG). i-j. Embrión somático con suspensor (S). k. Cuerpo de embriones fusionados. M. Tejido vascular (X) en callo E.



(48h:44%) y Venezuela-21 (24h:45%) (Tabla 6), particularmente en 24 horas, mientras que a 72 horas se necrotizaron los callos en la primera semana de cultivo y no regeneraron plantas, concordando así nuestros resultados con los obtenidos por Saharan et al., (2004). Al parecer, el estrés osmótico favorece la regeneración, debido a que induce cambios estructurales y enzimáticos en la conformación de la pared celular (Crosgrovel, 1997), así como en el metabolismo de los carbohidratos, incrementándose el nivel de azucares solubles (glucosa) a partir de la degradación de almidón (Huang & Liu, 2002).

En el proceso de regeneración se obtuvieron plantas completas. Después de dos semanas de subcultivo en el medio respectivo, se evidenciaron cambios morfológicos en los callos, observándose la germinación de los embriones somáticos al visualizar el vástago o ápice del mismos, los cuales de blanco crema (Fig.3a) se tornaron a verde (Fig.3b); luego de 3 semanas se observaron estructuras completas con múltiples hojas y raíces con abundantes pelos radiculares (Fig. 3c y 3d), aisladas (Fig. 3e) o en grupos (Figura 3f), teniendo finalmente a las 4 semanas 4. Conclusionesplántulas individuales (Fig. 3g) o en macollas (Fig. 3h). Por lo tanto, este sistema de La respuesta tanto en la fase de inducción regeneración fue eficaz para cultivares indica, tal como de regeneración dependió del cultivar. como lo señalaron Saharan et al., (2004).

Los cultivares Centauro y Venezuela 21, presentaron los mayores porcentajes de callo embriogénico, en medios de inducción con 1-2

-1 -1 mg.L de 2,-D con 2 mg.L de BA o K.

-1El medio de regeneración con BA (2 mg.L ), favoreció una mayor frecuencia regenerativa, en las variedades venezolanas arroz.

El estrés osmótico aplicado (desecación del callo) a las 24 o 48 h, presentó un efecto

Tabla 6. Frecuencias de regeneración de los cultivares: significativamente favorable en la regeneración Centauro y Venezuela-21 de un mayor número de plantas, por Cito: citoquinina

embriogénesis somática indirecta, siendo esto

Fig. 3. Proceso regenerativo. a-b. Callo E con embriones globulares (EG) y de mayor desarrollo donde se detalla el vástago (V) o ápice (Ap). c-f. Embriones somáticos germinando donde se detalla el vástago (V) y la raíz (R). g. Plántula. h. Macolla de Plantas.

Hormonas ( mg.L-1)

Regeneración Plantas

M AIA

cito

Estrés

Osmótico (horas)

Centauro

Venezuela-21

0 28 10

24 12.5 37 48 37 15

R1 2K

72 - -

0 30 25

24 37.5 45 48 44 19

R2

0.5

2B

A

72 - -



potencialmente importante en futuros programas Carnoso, N. & T. Yoshida. (2006). Identification de mejoramiento genético de arroz. of Callus Induction Potencial of 15 Indonesian

Rice Genotypes. Plant. Prod. Sci. 9 (1): 65-70. 6. Bibliografía

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(48h:44%) y Venezuela-21 (24h:45%) (Tabla 6), particularmente en 24 horas, mientras que a 72 horas se necrotizaron los callos en la primera semana de cultivo y no regeneraron plantas, concordando así nuestros resultados con los obtenidos por Saharan et al., (2004). Al parecer, el estrés osmótico favorece la regeneración, debido a que induce cambios estructurales y enzimáticos en la conformación de la pared celular (Crosgrovel, 1997), así como en el metabolismo de los carbohidratos, incrementándose el nivel de azucares solubles (glucosa) a partir de la degradación de almidón (Huang & Liu, 2002).

En el proceso de regeneración se obtuvieron plantas completas. Después de dos semanas de subcultivo en el medio respectivo, se evidenciaron cambios morfológicos en los callos, observándose la germinación de los embriones somáticos al visualizar el vástago o ápice del mismos, los cuales de blanco crema (Fig.3a) se tornaron a verde (Fig.3b); luego de 3 semanas se observaron estructuras completas con múltiples hojas y raíces con abundantes pelos radiculares (Fig. 3c y 3d), aisladas (Fig. 3e) o en grupos (Figura 3f), teniendo finalmente a las 4 semanas 4. Conclusionesplántulas individuales (Fig. 3g) o en macollas (Fig. 3h). Por lo tanto, este sistema de La respuesta tanto en la fase de inducción regeneración fue eficaz para cultivares indica, tal como de regeneración dependió del cultivar. como lo señalaron Saharan et al., (2004).

Los cultivares Centauro y Venezuela 21, presentaron los mayores porcentajes de callo embriogénico, en medios de inducción con 1-2

-1 -1 mg.L de 2,-D con 2 mg.L de BA o K.

-1El medio de regeneración con BA (2 mg.L ), favoreció una mayor frecuencia regenerativa, en las variedades venezolanas arroz.

El estrés osmótico aplicado (desecación del callo) a las 24 o 48 h, presentó un efecto

Tabla 6. Frecuencias de regeneración de los cultivares: significativamente favorable en la regeneración Centauro y Venezuela-21 de un mayor número de plantas, por Cito: citoquinina

embriogénesis somática indirecta, siendo esto

Fig. 3. Proceso regenerativo. a-b. Callo E con embriones globulares (EG) y de mayor desarrollo donde se detalla el vástago (V) o ápice (Ap). c-f. Embriones somáticos germinando donde se detalla el vástago (V) y la raíz (R). g. Plántula. h. Macolla de Plantas.

Hormonas ( mg.L-1)

Regeneración Plantas

M AIA

cito

Estrés

Osmótico (horas)

Centauro

Venezuela-21

0 28 10

24 12.5 37 48 37 15

R1 2K

72 - -

0 30 25

24 37.5 45 48 44 19

R2

0.5

2B

A

72 - -



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ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE REGENERACIÓN IN VITRO DE...

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