8 Medicina Infantil Vol. XXIII N° 1 Marzo 2016

TRABAJOS ORIGINALES

ESTIMACION DEL INTERVALO DE REFERENCIA DE CALCIO, FOSFORO Y FOSFATASA ALCALINA SERICOS EN POBLACION PEDIATRICA UTILIZANDO UNA BASE DE DATOS POR EL METODO DE HOFFMANN MODIFICADO

Dres. G. D’Isa*, C. Chilelli*, C. Tau**, G. Viterbo**, M. Rubinstein*, E. Chaler*

* Laboratorio Central.** Laboratorio de Metabolismo fosfocálcico.Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan.Recibido: 03/02/2016 — Aceptado: 10/02/2016Correspondencia: Eduardo Chaler, e-mail:echaler@yahoo.com

RESUMENLas concentraciones de calcio (Ca), fósforo (P) y fosfatasa alca-lina sérica (FAL) son extensamente evaluados en pediatría. La aplicación del procedimiento recomendado por la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) para evaluar FAL en el equipo Cobas 501 de Roche, requirió de una reevaluación del Intervalo de referencia (IR) en nuestra población pediátrica. El método indirecto de Hoffmann con la modificaciones propuestas por Katayev et al. provee un mecanismo para estimar IR en po-blaciones de difícil estudio como la pediátrica. A partir de trabajar con nuestra base de datos nos propusimos fijar IR para Ca., P, y FAL discriminados por edad y sexo (en el caso de la FAL) en nuestra población pediátrica. Se utilizaron los resultados de un año de la base de datos del hospital de sujetos entre 0 y 18 años El total de los sujetos analizados fue de 13.906 pacientes para Calcio 14.790 para fósforo y 6.333 para FAL. En FAL encontra-mos dimorfismo sexual en los grupos de 7 a 9, 10 a 12, 13 a 15 y 16 a 18 años con una diferencia significativa (p<0,0001). Los IR fueron calculados con los procedimientos recomendados por edad y género, los analitos Ca y P no presentaron diferencias por sexo y las diferencias por edad no fueron significativas aun-que sí resultaron útiles para fijar los rangos frente a la FAL. El método de Hoffmann modificado es útil para la evaluación de poblaciones con dificultades para su estudio como la pediátrica.

Palabras clave: fosfatasa alcalina sérica, dimorfismo sexual.

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ABSTRACTSerum calcium (Ca), phosphorus (P), and alkaline phosphatase (AP) levels are broadly assessed in pediatrics. The procedure recommended by the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) for measuring AP in the Cobas 501 of Roche required reassessment of the reference interval (RI) in our pediatric population. The indirect method of Hoffmann with modifications proposed by Katayev et al. provides a mechanism to estimate the RI in difficult-to-study populations, such as children. Based on our data base, we aimed at determining the RI for Ca, P, and AP divided by age and sex (in the case of AP) in our pediatric population. One-year results of the hospital data base of subjects between 0 and 18 years of age were used. A total of 13.906 patients were analyzed for Ca, 14,790 for Ph, and 6,333 for AP. For AP sexual dimorphism was found in the age groups 7 to 9, 10 to 12, 13 to 15, and 16 to 18 years with a significant difference (p<0.0001). RIs were calculated with recommendations for age and sex. The analytes Ca and P did not show differences according to age, and differences according to sex were not significant although they were useful to determine ranges relative to AP. The modified Hoffmann method is useful in the evaluation of difficult-to-study populations, such as children.

Key words: Serum alkaline phosphatase, sexual dimorphism.

Medicina Infantil 2016; XXIII: 8 - 12.

INTRODUCCIONLas concentraciones de calcio (Ca), fósforo (P)

y fosfatasa alcalina sérica (FAL) son extensamente

evaluados en pediatría. La FAL es una enzima que posee diferentes isoenzimas y está presente en un gran número de tejidos incluyendo hígado, huesos, intestino, riñón y placenta. La FAL sérica proviene de cuatro genotipos estructurales: hígado, hueso, riñón e intestino, también hay una forma placentaria y una variante de células germinales. La FAL es amplia-mente utilizada en la evaluación de dos condiciones

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Intervalo de referencia 9

patológicas: enfermedad hepatobiliar y enfermedad ósea con incremento de la actividad osteoblástica.

Desde principio de los 80’ existe el propósito de estandarizar el procedimiento de medida de la FAL (1). El principio de la reacción de medida se basa en el uso de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP) como bu-ffer, el agregado de cationes magnesio y zinc como cofactores, la utilización de 4-nitrofenil fosfato (NPP) como sustrato y una temperatura de incubación de 37°C. El resultado se expresa como hidrólisis de un µmol de sustrato por unidad de tiempo2.

FAL NPP + H2O p-Nitrofenol + Fosfato

NPP: paranitrofenilfosfato

A pesar de los numerosos intentos realizados, no existe armonización en los resultados obtenidos de-bido a varios factores que modifican la cinética de la reacción, como la aplicación de diferentes pH en el medio de reacción, el uso de distintas concentracio-nes de sustrato y a diferencias en las concentracio-nes de cationes utilizados como cofactores. Esto lleva a la necesidad de evaluar el intervalo de referencia (IR) para FAL según el método utilizado y la pobla-ción en estudio, definiendo intervalo de referencia al intervalo de datos que cuando se aplica a la población atendida por el laboratorio incluye correctamente a la mayoría de los sujetos con características similares a las del grupo de referencia y excluye a otros, en general incluyen a un 95% de la población.

Para FAL el fabricante (Roche) no evaluó IR para población pediátrica). Por lo tanto, la aplicación del procedimiento recomendado por la International Fe-deration of Clinical Chemistry (IFCC) para evaluar FAL en el equipo Cobas 501 de Roche, requirió de una ree-valuación del IR en nuestra población pediátrica.

El método indirecto de Hoffmann3 con las modi-ficaciones propuestas por Katayev et al4 provee un mecanismo para estimar intervalos de referencia (IR) en poblaciones de difícil estudio como la pediátrica. El cálculo se realiza a partir de grandes cantidades de datos dentro de los cuales, se supone, están incorpo-rados los valores de referencia de la población en es-tudio. Se construye un gráfico de resultados obtenidos (concentración del analito) en función de su frecuencia de aparición. Si el número de datos es importante y la distribución de los mismos es normal o normalizada, el gráfico presenta una zona lineal que representa la población de referencia, a partir de la ecuación obte-nida de esta zona lineal (y: a*x + b, donde y es la con-centración del analito, a la pendiente de la recta, x la frecuencia de aparición y b la ordenada al origen). Se calcula el valor de concentración para una frecuencia de aparición de 2,5% y de 97,5% y éste sería el IR para la población en estudio ± 2 desvíos estándar.

Se ha propuesto el valor de referencia de cambio (VRC) para determinar la significación estadística de

las diferencias observadas entre el IR calculado para nuestra población y el IR publicado, si lo hubiera, para el mismo método. El criterio es si las diferencias por-centuales observadas son menores que el VRC, la di-ferencia es considerada no significativa y aceptamos el IR calculado para ser utilizado en nuestra población.

El VRC se calcula como VRC: 2½*1.96*(CVa2 + CVi2) ½ donde CVa: coeficiente de variación analítico obtenido a partir de los datos del control de calidad in-terno y CVi: coeficiente de variación biológica. Repre-senta la variación aceptable entre dos resultados de un mismo paciente e incorpora la variación analítica de un resultado usando el mismo método y la varia-ción debida a ritmos biológicos y/u oscilación alrede-dor de un punto homeostático, la cual se considera fisiológica y se denomina variación biológica.

A partir de estas estimaciones y de la posibilidad de trabajar con nuestra base de datos y pudiendo eli-minar resultados de pacientes con registros de posi-bles patologías que afecten los mismos nos propu-simos fijar el IR para Ca, P y FAL discriminados por edad y también por sexo (en el caso de la FAL) en nuestra población pediátrica5.

OBJETIVOS

Establecer el IR para Ca, P y FAL (utilizando el procedimiento recomendado por la IFCC) en nuestra población pediátrica

MATERIALES Y METODOSSe utilizaron los resultados de un año de la base

de datos del hospital de sujetos entre 0 y 18 años. Los n resultantes fueron: Ca: 32.592, P: 35.794, FAL: 37.725. Se excluyeron todos los resultados de pa-cientes que registraran algún diagnóstico que pudiera afectar los resultados, como enfermedades hepáti-cas, alteraciones óseas, alteraciones del metabolismo fosfo-cálcico, alteraciones renales. Los IR para Ca y P sérico fueron calculados por el método de Hoffmann modificado y comparados con los IR publicados por Soldin et al6.

Para la FAL se excluyeron todos los sujetos con Ca o P fuera del IR obtenidos previamente, con ni-veles elevados de alanino amino transferasa (GPT), aspartato amino transferasa (GOT) y gamma glutamil transpeptidasa (GGT) y/o con urea o creatinina fuera del rango de normalidad.

Se eliminaron outliers utilizándose el rango inter-cuartilico (IQR).

Todas las determinaciones séricas fueron realiza-das en el equipo Cobas 6000-501 de Roche. El mé-todo utilizado para el Ca fue el método colorimétrico BAPTA. El método utilizado para el P fue el método enzimático del fosfomolibdato UV.

RESULTADOSCalcio

El total de los sujetos analizados fue 35.592. Se

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eliminaron los sujetos con algún diagnóstico que pu-diera afectar los resultados y quedaron 14.603. Pos-teriormente se eliminaron outliers y el n resultante fue 13.906 pacientes (Figura 1). Se realizó el estudio en función de la edad de los pacientes según la siguiente distribución: de 1 a 30 días (n = 30), 31 a 365 días (n = 914), 1 a 3 años (n = 2.351), 4 a 6 años (n = 2.096), 7 a 9 años (n = 2.114), 10 a 12 años: (n = 2.253), 13 a 15 años (n = 2590) y 16 a 18 años (n = 1.558). Los valores fueron analizados por el método de Hoffmann modificado grupo por grupo y arrojaron un IR para Ca (mg/dl) según edad de 1 a 30 días: 8,7 – 11,0, de 31 a 365 días: 8,9 – 10,9, de 1 a 3 años: 8,9 – 10,2 , de 4 a 6 años: 8,9 – 10,2, de 7 a 9 años: 8,9 – 10,2, de 10 a 12 años: 8,9 – 10,2, de 13 a 15 años: 8,8 – 10,1 y de 16 a 18 años: 8,7 – 10,1. Estos resultados es-tán contenidos dentro de los publicados6 aplicando el VRC (Tabla 1).

FósforoEl total de los sujetos analizados fue 35.794. Se eli-

minaron los sujetos con algún diagnóstico que pudiera afectar los resultados y quedó un n de 15.501. Poste-riormente se eliminaron los outliers y quedaron 14.790 pacientes (Figura 2). Se estudiaron con una distribu-ción en función de la edad de 1 a 30 días (n = 18), de 31 a 365 días (n = 948), de 1 a 3 años (n = 2.490), de 4 a 6 años (n = 2.165), de 7 a 9 años (n = 2.281), de 10 a 12 años (n = 2.435), de 13 a 15 años (n = 2.766) y de 16 a 18 años (n = 1.687). Estos resultados fueron analizados por el método de Hoffmann modificado to-mando cada uno de los grupos y arrojaron un IR para P (mg/dl) según edad de 1 a 30 días: 4,0 – 7,3, de 31 a 365 días: 4,2 – 6,7, de 1 a 3 años: 3,9 – 6,0, de 4 a 6 años: 3,7 – 5,7, de 7 a 9 años: 3,8 – 5,6, de 10 a 12 años: 3,6 – 5,5, de 13 a 15 años: 3,2 – 5,4 y de 16 a 18 años: 2,9 – 5,0. Estos resultados están contenidos dentro de los publicados6 aplicando el VCR. (Tabla 2).

FALEl total de sujetos analizados fue de 37.725. Se

eliminaron los sujetos con algún diagnóstico que pu-diera afectar los resultados y quedó un n = 24.683. Se eliminaron los outliers y quedaron 22.863. De estos sujetos se seleccionaron aquellos con Ca, P, GPT, GOT y GGT normales. El grupo a analizar fue de 6.333 resultados (Figura 3), 3.036 niños y 3.297 niñas (Figura 4). La distribución en función de la edad de los niños fue: de 31 a 365 días (n = 181), de 1 a 3 años (n = 583), de 4 a 6 años (n = 456), de 7 a 9 años: (n =512), de 10 a 12 años (n = 404), de 13 a 15 años (n = 566) y de 16 a 18 años (n = 334). En niñas la distribución fue de 31 a 365 (n = 180), de 1 a 3 años (n = 499), de 4 a 6 años (n = 438), de 7 a 9 años (n = 531), de 10 a 12 años (n = 603), de 13 a 15 años (n = 672) y de 16 a 18 años (n = 374).

Tabla 1: El IR del Ca expresado en mg/dl esta referido por rango eta-rio. Se identifica el número de resultados para cada edad (n), su total (13.906) y la comparación con los resultados publicados en el Pediatric reference range por Soldin et al.6, la diferencia porcentual entre nues-tros resultados obtenidos y los publicados y el valor de referencia de cambio (VCR) para la determinación.

Edad n Ca(mg/dl)

IR Soldin

Diferencia (%)

VCR(%)

1-30 días 30 8,7 -11,0 8,5 - 10,6 2,35-3,77 8,3

31-365 días 914 8,9 - 10,9 8,7 - 10,5 2,30-3,80

1-3 años 2.351 8,9 - 10,5 8,8 - 10,6 1,13-0,94

4-6 años 2.096 8,9 - 10,2 8,8 - 10,6 1,13-3,77

7-9 años 2.114 8,9 - 10,2 8,7 - 10,3 2,30-0,97

10-12 años 2.253 8,9 - 10,2 8,7 - 10,2 2,30-0,00

13-15 años 2.590 8,8 - 10,1 8,5 - 10,2 3,53-0,98

16-18 años 1.558 8,7 - 10,1 8,4 - 10,3 3,57-1,94

Total 13.906

Figura 1: A. Resultados de Ca sérico de un año de la base de datos hospitalaria (sujetos totales: 35. 522). B. Se eliminaron todos aque-llos que tuvieran algún registro patológico (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados: 14.603), C. Se eliminaron los outliers por análisis del rango intecuartilico (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados y sin outliers: 13.906).

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20

Calci

o (m

g/dl

)

Calcio Sujetos totales n: 34592

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20

Calci

o (m

g/dl

)

Sujetos sin diagnos�co n: 14603

4

6

8

10

12

14

16

0 5 10 15 20

Calci

o (m

g/dl

)

Edad (años)

Sujetos sin diagnosco, sin outliers n: 13906

A

B

C

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Intervalo de referencia 11

Cada grupo fue procesado utilizando el método de Hoffmann modificado y se obtuvieron los siguientes rangos para FAL (U/L):

Niños: de 31 a 365 días 107 - 366, de 1 a 3 años 116 - 293, de 4 a 6 años 110 - 286, de 7 a 9 años 110 - 302, de 10 a 12 años 91 - 291, de 13 a 15 años 106 - 343 y de 16 a 18 años 54 – 221.

Niñas: de 31 a 365 días 133 - 335, de 1 a 3 años 125 - 294, de 4 a 6 años 109 - 290, de 7 a 9 años 128 - 318, de 10 a 12 años 98 - 348, de 13 a 15 años 45 - 216 y de 16 a 18 años 36 – 149.

Encontramos dimorfismo sexual en los grupos de 7 a 9, 10 a 12, 13 a 15 y 16 a 18 años con una diferen-cia significativa (p<0,0001) (Tabla 3) . El análisis de covarianza confirma una diferencia entre varones y mujeres dependiente de sexo y edad con las siguien-tes ecuaciones:

Niños: FAL: 219 – (4.64 x edad).Niñas: FAL: (219+34) –(4.64 x edad).

DISCUSION Según la norma ISO 15189 para laboratorios de

análisis clínicos, en uno de sus requisitos particulares a la calidad y la competencia, indica que los labora-torios deben verificar o establecer sus intevalos de referencia para la población en estudio.

El cálculo de IR en poblaciones pediátricas es un desafío que se enfrenta a decisiones éticas, organi-zativas y técnicas difíciles de superar5; sin embargo la velocidad del cambio tecnológico con la permanente búsqueda de mejorar la calidad analítica hacen que con frecuencia debamos estar reevaluando metodo-logías (7,8) y renovando el desafío. Los IR fueron calculados con los procedimientos recomendados por edad y género, los analitos Ca y P no presenta-ron diferencias por sexo y las diferencias por edad no fueron significativas aunque sí resultaron útiles para fijar los rangos frente a la FAL, la cual presenta di-morfismo a partir de los 7 años de edad, reflejando las diferencias en la maduración esquelética entre ambos sexos. Para Ca y P se pudieron comparar los

Figura 2: A. Resultados de P sérico de un año de la base de datos hospitalaria (sujetos totales: 35.794). B. Se eliminaron todos aque-llos que tuvieran algún registro patológico (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados: 15.501), C. Se eliminaron los outliers por análisis del rango intecuartilico (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados y sin outliers: 14.790).

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

Fosf

oro

(mg/

dl)

Fosforo Sujetos totales n: 35794

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

Fosf

oro

(mg/

dl)

Sujetos sin diagnosco n: 15501

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20

Fosf

oro

(mg/

dl)

Edad (años)

Sujetos sin diagnos�co, sin outliers n: 14790

A

B

C

Tabla 2: El IR del P expresado en mg/dl está referido por rango etario, se identifica el número de resultados para cada edad (n) su totalidad (14.790), la comparación con los resultados publicados en el Pediatric reference range por Soldin et al6, la diferencia porcentual entre nues-tros resultados obtenidos y los publicados y el valor de referencia de cambio (VCR) para la determinación.

Edad n P(mg/dl)

IRSoldin

Diferencia(%)

VCR(%)

1-30 días 18 4,0 - 7,3 4,6 - 8,0 13,04 - 8,75 24,331-365 días 948 4,2 - 6,7 3,9 - 6,5 7,69 - 3,071-3 años 2.490 3,9 - 6,0 4,0 - 5,4 2,50 - 11,114-6 años 2.165 3,7 - 5,7 3,7 - 5,6 0,00 - 1,787-9 años 2.281 3,8 - 5,6 3,7 - 5,6 2,70 - 0,0010-12 años 2.435 3,6 - 5,5 3,3 - 5,4 9,09 - 1,8513-15 años 2.766 3,2 - 5,4 2,9 - 5,4 10,34 - 0,0016-18 años 1.687 2,9 - 5,0 2,8 - 4,6 3,57 - 8,69Total 14.790

Tabla 3: El IR de la FAL expresado en U/L está referido por rango etario, se identifica el número de resultados para cada edad y gene-ro (n), su total para cada sexo (niños = 3.036, niñas = 3.297).

Edad FAL (U/L) Niños

n FAL (U/L) Niñas

n

1-30 días 31-365 días 107 - 366 181 133 - 335 1801-3 años 116 - 293 583 125 - 294 4994-6 años 110 - 286 456 109 - 290 4387-9 años 110 - 302 512 128 - 318 531*10-12 años 91 - 291 404 98 - 348 603*13-15 años 106 - 343 566 45 - 216 672*16-18 años 54 - 221 334 36 - 149 374*

3.036 3.297

Diferencia significativa *p<0,0001

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IR obtenidos con publicaciones con la misma tecnolo-gía y para población pediátrica6. No fue así para FAL donde el IR lo definimos con este trabajo. El método de Hoffmann modificado es útil para la evaluación de poblaciones con dificultades para su estudio como la pediátrica.

REFERENCIAS1. Tietz NW, Rinker AD, Shaw LM. International Federation of Clinical

Chemistry. IFCC methods for the measurement of catalytic concen-tration of enzymes. Part 5. IFCC method for alkaline phosphatase (orthophosphoric-monoester phosphohydrolase, alkaline optimum, EC 3.1.3.1). IFCC Document Stage 2, Draft 1, 1983-03 with a view to an IFCC Recommendation. Clin Chim Acta. 1983;135:339F-367F.

2. Siekmann L, Bonora R, Burtis CA, et al. IFCC primary reference pro-cedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37°C. Part 1. The concept of reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes. Clin Chem Lab Med 2002;40:631-4.

3. Hoffmann RG. Statistics in the practice of medicine. JAMA 1963; 185: 864-73.

4. Katayev MD, Balciza C, Seccombe DW. Establishing reference inter-vals for clinical laboratory test results: is there a better way? Am J Clin Pathol 2010; 133: 180-86.

5. Colantonio DA, Kyriakopoulou L, Chan MK, et al. Closing the gaps in pediatric laboratory reference intervals: a CALIPER database of 40 biochemical markers in a healthy and multiethnic population of children. Clin Chem 2012; 58: 854-68.

6. Soldin SJ, Brugnara C, Hicks JM. Pediatric Reference Ranges, 3rd ed. AACC Press, Washington, DC, USA, 1999.

7. Ceriotti F. Establishing pediatric reference intervals: a challenging task. Clin Chem 2012;58:808-10.

8. Siest G, Henny J, Gräsbeck R, et al. The theory of reference values: an unfinished symphony. Clin Chem Lab Med. 2013 51:47-64.

01002003004005006007008009001000

0 5 10 15 20

FAL (

U/L

) FAL

Sujetos Totales n: 37725

01002003004005006007008009001000

0 5 10 15 20

FAL

(U/L

)

Sujetos sin diagnos�co n: 24683

01002003004005006007008009001000

0 5 10 15 20

FAL (

U/L

)

Sujetos sin diagnos�co, sin outliers n: 22863

01002003004005006007008009001000

0 5 10 15 20

FAL (

U/L

)

Edad (años)

Sujetos sin diagnosco, sin outliers y con Ca, P, GPT, GOT, GGT normales n: 6333

A

B

C

D

Figura 3: A. Resultados de FAL sérica de un año de la base de datos hospitalaria (sujetos totales: 37.725). B. Se eliminaron todos aquellos que tuvieran algún registro patológico (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados: 24.683), C. Se eli-minaron los outliers por análisis del rango intercuartilico (sujetos sin diagnóstico, sin outliers: 22.863), D. Se eliminaron también aquellos con Ca, P, GPT, GOT, GGT fuera de rango (sujetos sin diagnóstico que pudiera alterar los resultados, sin outliers y con Ca, P, GPT, GOT y GGT normales: 6.333).

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20

FAL

(U/L

)

FAL n: 6333

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20

FAL

(U/L

)

Niños n: 3036

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20

FAL

(U/L

)

Edad (años)

Niñas n: 3297

A

B

C

Figura 4: Los resultados de FAL se dividen por género y se gra-fican juntos (A) y por separado (B. Niños y C. Niñas).

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