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Tesis Doctoral

Estudio de las vías visualesEstudio de las vías visualessuperiores en el glaucomasuperiores en el glaucoma

experimentalexperimental

Bordone, Melina Paula

2015-03-20

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:

Bordone, Melina Paula. (2015-03-20). Estudio de las vías visuales superiores en el glaucomaexperimental. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Bordone, Melina Paula. "Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental".Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2015-03-20.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental

Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS

Melina Paula Bordone

Directora de tesis: Prof. Dra. Ruth Estela Rosenstein Consejero de Estudios: Prof. Dr. Matías Pandolfi

Lugar de trabajo: Departamento de Bioquímica Humana, Laboratorio de Neuroquímica Retiniana y Oftalmología Experimental, Facultad de Medicina, UBA. CEFyBO/CONICET. Buenos Aires, 2015

Estudio de las vías visuales superiores en el glaucoma experimental

El glaucoma, una de las principales causas de ceguera irreversible, se caracteriza por una pérdida

progresiva de las funciones visuales, que se asocia a la muerte de células ganglionares retinianas

(CGRs) y atrofia de la cabeza del nervio óptico (NO). El principal factor de riesgo es el aumento de

la presión intraocular (PIO). Aunque el glaucoma fue concebido como una enfermedad limitada al

ojo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En

este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y crónico sobre el

sistema visual consciente (SV-C) y el sistema visual no formador de imagen (SV-NFI). El SV-C en

la rata, se compone de las CGRs clásicas y sus axones que proyectan al colículo superior (CS) y al

núcleo geniculado lateral (NGL). El SV-NFI se compone por las CGRs intrínsecamente fotosensibles

que expresan melanopsina (CGRsm) y proyectan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), al núcleo

pretectal olivar (NPO) y al intergeniculado (IG), que participan en la sincronización del reloj

circadiano y el reflejo pupilar, entre otros. El modelo de glaucoma agudo consistió en un aumento de

la PIO a 70 mm de Hg durante 90 min (hipertensión ocular aguda, HOA), en tanto que el glaucoma

crónico se indujo a través de inyecciones intracamerales de condroitín sulfato (CSU), una vez por

semana, durante 15 semanas. A los 7 días post-HOA se observó una alteración significativa de la

función y estructura retinianas, con una pérdida significativa de CGRs, así como cambios astro- y

microgliales en el CS y una disminución en el transporte anterógrado desde la retina al CS y NGL,

pero no a los NSQ y al NPO. El número de CGRsm, los niveles de melanopsina y el reflejo pupilar

consensual permanecieron inalterados aún a las 4 semanas post-HOA. La administración de CSU por

6 semanas indujo alteraciones en la función retiniana y en la vía visual, una disminución en el

transporte anterógrado a todas las áreas de proyección y cambios gliales a nivel del NO, el CS y la

retina. En el CS, estas alteraciones incluyeron una marcada respuesta micro- y oligodendroglial y una

moderada respuesta astrocitaria, que se acompañaron de una disminución del contenido lipídico. A

las 15 semanas de glaucoma crónico, estas alteraciones fueron más marcadas e incluyeron

alteraciones en los axones, sin afectar el número de neuronas coliculares. La minociclina previno

algunas de las alteraciones inducidas por la hipertensión ocular crónica, como el déficit en el

transporte anterógrado desde la retina al CS. En cuanto al SV-NFI, el glaucoma crónico indujo una

caída significativa en el número de CGRsm y los niveles de melanopsina, así como en el transporte

desde la retina a los NSQ y el NPO, con una disminución en el reflejo pupilar consensual. En suma,

los resultados obtenidos en esta Tesis aportan datos de relevancia respecto a la participación de las

áreas visuales post-retinianas en el daño glaucomatoso.

Palabras clave: células ganglionares, glaucoma, glía, hipertensión ocular, minociclina, sistema visual

consciente, sistema visual no formador de imagen, transporte axonal.

Study of superior visual pathways in experimental glaucoma

Glaucoma, one of the main causes of irreversible blindness, is characterized by a progressive loss of

visual functions, which is associated to retinal ganglion cell (RGCs) death and optic nerve (NO)

atrophy. The increase in intraocular pressure (IOP) is one of the main risk factors. Classically,

glaucoma has been conceived as a disease limited to the eye, but axons of RGCs have extraorbital

and intracranial components. In this Thesis work, the effects of acute and chronic experimental

glaucoma on the conscious visual system (C-VS) and the non-image forming visual system (NIF-VS)

were examined. The C-VS in rats includes classical RGCs and their axons that project to the superior

colliculus (SC) and the lateral geniculate nucleus (LGN). The NIF-VS is composed by intrinsically

photosensitive RGCs expressing melanopsin (mRGCs) that project to the suprachiasmatic nuclei

(SCN), pretectal olivary nucleus (OPN) and intergeniculate leaflet (IG), which drive circadian

rhythms and pupillary light reflex (PLR), among others. The acute glaucoma model was induced by

increasing IOP to 70 mm Hg for 90 min (acute ocular hypertension, AOH), whereas chronic

glaucoma was induced by intracameral injections of chondroitin sulfate (CSU), once a week, for 15

weeks. At seven days post-AOH, a significant impairment of retinal function and structure, with a

significant RGCs loss, and astro- and microglial changes were observed in the CS. At the same time,

a marked reduction in anterograde transport to the SC and LGN, but not to the SCN and the OPN,

was observed. At 4 weeks post-AOH, mRGCs cell number, melanopsin levels, and consensual PLR

remained unchanged. CSU administration for 6 weeks induced alterations in retinal and visual

pathway function, a decrease in anterograde transport to all of the RGCs projecting areas, and glial

changes at the level of the retina, ON, and SC. In the SC, these alterations included a marked micro-

and oligodendroglial response and a moderate astrocytic response, which were accompanied by a

decrease in lipid content. At 15 weeks of chronic glaucoma, these changes were more intense and

included axonal changes, without affecting collicular neuron number. Minocycline prevented some

of the alterations induced by chronic ocular hypertension, and the anterograde transport deficit to the

CS. As for the NIF-VS, chronic glaucoma induced a significant reduction of mRGCs number,

melanopsin levels, and anterograde transport to the SCN and OPN, as well as a decrease in

consensual PLR. In summary, the results obtained in this Thesis work provide relevant information

regarding the participation of post-retinal visual areas in glaucomatous damage.

Keywords: retinal ganglion cells, glaucoma, glia, ocular hypertension, minocycline, conscious visual

system, non-image forming visual system, axonal transport.

Agradecimientos

Describir lo que significó la realización de esta Tesis inevitablemente me traslada a lo vivido durante mi

primer Maratón. Entrenar para un maratón no solo requiere preparación física sino también mental.

Motivación, confianza, dedicación, responsabilidad, tolerancia a la frustración y al dolor, paciencia,

perseverancia, compañerismo y entrega, son cualidades que se cultivan en las pistas y se trasladan a la

vida, y en este caso también, al quehacer científico. El científico, y sobre todo el que aspira a serlo,

motivado por la curiosidad y un eventual descubrimiento a veces se ve frustrado por experimentos que no

dan, técnicas que no salen e incluso aparatos que no andan, reactivos que no llegan y otras cuestiones que

superan la realidad para la que uno ha sido entrenado durante sus épocas de estudiante. Luego, la

paciencia, las charlas con compañeros de labo más experimentados o con amigos y familiares que tocan el

tema de oído y mucha perseverancia, permiten volverse a embarcar en la búsqueda de alguna nueva pista.

Aprender a aceptar la incertidumbre y confiar en que en algún momento todo va a llegar a buen puerto

resulta imprescindible para no bajar los brazos y volverlo a intentar. Tal como le ocurre al maratonista,

los primeros kilómetros casi no se sienten, pasada la primera mitad afloran un mar de dudas e incontables

dolores y sin embargo, uno sigue. Sólo cuando ya falta poco se toma conciencia del esfuerzo invertido y

el camino transitado. Es entonces cuando la balanza se inclina y brotan energías desde lo más profundo,

para tirar hasta el 40 y disfrutar del sprint final, esos 2,195 km llenos de emociones indescriptibles junto

con la imagen de todas aquellas personas que hicieron posible tremenda locura. Les agradezco:

A Ruth, por confiar en mí para lanzarme a la aventura, por transmitirme su amor por la retina, por

acompañarme en los primeros pasos y en los últimos, por sacar la brújula en los momentos clave,

por su rigurosidad y sus críticas para hacer de éste un trabajo más sólido y de mí una persona más

fuerte.

A Laura Pasquini, por enseñarme el mundo de los oligodendrocitos, la infinidad de inmunos y

anticuerpos, las horas en el confocal, el IMARIS, las charlas y los papers.

A Dami, por su amistad, sus consejos y su guía, su entusiasmo, su generosidad inmensa y su

tiempo, muchas veces hasta largas horas de la noche.

A Moni, por ser madre y compañera al mismo tiempo. ¡Trabajo difícil ese, si los hay! Por ser mi

ejemplo desde que tengo 6, por guiarme hasta acá y ¿después?, por la búsqueda de papers, la

puesta a punto de técnicas y la bibliografía de la Tesis. A vos Ma, gracias infinitas.

A Ine, por la paciencia y ayuda con las compras de reactivos, trámites burocráticos, las meriendas

todas y los descuentos, Jaja!

A Dani, por las charlas y los mates, las recetas vegetarianas y por localizar algo en el labo cada

vez que necesitaba.

A Pablito, por las inyecciones de CSU, sus chistes malos, su entusiasmo y su carisma, su amistad.

Agradecimientos

A los peques, Flor, Marquitos y Magui, por rejuvenecer al labo, la buena onda, el inmenso

compañerismo, los mates, las horas de compu, los VEPs, las charlas de biología y de la vida.

Chiquis, los quiero!

A Maga, por ofrecerme su hogar durante el doctorado y sus consejos para los formularios de las

becas.

A Diego, Eze, Nuria, Nico, con quienes compartí los últimos años de la Licenciatura y los

primeros del Doctorado, por enseñarme mucho de lo que sé de la “mesada” y dejarme “meter

mano” en sus experimentos.

A Charly, por procesar todos mis “nervios”, las horas y charlas en el MET y por su buena onda.

A Mariana, por ayudarme con el Red Oil, su compañía en las interminables cuantificaciones de

los procesos de la glía, las charlas de la vida y su amistad.

A los “Lemmings”, por los reactivos y la yerba prestada/robada, el microscopio, los almuerzos

compartidos, los festejos conjuntos. En especial a Memi y, también en este último tiempo, a

Silvia, por sus charlas y su amistad.

A mis padres, por darme la vida y por hacer de mí hoy una mujer independiente. A Mamá, por

estar en los momentos más difíciles, darme su garra, su sensibilidad y su valor y por su inmenso

amor. A Papá, por decir sí a todas mis locuras, inculcarme el amor por la naturaleza y la aventura,

y por los no sé cuántos miles de km de ruta para verme cruzar la Cordillera de los Andes a pie!

A mis hermanos, Aye y Ale porque son únicos, por el amor/odio, porque los veo y me veo y los

amo.

A Javi, por entregarme su corazón, hacer mi vida más hermosa y el mundo un lugar más feliz, por

su infinito compañerismo y generosidad, por su ternura y espontaneidad, por su música y por su

gran ayuda en toda esta última etapa.

A mis primos Lore y Victor y sus pimpollos, Celes y Tizi, por su apoyo incondicional, su amor y

sus abrazos.

A Jorge y a Pablito, por las intensas charlas y consejos y por su incondicional apoyo y su cariño.

A mi abuela, por ofrecerme su casa para internarme a estudiar y por bancarse mis nervios antes de

los exámenes.

Agradecimientos

A Laura Colman, por estos 5 años que llevamos juntas, por enseñarme a superar dificultades y

miedos, por animarme a animarme y perseguir mis sueños y por confiar en mí antes que yo

misma.

A “las chichis del Nacional” (Ceci, Flor, Naty, Meli, Lu y Andy) y a mis “compañeritas de la

vida” (Romi, Taty, Nadia, Fer, Lau y Adri), por cultivar todos estos años de amistad repletos de

los más hermosos recuerdos.

A mis amigos de la Facu (Ale, Vero, Belu y Camilo), por las innumerables catarsis doctorales y

científicas. Ya casi estamos, chicos! =)

A Eric Rosenberg, por quererme como un hermano, por las interminables charlas a la salida de los

entrenamientos, por las marchas, su confianza y su apoyo. HLVS!

A Pablito y a Pau, por enseñarme la otra cara del deporte, a correr con una sonrisa y a respirar

para desechar lo negativo, por su tiempo, su entrega, su sensibilidad y su amistad sincera.

A los TROTAS, por su compañerismo y su generosidad desinteresada, por contagiarme su

entusiasmo y energía, por los domingos a las 6 AM, por los fondos y decenas de km, por los

nervios de las largadas y el llanto de llegada, por demostrarme que no existen imposibles, por los

PISTA, PISTA, PISTA que pasaron y que están por venir!

A la Facultad de Medicina de la UBA, en especial al CEFyBO, por el lugar de trabajo brindado

para la realización de esta Tesis.

Al Sistema Nacional de Microscopía por haberme permitido la utilización de los equipos de

microscopía confocal (Dpto. de Fisiología de la Fac. de Medicina de la UBA) y de microscopía

electrónica (Instituto de Biología Celular y Neurociencia “Prof. E. De Robertis”).

Al IQUIFIB del Dpto. de Química Biológica de la Fac. de Farmacia y Bioquímica de la UBA, por

las innumerables horas en el crióstato y en el microscopio de fluorescencia.

Al Estado Nacional que financió mi educación primaria, secundaria y hasta mi formación

universitaria y de post-grado.

A mis padres, Mónica y Sergio.

Al NROE, porque esta Tesis es el

reflejo de un trabajo en equipo.

A Javi, por acompañarme desde

el 28 y hacer los últimos km

más felices y divertidos.

“The difficulty lies, not in the new ideas, but in escaping from the old ones…”

John Maynard Keynes (1883-1946)

“…Mi abuelo era ciego. Año tras año se sentó en la misma habitación ante un brasero de carbón, en el mismo rincón vuelto hacia el Este. Cada tanto volvía la cabeza hacia el Sur, pero nunca al Norte. Una vez que me di cuenta de ese hábito suyo de volver la cara sólo en una dirección, me sentí tremendamente perturbado (…) Eso me provocaba malestar. Me parecía misterioso. Al sur había lugares soleados y me pregunté si, aun siendo ciego, podría percibir esa dirección como algo un poco más luminoso…”

Historias en la palma de la mano, Yasunari Kawabata, 1971.

“The pressures on scientists today oppose truly creative thinking.”

Craig Loehle, 1990.

Los resultados presentados en este trabajo de Tesis forman parte de las siguientes publicaciones

- Effect of retinal ischemia on the non-image forming visual system.

Ma. Florencia González Fleitas 1, Melina P. Bordone1, Ruth E. Rosenstein, Damián Dorfman.

Chronobiology International 2014; 19:1-12. (versión electrónica previa a publicación) 1: ambos autores prestaron igual contribución al trabajo citado.

- Experimental glaucoma in rats induces early glial alterations in the superior colliculus

Melina P. Bordone, Laura A. Pasquini, Pablo H. Sande, Marcos Aranda, Ezequiel Salido, Ruth

Rosenstein. (manuscrito en redacción)

- Involvement of microglia in the early disruption of the retinal anterograde transport

induced by experimental glaucoma

Melina P. Bordone, Damián Dorfman, Pablo H. Sande, Laura A. Pasquini, Ma. Florencia

González Fleitas, Ruth Rosenstein. (manuscrito en redacción)

Índice

ABREVIATURAS 1

INTRODUCCIÓN 6

1. El ojo 6

1.1. Características generales 6

1.2. Cámara anterior y cámara posterior 9

1.2.1. Producción y circulación del humor acuoso 11

1.2.2. La red trabecular o trabeculado 12

1.3. La retina 15

1.4. Vasculatura del ojo 19

2. El nervio óptico 21

3. Las vías visuales superiores 23

3.1. Características generales 23

3.2. Colículo superior 24

3.3. Núcleo geniculado lateral 26

3.4 Núcleos supraquiasmáticos 27

4. Las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles 28

5. La glía 30

5.1. Macroglía 30

5.1.1. Astrocitos 30

5.1.2. Células de Müller 31

5.2. Microglía 32

5.3. Oligodendrocitos 37

6. El glaucoma 40

6.1. Características generales 40

6.2. Modelos experimentales de glaucoma 41

Índice

6.3. La vía visual en el glaucoma 44

7. La minociclina 47

OBJETIVOS 49

MATERIALES Y MÉTODOS 50

1. Animales 50

1.1. Inducción de glaucoma agudo 50

1.2. Inducción de glaucoma crónico 51

1.2.1. Tratamiento con minociclina 52

2. Determinación de la presión intraocular 52

3. Función de la retina y la vía visual 53

3.1. Electrorretinografía escotópica 53

3.2 Potenciales oscilatorios 54

3.3 Potenciales visuales evocados (VEPs) 54

4. Evaluación del reflejo pupilar 55

5. Procesamiento histológico 56

5.1. Secciones semifinas 56

5.2. Obtención de cortes en parafina 57

5.3. Cortes por congelación 57

6. Microscopía electrónica 58

6.1. Análisis ultraestructural del nervio óptico 58

6.2. Análisis ultraestructural del colículo superior 58

7. Análisis de células TUNEL(+) 59

8. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I 59

8.1. Inmunofluorescencia 60

8.2. Inmunohistoquímica y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I 61

Índice

8.2.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano 61

9. Coloración de lípidos por Red Oil 62

10. Procesamiento de imágenes y cuantificación 62

10.1. Análisis de la retina 62

10.1.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina 62

10.1.2. Cuantificación de células ganglionares en retinas en montaje plano 63

10.1.3. Cuantificación de CGRs melanopsina(+) (CGRsm) 63

10.2. Análisis del nervio óptico 64

10.2.1. Determinación del número y área axonal 64

10.2.2. Distribución de frecuencias del número de líneas intraperiódicas 65

10.3. Determinación del área inmunorreactiva en la retina y el nervio óptico 65

10.4. Análisis del colículo superior 66

10.4.1. Cuantificación del área inmunomarcada por GFAP y VgluT-2 66

10.4.2. Cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 y el número de

células Iba-1(+)

66

10.4.3. Cuantificación de la marca de Red Oil, O1 y pNF-H 67

10.4.4. Análisis por microscopía confocal 67

10.4.4a. Cuantificación del número de células NeuN(+) 68

10.4.4b. Análisis de la complejidad celular por IMARIS 68

11. Transporte de la subunidad de la toxina colérica (CTB) 69

11.1. Inyección intravítrea de CTB 69

11.2. Análisis del transporte de CTB 70

12. Western blot 70

14. Análisis estadístico 71

Índice

RESULTADOS 72

1. Modelo experimental de glaucoma agudo 72

1.1. Sistema visual formador de imagen 72

1.2. Sistema visual no formador de imagen 78

2. Modelo experimental de glaucoma crónico 82

2.1. Sistema visual formador de imagen 82

2.1.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico 94

2.1.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial

del colículo superior

103

2.1.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano 123

2.1.4. Tratamiento con minociclina 126

2.2. Sistema visual no formador de imagen 134

DISCUSION 138

1. Modelo experimental de glaucoma agudo 138

2. Modelo experimental de glaucoma crónico 140

2.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico 147

2.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del

colículo superior

151

2.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano 164

2.4. Tratamiento con minociclina 166

3. Sistema visual no formador de imagen en el glaucoma agudo y crónico 169

4. Consecuencias conceptuales de los resultados obtenidos y perspectivas futuras 175

BIBLIOGRAFÍA 178

Abreviaturas

1

ABREVIATURAS

A: amácrina

ACPs: arterias ciliares posteriores

ACR: arteria central retiniana

AH: ácido hialurónico

Al: axolema

Ap: axoplasma

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

AS: astrocito

B: bastón

BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro

C: cono

CB: célula bipolar

CCG: capa de células ganglionares

CFN: capa de fibras nerviosas

CG: célula ganglionar

CGRs: células ganglionares retinianas

CGRsm: células ganglionares retinianas melanopsina(+)

CNE: capa nuclear externa

CNI: capa nuclear interna

CNP: actividad CNPasa, β’:γ’-nucleótido cíclico-3-fosfodiesterasa

CPE: capa plexiforme externa

Abreviaturas

2

CPI: capa plexiforme interna

CPO: célula precursora de oligodendrocitos

CS: Colículo Superior

CSS: Colículo Superior Superficial

CSU: condroitín sulfato

CTB: subunidad de la toxina colérica

CV1: corteza visual primaria

DS: dermatán sulfato

EE: error estándar

EP: epitelio pigmentario

ERG: electrorretinograma

FR: fotorreceptores

GABA: ácido -aminobutírico

GAGs: glicosaminoglicanos

GalC: galactocerebrósido

GFAP: proteína glial fibrilar ácida.

G-HT: tracto genículo-hipotalámico

GSA: aglutinina de Griffonia simplicifolia

H: célula horizontal

HOA: hipertensión ocular aguda

HS: heparán sulfato

Iba-1: molécula adaptadora de unión a calcio ionizado- 1

IG: Intergeniculado

Abreviaturas

3

IL: interleuquina

KS: keratán sulfato

Li: líneas intraperiódicas

LPS: lipopolisacárido bacteriano

M: célula de Müller

MAG: glicoproteína asociada a mielina

MBP: proteína básica de mielina

MEC: matriz extracelular

MET: microscopio electrónico de transmisión

Mi : microglía

MINO:minociclina

MLE: membrana limitante externa

MLI: membrana limitante interna

MOG: glicoproteína de mielina de oligodendrocitos

Nf: neurofilamento

NG2: proteoglicano condroitín sulfato- 4

NGL: Núcleo Geniculado Lateral

NGLd: NGL dorsal

NGLv: NGL ventral

NMDA: N-metil-D-aspartato

NO: nervio óptico

NOS: óxido nítrico sintasa

Np: neuropilo

Abreviaturas

4

NPO: Núcleo Pretectal Olivar

NSQ: Núcleos Supraquiasmáticos

O1: marcador de oligodendrocitos- 1

O4: marcador de oligodendrocitos-4

Ol: oligodendrocito

OM: oligodendrocito mielinizante

OMi: oligodendrocito mielinizante inmaduro

OMm: oligodendrocito mielinizante maduro

OX-42: integrina -M/-2, también conocido como CD11b.

PACAP: polipéptido hipofisario activador de la adenilato ciclasa

PDGFR-: receptor para el factor de crecimiento derivado de plaquetas

PI3K: fosfatidilinositol-3-quinasa

PIO: presión intraocular

PLP: proteína proteolipídica

pNF-H: cadena pesada del neurofilamento fosforilado

POs: potenciales oscilatorios

preMO: oligodendrocitos pre-mielinizantes

R-HT: tracto retino-hipotalámico

ROS: especies reactivas de oxígeno

SAI: Stratum album intermediale

SAP: Stratum album profundum

SE: segmentos externos

SGI: Stratum griseum intermediale

Abreviaturas

5

SGP: Stratum griseum profundum

SGS: Stratum griseum superficiale

SI: segmentos internos

SNC: Sistema Nervioso Central

SO: Stratum opticum

SZ: Stratum zonale

TO: tracto óptico

TUNEL: terminal transferase dUTP nick end labeling

VCR: vena central retiniana

VEPs: potenciales visuales evocados

VgluT-2: transportador vesicular de glutamato -2

VM: vaina de mielina

Introducción

6

INTRODUCCIÓN

1. El ojo

1.1. Características generales

El ojo es el órgano sensorial especializado en el procesamiento de la información visual.

Los principales componentes estructurales del ojo se representan en la Figura 1. La córnea y el

cristalino concentran la luz y enfocan la imagen sobre la retina, una estructura derivada del

diencéfalo, que constituye la primera estación de relevo del procesamiento de la información

fótica en mamíferos. Los diferentes elementos que componen la imagen (intensidad de luz, color,

forma y movimiento) son descifrados y codificados en la retina, a través de la transformación de

la radiación electromagnética en impulsos nerviosos. Esta información se transmite por fibras

nerviosas que se originan en la retina y constituyen el nervio óptico (NO). Por fuera de la región

intraorbital, el NO avanza hacia la base del cráneo donde atraviesa el canal óptico. En la cavidad

intracraneal, los NOs se entrecruzan parcialmente en humanos, pero casi completamente ( 98%)

en ratas (Lund y col., 1980), formando el quiasma óptico y continúan como tractos ópticos hacia

centros visuales cerebrales, donde se produce el procesamiento de la información sobre los

diferentes elementos que componen la imagen visual consciente. En las cortezas visuales, las

señales son interpretadas y configuran la percepción visual: una sensación subjetiva de la forma,

el color, la profundidad, el movimiento de los objetos y el espacio que nos rodea. En las últimas

décadas se ha demostrado la participación de la retina en procesos visuales no conscientes

(“sistema visual no formador de imagen”) que involucran la transmisión de información fótica a

otros centros del encéfalo, lo que permite la coordinación de tareas reflejas como la adaptación

del tamaño pupilar y la dirección de los ojos hacia blancos de interés, o respuestas más

complejas como la regulación del comportamiento asociado a los ritmos biológicos,

particularmente a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) del hipotálamo, (revisado por Schmidt y

col., 2011).

Introducción

7

La pared del globo ocular está constituida por tres capas, que de afuera hacia adentro son:

1. Túnica externa-fibrosa o esclero-corneal formada por la esclera, el limbo esclero-

corneal y la córnea.

2. Túnica media-vascular, úvea o tracto uveal formada por la coroides, tejido conectivo,

los músculos del cuerpo ciliar y los músculos del iris.

3. Túnica interna-nerviosa o retina formada por la retina, el epitelio pigmentario, el

epitelio del cuerpo ciliar y el epitelio del iris.

Figura 1. Representación esquemática de las principales estructuras oculares en el humano (Panel

izquierdo) y esquema simplificado en la rata (Panel derecho).

La túnica externa es una gruesa capa fibrosa que protege las estructuras internas del ojo, y

junto con la presión del humor acuoso, mantienen la forma y turgencia del globo ocular. Esta

túnica es opaca en la mayor parte del globo ocular, y se denomina esclera o esclerótica. Allí se

fijan los músculos extrínsecos del ojo que regulan su movimiento. En la salida del NO, la esclera

se reduce a una membrana fenestrada, la lámina cribosa. En contacto con la túnica media, la

esclera presenta una capa de tejido conectivo laxo, rico en melanocitos demoninada lamina fusca

sclerae. Hacia la porción anterior, la túnica externa se diferencia en la córnea, una estructura

transparente constituida por cinco capas, que en orden externo-interno son: epitelio corneal

Introducción

8

(donde se encuentra la inervación corneal), capa de Bowman, estroma, membrana de Descemet y

endotelio. La córnea, al igual que la esclera, está esencialmente constituida por colágeno,

glicosaminoglicanos (GAGs) y agua, pero se diferencia de ella en que posee un menor porcentaje

de hidratación y en la disposición ordenada de las fibras colágenas del estroma. Esta disposición

disminuye la dispersión de la luz y de este modo, la córnea además de tener un rol protector,

posibilita la entrada de luz al ojo con escasa distorsión. La zona de transición entre la córnea y la

esclera se denomina limbo esclero-corneal.

La túnica media vascular o úvea es responsable de la nutrición y el mantenimiento de la

retina y la esclera, y de la producción de humor acuoso que nutre la córnea y el cristalino, ambos

avasculares (revisado por Kanski, 2005). Posee tres regiones diferentes: la coroides, el cuerpo

ciliar y el iris. La coroides es la porción más vascularizada de la úvea y se encuentra entre la

esclera y la retina. En la coroides se distinguen tres capas: la capa vascular (externa), que limita

con la esclera, la capa coriocapilar (media) y la membrana de Bruch (interna), por la que se

adhiere a la capa pigmentaria de la retina. Esta última, es una capa refringente no homogénea,

constituida por la lámina basal del endotelio de los coriocapilares, una primera capa de fibras de

colágeno, una de fibras elásticas, una segunda capa de fibras de colágeno y la lámina basal del

epitelio pigmentario. El cuerpo ciliar es un engrosamiento que se extiende hacia el interior por

detrás de la unión esclero-corneal. Por último, el iris se ubica por encima de la superficie anterior

del cristalino, varía en su color de acuerdo al contenido de melanina y contiene a los músculos

dilatador (de disposición radial) y constrictor (de disposición circular). En el centro, el iris define

un espacio circular llamado pupila, que regula la entrada de luz al ojo.

La túnica interna-nerviosa o retina es la porción fotosensible del ojo y forma parte del

sistema nervioso central (SNC). Se extiende superficialmente sobre la coroides hasta la ora

serrata, en donde se une firmemente, y luego se extiende como una delgada prolongación

formando las porciones ciliar e irídea de la retina. En el extremo opuesto la retina se une

Introducción

9

firmemente en la papila óptica, donde se continúa con el NO.

A su vez, en el ojo se delimitan 3 compartimientos: 1) la cámara anterior, situada entre la

córnea y el iris; 2) la cámara posterior, ubicada entre el iris y el cristalino; 3) el espacio vítreo,

que se ubica detrás del cristalino, y está rodeado por la retina.

El cristalino es un cuerpo elástico que se encuentra suspendido por un ligamento circular.

En los humanos posee una forma biconvexa, mientras que en la rata tiene forma esférica (Figura

1). El ligamento circular junto con el músculo ciliar, modifican su curvatura y acomodan la

visión a diferentes distancias, lo que le permite funcionar como una lente. Así, tanto la córnea

como el cristalino son los medios refractivos del ojo que permiten que la luz incida en la retina.

El espacio entre la pared posterior del cristalino y la retina está formado por una matriz

extracelular (MEC) transparente y gelatinosa denominada humor vítreo o cuerpo vítreo. Esta

matriz es rica en agua (90%), ácido hialurónico, fibras colágenas tipo II, otras proteínas

glicosiladas o no y escasas células denominadas hialinocitos (revisado por Geneser, 2006)

1.2. Cámara anterior y cámara posterior

Una correcta función visual requiere una forma constante del globo ocular y un trayecto

transparente y sin alteraciones desde la superficie de la córnea hasta la retina. Una vez atravesada

la córnea, la luz pasa por las cámaras anterior y posterior (Figura 1). La cámara anterior es un

área delimitada por la superficie posterior de la córnea, por la superficie anterior del iris y por la

cara anterior y central del cristalino (Figura 2). La cámara anterior contiene el humor acuoso, un

líquido cristalino con una composición que varía desde su formación en los procesos ciliares

hasta su filtrado por el trabeculado, una red de fibras colágenas recubiertas por células

endoteliales y MEC ocupando los espacios entre las fibras (ver más adelante). El humor acuoso

contiene una baja concentración de proteínas (0,1 - 0,2% de la concentración de proteínas del

plasma) pero una mayor concentración de aminoácidos, así como niveles elevados de lactato

(Tokuda y col., 2007), bicarbonato (Gerometta y col., 2005) y ascorbato (Ringvold y col., 2000).

Introducción

10

La pequeña cantidad de proteínas plasmáticas del humor acuoso proviene de la difusión desde el

estroma del cuerpo ciliar a la raíz del iris, se acumula en el estroma del iris y se libera a

continuación en el humor acuoso (revisado por Freddo, 2013). La composición del humor acuoso

difiere del plasma por la presencia de una barrera mecánica epitelial/endotelial (barrera hemato-

humor acuoso) (Kolker y Hetherington, 1981; Sears, 1985), y por el transporte activo de varias

sustancias orgánicas e inorgánicas desde el epitelio ciliar (Macknight y col., 2000).

Figura 2. Representación de las cámaras anterior y posterior del ojo. Panel A: Esquema de la circulación

del humor acuoso (flecha roja) desde los procesos ciliares, donde se origina, fluye alrededor del cristalino

e ingresa a la cámara anterior al atravesar la pupila. Panel B: Se muestra una imagen histológica

representativa a nivel del ángulo irido-corneal (recuadro del Panel A) y las mismas estructuras de (A)

señaladas con números. Hematoxilina-eosina.

La cámara posterior es la región comprendida entre el iris y el cristalino, allí se

encuentran las crestas del cuerpo ciliar que producen el humor acuoso. A diferencia del humor

acuoso, el fluido presente en la cámara posterior es esencialmente plasma libre de proteínas,

debido al flujo continuo hacia adelante del humor acuoso, a las uniones estrechas del epitelio

posterior del iris (que impiden la difusión posterior de las proteínas del estroma del iris) y a la

válvula unidireccional que forma la pupila, que descansa sobre la cápsula anterior del cristalino

(revisado por Freddo, 2013).

Como ya se mencionó, no existe una perfusión vascular directa de la córnea y el

cristalino, sino que la circulación normal del humor acuoso, a través de las cámaras anterior y

A B

Introducción

11

posterior, es responsable de la nutrición y metabolismo de estas estructuras.

1.2.1. Producción y circulación del humor acuoso

El balance entre la producción y la reabsorción del humor acuoso mantiene la claridad

óptica y niveles adecuados de presión intraocular (PIO), que otorgan estabilidad mecánica y

ayudan a mantener la turgencia y la forma del ojo. La formación de humor acuoso depende de la

combinación entre una fuerza hidrostática y un gradiente de presión osmótica generado por el

epitelio ciliar. Este último provoca la difusión de agua a través de un gradiente de concentración,

debido a un transporte activo de electrolitos y moléculas pequeñas a través de dos capas de

epitelio (pigmentada y no pigmentada) (revisado por Geneser, 2006). El transporte activo se

produce en las células no pigmentadas y el gradiente generado se mantiene por medio de uniones

estrechas (zónulas ocluyentes) entre las células, que restringen el pasaje de sustancias y forman

la barrera hemato-humor acuoso (revisado por Freddo, 2013). La formación de humor acuoso

ocurre por tres mecanismos: 1) difusión, 2) ultrafiltración y 3) secreción activa. Éste último, es

en mayor medida responsable de la composición química y el volumen del humor acuoso

(Macknight y col., 2000).

Diversos mecanismos colinérgicos y adrenérgicos desempeñan un papel relevante en la

formación y drenaje de humor acuoso, tanto en la fisiología normal como en la terapia del

glaucoma. Alteraciones moderadas de la presión sanguínea sistémica y del flujo sanguíneo del

proceso ciliar no afectan significativamente la formación del humor acuoso.

La circulación del humor acuoso (Figura 2) está determinada por el gradiente de presión

entre las cámara posterior y anterior y por las diferencias de temperatura entre el iris (mayor

temperatura) y la córnea. El humor acuoso entra a la cámara posterior desde el proceso ciliar a

través de un gradiente hidrostático y osmótico. Luego, fluye alrededor del cristalino, y a través

de la pupila se dirige hacia la cámara anterior. Finalmente, abandona el ojo por flujo pasivo en el

ángulo de la cámara anterior por dos vías: 1) la vía trabecular, a través de la cual primero ingresa

Introducción

12

al trabeculado, pasa al lumen del canal de Schlemm (Figuras 2 y 3) y luego a las venas

epiesclerales, desde donde llega a la circulación venosa general, y 2) la vía uveo-escleral, a

través de la cual desde la raíz del iris alcanza la malla escleral, luego pasa por la cara anterior del

músculo ciliar y abandona el ojo a través de los vasos esclerales. En monos, la vía trabecular

drena entre el 40 - 65 % del total del flujo de humor acuoso, y el 35 - 60 % restante lo hace por la

vía uveo-escleral, cuya contribución en gatos y conejos es bastante menor (Bill, 1989), en tanto

que en ratones esta vía drena un porcentaje similar al de humanos (Aihara y col., 2003). El

porcentaje de flujo de humor acuoso por la vía trabecular en humanos oscila entre 75 - 95%,

según resultados obtenidos mediante estudios con isótopos, aunque los cálculos basados en

métodos no invasivos han sugerido un valor del 75% en ojos normales (Bill, 1989).

1.2.2. La red trabecular o trabeculado

Como ya se mencionó, la red trabecular, ubicada en el ángulo de unión del iris y la córnea

(ángulo irido-corneal), es en parte responsable del drenaje del humor acuoso (Figuras 2 y 3). Esta

estructura está constituida por una red entrelazada de finos haces de tejido conectivo con

espacios intermedios de hasta 70 micrómetros. Las trabéculas están formadas por un corazón de

colágeno y fibras elásticas, rodeadas por más fibras elásticas y una zona cortical que consiste en

colágeno parcialmente polimerizado y la membrana basal de las células endoteliales trabeculares

más externas. Los tipos celulares que ocupan este espacio incluyen el endotelio trabecular y

corneal, así como melanocitos y fibroblastos de la capa anterior del iris y del cuerpo ciliar.

El canal de Schlemm se localiza en la parte inferior del trabeculado (Figuras 2 y 3). Las

células endoteliales en esta capa están íntimamente asociadas entre sí y a la membrana basal

mediante complejos de unión (Tian y col., 2000). Estas células secretan el material de la

membrana basal, precursores de colágeno (prolina e hidroxiprolina), fibras elásticas y GAGs.

Introducción

13

A B

Figura 3. Representación de la estructura y localización del trabeculado. Panel A: Esquema de las capas

de la red trabecular. Panel B: Imágenes de microscopía electrónica de barrido (200x) del trabeculado a

nivel de la úvea en condiciones normales y patológicas (Sihota y col., 2012).

Los GAGs están constituidos por largas cadenas de azúcares no ramificadas, formadas

por la repetición sucesiva de unidades de disacáridos. Los principales tipos de GAGs son: el

ácido hialurónico (AH), el queratán sulfato (KS), el dermatán sulfato (DS), el heparán sulfato

(HS) y el condroitín sulfato (CSU). Todos los GAGs, con excepción del AH, poseen grupos

sulfato en varias posiciones y proporciones (Figura 4). Por ejemplo, las cadenas de CSU son por

lo general sulfatadas en el grupo hidroxilo 4 y/ó 6, las cadenas de DS en la posición 4- y 2-,

mientras que las cadenas de HS pueden estar sulfatadas en posición 2-, 6- y/ó 3-. A su vez, todos

los GAGs con excepción del AH, se unen covalentemente a un núcleo proteico formando un

proteoglicano a medida que pasan por el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi. Las

células endoteliales del trabeculado tienen actividad fagocítica y la capacidad de migrar a través

de los haces trabeculares (Buller, 1990). Por lo tanto, la función del endotelio no es sólo

mantener la integridad estructural de las trabéculas, sino también contribuye a mantener la

función de filtración del área, especialmente cuando concentraciones anormales de alguna

sustancia impiden la salida del humor acuoso.

Introducción

14

Figura 4. Estructura de los principales GAGs del trabeculado.

Como ya se mencionó, la principal vía de salida del humor acuoso es el trabeculado que

está ubicado en el ángulo irido-corneal. La apariencia clínica de esta estructura permite inferir la

facilidad de salida del humor acuoso. Los ángulos cerrados o estrechos y aquellos con depósitos

patológicos tendrán una disminución en el drenaje, con el consiguiente aumento de la PIO.

Evidencias anátomo-fisiológicas indican que el sitio primario de resistencia al flujo

acuoso reside en la red trabecular, la porción profunda de la red esclero-corneal y la membrana

basal yuxtacanalicular cercana al canal de Schlemm, como se muestra en la Figura 3 (Tamm y

col., 2004). Una intensa tinción histoquímica en varias capas del trabeculado humano indica la

presencia de cantidades sustanciales de AH y CSU en las vías de salida del humor acuoso y un

análisis cuantitativo demuestra que del total de GAGs trabeculares, un 20 - 25% corresponde a

AH, 40 - 60% a CSU y DS, 5 - 10% a KS y 15 - 20% a HS (revisado por Acott y Kelley, 2008).

Se ha demostrado que la hipertensión ocular en ratas inducida por la administración de

esclerosantes suaves se correlaciona con una deposición anormal de componentes de la MEC a

nivel de la cabeza del NO en forma análoga a lo observado en ojos glaucomatosos humanos y de

Introducción

15

primates no humanos (Morrison y col., 1990).

1.3. La retina

La retina es una lámina fina de tejido nervioso situada en el fondo del ojo, que constituye

una prolongación del SNC. Está constituida por varios tipos celulares: los fotorreceptores (conos

y bastones), las células horizontales (2 subtipos), las células bipolares (de bastones (ON, único

tipo) y de conos (ON u OFF subdivididas en 6 y 5 subtipos, respectivamente)), las células

amácrinas (entre 23 y 40 subtipos, según el método de clasificación utilizado, genético o

anatómico, respectivamente), las células ganglionares (entre 12 y 22 subtipos, basados en

propiedades anatómicas, moleculares y/o fisiológicas) y células gliales, astrocitos y células de

Müller (revisado por Seung y Sümbüll, 2014). Además, en la retina existen dos poblaciones

discretas de células derivadas del linaje mieloide: los macrófagos perivasculares, y la microglía

(Karlstetter y col., 2014).

En un corte transversal de la retina (Figura 5) se observan diez capas paralelas que desde

la más externa a la más interna son: 1) El epitelio pigmentario (EP), 2) Los segmentos externos

(SE) e internos (SI) de los fotorreceptores (FR), 3) La membrana limitante externa (MLE), 4) La

capa nuclear externa (CNE), que contiene los núcleos de los conos y los bastones, 5) La capa

plexiforme externa (CPE), donde hacen sinapsis los terminales axónicos de los FR con las

dendritas de las células horizontales y bipolares, 6) La capa nuclear interna (CNI), que contiene

los núcleos de las células horizontales, amácrinas y bipolares, 7) La capa plexiforme interna

(CPI), donde hacen sinapsis las células bipolares y amácrinas con las células ganglionares

retinianas (CGRs), 8) La capa de células ganglionares (CCG), que contiene CGRs y amácrinas

desplazadas, 9) La capa de fibras nerviosas (CFN) y, 10) La membrana limitante interna (MLI)

(revisado por Geneser, 2006).

Introducción

16

A B

Figura 5. Estructura de la retina. Panel A: Esquema representativo de las distintas capas celulares

retinianas. Las flechas indican la dirección de entrada de la luz. C, cono; B, bastón; CB, célula bipolar; H,

célula horizontal; A, amácrina; CG, célula ganglionar; M, célula de Müller; AS, astrocito (Modificado de

Krstić, 1997). Panel B: Sección transversal de la retina adulta del ratón en que se identificó un subtipo de

CB (verde), las CG, A y H (rojas) y los conos (azul-violeta). Modificado de Josh Morgan, portada de

Nature Neuroscience, (9):1, 2006.

Los FR se encuentran en la capa de la retina más cercana al fondo del globo ocular y más

alejada de la córnea y de la entrada de luz, excepto en un área denominada fóvea, donde la luz

incide directamente. En consecuencia, la posición de la retina se encuentra “invertida” respecto a

la entrada de la luz, ya que ésta debe atravesar todas las capas retinianas antes de alcanzar los

fotorreceptores que se encuentran en contacto estrecho con el EP. Las células del EP poseen

gránulos de melanina, un pigmento negro que evita que la luz se refleje en la parte posterior del

ojo y vuelva a la retina, lo que podría provocar distorsión de la imagen visual (Hubel, 1988).

En la retina de mamíferos existen dos tipos de FR: los conos y los bastones. Sus

segmentos externos son la porción sensible a la luz y contienen el pigmento visual (conopsinas o

rodopsina, respectivamente), así como los demás componentes de la cascada de fototransducción

en la que participan diversos mensajeros, enzimas y canales iónicos. Las células del EP

Introducción

17

participan de la remoción y reemplazo de la porción más distal del SE de los FR a través de un

proceso de fagocitosis. Los SE de los conos están constituidos por pliegues apilados de

membrana plasmática invaginada y los de los bastones están formados por discos membranosos,

estructuras saculares donde las paredes de doble membrana quedan separadas por el espacio

intradiscal. En ambos tipos de FR, los SE se unen a los SI a través de un tallo estrecho o cilio. El

cuerpo celular de los FR ubicado en la CNE, contiene al núcleo y demás organelas subcelulares.

Los FR poseen un cinturón de zónulas adherentes que divide a la célula en un dominio

apical y uno basal. El aspecto de este cinturón al microscopio óptico llevó a denominar a esta

región membrana limitante externa (Rodieck, 1973). Participan también los procesos apicales de

las células de Müller, que rodean y dan soporte a los elementos nerviosos. Estas células poseen

un cuerpo celular delgado, que se extiende desde la MLE hasta la zona más interna de la retina,

donde su lámina basal constituye la MLI.

Desde un punto de vista funcional, los conos son responsables de la visión diurna y la

percepción del color. La respuesta de los conos tiene mayor resolución espacial y temporal que la

de los bastones. Los bastones son responsables de la visión nocturna, expresan mayores niveles

de fotopigmento, responden más lentamente a la señal luminosa y sus conexiones con las células

bipolares son más convergentes, lo que amplifica la señal, confiriéndole sensibilidad frente a

luces demasiado tenues como para excitar a los conos. En la mayoría de las especies de

mamíferos, los bastones son aproximadamente 20 veces más numerosos que los conos, aunque la

cantidad relativa de ambos tipos celulares varía marcadamente sobre la superficie de la retina

(LaVail, 1976; Masland, 2001a). Por ejemplo, en la fóvea, ubicada cerca del NO en el centro de

la retina humana y de primates, la agudeza visual es máxima y sólo se observan conos. En la

rata, un animal de hábitos nocturnos, los conos constituyen sólo entre el 1 - 2% del total de FR y

no hay una fóvea similar a la de humanos.

En la CPE, los FR hacen sinapsis con células bipolares y horizontales. Las células

Introducción

18

bipolares reciben input directo de los FR (distintos tipos de células bipolares pueden conectarse

exclusivamente a conos o a bastones) y hacen sinapsis con las CGRs en la CPI y las células

horizontales conectan los FR con las bipolares. La CNI está constituida por los somas de células

horizontales, bipolares y amácrinas. Estas últimas presentan numerosas dendritas pero carecen de

axón. La CPI es una zona de contactos sinápticos, en la que las células amácrinas se conectan

entre sí, con las terminales axónicas de las células bipolares y con dendritas de las CGRs. La

capa de CGRs está constituida por los somas celulares (>17 μm o ganglionares gigantes

ocasionales, > 14 μm o ganglionares grandes y de 5 a 11 μm o ganglionares pequeñas), mientras

que los axones convergen radialmente hacia el disco óptico, por donde las fibras abandonan el

globo ocular (Figura 1) y proyectan al cerebro medio a través del tracto óptico, excepto un

número comparativamente menor de fibras que proyectan a los NSQ, a través del haz retino-

hipotalámico.

En base a las conexiones anatómicas y funcionales entre los distintos tipos celulares

retinianos, se considera que la información fluye a través de la retina siguiendo dos vías: un

camino directo (desde los FR a las células bipolares y de éstas a las CGRs) y uno indirecto (en el

que entre los FR y las células bipolares se interponen las células horizontales y entre las

bipolares y las CGRs, se interponen las amácrinas). La vía directa de transmisión de información

es altamente específica; la vía indirecta, en cambio, es más difusa. Este plan general de

conexiones retinianas, fundamentalmente a nivel de las vías directas, varía dramáticamente entre

la fóvea y las zonas periféricas. Como se mencionó anteriormente, en la fóvea y zonas

adyacentes un fotorreceptor (cono) se conecta con una única célula bipolar y ésta a su vez con

una única ganglionar. Esta relación entre FR, células bipolares y CGRs, es cada vez más

convergente hacia la periferia. La ventaja de este sistema es la alta densidad de muestreo que

permite una gran resolución espacial (Masland 2001b, revisado por Kandel, 2000).

El principal neurotransmisor excitatorio de la retina es el glutamato, que participa en la

Introducción

19

transmisión de la información visual de la vía directa. El glutamato se libera desde los FR a

células bipolares y horizontales y desde las células bipolares a CGRs y amácrinas. En oscuridad,

el glutamato se libera a la brecha sináptica desde los FR, mientras que la exposición a luz inhibe

su liberación. El glutamato induce despolarización de las células bipolares OFF e

hiperpolarización de las bipolares ON. Estas células a su vez, liberan glutamato en las sinapsis

con las CGRs. Un conjunto variado de señales liberadas por células horizontales y amácrinas,

que incluyen al ácido -aminobutírico (GABA), glicina y dopamina, modulan la transmisión de

la información fótica. En concentraciones suprafisiológicas el glutamato tiene efectos

neurotóxicos sobre las CGRs. Por lo tanto, resulta esencial que las células gliales que rodean las

sinapsis glutamatérgicas, principalmente astrocitos y células de Müller, permitan un clearance

apropiado del neurotransmisor. La excitotoxicidad glutamatérgica ha sido involucrada en

diversas enfermedades oculares como el glaucoma, la retinopatía diabética y el daño isquémico

retiniano (revisado por Kalloniatis y Tomisich, 1999).

1.4. Vasculatura del ojo

La arquitectura vascular del ojo de los mamíferos difiere entre especies, pero tiene una

organización general común, que se esquematiza en la Figura 6 (Funk, 1993; Morrison y col.,

1987). La sangre llega al ojo a través de la arteria oftálmica por encima de la vaina de tejido

conectivo que rodea al NO, hasta penetrar la cabeza del nervio, donde se ramifica en la arteria

central de la retina (ACR) y en las arterias ciliares, a cada lado del NO (Figuras 6 y 7). Estas

últimas, se dividen en dos arterias ciliares posteriores (ACPs) largas y en numerosas ACPs cortas

(Henkind y col., 1979). Las ACPs cortas irrigan la coroides directamente, mientras que las ACPs

largas avanzan por la coroides hacia la parte anterior del ojo, pasan a arteriolas, arteriolas

precapilares cortas y capilares (coriocapilares) que se anastomosan y forman un plexo que se une

a los vasos del cuerpo ciliar en la ora serrata. Junto con el cuerpo ciliar, el iris es irrigado por el

anillo arterial irido-ciliar, que se origina de la arteria ciliar anterior, que es a su vez, una

Introducción

20

ramificación de las ACPs, y surge a la altura del ecuador del globo ocular.

Figura 6. Esquema de la disposición de los principales vasos sanguíneos que irrigan el ojo humano.

Arterias ciliares posteriores (ACPs) largas, ACPs cortas que dan origen a los coriocapilares, Arteria

central de la retina (ACR), vena central de la retina (VCR), venas vorticosas, y arterias y venas del iris.

La circulación sanguínea retiniana constituye el porcentaje remanente (15 - 35%) de la

irrigación del ojo (Henkind y col., 1979) e incluye arterias, arteriolas y capilares, que transportan

sangre rica en nutrientes y oxígeno, y por venas y vénulas, que remueven productos de desecho

que se liberan hacia la MEC.

La ACR se divide en arterias radiales que nutren toda la retina hasta la base del cuerpo

ciliar. La fina red vascular está formada por arteriolas delgadas que nacen de las arterias mayores

y luego siguen como arteriolas precapilares que regulan el flujo sanguíneo. La retina presenta

una doble capa vascular formada por capilares finos entre la CFN y la CCG, y otra capa

localizada entre la CNI y la CPE, que drenan en vénulas postcapilares, que constituyen la red

venular. Los FR y el EP no presentan contacto directo con capilares o vénulas, sino que reciben

nutrientes por difusión desde los coriocapilares. Finalmente, las vénulas de la retina se continúan

en venas largas que desembocan en la vena central de la retina (VCR), cerca del disco óptico.

Las uniones estrechas (zónulas ocluyentes) entre las células endoteliales de los vasos sanguíneos

de la retina, entre las células del EP (barrera hemato-retiniana externa) y las uniones entre las

Introducción

21

células de Müller y los FR de la MLI conforman la barrera hemato-retiniana interna.

En la rata, la sangre venosa del iris y de la mayor parte de la coroides y el cuerpo ciliar

drena en vénulas vorticosas. Las vénulas confluyen cerca del ecuador del ojo en cuatro venas

vorticosas (Figura 6), según cuatro cuadrantes (dorsal, ventral, nasal y temporal), que finalmente

llegan a la esclera, donde confluyen en las venas epiesclerales, ubicadas entre la conjuntiva y la

esclera. Por otro lado, los capilares de la mitad posterior de la coroides drenan en un seno venoso

que se continúa en las venas ciliares, y una pequeña parte de la sangre que irriga la mitad anterior

del cuerpo ciliar, drena a través de la vena ciliar anterior que desemboca en la vena oftálmica

superior.

2. El nervio óptico

El nervio óptico (NO), una evaginación del prosencéfalo (la vesícula óptica), no es un

nervio periférico como los demás nervios craneales, sino un fascículo del SNC. Está formado por

los axones de las CGRs, estructurados en fibras nerviosas por la glía residente. Sobre la

superficie de cada haz, la glía forma una delgada membrana entre los elementos nerviosos y el

tejido conectivo. Las meninges y los espacios inter-meníngeos del encéfalo se continúan sobre el

NO, como se muestra en la Figura 7. La vaina externa del NO está constituida por la duramadre,

que se prolonga hasta el ojo, uniéndose a la esclera. La piamadre forma una capa de tejido

conectivo, íntimamente adherida a la superficie del NO, y se une a la esclera a la altura de la

entrada del NO. Esta vaina pial envía tabiques de tejido conectivo y vasos sanguíneos dentro del

NO.

Introducción

22

Figura 7. Estructura del NO proximal y su irrigación. Panel A: Esquema de los principales vasos

sanguíneos que irrigan el NO a la altura de la cabeza del nervio. Panel B: Corte semifino longitudinal del

NO a la misma altura que en A (azul de metileno y Azur II), con las principales estructuras señaladas con

números (Extraído y modificado de Dai y col., 2012).

En primates, las fibras amielínicas de las CGRs se unen en el disco óptico y abandonan el

globo ocular a través de una apertura en la esclera, denominada lámina cribosa, constituida por

una red de fibras de colágeno. Diversos estudios demuestran la ausencia de una lámina cribosa

clásica en ratones y ratas, especies en las que se describió una estructura denominada lámina

glial, constituida por una red compleja de procesos gliales orientados transversalmente a los

axones, en ausencia de fibras colágenas (Howell y col., 2007; Sun y col., 2009). Los procesos

primarios de los astrocitos organizan los axones en fascículos. En la región próxima a la retina,

estos procesos son mayores y se vuelven más delgados y menos numerosos hacia la zona

mielinizada, más distal de la retina. Existen además procesos secundarios, que subdividen los

fascículos en unidades menores. Los astrocitos, a través de esta red compleja de procesos,

permiten comunicar y regular la función de numerosos axones y, a su vez, la de otros astrocitos

(Sun y col., 2009). En ratas, la lámina glial se extiende aproximadamente entre 80 - 85 μm (en el

eje longitudinal) desde el disco óptico hasta la zona de transición, donde comienza la

mielinización de las fibras (Figura 8). En roedores, se ha descripto que en la porción próxima al

quiasma óptico, se pierde la organización retinotópica de los axones (Baker, 1990) y se ha

sugerido que esto podría deberse al cambio en la organización glial (Guillery y Walsh, 1987).

Introducción

23

Figura 8. Representación de las diferentes regiones del NO proximal. Panel A: Esquema en el que se

indican la CFN, la porción pre-laminar, la lámina glial, la zona de transición y la región mielinizada.

Panel B: Microfotografía del NO proximal de ratón indicando la localización de astrocitos de la lámina

(amarillo), los oligodendrocitos mielinizantes (verde), los axones (amielínicos) de las CGRs (rojo) y los

núcleos de la retina (cyan) (Modificado de Mark Ellisman, NCMIR, San Diego, EE.UU

http://ucsdnews.ucsd.edu/pressrelease/getting_rid_of_old_mitochondria). Panel C: Comparación de la

disposición de los astrocitos (verde) y los axones de las CGRs (rojo) a la altura de la lámina glial y la

región mielinizada del NO de rata (Extraído de Dai y col., 2012).

La mayoría de los axones del NO tienen 0,2 - 0,7 m de diámetro, tanto en primates

como en roedores (a pesar de las diferencias en el largo total del NO entre estas especies),

mientras que los axones más grandes y menos frecuentes tienen entre 1,5 - 2,0 m de diámetro

(Perge y col., 2009). El relativamente pequeño tamaño de la mayoría de los axones de las CGRs

parece estar optimizado en función de la velocidad de transmisión de la información y el

consumo energético (Niven y Laughlin, 2008; Perge y col., 2009, 2012; Wang SS y col., 2008).

3. Las vías visuales superiores

3.1. Características generales

Los axones de todas las CGRs salen del ojo a través del disco óptico y forman el NO. Los

NOs de ambos ojos confluyen en el quiasma óptico. Dependiendo de la especie, una sub-

población de axones de número variable, se cruzan al lado opuesto del encéfalo, mientras otros

A B

C

Introducción

24

axones continúan su proyección en forma ipsilateral. De esta forma, los axones provenientes de

ambos ojos forman los tractos ópticos izquierdo y derecho que proyectan a los núcleos

subcorticales que participan en el procesamiento visual formador de imagen y no formador de

imagen. En la rata, la proyección es esencialmente cruzada.

El sistema de transporte axonal (o flujo axoplasmático) juega un rol clave en la

comunicación entre las CGRs y los núcleos centrales. El transporte anterógrado, mediado por la

proteína quinesina, participa en el transporte de proteínas sintetizadas en el cuerpo neuronal que

están asociadas a la estructura axonal y la transmisión sináptica. El transporte retrógrado,

mediado por dineína, participa en el transporte de factores que afectan el estado metabólico de

las CGRs. Los microtúbulos son los elementos motores que participan en el transporte, y el ATP

y el calcio son esenciales para este proceso.

Entre los núcleos de proyección retiniana se encuentran el colículo superior (CS), el

núcleo geniculado lateral (NGL) y los núcleos pretectales como el núcleo pretectal olivar (NPO),

los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) y los núcleos del sistema ocular accesorio, entre otros.

3.2. Colículo superior

El colículo superior (CS) es un centro integrador del cerebro medio que recibe

información visual directamente desde la retina, y controla el movimiento reflejo de la cabeza y

el movimiento de los ojos. Es una estructura organizada en capas, según la distribución de fibras

y el tamaño y arreglo neuronal. Las capas superficiales están relacionadas con la recepción de

información sensorial, las profundas están relacionadas con la ejecución motora y las intermedias

contienen células multisensoriales integradoras (revisado por May, 2006). La capa superior es

delgada, está compuesta por fibras nerviosas, y se denomina Stratum zonale (SZ). Por debajo de

ella se encuentra una capa de neuronas y neuropilo, el Stratum griseum superficiale (SGS), y

luego sigue el Stratum opticum (SO) que contiene predominantemente fibras. Estas tres capas

constituyen la porción superficial del CS que participa del procesamiento de la información

Introducción

25

visual aferente. Estas neuronas responden principalmente a puntos pequeños dentro de su campo

visual o a puntos en movimiento. Dependiendo de la especie, reciben inputs de la retina

contralateral e ipsilateral, y de áreas visuales de la corteza ipsilateral. El CS profundo contiene

neuronas motoras de proyección. Próximo al SO se encuentra una capa delgada con una variedad

amplia de neuronas multipolares que procesan información multisensorial, denominada Stratum

griseum intermediale (SGI). La capa siguiente se denomina Stratum album intermediale (SAI) y

contiene numerosas fibras. Por debajo del SAI, se encuentra una capa celular denominada

Stratum griseum profundum (SGP). Finalmente, la capa más profunda está formada por fibras

adyacentes a la sustancia gris periacueductal y se denomina Stratum album profundum (SAP)

(Figura 9), que recibe información de las capas superficiales del CS, de los sistemas somato-

sensoriales y auditivos, de áreas corticales no visuales y del colículo contralateral.

Los axones de las CGRs ingresan al CS por el SO (y en menor medida por el SZ, que

contiene axones de neuronas intrínsecas) y avanzan hasta las capas más superficiales. El

principal sitio de conexión es el SGS superior. En animales con escasa binocularidad (como los

roedores), la gran mayoría de las terminales retinianas proyectan al CS contralateral. Se estima

que en la rata, aproximadamente el 98% de las CGRs proyectan al CS contralateral (Lund y col.,

1980). Las fibras de proyección ipsilateral de las CGRs llegan a la porción rostro-medial del CS

(Isenmann y col., 1999; Lund, 1965; Rao y Lund, 1989; Rodger y col., 2005). Algunas fibras de

la retina temporal proyectan al SO y al SGS inferior. Su principal proyección es hacia el tallo

encefálico, particularmente a los núcleos involucrados en la coordinación de movimientos de los

ojos y cabeza, y proyecciones ascendentes a regiones talámicas. Otro núcleo de conexión con el

CS es el NGL. Neuronas de la capa SGS proyectan a la porción dorsal y ventral del NGL (Figura

9D).

Introducción

26

Figura 9. Representación esquemática de la estructura del CS. Panel A: Esquema en vista sagital del

cerebro de rata. La línea punteada indica la zona medial del CS en corte coronal que se muestra en el

Panel B. Panel B: Corte coronal en la zona medial del CS (en gris). Panel C: Se muestra un detalle de las

capas del CS. Panel D: Patrón de inervación de las capas superiores del CS. Las capas superiores del CS

reciben inervación de las CGRs, fibras del NGL y también terminales de neuronas corticales (neuronas

piramidales de la capa V). SZ, Stratum zonale; SGS, Stratum griseum superficiale; SO, Stratum opticum;

SGI, Stratum griseum intermediale; SAI, Stratum album intermediale; SGP, Stratum griseum profundum;

SAP, Stratum album profundum. Modificado de Paxinos y Watson, 1997 y de May, 2006.

Estudios en ratones han demostrado que las proyecciones retinianas tienen una

representación topográfica ordenada de inervación en las capas superficiales del CS: el eje nasal-

temporal y el eje dorsal-ventral de la retina tienen proyección anterior-posterior y medial-lateral

en el CS, respectivamente (Dräger y Hubel, 1975; Siminoff y col., 1966).

3.3. Núcleo geniculado lateral

En primates, el NGL está constituido por seis capas de neuronas; las dos capas ventrales

contienen neuronas grandes (magnocelulares (M)), mientras que las cuatro capas dorsales

contienen neuronas más pequeñas (parvocelulares, (P)). La vía M está involucrada en el

Introducción

27

procesado de la información del movimiento y la forma del estímulo, mientras que la vía P

participa en el análisis de la visión de detalles y de color. La organización funcional del NGL

involucra circuitos retinianos y no retinianos, lo que sugiere que esta estructura participa en

procesos modulatorios que alteran la señal visual proyectada la corteza (Kandel y col., 2000). Se

ha demostrado que las aferencias retinianas a las células tálamo-corticales del gato representa

sólo un 10% del total de sinapsis, en tanto que las sinapsis restantes corresponden a

interneuronas GABAérgicas, proyecciones del núcleo talámico ventricular y el pretectum,

neuronas glutamatérgicas de la corteza visual, señales histaminérgicas del hipotálamo,

noradrenérgicas, colinérgicas y serotoninérigas del mesencéfalo y la protuberancia y fibras e

interneuronas que expresan la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) (Carden y col., 2000; Sherman

y Guillery, 1996;). En ratas, el NGL está constituido por un núcleo dorsal (dNGL) y uno ventral

(vNGL) que son rudimentarios en humanos (Bron y col., 1997). A diferencia de los primates, no

existe una laminación aparente en el NGL de roedores (Reese, 1988).

3.4. Núcleos supraquiasmáticos

Los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) constituyen el componente principal del reloj

biológico endógeno en mamíferos. Están formados por dos grupos de neuronas que se

encuentran localizadas en la base del tercer ventrículo, sobre el quiasma óptico, en la parte

anterior del hipotálamo (Figura 12). Los NSQ están compuestos por una población heterogénea

de células, incluyendo múltiples clases de neuronas peptidérgicas y astrocitos (Abrahamson y

Moore, 2001). En roedores, estos núcleos están compuestos por alrededor de 20.000 neuronas y

8.000 astrocitos, compactados en un volumen de aproximadamente 1 mm3 (Güldner, 1983; Klein

y col., 1991). Aun en condiciones aisladas, los NSQ mantienen su actividad de marcapasos

(Colwell, 2000; Newman y Hospod, 1986). La lesión o ablación de los NSQ provoca la

desaparición de los ritmos circadianos de secreción hormonal, actividad locomotora y bebida,

entre otros. De hecho, transplantes de tejido hipotalámico conteniendo NSQ a animales con sus

Introducción

28

NSQ lesionados, restauran los ritmos circadianos de estos últimos, induciendo la ritmicidad del

donante en el receptor (Ralph y Lehman, 1991).

Los NSQ se comunican con el resto del organismo a través de proyecciones nerviosas y

secreciones humorales, tanto para las vías de entrada como para las de salida. Las principales

aferencias provienen de la retina. La información desde la retina sigue dos vías, una directa a

través del tracto retino-hipotalámico (R-HT) y una vía colateral que pasa por el intergeniculado

(IG), una estructura laminar pequeña intercalada entre la porción dorsal y ventral del NGL, y

luego inerva la zona ventro-lateral de los NSQ, denominado tracto genículo-hipotalámico (G-

HT). Además, existen aferencias desde el rafe, tanto del núcleo dorsal como del medial y del

núcleo paraventricular del tálamo (Krout y col., 2002; Moga y Moore, 1997). En realidad,

muchos de los núcleos hipotalámicos inervados por los NSQ establecen circuitos bidireccionales,

inervando ellos mismos a los NSQ en forma recíproca (Krout y col., 2002). De todas las vías

aferentes, la mejor caracterizada es la del R-HT. Esta vía se origina en CGRs que contienen

opsinas y capacidad fotorreceptora intrínseca (Beaulé y col., 2003; Berson y col., 2002; Hattar y

col., 2002; Morin y col., 2003; Provencio y col., 2002), como se detalla a continuación.

4. Las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles

En las últimas décadas, se describió un subtipo particular de CGRs que expresan el

fotopigmento melanopsina (CGRsm) y son intrísecamente fotosensibles es decir, son capaces de

responder a la luz independientemente del input de los conos y los bastones (Berson y col.,

2002). La melanopsina es una opsina/fotopigmento basado en vitamina A, cuyo máximo de

absorción se encuentra entre los 420 y 440 nm en humanos (Melyan y col., 2005) y los 480 nm

en el ratón (Panda y col, 2005; Qiu y col., 2005), que corresponde a la luz azul en el espectro

visible, y no coincide con el de los FR retinianos clásicos (Brainard y col., 2001; Thapan y col.,

2001; Yoshimura y Ebihara, 1996). Varias líneas de evidencia señalan que las CGRsm son

capaces de transducir funciones visuales no formadoras de imagen, incluyendo la sincronización

Introducción

29

del reloj circadiano, el reflejo pupilar, la regulación del período circadiano en respuesta a luz

constante, la fotoinhibición aguda de la actividad nocturna y la supresión fótica de la liberación

nocturna de melatonina pineal (Berson y col., 2002; Hattar y col., 2002; Lucas y col., 2001;

Provencio y col., 2002). En los últimos años, la descripción de las CGRsm ha dado a la

fototransducción visual no formadora de imagen una base anatómica y permitió explicar por qué

algunas funciones visuales persisten incluso en ratones que carecen de conos y bastones y en

algunas personas ciegas (Hannibal y col., 2004; Wee y Van Gelder, 2004). Los déficits en estas

funciones son sutiles o no evidentes en ratones nulos para melanopsina (Lucas y col., 2003;

Mrosovsky y Hattar, 2003; Panda y col., 2002; Ruby y col., 2002), lo que ha sugerido que los FR

clásicos complementan las funciones de la melanopsina en la regulación de las respuestas no

visuales. Sólo después de que estos ratones se cruzan con otros que carecen de bastones y conos

funcionales se observan fenotipos extremos (Hattar y col., 2003; Panda y col., 2003). Las

CGRsm proyectan principalmente a los NSQ, al NPO y al IG (Gooley y col., 2003; Hattar y col.,

2006). Las CGRsm que proyectan a los NSQ regulan la actividad del reloj circadiano (Berson y

col., 2002; Gooley y col., 2001), mientras que aquellas que proyectan a los NPO son

responsables del reflejo pupilar (revisado por Berson, 2003). El IG recibe aferencias retinianas

casi íntegramente de las CGRsm (Gooley y col., 2003; Hattar y col., 2006) y sus funciones aún

no son del todo claras (revisado por Morin, 2003). Se ha demostrado que las CGRsm también

proyectan, en menor medida, a la zona ventral y subparaventricular del núcleo ventro-lateral

preóptico, regiones del cerebro involucradas en la regulación del sueño y del ritmo circadiano de

actividad locomotora (Gooley y col., 2003; Morin y col., 2003).

Por otra parte, las CGRsm que representan una red heterogénea con amplios campos

receptivos, han sido también involucradas en la regulación del sistema visual formador de

imagen, por ejemplo a través de la regulación de la vía visual de los conos humanos en respuesta

a la exposición a luz por largo plazo (Hankins y Lucas, 2002). Belenky y colaboradores (2003)

Introducción

30

han demostrado que las dendritas de las CGRsm reciben información de células amácrinas y

bipolares, lo que provee a esta última hipótesis una base anatómica, aunque la posibilidad de que

la melanopsina desempeñe un rol en las funciones visuales formadoras de imagen es aún

controversial.

5. La glía

5.1. Macroglía

Las células macrogliales incluyen a los astrocitos presentes en la porción más interna de

la retina, en el NO y en los núcleos visuales mencionados más arriba, y a las células de Müller,

(exclusivas de la retina).

5.1.1. Astrocitos.

Los astrocitos son células grandes, no excitables, con forma estrellada, y se caracterizan

por la presencia de gran cantidad de gránulos de glucógeno en el citoplasma y de haces de

filamentos intermedios, donde se localiza la proteína glial fibrilar ácida (GFAP), específica de

este tipo celular. De acuerdo a diferencias en morfología y localización anatómica, los astrocitos

se clasifican en astrocitos protoplasmáticos (tipo I) y fibrosos (tipo II). Los astrocitos tipo I se

encuentran principalmente en la sustancia gris del SNC y poseen gran número de prolongaciones

ramificadas que suelen extenderse hasta las paredes de los vasos sanguíneos en forma de

pedicelos. De esta forma, participan en la regulación de las uniones estrechas de las células

endoteliales de los capilares y vénulas. Los astrocitos más superficiales emiten prolongaciones

con pedicelos hasta contactar con la piamadre, lo que origina la membrana pial-glial. Los

astrocitos tipo II se encuentran a lo largo de la sustancia blanca y poseen pocas y muy largas

prolongaciones que contactan la membrana axonal en los nodos de Ranvier de axones mielínicos

y suelen encapsular a las sinapsis químicas.

En la retina, los astrocitos se localizan en las regiones de las capas vascularizadas de la

Introducción

31

retina de mamíferos (Schnitzer, 1987, 1988; Stone y Dreher, 1987), y están ausentes en la retina

de aves, que es avascular (Meyer 1977; Reichenbach y col., 1993).

Además de la red compleja de procesos celulares que pone en contacto diversos

astrocitos, existen uniones nexo (gap junctions) entre astrocitos que permiten “concebir” a la red

de astrocitos como una unidad o sincicio funcional (Malone y col., 2007) mediante el cual

pueden comunicarse a través de ondas de aumento en los niveles intracelulares de calcio, y a su

vez, estas ondas pueden disparar la liberación de moléculas neuroactivas (gliotransmisores),

como glutamato y ATP, que modulan la actividad sináptica. De esta manera, una red compleja de

procesos celulares permite a la astroglía un contacto directo con las neuronas y los vasos

sanguíneos, lo que posibilita la modulación del microambiente. Sus funciones son múltiples: el

sostén estructural, la conformación de la barrera hemato-encefálica, la regulación del flujo

sanguíneo, la modulación de la función sináptica, la participación en procesos de plasticidad, la

captación de neurotransmisores, la homeostasis de fluidos, el control de pH y de la concentración

de potasio, el almacenamiento de glucógeno y la participación en procesos de reparación y

cicatrización, entre otros (revisado por Yi y col., 2011). Frente a una alteración en la homeostasis

neuronal, ocurre un amplio espectro de cambios funcionales y estructurales que inducen un

estado macroglial activado. Estos cambios pueden abarcar desde un aumento en la expresión de

GFAP en los procesos celulares, hasta la hipertrofia y proliferación astrocitaria y en casos más

severos, la formación de una cicatriz glial y la reorganización estructural.

5.1.2. Células de Müller

Las células de Müller derivan de la glia radial y constituyen las principales células gliales

de la retina de vertebrados. Poseen un cuerpo celular delgado que se extiende desde la MLE

hasta la MLI, donde se ubican sus pies terminales. Las células de Müller atraviesan todo el

espesor de la retina, rodeando y dando soporte a los somas y procesos de todas las células

retinianas. Entre las numerosas funciones de las células de Müller, se destacan: 1) su

Introducción

32

participación en el metabolismo de la glucosa y en el aporte de nutrientes a las neuronas, así

como en la remoción de sus productos metabólicos; 2) la regulación del flujo sanguíneo y la

participación en la formación y mantenimiento de la barrera hemato-retiniana interna; 3) la

participación en procesos de comunicación neuronal, particularmente a través de la captación

rápida y el reciclaje de neurotransmisores; 4) el control de la homeostasis de iones y agua y la

regulación del pH extracelular; 5) la participación en procesos de reparación y reactividad frente

a una injuria; y 6) la liberación de diversos factores neurotróficos que regulan la función

retiniana (ATP, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento derivado del

epitelio pigmentario, factor de crecimiento transformante y factor neurotrófico derivado de

cerebro (BDNF), entre otros) (revisado por Bringmann y col., 2006). El BDNF sintetizado en las

células de Müller es un factor clave para la supervivencia de las CGRs durante el desarrollo y

frente al daño neuronal.

En condiciones fisiológicas, las células de Müller no expresan GFAP pero sí lo hacen

frente a una variada gama de noxas retinianas como la isquemia, el daño por luz y la retinopatía

diabética, entre otras (Dorfman y col., 2013; Grosche y col., 1997; Salido y col., 2013). En este

contexto, el aumento en la expresión de GFAP en las células de Müller constituye un reconocido

indicador de daño o estrés retiniano (Osborne y col., 1991; Wu y col., 2003).

5.2. Microglía

Las células microgliales son las células inmunes residentes del SNC, constituyen el 10%

de la población glial total del cerebro y cumplen diversas funciones, tanto en condiciones

normales como patológicas. Pueden tener efectos tóxicos sobre las neuronas durante el desarrollo

o después de una lesión, como resultado de producción de sustancias citotóxicas y la expresión

de diferentes receptores y sustancias relacionadas con la presentación de antígenos. Por otro

lado, también pueden facilitar la diferenciación neuronal, la supervivencia, y la regeneración a

través de la producción de factores neurotróficos, como BDNF, factor de crecimiento nervioso,

Introducción

33

neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, factor básico de crecimiento de fibroblastos, factor de

crecimiento de hepatocitos y factor de crecimiento transformante y sus receptores, así como

diversos factores de diferenciación (Aarum y col., 2003; Hanisch, 2002; Kim y de Vellis, 2005).

Perry y Gordon (1988) propusieron que la microglía atraviesa la barrera hemato-retiniana intacta

en estadíos embrionarios tardíos y postnatales tempranos y se mantiene en el parénquima,

integrada a la retina, principalmente en los estratos fibrosos (CPE, CPI), y en escaso número en

la CFN de la zona central de la retina, adyacente al NO. Más recientemente, la hipótesis de que la

microglía se origina a partir de monocitos circulantes, precursores de monocitos inmaduros, o

células progenitoras mesenquimáticas está adquiriendo mayor aceptación.

En forma relativamente reciente, diversos estudios se han centrado en la participación de

la microglía en diferentes enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer (McGeer y col.,

1987), la enfermedad de Parkinson (Imamura y col., 2003), la esclerosis múltiple (Napoli y

Neumann, 2010) y el glaucoma (Bosco y col., 2011) y en condiciones patológicas como la

hipoxia (Morigiwa y col., 2000), la isquemia cerebral (Hur y col., 2010) o procesos tumorales.

Muchos de estos trabajos se han enfocado particularmente en la marcada transformación de la

microglía a partir de un estado latente o “en reposo” a un fenotipo hipertrofiado o “activado” e

incluso ameboide (Figura 10). En forma previa a su activación, la microglía exhibe una

morfología altamente ramificada, con sitios de ramificación primaria que pueden exceder los 50

m de largo (estado de reposo). En respuesta a una señal de activación, se inicia una etapa de

reestructuración del citoesqueleto, en la que la microglía retrae sus prolongaciones y puede

hipertrofiarse. Durante esta etapa, hay poca o nula extensión de procesos, y sólo se observa

retracción. En algunos casos y en etapas más avanzadas, los procesos microgliales pueden

retraerse hasta aproximadamente el diámetro del cuerpo celular, y nuevas prolongaciones

vuelven a protruir. En la etapa mótil, las prolongaciones nuevas pueden crecer y encogerse, lo

que permite a las células microgliales contactarse con células vecinas (o restos celulares),

Introducción

34

interactuar con ellas y también fagocitarlas (Stence y col., 2001). En la etapa de locomoción, las

células pueden migrar al sitio de la lesión siguiendo un gradiente quimiotáctico de ATP y óxido

nítrico, entre otros factores, liberados directa o indirectamente en el sitio del daño (Duan y col.,

2009).

Figura 10. Modelo de la dinámica de activación microglial. Se muestra un esquema de la microglía

ramificada en reposo (negro), previa a una señal de activación (amarilla) y los cambios fenotípicos que se

suceden tras la activación microglial: estado hipertrófico y de retracción de los procesos (rojo); estado de

transición, en el que la retracción llega a ser máxima; estado mótil, en el que se generan nuevos procesos

(en verde) y estado locomotor, en el que adquiere la capacidad de migrar, estos últimos también estados

fagocíticos. Se indica el nivel de expresión del marcador microglial: molécula adaptadora de unión a

calcio ionizado- 1 (Iba-1), que aumenta o disminuye en relación a la remodelación del citoesqueleto o a

los cambios en la forma celular de un estado a otro. Modificado de Stence y col. (2001).

Además de la notable plasticidad morfológica, la microglía es capaz de realizar diversas

funciones similares a los macrófagos, incluyendo la fagocitosis, la producción de citoquinas pro-

o anti-inflamatorias y la presentación de antígenos (Garden y Moller, 2006), por lo que pueden

tener efectos tanto neurotóxicos como neuroprotectores y regenerativos (Yokoyama y col.,

2004). Actualmente, según una clasificación funcional y molecular la microglía activada se

subdivide en: M1, estadío de activación clásica con propiedades citotóxicas, usualmente refiere a

células estimuladas con interferón y/o factor de necrosis tumoral que expresan citoquinas

pro-inflamatorias; M2a, estadío de activación alterna, se polariza in vitro por interleuquina 13

Introducción

35

(IL-13) y participa en procesos de reparación y regeneración y M2b, con un fenotipo

inmunorregulador polarizada por IL-10. Existe también un tipo microglial M2c, con un fenotipo

desactivado adquirido (Mosser y Edwards, 2008).

La mayoría de los estudios se han enfocado a los procesos de activación microglial, en

tanto que los procesos de “resolución” o “desactivación” que frenan la respuesta han sido

comparativamente menos estudiados (revisado por Luo y Chen, 2012).

Indudablemente, estas clasificaciones tienden a sobre-simplificar la capacidad de las

distintas poblaciones microgliales para sintonizar finamente una respuesta inmune. En este

sentido, las evidencias indican que es el microambiente más que el modo de activación, lo que

podría regular las características de la microglía. En la enfermedad priónica de roedores, la

microglía retrae sus procesos y sobre-expresa Iba-1 y otros marcadores microgliales (Betmouni y

col., 1996; Broom y col., 2007) pero carece de la capacidad de sintetizar IL-1 a menos que sea

expuesta a lipopolisacárido bacteriano (LPS) administrado a nivel periférico (Walsh y col., 2000,

2001), lo que contribuye a exacerbar la neurodegeneración. El concepto de polarización

microglial es limitado, en tanto no toma en cuenta muchas otras variables, como el nivel de

activación de un dado subtipo, el tiempo de permanencia de las señales de activación, la

interacción con neuronas y astrocitos, la disfunción microglial asociada a la edad, el origen de la

microglía, las poblaciones y proporciones de otros leucocitos y el potencial de una célula

microglial de transformarse entre diferentes estados de activación. Frente a una lesión, se

produce aparentemente una mezcla de células M1 o M2 y muchos otros subtipos (revisado por

Anthony y Pitossi, 2013).

El rol dual de la microglía refiere a la influencia de la microglía sobre las neuronas. Sin

embargo, muchos estudios indican que las neuronas no son meramente “blancos” pasivos de la

microglía, sino que ejercen cierto control sobre las actividades de estas últimas. Existen muchos

tipos de interacción entre las neuronas y la microglía, algunas de las cuales se muestran en la

Introducción

36

a

Figura 11.

Figura 11. Esquema del “diálogo neurona-microglía”. La microglía expresa un grupo de receptores de

superficie que desencadenan señales intracelulares en condiciones de reposo. Muchas de estas señales son

ligandos liberados o expresados en la superficie neuronal como los receptores inhibitorios CX3CR1,

CD200R, y CD172a/Sirp alpha, cuyos ligandos se encuentran en la superficie de neuronas “sanas”. La

disminución de estas señales es indicativa de la pérdida de integridad neuronal. Los receptores como

TREM-2 y purinérgicos median señales que reproducen la injuria neuronal e inducen fagocitosis y

funciones anti-inflamatorias en la microglía. Las neuronas también liberan factores como IL-34 y Csf1

que se unen a su receptor en la superficie microglial e inducen la supervivencia celular o proliferación.

Modificado de Kierdorf y Prinz (2013).

Se ha postulado que la activación microglial, como consecuencia de la injuria neuronal,

estaría involucrada en mecanismos neuroprotectores y que la pérdida posterior de la

comunicación específica entre las neuronas y la microglía, conduciría al comportamiento

neurotóxico de estas últimas (Polazzi y Contestabile, 2002). Múltiples evidencias han

demostrado un intercambio considerable de información entre estos dos tipos celulares y se ha

sugerido que dependiendo el estado neuronal, señales ON u OFF desde las neuronas inducirían

fenotipos microgliales de activación o reposo, respectivamente (Biber y col., 2007). En

consecuencia, la microglía no solo “patrulla” el SNC, sino que también recibe y responde

activamente a señales neurales. Asimismo, la microglía se comunica bidireccionalmente con

astrocitos, determinando el microambiente y la influencia que tendrá sobre procesos de

degeneración o regeneración neuronal. Por un lado, los astrocitos ejercen un rol neuroprotector al

Introducción

37

modular la actividad de la microglía es decir, disminuyendo su citotoxicidad, por ejemplo al

reducir la expresión de IL-12 (Aloisi y col., 1997) e iNOS (Pyo y col., 2003); por el otro, la

microglía libera citoquinas pro-inflamatorias que disminuyen la expresión de conexina 43

(Rouach y col., 2002) y bloquean las uniones estrechas en astrocitos, lo que aumenta su

supervivencia. Además, la activación de astrocitos no sólo facilita la activación de la microglía

distante mediante ondas de calcio, sino también puede inhibir la actividad microglial (Liu y col.,

2011).

5.3. Oligodendrocitos

Los oligodendrocitos maduros (OM) poseen un cuerpo celular pequeño con un

citoplasma muy denso. Presentan un retículo endoplasmático rugoso abundante, frecuentes

polirribosomas libres, un complejo de Golgi desarrollado y numerosas mitocondrias. El núcleo es

esférico y contiene gran cantidad de heterocromatina, pero es más pequeño que el de los

astrocitos. Los OM presentan menor cantidad de prolongaciones y son menos ramificadas que las

de los astrocitos. Son las células gliales especializadas en la formación y mantenimiento de la

vaina de mielina de las fibras del SNC, por lo que se localizan en columnas entre los axones. En

la retina, no existen oligodendrocitos y los axones de las CGRs en la CFN de la retina son

amielínicos. Por otra parte, la porción más cercana a la retina del NO posee fibras amielínicas y

río abajo de una zona de transición, las fibras se mielinizan por oligodendrocitos que se ubican

en esta porción del NO (Figura 8).

Los oligodendrocitos se desarrollan de acuerdo a un linaje bien establecido, definido por

etapas secuenciales en las que se expresan marcadores de superficie y epitopes específicos de

mielina (Figura 12). Los estadios sucesivos se distinguen por el aumento progresivo en la

complejidad morfológica. La célula precursora de oligodendrocitos (CPO) se identifica por la

inmunomarcación para el proteoglicano condroitín sulfato-4 (NG2) o para el receptor del

factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-). El oligodendrocito premielinizante

Introducción

38

(preMO), es una célula progenitora tardía, mitóticamente activa y de morfología multipolar

simple y se la identifica por la presencia del marcador O4 y la ausencia del marcador

oligodendrocitos 1 (O1), un galactocerebrósido también denominado GalC. El oligodendrocito

mielinizante inmaduro (OMi) es una célula de morfología multipolar compleja, post-mitótica,

identificada por la presencia de O1 y por la ausencia de moléculas presentes en las vainas de

mielina. Por último, el OM maduro (OMm) se identifica por marcadores asociados a mielina,

como MBP y otros que se indican en la Figura 12 (Back y col., 2007). De este modo, es posible

definir tanto in vivo como in vitro, el momento y las características de la progresión del linaje de

los oligodendrocitos.

Figura 12. Maduración del linaje de oligodendrocitos. En el esquema se muestran cuatro estadíos del

linaje de oligodendrocitos, junto con sus correspondientes características morfológicas y capacidad de

mielinización, migración y proliferación. Cada estadío se define por la combinación de genes,

glicolípidos o proteínas marcadoras que se indican en la Figura. CNP, actividad CNPasa, β’:γ’-nucleótido

cíclico-3-fosfodiesterasa; GalC(O1), galactocerebrósido; MAG, glicoproteína asociada a mielina; MBP,

proteína básica de mielina; MOG, glicoproteína de mielina de oligodendrocitos; NG2, proteoglicano

condroitín sulfato-4; PDGFR, factor de crecimiento derivado de plaquetas-; PLP, proteína

proteolipídica. Olig2 y Sox10 son genes altamente expresados en preMO. Extraído de Back y col., 2007.

Introducción

39

Los axones que forman parte del NO están rodeados por segmentos internodales de

mielina formada por diversos OMm. El espacio entre las vainas de mielina de distintos OMm se

denomina nodo de Ranvier. La mielina actúa como aislante de baja capacitancia y alta

resistencia, de manera que la corriente iónica que se transmite en la zona intermodal lo hace a

alta velocidad (conducción electrotónica o pasiva), mientras que en el nodo de Ranvier la

conducción es mucho más lenta (conducción activa). Esta diferencia de velocidades de

conducción entre la zona intermodal y el nodo de Ranvier hace que la conducción sea

“saltatoria” (de nodo a nodo). Esta adaptación permite un aumento considerable en la velocidad

de conducción y representa un “ahorro” significativo en términos energéticos. La mielina cumple

además una función protectora, ya que asegura la continuidad de la conducción del impulso

nervioso. La estructura de la vaina de mielina consiste en una sucesión de capas alternantes de

lípidos mixtos y proteínas, que se mantienen íntimamente unidas por moléculas de adhesión,

tales como PLP, MBP y MAG, formando una vaina compacta (Baumann y Pham-Dinh, 2001;

Kursula, 2008). Los altos niveles de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno pueden afectar la

estabilidad de la vaina de mielina, al modificar tanto a PLP por peroxidación lipídica, como a las

proteínas que residen entre las superficies repulsivas externas de las láminas de mielina,

causando un debilitamiento o desprendimiento de láminas y el aumento del espesor general la

vaina (Bizzozero y col., 2001; Bongarzone y col., 1995). Se ha sugerido que las subpoblaciones

de oligodendrocitos que mielinizan axones de mayor calibre, identificados como

CNP(+)/anhidrasa carbónica II(-), son más susceptibles al daño oxidativo y a la subsecuente

descompactación y pérdida de la integridad axonal, que las subpoblaciones que envuelven mayor

cantidad de axones, de menor calibre y son CNP(+)/anhidrasa carbónica II(+) (Butt y col, 1995;

Payne y col., 2012).

Introducción

40

6. El glaucoma

6.1. Características generales

El glaucoma define a un grupo de desórdenes visuales que constituye una de las

principales causas de ceguera irreversible en el mundo (Weinreb y Khaw, 2004). Es una

disfunción ocular caracterizada por manifestaciones clínicas e histopatológicas que incluyen una

pérdida progresiva de las funciones visuales, que se acompaña de la muerte de CGRs y la atrofia

progresiva de la cabeza del NO. Una complejidad adicional del glaucoma es que su curso es

prácticamente asintomático hasta etapas avanzadas de pérdida visual, debido a que la enfermedad

afecta en primera instancia al campo visual periférico y sólo en las últimas etapas compromete la

visión central.

A pesar del esfuerzo realizado en el área en los últimos 40 años, aún no se conocen

completamente los agentes etiológicos de la enfermedad. El aumento de la PIO es el principal

factor de riesgo para el desarrollo del glaucoma (Gordon y col., 2002; Sommer, 1989). De hecho,

la farmacología disponible para el tratamiento de esta disfunción está orientada esencialmente al

control de la PIO. Sin embargo, un porcentaje considerable de los diagnósticos de glaucoma

(Shields, 2008) corresponden a casos de glaucoma de PIO normal. Por otra parte, es

considerablemente frecuente la detección de una hipertensión ocular crónica sin daño a nivel del

NO (revisado por Heijil y col., 2002).

Existen distintas formas de clasificar a los glaucomas. Según su etiología, se dividen en

primarios (sin causa aparente) o secundarios a otras patologías como diabetes, miopía y uveítis

entre otras (Daubs y Crick, 1981; Klein y col., 1994; Richler y col., 1982). De acuerdo a la

apariencia del ángulo de la cámara anterior, pueden ser glaucomas de ángulo cerrado o abierto

(que es la forma más frecuente (60 -70%) de la enfermedad) (Choong y col., 2003; Weinreb y

Khaw, 2004). Por último, según su evolución pueden cursar en forma aguda o crónica. Se ha

postulado la influencia de un factor hereditario (Shin y col., 1977), así como de un componente

Introducción

41

etario (Quigley y col., 1994) y racial (Tielsch y col; 1994). En el glaucoma primario de ángulo

abierto, la resistencia a la salida del humor acuoso está incrementada, causando una elevación de

la PIO. El mecanismo preciso de la disminución del flujo de humor acuoso es aún elusivo,

aunque muy probablemente esté asociado a alteraciones a nivel del trabeculado y/o el canal de

Schlemm (Cernea, 1993).

El diagnóstico clínico del glaucoma primario de ángulo abierto se fundamenta en tres

alteraciones oculares: el aumento de la PIO, la alteración concéntrica del campo visual y la

excavación de la papila, debida a la pérdida de axones del NO. Si bien la disminución

farmacológica o quirúrgica de la PIO es por ahora la terapia de elección, en muchos casos se ha

observado que la pérdida visual persiste o incluso progresa luego de su restauración a valores

normales. A pesar de la gran variedad de fármacos disponibles (agonistas o antagonistas

adrenérgicos, agonistas colinérgicos o inhibidores de la colinesterasa y análogos de

prostaglandinas, entre otros), aún existe controversia en la terapia médica del glaucoma. En el

inicio de la enfermedad, el tratamiento frecuente es la administración tópica de alguno de los

fármacos; cuando el daño en el NO o en el campo visual progresa a pesar de la terapia

farmacológica (Edmunds y col., 1999) o no se logra un adecuado control de la PIO, se recurre a

una intervención quirúrgica que puede optar entre dos modalidades: una esclerotomía penetrante

o no penetrante. La primera consiste en la creación de una vía accesoria de filtración del humor

acuoso mediante la eliminación de la red trabecular y de una comunicación permanente entre la

cámara anterior y posterior; la segunda técnica consiste también en la creación de una vía

accesoria de filtración del humor acuoso a través de la esclera por eliminación de la red

trabecular pero sin penetrar en la cámara anterior.

6.2. Modelos experimentales de glaucoma

Desde hace varias décadas, la comunidad científica internacional reconoce el uso de

modelos animales como una herramienta útil para el estudio de la patología humana. La similitud

Introducción

42

de un proceso patológico en animales de experimentación, aún con diferencias respecto al

humano, contribuye significativamente a la comprensión de un proceso en su contraparte

humana. A pesar de múltiples intentos, el desarrollo de modelos para el estudio del glaucoma

todavía no ha alcanzado consenso en un modelo que reproduzca completamente la enfermedad

en animales de laboratorio y sea reproducible. Dado el vínculo estrecho entre la hipertensión

ocular y el daño glaucomatoso, los modelos animales de glaucoma generalmente se desarrollan a

través de la inducción de hipertensión ocular o hacen uso de cepas de animales con aumento

espontáneo de la PIO (Pang y Clark 2007; Sappington y col., 2010). En este sentido, las

estrategias más frecuentemente utilizadas son: 1) la cauterización u oclusión de 2 ó 3 de las

venas epiesclerales (Shareef y col., 1995); 2) la inyección de solución salina hipertónica en las

venas acuosas (Morrison y col., 1997); 3) el bloqueo del flujo acuoso por fotocoagulación luego

de la inyección de tinta china en la cámara anterior (Ueda y col., 1998); 4) la inyección de

microesferas de látex en la cámara anterior del ojo que bloquea el drenaje del humor acuoso a

nivel del trabeculado (Weber y Zelenak, 2001) y 5) el uso de cepas de animales en los que la

patología se produce por alteraciones genéticas, de los cuales el más frecuentemente utilizado es

el ratón DBA/2J (Anderson y col., 2002). Estos ratones desarrollan una hipertensión ocular

espontánea, muy variable entre individuos, entre sexos e incluso entre ojos de un mismo animal,

que se hace evidente entre los 6 - 10 meses de vida. Este aumento de la PIO se debe a la

mutación recesiva de dos genes, Gpnmb y Tyrp-1 y tiene como consecuencia una atrofia del

estroma del iris y una dispersión del pigmento que produce la obstrucción de la vía de salida del

humor acuoso, provocando el aumento de la PIO que se asimila al glaucoma pigmentario en

humanos (Anderson y col., 2002). Ninguno de estos modelos es ideal y todos ellos tienen

algunas desventajas, como la necesidad del uso de equipos especializados y de técnicas

quirúrgicas complejas, o presentan una cinética de aumento de la PIO marcadamente diferente a

la de los humanos.

Introducción

43

Como ya se mencionó, los tipos predominantes de GAGs en el trabeculado son el AH y el

CSU. Trabajos pioneros de Barany y Scotchbrook (1954) demostraron que el tratamiento de ojos

de gato con hialuronidasa testicular bovina disminuye la resistencia al filtrado de humor acuoso

en el ángulo, a casi la mitad de su valor inicial. Desde entonces, se ha dedicado considerable

atención a los mucopolisacáridos sensibles a hialuronidasa en el sistema de salida del flujo

acuoso. En este sentido, se ha demostrado que la hialuronidasa testicular incrementa el flujo de

humor acuoso en ojos de perros (Van Buskirk y Brett, 1978) aunque la evidencia sugiere un

efecto menor en ojos humanos (Hayasaka y Sears, 1978). Asimismo, se demostró una

correlación entre la remoción del AH y la disminución en el flujo de humor acuoso en ojos de

conejo (Knepper y col., 1984), perro (Van Buskirk y Brett, 1978) y vaca (Barany y Scotchbrook,

1954), pero no en ojos de primates (Hubbard y col., 1997; Sawaguchi y col., 1992).

En la práctica oftalmológica, se dispone de evidencias considerables a partir del uso de

agentes viscoelásticos que avalan el vínculo entre los GAGs y la PIO. Estos agentes contienen

AH y CSU y se han convertido en una herramienta esencial en la cirugía del segmento anterior

para generar espacio y reducir el trauma y la pérdida de células endoteliales. Estos agentes son

responsables de causar o exacerbar en forma transitoria, pero a veces significativa, una elevación

post-quirúrgica de la PIO (Jurgens y col., 1997). Estos resultados sugieren que el AH y el CSU

podrían participar en la regulación del flujo de humor acuoso y que la acumulación de estos

GAGs en el trabeculado podría cumplir un rol significativo en el glaucoma crónico de ángulo

abierto. En trabajos previos de nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo experimental

de glaucoma a través de la administración semanal de AH en la cámara anterior del ojo. En este

sentido, hemos demostrado que la inyección aguda o crónica de AH aumenta significativamente

la PIO en el ojo de rata (Benozzi y col., 2002) y su administración en forma crónica reproduce

aspectos centrales del glaucoma crónico humano tanto a nivel funcional como histológico

(Moreno y col., 2005a). Sin embargo, el análisis bioquímico del perfil de GAGs de la red

Introducción

44

trabecular de pacientes con glaucoma demuestra una marcada disminución en el contenido de

AH y un aumento en el contenido de CSU (Knepper y col., 1996). Resultados similares se

demostraron en un modelo de glaucoma en conejos (Knepper y col., 1985). Estos resultados

sugieren que el CSU podría participar activamente en la regulación de la salida del humor acuoso

y que una acumulación de CSU en el trabeculado podría desempeñar un rol central en el

glaucoma crónico. De hecho, se demostró que el aumento en el contenido de CSU en el tejido

conectivo yuxtacanalicular de pacientes con glaucoma tiene mayor impacto sobre la resistencia a

la salida de humor acuoso que el aumento en los niveles de AH (Knepper y col., 2005). Estas

evidencias avalan la posibilidad de que un aumento en el contenido de CSU en la cámara anterior

del ojo podría provocar un aumento en la PIO, aspecto que se analizará en este trabajo de Tesis.

6.3. La vía visual en el glaucoma

El glaucoma es usualmente concebido como una enfermedad limitada al ojo; sin

embargo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e

intracraneales. En el sistema visual, como en otros sistemas cerebrales, la función y

supervivencia neuronal depende de las conexiones con otras neuronas. Se ha demostrado una

reducción marcada en la densidad de fibras retinianas procedentes de ojos con glaucoma

experimental en el NGLd y el CS (Drouyer y col., 2008). Sin embargo, la información disponible

respecto a cambios trans-sinápticos a nivel del NGL, el CS y la corteza visual primaria (CV1)

han sido hasta ahora sólo escasamente examinados. Estudios en modelos experimentales de

glaucoma en monos han demostrado una disminución significativa en el número, la densidad y el

tamaño de neuronas, así como en el volumen laminar del NGL ipsilateral al ojo glaucomatoso en

las capas retinorreceptivas del NGL que reciben aferencias del ojo glaucomatoso (Weber y col.,

2000; Yücel y col., 2001). En algunos casos, se ha observado un daño preferencial en la vía M

(Weber y col., 2000), en otros de la vía P (Yücel y col., 2001), en tanto que otros estudios

demostraron daños comparables en ambos sistemas (Vickers y col., 1997; Yücel y col., 2003).

Introducción

45

Esta contradicción se extiende también a los resultados obtenidos en un número pequeño de

autopsias humanas (Chaturvedi y col., 1993; Gupta y col., 2006).

Los mecanismos involucrados en el daño neuronal del NGL, el CS y la CV1 en el

glaucoma son aún elusivos. Aunque es un hecho establecido que en el glaucoma las CGRs

mueren por apoptosis, no se han realizado estudios similares a nivel de las proyecciones

cerebrales. Sin embargo, se ha demostrado en situaciones experimentales en las que se produce

desconexión de vías aferentes que las neuronas desaferentadas se “encogen” y posteriormente

mueren por apoptosis (Guillery, 1973). Se ha sugerido que la atrofia neuronal inducida por la

hipertensión ocular podría representar tanto un estado de quiescencia o reducción en el consumo

de energía secundario a la pérdida del input retiniano (Zhang y col., 2009). Algunas evidencias

sugieren que estos cambios podrían ser reversibles, lo que permitiría inducir alguna forma de

intervención terapéutica para prevenir la muerte celular aún en estadíos en los que se observa

reducción del tamaño neuronal (Guillery, 1973; Matthews, 1964). Sin embargo, todos los

estudios dedicados a la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para el glaucoma, no han

examinado si el beneficio terapéutico se extiende a las vías de procesamiento cortical de la

información visual.

Otro aspecto de interés es la elucidación del curso temporal del daño glaucomatoso en las

vías visuales superiores. Si bien en un modelo de glaucoma en monos se ha descripto una

relación lineal entre el grado de daño del NO y la atrofia de neuronas en el NGL (Yücel y col.,

2001; 2003), también se ha descripto una reducción del tamaño de neuronas del NGL en monos

con hipertensión ocular, sin pérdida evidente de fibras del NO. Esto podría sugerir que la atrofia

del NGL es un evento temprano, eventualmente relacionado en forma directa con la hipertensión

ocular o con cambios funcionales (pero no histológicos) retinianos. La degeneración de neuronas

del NGL y del CS podría ser un mecanismo activo de daño glaucomatoso sobre las CGRs y sus

axones al reducir su metabolismo y disminuir el suministro de factores tróficos a la retina (Gupta

Introducción

46

y Yücel, 2007; Pearson y Stoffler, 1992). Además, cambios en las neuronas del NGL pueden

provocar daños post-sinápticos (degeneración trans-sináptica) en la CV1, localizada en la parte

posterior del cerebro y organizada en columnas de dominancia ocular específica (Crawford y

col., 2001; Lam y col., 2000). Estudios de resonancia magnética demostraron alteraciones

significativas en la CV de pacientes con glaucoma, con una reducción en la densidad de la

sustancia gris en las zonas corticales de proyección visual (Boucard y col., 2009). Estos

resultados sugieren que el glaucoma induce una degeneración retinotópica específica en la CV.

En un modelo de glaucoma experimental en ratas se demostró una alteración del metabolismo de

colina y un aumento marginal en los niveles de glutamato en la CV1 contralateral al ojo

glaucomatoso (Chan y col., 2009). Asimismo, se han demostrado cambios metabólicos en la

CV1 en monos con glaucoma experimental (Lam y col., 2003).

Estos resultados, aunque aún son evidencias fragmentarias obtenidas en un número muy

reducido de muestras humanas y en diferentes modelos experimentales de glaucoma, sugieren

que el daño de las CGRs provoca cambios degenerativos en el NGL, el CS y la CV1. Sin

embargo, las evidencias resultan contradictorias en algunos aspectos, los mecanismos

involucrados en el proceso degenerativo y el curso temporal de este proceso no han sido

exhaustivamente examinados y no se dispone al presente de estrategias terapéuticas capaces de

prevenir, curar, o detener el daño cortical asociado a la pérdida visual glaucomatosa. Desde una

perspectiva clínica, un estudio detallado de la relación entre el déficit retiniano y los cambios

estructurales y funcionales corticales, podrían contribuir a una mayor comprensión de la

progresión en la disfunción visual glaucomatosa, así como al desarrollo de estrategias

terapéuticas diseñadas para la protección del daño cerebral asociado al glaucoma.

Introducción

47

7. La minociclina

La minociclina (MINO) es un análogo semi-sintético de la tetraciclina, de fácil absorción

por el tracto gastro-intestinal, con una vida media aproximada de 18 h (revisado por Chen y col.,

2011). La MINO es una molécula altamente liposoluble, por lo que puede atravesar fácilmente la

barrera hemato-encefálica y hemato-retiniana. En dosis terapéuticas, la MINO tiene buena

tolerancia para su uso en humanos (Chen y col., 2011; Garrido-Mesa y col., 2013). Además de

sus propiedades antimicrobianas, la MINO tiene un potente efecto antiinflamatorio

inmunomodulatorio y neuroprotector (Maier y col., 2007; Chen y col., 2011). El efecto anti-

inflamatorio de la MINO involucra la inhibición de la activación y la migración microglial,

estimulando su transformación al fenotipo en “reposo” tanto in vivo como in vitro (Garrido-Mesa

y col., 2013), así como la inhibición de la síntesis de óxido nítrico y citoquinas pro-inflamatorias

(Yang y col., 2007; Baptiste y col., 2005; Bosco y col., 2008). Asimismo, se ha demostrado que

la MINO induce cascadas de señales anti-apoptóticos, disminuye la toxicidad glutamatérgica (Du

y col., 2001; Chen y col., 2000; Levkovitch-Verbin y col., 2013; 2014; Sánchez Mejía y col.,

2001; Wang y col., 2004; Zhu y col., 2002), y actúa como scavenger de radicales libres (Kraus y

col., 2005, Wilkins y col., 2004).

Como ya se mencionó, luego de una lesión neuronal, la microglía se activa y libera

sustancias con alto poder deletéreo. De hecho, existe consenso en que la microglía constituye un

blanco potencialmente explotable con fines preventivos y terapéuticos en procesos

neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Sobre la base de sus efectos sobre la reactividad

microglial, se han demostrado efectos beneficiosos de la MINO en diversos modelos de injuria

neuronal, como isquemia cerebral (Yrjänheikkii y col., 1998), daño en la médula espinal (Teng y

col., 2004), esclerosis múltiple (Zhang y col., 2008), esclerosis lateral amiotrófica (Kriz y col.,

2002; Zhu y col., 2002), enfermedad de Huntington (Chen y col., 2000; Wang y col., 2006),

enfermedad de Parkinson (Du y col., 2001), y en modelos de daño retiniano inducido por luz

Introducción

48

intensa (Zhang y col., 2004) y transección del NO (Baptiste y col., 2005; Levkovitch-Verbin y

col., 2006; 2011). De hecho, se han realizado estudios clínicos para analizar el efecto de la

MINO en el tratamiento de pacientes con esclerosis múltiple, con resultados alentadores (Zabad

y col, 2007; Zhang y col., 2008). Sin embargo, sólo existen escasos antecedentes sobre el uso de

MINO en el glaucoma (Bosco y col., 2008; Levkovitch-Verbin y col., 2006; 2014). Bosco y

colaboradores (2008) demostraron que el tratamiento de ratones DBA/2J con MINO aumenta la

fracción de células microgliales con fenotipo ramificado, reduce los niveles de Iba-1 y previene

la disminución del transporte axonal retrógrado (desde el CS a la retina). Por otra parte, en un

modelo de glaucoma experimental en ratas inducido por la fotocoagulación translimbal con láser,

se ha demostrado que la MINO aumenta significativamente la expresión del gen anti-apoptótico

Bcl-2, disminuye la expresión de IL-18 y reduce el número de células microgliales fagocíticas en

la retina (Levkovitch-Verbin y col., 2014). El conjunto de antecedentes mencionados, avala la

realización de estudios adicionales para la evaluación del efecto de la MINO con fines

terapéuticos en el glaucoma, aspecto que se analizará en el marco de este trabajo de Tesis.

Objetivos

49

OBJETIVOS

Sobre la base de las consideraciones mencionadas en la Introducción, los objetivos centrales de

este trabajo de Tesis fueron:

1. Analizar los efectos del glaucoma agudo experimental sobre la retina y las vías visuales

superiores.

2. Analizar los efectos del glaucoma agudo experimental sobre el sistema visual no

formador de imágenes.

3. Desarrollar un modelo de glaucoma crónico experimental en ratas.

4. Analizar los efectos del glaucoma crónico experimental sobre las vías visuales superiores.

5. Examinar el efecto de la minociclina sobre las alteraciones inducidas por el glaucoma

crónico a nivel de la retina, el nervio óptico y el colículo superior.

6. Analizar los efectos del glaucoma crónico experimental sobre el sistema visual no

formador de imágenes.

Materiales y Métodos

50

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Animales

Se utilizaron ratas Wistar macho adultas (300 ± 50 g). Los animales se mantuvieron bajo

condiciones controladas de temperatura (21 ± 2°C) y humedad, bajo un fotoperíodo de 12 h de

luz (~ 150 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a las 08.00 h), con agua

y alimento ad libitum. En todos los casos, los animales se anestesiaron con hidrocloruro de

ketamina (150 mg/kg) e hidrocloruro de xilacina (2 mg/kg), administradas intraperitonealmente.

En algunos casos, se aplicó anestesia local (hidrocloruro de proparacaína al 0,5%) en la córnea.

1.1. Inducción de glaucoma agudo. Bajo anestesia general, se canuló la cámara anterior de

cada ojo con una aguja 30G conectada a un reservorio presurizado, conteniendo solución Ringer

lactato. Mediante la regulación de la presión del reservorio, se modificó la presión intraocular

(PIO), que se elevó a 70 mm de Hg durante 90 minutos. De esta manera se indujo una

hipertensión ocular aguda (HOA), caracterizada por el bloqueo total del flujo sanguíneo

(observado mediante examinación del fondo de ojo) y pérdida de la respuesta

electrorretinográfica. Luego de completado el período de hipertensión ocular, se retiró la aguja

de la cámara anterior y se comprobó la inmediata reperfusión y recuperación del flujo sanguíneo.

En el caso del tratamiento simulado, se realizó el mismo procedimiento pero sin el aumento de la

PIO (Figura 13). Durante todo el procedimiento se mantuvo constante la temperatura corporal

mediante el uso de mantas térmicas. Se excluyeron de los experimentos aquellos animales que

sufrieron daño en el cristalino (desarrollo de cataratas) durante el procedimiento. Los animales

se sacrificaron al cabo de 1, 2 ó 4 semanas.

Materiales y Métodos

51

Figura 13. Fotografías de ojos canulados en la cámara anterior. Panel A: Se muestra un ojo canulado con

una aguja 30G durante el procedimiento simulado. Panel B: Se muestra un ojo con ausencia de rubidez

durante la HOA.

1.2. Inducción de glaucoma crónico. Las ratas se anestesiaron como ya se mencionó.

Mediante el uso de agujas 30G, se inyectaron 10 l de condroitín sulfato (CSU) (400 mg/ml) en

un ojo y el mismo volumen de solución fisiológica en el ojo contralateral. Para ello, los ojos se

enfocaron bajo un microscopio quirúrgico con luz coaxial (Colden, Argentina). Se movió la

aguja a través del limbo esclero-corneal hacia la cámara anterior con el bisel hacia abajo. Cuando

la punta del bisel alcanzó la cámara anterior, el líquido progresivamente incrementó la

profundidad de la cámara, separando la aguja del iris y evitando el contacto con el cristalino. Las

inyecciones se realizaron una vez/semana usando la fuerza necesaria para vaciar el contenido de

la jeringa de tuberculina. El sitio de inyección fue el limbo esclero-corneal, comenzando en la

hora 12 y cambiando semanalmente el sitio de la inyección de hora en hora para evitar la

formación de pannus y rotando el animal para lograr mejor acceso al limbo. Se excluyeron los

animales que desarrollaron cataratas o pthisis bulbi, cuya incidencia no superó el 5% del total de

animales utilizados. Además, casi todos los animales desarrollaron un edema corneal localizado

en el sitio de la inyección que no duró más de 24 h. Durante el período en que los animales

estuvieron anestesiados, se colocó gel sobre los ojos para evitar la sequedad corneal. No se

observaron diferencias en la incidencia de las complicaciones oculares entre los grupos

inyectados con vehículo o CSU. Como control del efecto de las inyecciones per se, se utilizó un

grupo de animales que se manipuló y anestesió en forma análoga, pero no se aplicaron

B A

Materiales y Métodos

52

inyecciones intracamerales. En algunos experimentos, se inyectó vehículo y el ojo contralateral

permaneció intacto. Los animales se sacrificaron a las 3, 6, 10 ó 15 semanas de tratamiento.

1.2.1. Tratamiento con minocilina. Un grupo de animales con glaucoma crónico unilateral al

cabo de cuatro semanas, se dividió al azar en dos subgrupos: uno de ellos recibió

intraperitonealmente una solución de 30 mg/kg de hidrocloruro de minociclina (Sigma, EE.UU.)

en solución salina, una vez por día durante 2 semanas y el otro grupo, fue tratado en forma

análoga con el mismo volumen de vehículo (solución salina). La dosis, vía y esquema de

administración seleccionados se basó en trabajos de otros autores (Guasti y col., 2009). Los

animales se sacrificaron luego de dos semanas de tratamiento.

En todos los procedimientos se respetaron estrictamente las Guías para el Cuidado y Uso

de Animales de Laboratorio de la Association for Research in Vision and Ophthalmology

(ARVO).

2. Determinación de la presión intraocular

La PIO se determinó mediante un TonoPen XL (Figura 14) (Mentor, Norwell, MA,

EE.UU.) en ratas conscientes, según la técnica descripta por Moore y col. (1995). Los animales

se envolvieron suavemente con una toalla, sin provocar estasis venosa ni efectos valsalva, y

mientras un operador lo mantenía firme, otro realizaba la determinación. Se obtuvieron cinco

lecturas de cada ojo, omitiendo las que se registraban cuando el aparato no estaba en contacto

firme con la córnea. La variación entre lecturas resultó menor al 10%. Los promedios de estas

lecturas se registraron como la PIO de un ojo y un día determinados. La PIO de cada animal se

promedió con las del resto de los animales del mismo grupo y el valor promedio resultante se

registró como la PIO media ± error estándar (EE). No se observaron diferencias significativas

entre el ojo derecho y el ojo izquierdo en animales intactos o inyectados con vehículo. Las

mediciones de la PIO se realizaron a la misma hora cada día o semana (entre las 11.00 h y las

12.00 h), para evitar las variaciones diarias en este parámetro.

Materiales y Métodos

53

Figura 14. Determinación de la PIO en ratas.

3. Función de la retina y la vía visual

3.1. Electrorretinografía escotópica. Los animales se adaptaron a oscuridad por 6 h y luego se

anestesiaron, como ya se describió. Se utilizó hidrocloruro de fenilefrina al 2,5% y tropicamida

al 1% (Laboratorios Alcon, Argentina) para dilatar la pupila y se administró solución salina

(Laboratorios Alcon, Argentina) en forma continua sobre la córnea, para mantener un registro

estable y prevenir una queratopatía. Los animales se colocaron a 20 cm de la fuente luminosa.

Todos los registros se realizaron dentro de los 20 min luego de la inducción de la anestesia y se

mantuvo constante la temperatura corporal usando una manta térmica. Se usó un electrodo de

referencia en la oreja (ipsilateral), un electrodo de tierra en la porción media de la cola y un

electrodo de oro en el centro de la córnea. Para la correcta implantación de los electrodos se

utilizó una luz roja de 15 W, que no afectó la adaptación de los animales a la oscuridad. Los

electrorretinogramas (ERGs) de ambos ojos se registraron simultáneamente y en completa

oscuridad. Para ello, se aplicaron 20 pulsos de luz blanca sin atenuación (5 ms, 0,2 Hz)

generados por un estimulador fótico de diodos aplicados con una intensidad máxima de 9 cd

s/m2. Los registros se amplificaron utilizando un equipo Akonic BIO-PC (Akonic, Argentina).

La señal se registró con una ganancia de 100 V, sin atenuación, con filtros de ruido de baja (1,5

Hz) y de alta (1000 Hz) frecuencia para optimizar el registro. Se determinó la amplitud (en V)

de la onda a, como la diferencia en amplitud entre la línea isoeléctrica y el pico negativo, y la

Materiales y Métodos

54

amplitud de la onda b, como la diferencia entre el pico de la onda a y el pico positivo de la onda

b (Figura 15A). Se determinaron las latencias de cada onda. La respuesta electrorretinográfica se

obtuvo como el promedio de los valores de cada corrida. Se realizaron tres estímulos, con un

intervalo de 5 min.

3.2. Potenciales oscilatorios. Los potenciales oscilatorios (POs) se registraron utilizando el

mismo estimulador fótico (5 ms, 0,2 Hz), con filtros de baja (100 Hz) y alta frecuencia (300 Hz).

La amplitud de los POs se calculó como el punto de máxima amplitud de cada pico en relación

a la línea de base (Figura 15B). El resultado obtenido de la suma de los tres picos de los POs se

utilizó para el análisis estadístico.

Figura15. Determinación de la función retiniana. Panel A: Se muestra un registro de ERG escotópico

característico y el método utilizado para evaluar la amplitud y latencia de las ondas a y b. Panel B: Se

muestra un registro de los POs, y se señalan los picos P1, P2 y P3.

3.3. Potenciales visuales evocados (VEPs). Para el registro de los VEPs se colocaron

quirúrgicamente dos electrodos de acero inoxidable 4 mm lateral a la cisura inter-hemisférica y

5,6 mm por detrás de bregma (electrodo activo). Se colocaron electrodos de referencia en

posición 2 mm lateral a la línea media y 2 mm antes de bregma, y un electrodo de tierra en la

cola. Ambos electrodos se aislaron y fijaron con acrílico dental, y la piel se suturó con nylon 5/0.

Los VEPs se registraron 5 días después de la implantación de los electrodos de la siguiente

Materiales y Métodos

55

manera: luego de 6 h de adaptación a la oscuridad, las ratas se anestesiaron, las pupilas se

dilataron y la córnea se irrigó de forma intermitente como ya se describió, bajo luz roja tenue.

Cada ojo se registró individualmente, para lo cual se ocluyó el ojo contralateral, y se registró un

promedio de 70 estímulos. Los ojos se estimularon con luz blanca sin atenuar (1 Hz) con un

estimulador fótico (diodos emisores de luz), fijado a la máxima intensidad de luz y los registros

se amplificaron, filtraron (0,5 Hz filtro de baja frecuencia, 100 Hz filtro de alta frecuencia) y

promediaron. Se evaluaron las amplitudes entre el pico P1 y la deflexión N2 (componente P1-

N2) y la deflexión N2 y el pico P2 (componente N2-P2), y desde el inicio de los registros se

determinaron las latencias de P1, N2 y P2 (Figura 16).

Figura 16. Determinación de la función de la vía visual. Se muestra un registro de VEPs y el método

utilizado para evaluar la amplitud de cada componente (P1-N2 y N2-P2) y latencias de P1, N2 y P2.

4. Evaluación del reflejo pupilar

Los animales se adaptaron a la oscuridad por 1 h. Se aplicó un pulso de luz blanca de

baja intensidad (120 lux) en un ojo y se registró la contracción de la pupila en el ojo

contralateral. Luego se re-adaptaron los animales a oscuridad por 1 h y se evaluó el reflejo

pupilar consensual frente a un estímulo de luz blanca de alta intensidad (1200 lux). Los registros

se realizaron bajo luz infrarroja con una cámara de video digital (Sony DCR-SR60, Japón). Se

determinó el diámetro de la pupila antes y 30 s después de aplicar el pulso de luz. La velocidad

de muestreo fue de 30 imágenes/s. Se adquirieron las imágenes a partir de la grabación de video

Materiales y Métodos

56

digital utilizando el programa OSS Video Decompiler Software (One Stop Soft, EE.UU.). El

porcentaje de contracción de la pupila se calculó como el porcentaje del área de la pupila a los

30 s del inicio del pulso (estado estacionario) en relación con el tamaño de la pupila dilatada.

Los datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y la media se utilizó como el

valor representativo de cada grupo.

5. Procesamiento histológico

Bajo anestesia profunda, los animales se perfundieron con ~ 250 ml de solución

fisiológica, seguida de ~ 300 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en buffer fosfato

(PBS) 0,1 M, pH 7,4). Se disecó cuidadosamente el globo ocular con la porción intraorbital del

nervio óptico (NO) proximal y el cerebro. Las muestras se post-fijaron en la misma solución

fijadora durante toda la noche. Los ojos se procesaron como se describirá posteriormente, y se

obtuvieron cortes transversales en parafina de la retina para el análisis morfométrico (espesor

total y de las capas retinianas y número de CGRs) y estudios de inmunomarcación y cortes

transversales del NO para inmunofluorescencia. Los cerebros se cortaron transversalmente (~ 2

mm por encima del quiasma óptico) y se procesaron para la obtención de cortes por congelación

(cortes coronales) de los distintos núcleos de proyección retiniana.

5.1. Secciones semifinas. Bajo anestesia profunda, se expuso el corazón de los animales y se

inyectó intracardiacamente 0,5 ml de heparina (como anticoagulante) y 0,5 ml de nitroprusiato

de sodio al 2,4% (como vasodilatador). Los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución

fisiológica seguida de ~ 300 ml de glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 4% en PBS. Se

disecó cuidadosamente el globo ocular y la porción proximal del NO y el cerebro a la altura del

colículo superior (CS) y se procesaron para la obtención de muestras semifinas. Luego de varios

lavados con PBS, las muestras se post-fijaron durante 1 h en OsO4 al 1% en el mismo buffer.

Posteriormente, se realizaron varios lavados, las muestras se deshidrataron mediante series

crecientes de etanol, se aclararon en acetona y se incluyeron en araldita. Se obtuvieron secciones

Materiales y Métodos

57

transversales semifinas (0,5 m) del NO y parasagitales del CS mediante el uso de navajas de

vidrio y un ultramicrótomo Ultracut E (Reichert-Jung, Austria), que se colorearon con azul de

toluidina-bórax (Bancroft y Stevens, 1990).

5.2. Obtención de cortes en parafina. Luego de varios lavados, las muestras se deshidrataron

(serie creciente de alcohol: 70%, 96%, 100%), se aclararon en acetato de n-butilo y se

embebieron en parafina. Se obtuvieron secciones a lo largo del eje sagital del ojo, manteniendo

la membrana nictitante para facilitar su posterior orientación y secciones transversales del NO

proximal. Los cortes se utilizaron para el análisis histológico y/o morfométrico,

inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de TUNEL (terminal deoxynucleotidyl

transferase dUTP nick end labeling). Todos los cortes se montaron sobre portaobjetos con carga

electrostática (Superfrost Plus Esco, EE.UU.).

5.3. Cortes por congelación. Las muestras se sumergieron en soluciones crecientes de sacarosa

(10%, 20% y 30%), y se armó un taco con solución criopreservante (Cryoblock, O.C.T,

EE.UU.). En un crióstato CM 1850 (Leica, Alemania) se realizaron secciones coronales seriadas

de 30 m a nivel de los NSQ, que se montaron en portaobjetos con carga electrostática. A nivel

del NGL, el NPO y el CS, se realizaron cortes coronales seriados y alternados de 40 m, de los

cuales el primero se descartó, el segundo se montó en portaobjetos cargados y el tercero se crio-

preservó en PBS y glicerol (1:1) a -20° C, para la realización de estudios de inmunomarcación

en cortes flotantes de cerebro para aquellos antígenos que requirieron una mayor penetración de

los anticuerpos. Para obtener cortes de retinas por congelación se realizaron dos pasos

adicionales: se extrajo la córnea y el cristalino antes del pasaje a sacarosa al 10% y previo al

armado del taco con solución criopreservante, se adsorbió con un papel de filtro el remanente de

sacarosa al 30% junto con el vítreo. Luego, los ojos se seccionaron sagitalmente para obtener

retinas en corte transversal junto con la cabeza del NO y la porción proximal del NO en corte

longitudinal de 15 m de espesor.

Materiales y Métodos

58

6. Microscopía electrónica

6.1. Análisis ultraestructural del nervio óptico. Se evaluó la ultraestructura de secciones

transversales de la región proximal del NO. Se realizaron secciones ultrafinas (70 nm) mediante

el uso de navajas de vidrio y un ultramicrótomo Ultracut E (Reichert-Jung, Austria). Las

secciones se montaron sobre grillas de 200 Mesh y se tiñeron con acetato de uranilo (2% en

etanol al 70%) y con citrato de plomo de Reynolds. Las secciones se analizaron en un

microscopio electrónico de transmisión Zeiss 109T (Zeiss, Alemania), equipado con una cámara

digital Gatan ES1000W, en el Laboratorio Nacional de Investigación y Servicio de Microscopía

Electrónica (LANAIS-MIE, CONICET-UBA, Buenos Aires, Argentina).

6.2. Análisis ultraestructural del colículo superior. Se utilizó un slicer de cerebro para ratas

de 200 - 300 g (# catálogo: NP 62-0047, Harvard Apparatus, EE.UU.) para obtener secciones

coronales de cerebro a la altura del CS de 1 mm de espesor. Se disecaron ambos CS tomando la

capa SGI como borde ventral y se orientaron las muestras mediante una muesca realizada en la

porción medial del CS. Posteriormente, se realizaron secciones ultrafinas parasagitales de la

porción lateral del CS como se muestra en la Figura 17, a fin de obtener cortes transversales de

los axones de las CGRs que ingresan a este nivel desde el tracto óptico (TO). A continuación, el

procedimiento utilizado fue esencialmente similar al que se describió para el NO.

Figura 17. Procesamiento del CS para microscopía electrónica. La figura de la izquierda esquematiza la

entrada de las fibras del tracto óptico (TO) al CS. La imagen central muestra un esquema del CS en corte

coronal y el plano de corte parasagital. La imagen de la derecha representa el plano parasagital con la

porción del CS lateral seccionada, indicada en verde. CSS: CS superficial, SO: Stratum opticum, D:

dorsal, L: lateral, C: caudal, y R: rostral.

Materiales y Métodos

59

7. Análisis de células TUNEL(+)

Para la detección de células apoptóticas, se utilizó el kit de detección in situ ApopTag

(S7110, Chemicon-Millipore, EE.UU.), según las especificaciones del fabricante. En cortes de

retina (a la altura de la cabeza del NO) se cuantificó el número de células TUNEL(+) por

sección. Los resultados obtenidos de 4 secciones separadas se promediaron y el valor promedio

de 5 animales se consideró representativo de cada grupo.

8. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:

Anticuerpo Antígeno Especie y tipo Dilución Empresa

Brn3a Factor de transcripción neuronal Cabra, policlonal 1:500 Santa Cruz,

EE.UU.

ED1 (CD68) Glicoproteína de superficie y de vesículas fagocíticas (microglía activada, macrófagos, neutrófilos y basófilos).

Ratón, monoclonal 1:200 Abcam, EE.UU.

GFAP Proteína glial fibrilar ácida (astrocitos y células de Müller reactivas).

Ratón, monoclonal 1:1200 Sigma, EE.UU.

(conjugado-Cy3)

Conejo, monoclonal

1:200 Cell Signaling,

EE.UU.

Iba-1 Proteína adaptadora de unión a calcio ionizado- 1 (microglía y macrófagos).

Cabra, policlonal 1:500 Abcam, EE.UU.

MBP Proteína básica de mielina (oligodendrocitos mielinizantes maduros).

Conejo, policlonal 1:400 *

Melanopsina Fotopigmento de las CGRsm. Conejo, policlonal 1:750 Affinity

Bioreagent, EE.UU.

Nestina

Filamento intermedio característico de progenitores neurales durante el desarrollo. En el adulto, puede re-expresarse en condiciones de daño del SNC.

Pollo 1:150 *

Neuromics, EE.UU.

NeuN Proteína nuclear específica de neuronas. Ratón, monoclonal

IgG 1:200

Millipore, EE.UU.

pNF-H (SMI-310)

Cadena pesada de neurofilamento extensivamente fosforilado (axones maduros).

Ratón, monoclonal 1:1000 Abcam, EE.UU.

NG2

Proteoglicano condroitín sulfato - 4 (polidendrocitos, entre las que se encuentran células precursoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos premielinizantes).

Conejo 1:200 *

O1 (GalC) Marcador de oligodendrocitos – 1 o Galactocererebrósido (oligodendrocitos mielinizantes).

Ratón, policlonal IgM

1:50 *

VgluT2 Transportador vesicular de glutamato - 2 característico de terminales axónicas de CGRs.

Cobayo, policlonal 1:4000 Millipore, EE.UU.

Materiales y Métodos

60

Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:

Anticuerpo 2rio Especie Dilución Empresa Conjugado

Anti-cabra Burro 1:500 Life Technologies, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-cobayo Cabra 1/500 Life Technologies, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-conejo Burro 1:500 Abcam, EE.UU. Alexa Fluor 488

Anti-conejo Burro 1:500 Abcam, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-conejo Cabra 1:500 Life Technologies, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-conejo Cabra 1:500 Molecular Probes, EE.UU. Alexa Fluor 488

Anti-pollo Cabra 1:100 * Alexa Fluor 488

Anti-pollo Cabra 1:200 * Conjugado-Cy3

Anti-ratón Burro 1:500 Abcam, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-ratón Burro 1:500 Abcam, EE.UU. Alexa Fluor 488

Anti-ratón Cabra 1:500 Molecular Probes, EE.UU. Alexa Fluor 568

Anti-ratón Cabra 1:500 Life Technologies, EE.UU. Alexa Fluor 488

Anti-ratón Burro 1:100 Jackson, EE.UU. Alexa Fluor 647-9

* Los anticuerpos anti-MBP, anti-nestina, anti-NG2, anti-O1 y anti-pollo fueron generosamente donados

por la Dra. Laura A. Pasquini del Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB),

Departamento de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA/CONICET, Argentina.

Las secciones incluidas en parafina se trataron con xilol, serie decreciente de alcohol

(rehidratación) y PBS. Las secciones obtenidas en crióstato se lavaron varias veces con PBS para

quitar el remanente de glicerol. Para secciones montadas en portaobjetos, excepto

especificaciones del anticuerpo, se realizó una recuperación antigénica en 50 ml de buffer citrato

(pH 6,3) a 80ºC durante 40 min. Para los cortes flotantes de cerebro, la recuperación antigénica

se realizó en tubos eppendorf con 1 ml de buffer citrato a 80ºC por 20 min en un bloque seco con

agitación (300 rpm). En ambos casos, la recuperación fue seguida de una permeabilización con

0,1% Tritón X-100 en PBS por 20 minutos. Las secciones se incubaron con suero de caballo

normal al 2% por 60 min para disminuir la unión inespecífica. Para cada tratamiento se

realizaron controles negativos sin el agregado del anticuerpo primario.

8.1. Inmunoflourescencia. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante toda

la noche a 4˚C. Luego de varios lavados, se agregaron los anticuerpos secundarios por β h a

temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se marcaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol

Materiales y Métodos

61

(DAPI, 0,5 g/ml en solución fisiológica) o Hoechst 33342 (5 g/ml en solución fisiológica) por

10 min y se montaron con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield; Vector

Laboratories, EE.UU.). Se utilizó un microscopio de fluorescencia BX50 (Olympus, EE.UU.)

conectado a una cámara para microscopía 3CCD (Sony, EE.UU.). Las imágenes se obtuvieron

con el software ImagePro Plus (Media Cybernetics, EE.UU.).

8.2. Inmunohistoquímica y detección con isolectina Griffonia simplicifolia I (GSA). Se

realizó el bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS durante

20 min. Luego de varios lavados con PBS, las secciones se incubaron con los anticuerpos

primarios durante toda la noche (excepto con el anticuerpo anti-melanopsina (48 h)) a 4˚C. Para

la detección de células microgliales, las secciones se incubaron por 48 h a 4°C con la isolectina

GSA (Isolectina B4, 1:200; Vector laboratorios, EE.UU.) acoplada a biotina. La

inmunorreactividad se reveló utilizando el complejo biotina-estreptavidina-peroxidasa del kit

LSAB2 System-HRP (Dako, EE.UU.). La reacción de diaminobenzidina se acentuó

posteriormente con un tratamiento con cloruro de cobalto al 0,5% por 15 minutos. Los cortes se

observaron y analizaron con un microscopio Eclipse E400 (Nikon, EE.UU.) conectado a una

cámara Coolpix s10 (Nikon, EE.UU.).

8.2.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano. Los animales se perfundieron como ya

se describió; se disecaron cuidadosamente los ojos y se post-fijaron en la misma solución por 30

min a 4°C. Se aislaron cuidadosamente las retinas y se realizaron marcas en los cuatro

cuadrantes, que permitieron su posterior orientación. Se realizó la inmunomarcación con

anticuerpos primarios como ya se mencionó, en retinas flotantes previa permeabilización con

Tritón X-100 en PBS por 30 min. Finalmente, se montaron en portaobjetos cargados (con la capa

de fibras del NO hacia arriba).

Materiales y Métodos

62

9. Coloración de lípidos por Red Oil

Se utilizaron cortes coronales del CS obtenidos en crióstato (40m de espesor) montados

en portaobjetos cargados. Los cortes se hidrataron con soluciones decrecientes de etanol (96º y

70º, 2 min cada uno) y con agua destilada (30 s). Se preparó una solución de Red Oil al 0,5 %

(m/v, Santa Cruz, EE.UU.) en isopropanol con una semana de anticipación para que decanten los

cristales y se utilizó el sobrenadante. Los cortes se incubaron en solución de Red Oil durante 15

min, y se lavó el exceso de colorante con agua destilada. Los cortes se montaron con medio de

montaje gelvatol.

10. Procesamiento de imágenes y cuantificación

Todas las imágenes obtenidas se ensamblaron y procesaron con Photoshop CS4 (Adobe

Systems, EE.UU.). Sólo se realizaron ajustes de brillo y contraste. Para todas las evaluaciones

morfométricas, las imágenes capturadas en formato TIFF se analizaron con el software ImageJ

(NIH, EE.UU.). Toda la nomenclatura usada corresponde al atlas de Paxinos y Watson (1997).

Para todos los estudios de inmunofluorescencia, se obtuvieron imágenes digitales en formato

TIFF grabadas con igual tiempo de exposición, brillo y contraste.

10.1. Análisis de la retina

10.1.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina. Se obtuvieron

microfotografías a una distancia aproximada de 1 mm del NO (región dorsal y ventral) con un

aumento final de 400x. Se determinó el espesor total de la retina y de cada una de sus capas y se

cuantificó el número de células presentes en la CCG (conteo lineal). Los resultados se

expresaron como número de células en 100 m, 200 m o a lo largo de toda la sección, en

secciones coloreadas con hematoxilina-eosina, y cada 100 m para la detección fluorescente de

células Brn3a(+) o TUNEL(+), respectivamente. Para cada ojo se promediaron los resultados

obtenidos de 4 cortes y la media de 5 ojos por grupo se consideró el valor representativo para

cada grupo.

Materiales y Métodos

63

10.1.2. Cuantificación de células ganglionares en retinas en montaje plano. Se calculó el área

total de la retina en montaje plano y se dividió en 4 cuadrantes. Se tomaron microfotografías de

5 sectores por cuadrante con una magnificación final de 200x. Las imágenes (área

correspondiente a 0,1 mm2) de 5 sectores por cuadrante se convirtieron a escala de grises de 8-

bits y se cuantificó el número de células Brn3a(+) como se muestra en la Figura 18, que se

expresó como número de células por área. Los resultados de 20 sectores por retina se

promediaron y la media de 5 retinas se consideró representativa para cada grupo. El resultado

final se expresó como el número de células en un área de 2 mm2.

Figura 18. Cuantificación del número de CGR con el programa ImageJ. Se calculó el área retiniana total,

se dividió a la retina en 4 cuadrantes y se escogieron 5 sectores por cuadrante (Panel A). Se obtuvieron

microfotografías, se convirtieron a escala de grises (Panel B) y, finalmente a modo binario para

cuantificar el número de células por sector (Panel C).

10.1.3. Cuantificación de CGRs melanopsina(+) (CGRsm). Se obtuvieron microfotografías de

las retinas en montaje plano a bajo aumento (40x) y se reconstruyeron en su totalidad. Se

marcaron manualmente las CGRsm y se construyó una máscara de cuantificación que se procesó

con el software ImageJ para cuantificar el número total de células por retina, como se muestra en

la Figura 19. El resultado obtenido para 5 retinas se promedió y la media se consideró

representativa para cada grupo.

Materiales y Métodos

64

Figura 19. Cuantificación del número de CGRsm con el programa ImageJ. Panel A: Se muestra la

reconstrucción de la retina en montaje plano. Panel B: Se muestra la máscara de cuantificación en la que

se delimitaron los bordes de la retina y se marcaron manualmente las células melanopsina(+). Panel C: Se

muestra la cuantificación del número total de CGRsm con el software ImageJ.

10.2. Análisis del nervio óptico.

10.2.1. Determinación del número y área axonal. En secciones transversales semifinas se

calculó el área total del NO a partir de microfotografías obtenidas con un aumento de 200x. Se

tomaron microfotografías (área de 0,01 mm2) con una magnificación de 1000x. El área total de

cuantificación para cada muestra fue de 0,05 mm2, que representó el 25% del área total del NO.

Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor umbral a todas las

imágenes, determinado inicialmente por examinación visual y finalmente se convirtieron a modo

binario. Las fibras mielínicas se delimitaron digitalmente por el margen interno de la vaina de

mielina. Se cuantificó el número y el área de axones por imagen (Figura 20). Para cada NO se

promediaron los resultados obtenidos de 5 secciones y la media obtenida de 5 nervios se

consideró el valor representativo para cada grupo. Por otra parte, se realizaron histogramas de

distribución de tamaño de fibras, utilizando el complemento de Análisis de Datos del programa

Excel (Microsoft Office 2010, EE.UU.).

Materiales y Métodos

65

Figura 20. Cuantificación del número y área de axones mielínicos con el programa ImageJ. Panel A: Se

muestra una microfotografía representativa de la porción proximal del NO en corte transversal de un

animal control. Panel B: Se muestra la misma imagen que en (A) luego de aplicar un valor umbral de

corte en la escala de grises y de convertirla a modo binario, donde al área axonal quedó delimitada por el

borde interior de la vaina de mielina. Panel C: Se muestra la cuantificación de los axones (número total y

área individual) limitando el rango de tamaño, para excluir procesos gliales y vasos sanguíneos.

10.2.2. Distribución de frecuencias del número de líneas intraperiódicas. Por microscopía

electrónica de transmisión (MET) se tomaron microfotografías con una magnificación de 50.000x

de secciones ultrafinas del NO proximal. Se tomaron un total de 10 imágenes en las que se

cuantificaron las líneas intraperiódicas (Li) de las vainas de mielina de axones de distinto calibre.

Se cuantificaron manualmente las Li de aproximadamente 100 axones por NO. Sólo se tuvieron

en cuenta a aquellos axones en apariencia normal o levemente degenerados. Los axones

degenerados sin axoplasma o con mielina completamente descompactada fueron excluidos.

Mediante el complemento de Análisis de Datos del programa Excel se obtuvo la frecuencia de

axones para cada rango de clase, distribuidos en rangos de cada tres líneas intraperiódicas.

10.3. Determinación del área inmunorreactiva en la retina y el NO. En cortes transversales de

retina inmunomarcados contra los antígenos Iba-1 y ED1 y en cortes transversales de NOs

inmunomarcados contra Iba-1, ED1, GFAP y pNF-H se tomaron microfotografías con un

aumento final de 400x y 200x, respectivamente. Las imágenes se reconstruyeron por Photoshop

y de cada una se obtuvieron 4 secciones de 200 x 200 m2 para las retinas o de 100 x 100 m2

para los NOs. Con el programa ImageJ se determinó manualmente un umbral en colores (RGB),

Materiales y Métodos

66

que se aplicó a todas las imágenes, y se cuantificó el número y área inmunorreactiva para cada

antígeno/sección. Para cada retina se promediaron los resultados obtenidos de 3 cortes (4

secciones/corte) consecutivos y la media obtenida de 4 - 5 retinas o nervios se consideró el valor

representativo para cada grupo.

10.4. Análisis del colículo superior

10.4.1. Cuantificación del área inmunomarcada por GFAP y VgluT-2. Para cada sección, se

delimitó y se calculó el área correspondiente a la región total marcada. Luego se convirtieron las

imágenes digitales a escala de grises de 8-bits y se calculó la densidad óptica para la marca de

GFAP (Cy3) o VgluT-2 (Alexa Fluor 568), que se relativizó al área total (Figura 21). En el caso

de GFAP, debido a la presencia de astrocitos perivasculares, el área relativizada se normalizó al

lado contralateral, que recibió aferencias de un ojo intacto o inyectado con vehículo, según el

caso. Se analizaron 5 animales por grupo.

Figura 21. Determinación del área fluorescente. Panel A: Se muestra una microfotografía representativa

de una sección coronal del CS de un animal control donde se observa la marca inmunofluorescente (CTB

en este ejemplo) en las capas superficiales. Panel B: Se muestra la delimitación del área total retino-

receptiva a la que se relativizó la densidad óptica del panel A.

10.4.2. Cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 y el número de células Iba-1(+).

Se tomaron dos fotografías (400x) de los sectores mediales, medio-laterales y laterales del CS,

como se muestra en la Figura 22A. Se convirtieron las imágenes digitales a escala de grises de 8-

bits, se aplicó un valor umbral a todas las imágenes y finalmente se convirtieron a modo binario.

Se limitó el área celular entre 500-1600 px2 y se analizó el número de células Iba-1(+), la

Materiales y Métodos

67

intensidad de marca de Iba-1/célula y el % del área inmunorreactiva en 98574 m2 (Figura 22).

Se analizaron dos secciones por animal y 6 animales por grupo. Para cada uno de los parámetros,

se promediaron los valores obtenidos en cada sector, obteniéndose un valor final para cada grupo

experimental.

Figura 22. Análisis de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS. Panel A: Se muestra una

microfotografía representativa de la marca para Iba-1 y la delimitación de los sectores analizados. Panel

B: Se muestra un detalle a 400X de uno de los sectores y las células Iba-1(+). Panel C: Se muestra la

misma imagen del panel B convertida en escala de grises y binarizada, sobre la que se determinó el

número de células Iba1(+), la inmunorreactividad por célula y el % del área inmunorreactiva con el

programa Image J.

10.4.3. Cuantificación de la marca de Red Oil, O1 y pNF-H. Se tomaron fotografías a 100x y

se reconstruyó el CS manualmente con el programa Photoshop. Se seleccionaron sectores de

0,04 mm2 de las capas Stratum Opticum (SO) y Stratum Griseum Intermediale (SGI) en la

porción medial, medio-lateral y lateral del CS y se guardaron las imágenes en formato TIFF.

Con el programa ImageJ se determinó manualmente un umbral en RGB, que se aplicó a todas las

imágenes, que se analizaron como se explicó anteriormente. Se utilizó la fracción de área

marcada, en porcentaje del área total, para expresar el área inmunopositiva para O1, pNF-H o el

contenido de lípidos marcado con Red Oil en 0,04 mm2. El procedimiento descripto se repitió en

dos cortes coronales de CS por animal y se promediaron los datos de 6 u 8 animales por grupo.

10.4.4. Análisis por microscopía confocal. Las muestras se procesaron como se describió en el

punto 8.1. Se utilizó un microscopio confocal Eclipse E800 (Nikon, EE.UU.).

Lateral

Lateral

Medial

Materiales y Métodos

68

10.4.4a. Cuantificación del número de células NeuN(+). Se obtuvieron imágenes confocales

con un aumento final de 400x de la porción medial y lateral del CS. Se obtuvieron 10 planos

focales de 1 m de espesor y con el programa IMARIS® 6.2.1 (Bitplane) se realizó una

reconstrucción tridimensional en dos planos (z-stacks) de las imágenes. A continuación, con el

programa ImageJ se convirtieron las imágenes a escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor

umbral a todas las imágenes y finalmente se convirtieron a modo binario. Se realizó un análisis

preliminar de las células NeuN(+) y se analizó su distribución. En función de estos resultados, se

determinó el límite inferior y superior para el tamaño del soma neuronal, de modo de excluir a

neuritas aisladas o somas yuxtapuestos, respectivamente. Se realizó el recuento de células

NeuN(+) y de observarse somas yuxtapuestos (> a 125 m2), el valor se corrigió manualmente.

El procedimiento descripto se repitió en dos cortes coronales de CS por animal y los datos de 5

animales por grupo se promediaron.

10.4.4b. Análisis de la complejidad celular por IMARIS. Se realizó un análisis detallado de la

morfología microglial, astroglial y de polidendrocitos (células NG2(+)) en el CS medial y

lateral, a partir de cortes inmunomarcados para Iba-1, GFAP o NG2, respectivamente. Para ello,

se realizó una reconstrucción tridimensional a partir de un barrido de imágenes confocales de 0,5

m de espesor con un paso óptico de 95 m, con el fin de incluir las prolongaciones

características de la glía. La adquisición de cada una de estas imágenes llevó aproximadamente

20 min, por lo que se obtuvo únicamente una imagen de cada sector por animal. Con la opción

surpass del programa IMARIS, previo ajuste manual de los puntos iniciales y finales de los

filamentos, se realizó un análisis automático (calidad del 75%) de largo, área y volumen, así

como del número de puntos de ramificación, cantidad de filamentos y puntos terminales de los

procesos gliales. El programa arrojó un archivo en formato Excel con la cuantificación de todos

los parámetros, que se utilizó para el análisis estadístico. Cada imagen se analizó por triplicado

para reducir el error de la cuantificación y verificar la reproducibilidad de las determinaciones.

Materiales y Métodos

69

Por otro lado, se tomaron imágenes de los filamentos reconstruidos a partir de la señal

inmunofluorescente y se superpusieron con éstas para corroborar el análisis, como se observa en

la Figura 23. Se analizaron 6 animales por grupo.

Figura 23. Análisis de la complejidad glial. La microscopía confocal, que suprime luz fuera de foco,

permitió obtener imágenes más nítidas que la microscopía de fluorescencia convencional y reconstruir la

morfología compleja de células microgliales, astrocitos y polidendrocitos (Panel A). El análisis

cuantitativo se realizó con el programa IMARIS que reconstruyó los filamentos (Panel B), a partir de la

fluorescencia de las imágenes. En el Panel C, se muestra la superposición de (A) y (B).

11. Transporte de la subunidad de la toxina colérica (CTB)

11.1. Inyección intravítrea de CTB. Los animales se anestesiaron y se administró una gota de

proparacaína en cada ojo, como anestésico local. La inyección intravítrea se realizó utilizando

una jeringa Hamilton de 10 l con una aguja 30G, bajo un microscopio binocular de cirugía con

luz coaxial. Con la ayuda de una pinza fina se sujetó el ojo y se introdujo la aguja a ~ 1 mm del

limbo esclerocorneal, a través de la pars plana, en un ángulo tal que evitara lesionar el cristalino.

Se descargó lentamente el contenido de la solución y se dejó la aguja por 30 s a fin de evitar la

pérdida de líquido de la cámara vítrea. Una vez completado el procedimiento, se realizó la

inyección intravítrea en el ojo contralateral. Se inyectaron 4 l de una solución 0,1% (en

solución fisiológica) de CTB conjugada con el flouróforo Alexa 488 ó Alexa 594 (Molecular

Probes, EE.UU.). Luego de la inyección, se evaluó la PIO a distintos intervalos y se observó que

en ningún caso este procedimiento provocó aumento de este parámetro (datos no mostrados). Se

Materiales y Métodos

70

excluyeron los animales que desarrollaron cataratas o sangrado intraocular como resultado de la

inyección intravítrea.

11.2. Análisis del transporte de CTB. Luego de 3 días de la inyección de CTB, los animales se

perfundieron, se disecaron cuidadosamente los cerebros y se post-fijaron durante toda la noche.

Se realizaron cortes coronales seriados por congelación como se especificó en el punto 5.3. Los

cortes se colorearon con DAPI y luego de varios lavados se montaron con medio de montaje

para fluorescencia. Se tomaron imágenes de los NSQ, el NGL, el NPO y el CS y se

compaginaron para obtener una reconstrucción completa en el plano rostro-caudal. De estas

últimas, a excepción del CS, sólo se utilizaron las imágenes en las que las estructuras

presentaron su mayor extensión. Además, se fotografiaron las retinas y NOs de los ojos

inyectados con CTB para corroborar la captación de la toxina por las CGRs y analizar el

transporte en cortes longitudinales del NO proximal, respectivamente. La marca de CTB del NO

se determinó con el programa ImageJ en un rectángulo de 50 m de espesor y 2 mm de longitud

desde la retina. Los valores se relativizaron al máximo de marca de CTB de NOs control.

12. Western blot

Los animales se sacrificaron y se extrajeron las retinas. Cada retina se homogeneizó en

100 l de buffer 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 10 mM de KCl, 0,5% de

Tritón (v/v) pH 7,9, con el agregado de un cóctel de inhibidores de proteasas y fosfatasas

(Sigma, EE.UU.). Luego de 15 min a 4°C, los homogenatos se agitaron por 15 s y se

centrifugaron a 3.000 g por 10 min. Los sobrenadantes se utilizaron para la determinación de la

concentración de proteínas. Las proteínas (100 µg/muestra) se separaron por SDS-PAGE en un

gel de poliacrilamida al 10 - 15 %. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a

membranas de difluoruro de polivinilideno durante 60 min a 15 V en un sistema Bio-Rad Trans-

Blot SD (Bio-Rad Laboratories, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en

polvo descremada en buffer Tris (pH 7,4), conteniendo 0,1% de Tween-20 durante 60 min a

Materiales y Métodos

71

temperatura ambiente. Las membranas se incubaron a 4C con los siguientes anticuerpos

primarios: anticuerpo policlonal de conejo anti-melanopsina (1:1000, Affinity Bioreagent,

EE.UU.) por 48 h, anticuerpo policlonal de cabra anti-Brn3a (1:200, Santa Cruz Biotechnology,

EE.UU.) por 48 h y anticuerpo policlonal de conejo anti-MBP (1:5000) por 24 h. Las

membranas se lavaron con buffer Tris (pH 7,4) conteniendo 0,1% de Tween-20 y se incubaron

durante 2 h con un anticuerpo secundario anti-conejo (1:2000, Bio-Rad) o anti-cabra (1:2000;

Bio-Rad) acoplado a peroxidasa. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (Western

Blotting Analysis System; Amersham Biosciences, Argentina) y se determinaron los niveles de

-actina (anticuerpo policlonal de conejo anti- -actina, 1:2000, Sigma, EE.UU.) como control

interno de carga. Las membranas se escanearon y la intensidad de las bandas se determinó

utilizando el programa ImageJ. Los valores se expresaron como unidades arbitrarias respecto a

los niveles de -actina.

La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y col. (1951),

utilizando albúmina bovina como estándar.

13. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los resultados se utilizaron el test de Student para la

comparación entre dos grupos experimentales, o el análisis de varianza a dos vías (ANOVA),

seguido de los tests de Tukey o de Dunnett, para comparaciones múltiples.

Resultados

72

RESULTADOS

Sobre el conjunto de antecedentes mencionados en la Introducción, el objetivo central de

este trabajo de Tesis fue analizar las consecuencias del glaucoma sobre el sistema visual

consciente, incluyendo la retina, el nervio óptico (NO) y las áreas de proyección retiniana, así

como sobre el sistema visual no formador de imagen. En este contexto, se realizaron estudios en

un modelo de glaucoma agudo y un modelo de glaucoma crónico. Se describen a continuación

los resultados obtenidos.

1. Modelo experimental de glaucoma agudo

1.1. Sistema visual formador de imagen

En la Figura 24 se muestran los resultados obtenidos en el registro de ERGs escotópicos

en ojos sometidos a un aumento agudo de la presión intraocular (PIO) a 70 mm de Hg por 90

min (glaucoma agudo) y ojos contralaterales sometidos a un procedimiento simulado (sham). En

la misma Figura se muestran registros representativos de los grupos experimentales. Luego de 7

días de la hipertensión ocular aguda (HOA), se observó una caída significativa en la amplitud de

las ondas a y b del ERG, así como de los POs.

Figura 24. Función electrorretinográfica a los 7 días post-HOA o tratamiento simulado (sham). Panel A:

Se muestran las amplitudes de las ondas a y b del ERG, así como de los POs. La HOA provocó una

disminución significativa de todos los parámetros evaluados. Se representan las medias ± EE de 5

Resultados

73

animales/grupo, **p < 0,01 vs. ojos con tratamiento simulado, test de Student. Panel B: Se muestran

registros electrorretinográficos representativos.

La disfunción visual no progresó significativamente en períodos posteriores (datos no

mostrados). El aumento agudo de la PIO indujo cambios evidentes en la estructura retiniana,

como se muestra en la Figura 25. A los 7 días post-HOA, se observó una reducción significativa

en el espesor total de la retina y de las CPI, CPE, CNE y SE de fotorreceptores, así como una

caída significativa en el número de células en la CCG (Tabla 1).

Figura 25. Efecto de la HOA sobre la histología retiniana. En el panel izquierdo se muestran imágenes

representativas de retinas en sección transversal de ojos con tratamiento simulado o sometidos a HOA. A

la derecha se muestra una magnificación del sector recuadrado en el panel izquierdo. La HOA indujo una

marcada alteración de la morfología retiniana, que incluyó una reducción del espesor total de la retina, de

la CNE y de los SE de los fotorreceptores, así como en el número de células en la CCG. Hematoxilina-

eosina.

Resultados

74

7 días post-tratamiento sham HOA Nº de células en la CCG 460,2 9,2 265,4 8,5**

Espesor total (µm) 165,6 7,9 85,4 17,5**

Espesor de la CPI (µm) 37,0 3,4 24,5 4,1*

Espesor de la CNI (µm) 23,5 0,8 18,0 2,9

Espesor de la CPE (µm) 9,0 0,6 3,0 1,0**

Espesor de la CNE (µm) 42,1 0,7 12,3 5,1**

Espesor de los SE (µm) 29,6 1,5 7,7 3,0**

Tabla 1. Análisis morfométrico retiniano a los 7 días post-tratamiento. Se representan las medias EE (5

retinas/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. grupo con tratamiento simulado (sham), test de Student. CCG:

Capa de células ganglionares; CPI: capa plexiforme interna; CNI: capa nuclear interna; CPE: capa

plexiforme externa; CNE: capa nuclear externa; SE: segmento externo de los fotorreceptores.

A continuación, se analizó el número de CGRs a través de la inmunorreactividad para

Brn3a (un marcador específico de este tipo celular) en retinas de ojos sometidos a un

procedimiento simulado o a HOA. La HOA indujo una disminución en el número de células

Brn3a(+), como se muestran en la Figura 26. Luego de 2 semanas de la HOA, se observó un

perfil similar y no se observaron diferencias en este parámetro entre ojos intactos y ojos

sometidos a un procedimiento simulado (datos no mostrados).

Figura 26. Efecto de la HOA sobre el número de CGRs. Se muestran imágenes representativas de la

inmunomarcación para Brn3a (rojo) y las capas nucleares de la retina coloreadas con DAPI (azul). Al

cabo de 7 días, la HOA provocó una disminución evidente en el número de células Brn3a(+), respecto al

grupo sometido al tratamiento simulado. Barra de escala: 20 m.

Resultados

75

Estos resultados fueron confirmados mediante el ensayo de TUNEL. Como se muestra en

la Figura 27, en la CCG de ojos sometidos a HOA, se observó un aumento significativo en el

número de células TUNEL(+).

Figura 27. Efecto de la HOA sobre la apoptosis de las CGRs a los 7 días post-tratamiento. En el panel

izquierdo se muestran imágenes representativas. En el panel derecho se muestra la cuantificación del

número de células TUNEL(+) (verde). La HOA indujo un aumento significativo de este parámetro. Se

muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student.

A continuación, se determinó el estado funcional de los axones de las CGRs a través de la

evaluación del transporte anterógrado de la subunidad de la toxina colérica (CTB) desde la

retina hacia su principal blanco sináptico en la vía visual consciente en la rata, el colículo

superior (CS). A los 7 días, la HOA indujo una marcada reducción en la marca de CTB en el área

retinorreceptiva del CS contralateral, en comparación con el CS contralateral a ojos con

tratamiento simulado (Figura 28). No se observaron diferencias en el transporte de CTB al CS

con aferencias de ojos con tratamiento simulado, respecto de ojos intactos.

Resultados

76

Figura 28. Efecto de la HOA sobre el transporte anterógrado de CTB al CS a los 7 días post-tratamiento.

Se muestra la reconstrucción en sentido rostro-caudal del CS a partir de secciones coronales de cerebro. A

la izquierda se muestra el transporte de CTB de un animal que recibió tratamiento simulado (sham)

unilateral y a la derecha el transporte de CTB de un animal con tratamiento simulado en un ojo e HOA en

el ojo contralateral. La HOA indujo una marcada reducción del transporte anterógrado respecto del

tratamiento simulado. El tratamiento simulado no tuvo efecto per se sobre este parámetro. Barra de

escala: 3 mm.

En la siguiente serie de experimentos, se examinó el estado de la microglía y macroglía

en el CS a los 7 días y 4 semanas post-HOA. Como se muestra en la Figura 29, a los 7 días se

observó una marcada reactividad microglial (evaluada por la inmunorreactividad para Iba-1).

Estas alteraciones se mantuvieron sin cambios luego de 4 semanas post-HOA.

Resultados

77

Figura 29. Estudio de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS a los 7 días y 4 semanas post-

tratamiento. En ambos períodos se observó una respuesta microglial manifiesta en el CS contrateral al ojo

sometido a HOA.

Asimismo, se observó un aumento en la inmunorreactividad para GFAP en el CS a los 7

días, que fue más marcada luego de 4 semanas post-HOA (Figura 30).

Figura 30. Análisis de la inmunorreactividad para GFAP en el CS. A los 7 días post-HOA, se observó

una moderada respuesta astroglial en las capas superficiales y en la SGI del CS contrateral al ojo

sometido a HOA. Estas alteraciones fueron más marcadas luego de 4 semanas post-HOA.

En conjunto, estos resultados indican que la HOA provocó una alteración funcional

retiniana, junto con cambios estructurales marcados que incluyeron una reducción significativa

en el número de CGRs, así como alteraciones en el transporte anterógrado al CS y en la

Resultados

78

estructura glial del área retinoceptiva y adyacente intermedia del CS. Al menos en la ventana

temporal analizada (7 días post-HOA), este conjunto de alteraciones ocurrieron en forma

simultánea. Por lo tanto, a través de este modelo no fue posible disecar el curso temporal de las

alteraciones visuales a nivel de la retina, el NO y del CS. Sin embargo, se consideró de interés

examinar la vulnerabilidad de las CGRs melanopsina(+) (CGRsm) en particular y del sistema

visual no formador de imagen en general, en este modelo experimental. Los resultados obtenidos

se describen a continuación.

1.2. Sistema visual no formador de imagen

Con el fin de analizar el efecto del glaucoma agudo sobre el sistema visual no formador

de imagen, se seleccionó un período de 4 semanas post-HOA, de manera de maximizar los

cambios en el sistema visual y evaluar las posibles consecuencias sobre este sistema en

particular. Como se muestra en la Figura 31, a las 4 semanas post-HOA se confirmó una

alteración electrorretinográfica altamente significativa en cuanto a la amplitud de la onda a, la

onda b y los POs. En la misma Figura se muestran registros representativos de los grupos

experimentales.

Figura 31. Estudio funcional a las 4 semanas post-HOA o tratamiento simulado. Panel A: Se muestran

las medias ± EE de las amplitudes de las ondas a, b y de los POs del ERG escotópico (5 animales/grupo),

Resultados

79

La HOA indujo una caída significativa en todos los parámetros analizados a las 4 semanas post-

tratamiento. **p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student. Panel B: Se muestran registros representativos

para cada grupo experimental.

En este mismo período, la estructura retiniana se encontró marcadamente alterada, con

cambios en las distintas capas retinianas y en el número de células en la CCG (Figura 32).

Figura 32. Estudio de la histología retiniana a las 4 semanas post-HOA o tratamiento simulado. En el

panel superior se muestran imágenes representativas de retinas de ambos grupos experimentales en

sección transversal (hematoxilina-eosina). Barras de escala: 100 y 50 m (detalles). En el panel inferior

se muestra el espesor total de la retina y el número de células en la CCG. La HOA indujo una marcada

desorganización de la estructura retiniana y una reducción significativa del espesor total y del número de

células en la CCG, con respecto del grupo sham. Se muestran las medias ± EE (5 retinas / grupo), ** p <

0,01 vs. grupo sham, test de Student.

Con el objeto de determinar el número total de CGRsm, el estudio inmunohistoquímico

para Brn3a y melanopsina se realizó en retinas en montaje plano, como se muestra en la Figura

33. Los resultados obtenidos indican que concomitantemente con una caída significativa en el

número de células Brn3a(+), el número de células melanopsina(+) no se modificó

significativamente.

Resultados

80

Figura 33. Estudio de la inmunorreactividad para Brn3a y melanopsina a las 4 semanas post-HOA o

tratamiento simulado. Panel A: Se muestran imágenes representativas de CGRsm en retinas en montaje

plano. Barra de escala: 1000 m. Panel B: a la izquierda se muestra un esquema de la retina y de los

cuadrantes analizados. A la derecha, se muestran imágenes representativas de la inmunorreactividad para

Brn3a (rojo) o melanopsina (verde) para ambos grupos experimentales. Barra de escala: 50m. Panel C:

Se muestra el área retiniana total y el número de células Brn3a(+) y melanopsina(+). Se observó una

disminución significativa del número de células Brn3a(+), en tanto que el número de células

melanopsina(+) permaneció inalterado. Se muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs.

grupo sham, test de Student.

Estos resultados se confirmaron por un análisis de Western blot (Figura 34), que indicó

una caída significativa en los niveles retinianos de Brn3a en retinas de ojos que fueron sometidos

a HOA, en tanto que los niveles retinianos de melanopsina no se modificaron significativamente.

Resultados

81

Figura 34. Determinación de los niveles proteicos de Brn3a y melanopsina retinianos a las 4 semanas

post-HOA o tratamiento simulado. Panel A: Se muestran geles representativos. Panel B: Se muestran los

niveles de Brn3a y melanopsina relativos a los niveles de -actina. La HOA indujo una reducción

significativa en los niveles de Brn3a, en tanto que los niveles de melanopsina no se modificaron. Se

muestran las medias ± EE (5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo con tratamiento simulado (sham), test

de Student.

Con el objeto de evaluar las proyecciones de la retina a áreas centrales del sistema visual

no formador de imagen, se examinó el transporte anterógrado de CTB a los NSQ y el NPO.

Como se muestra en la Figura 35, el transporte de CTB al NPO y los NSQ no se modificó en

forma evidente, en tanto que la marca de CTB disminuyó significativamente en el área

retinorreceptiva del CS y del NGL contralateral a ojos sometidos a HOA.

Figura 35. Efecto de la HOA sobre el transporte anterógrado a las 4 semanas post-tratamiento. En el

panel izquierdo se muestran imágenes representativas del CS, los NGL, NPO y NSQ de un animal que fue

inyectado con CTB-Alexa Fluor 488 (verde) en el ojo con tratamiento simulado y CTB-Alexa Fluor 568

Resultados

82

(roja) en el ojo con HOA. En el panel derecho se muestra un esquema de los núcleos analizados. La HOA

indujo una disminución en la marca de CTB en el CS y los NGL, pero no en los NPO y los NSQ.

Finalmente, se analizó el reflejo pupilar consensual en animales en los que un ojo fue

sometido a HOA o tratamiento simulado y el ojo contralateral permaneció intacto. Como se

muestra en la Figura 36, el reflejo pupilar consensual inducido por 120 lux disminuyó

significativamente en los animales sometidos a HOA, en tanto que cuando el estímulo luminoso

fue de 1200 lux, no se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales.

Figura 36. Efecto de la HOA sobre el reflejo pupilar consensual a las 4 semanas post-tratamiento. Panel

A: Se representa el porcentaje de contracción pupilar en respuesta a un estímulo luminoso de 120 ó 1200

lux. Se observó una reducción significativa en la contracción pupilar frente a un estímulo de 120 (pero no

de 1200) lux. Se muestran las medias ± EE (5 ojos/ grupo), ** p < 0,01 vs. grupo sham, test de Student.

Panel B: Se muestran fotos representativas de la contracción pupilar máxima para ambos grupos

experimentales.

2. Modelo experimental de glaucoma crónico.

2.1. Sistema visual formador de imagen

Como se mencionó en la Introducción, en trabajos previos de nuestro laboratorio

demostramos que la administración semanal de ácido hialurónico (AH) en la cámara anterior del

ojo reproduce aspectos centrales del glaucoma humano. Sin embargo, la utilización de este

modelo debió ser abandonada porque la empresa fabricante (Sigma®) interrumpió en forma

definitiva la producción de este tipo particular de AH (catálogo # H1751). No hemos logrado

Resultados

83

reproducir los resultados originales obtenidos con el tipo de AH con el que se realizaron

experimentos previos, que dieron origen a diversas publicaciones del laboratorio (Belforte y col.,

2007, 2010; Benozzi y col., 2002; Moreno y col., 2004, 2005a, 2005b, 2008;), incluso con

diferentes AH de ésta u otras empresas. Por lo tanto, resultó necesario desarrollar un modelo de

glaucoma experimental alternativo. Para ello, considerando los antecedentes mencionados en la

Introducción sobre la relevancia de los GAGs como barrera al pasaje de humor acuoso, así como

el hecho de que el condroitín sulfato (CSU) junto con el AH son los principales GAGs de la red

trabecular, se examinó el efecto de la administración intracameral de CSU sobre la PIO, la

función y la histología retiniana. Los resultados obtenidos se describen a continuación.

En una primera serie de experimentos, se inyectaron animales con diferentes

concentraciones de CSU en un ojo y vehículo en el ojo contralateral y se determinó la PIO en

ambos ojos de cada animal 24 h después de la inyección. En la Figura 37 se muestran los valores

de PIO de ojos inyectados con vehículo o CSU (10, 20 ó 40%). Se observó un aumento leve pero

no significativo de la PIO en los ojos inyectados con 10 ó 20% de CSU, en tanto que la

inyección con CSU al 40% indujo un aumento significativo de este parámetro.

Figura 37. Efecto de una única inyección intracameral de CSU sobre la PIO. Los ojos se inyectaron con

vehículo o CSU (10, 20 ó 40%), 24 h antes de la determinación de la PIO. Se observó un aumento

significativo de este parámetro en los ojos inyectados con 40 (pero no con 10 ó 20) % de CSU. Se

Resultados

84

representan las medias ± EE (n = 10 ojos / grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de

Dunnett.

Con el fin de analizar el curso temporal del efecto del CSU sobre la PIO, se realizó una

única inyección de CSU al 40% en un ojo y vehículo en el ojo contralateral y se determinó la

PIO en ambos ojos antes de la inyección (día 0) y diariamente a partir de 24 h post-inyección,

como se muestra en la Figura 38. La inyección de CSU indujo un aumento de casi al doble de la

PIO que duró 7 días, mientras que en el 8vo día post-inyección, la PIO en los ojos inyectados con

CSU alcanzó valores similares al control.

Figura 38. Determinaciones de la PIO en ojos tratados con una única inyección intracameral de vehículo

(círculos blancos) o CSU (círculos negros). El CSU aumentó significativamente la PIO hasta el día 7

post-inyección. Se representan las medias ± EE (n = 10 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con

vehículo en los mismos intervalos post-inyección, test de Student.

Con el objeto de inducir una hipertensión ocular persistente, los animales se inyectaron

una vez por semana con CSU (en un ojo) y vehículo (en el ojo contralateral). Se determinó

semanalmente la PIO en ambos ojos, antes de una nueva inyección, como se muestra en la

Figura 39. La PIO de los ojos tratados con CSU fue significativamente mayor que la de los ojos

inyectados con vehículo a lo largo de todo el estudio (15 semanas). No se observaron diferencias

significativas en la PIO de los ojos inyectados con vehículo entre los intervalos analizados, ni

entre ojos intactos o inyectados con vehículo (datos no mostrados).

Resultados

85

Figura 39. Efecto de la administración crónica de CSU sobre la PIO. Se realizaron inyecciones

semanales de vehículo (círculos blancos) o CSU (círculos negros), después de la determinación de la

PIO. El CSU indujo una hipertensión ocular persistente a lo largo de todo el estudio. Se representan las

medias ± EE (n = 15 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Student.

A continuación, se evaluó el efecto de la hipertensión ocular inducida por CSU sobre la

función de la retina y la vía visual. Para ello, se registraron ERGs escotópicos a las 3, 6, 10 y 15

semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En la Figura 40 se muestran las amplitudes de la

onda a, la onda b y los POs en ratas no inyectadas o inyectadas semanalmente con vehículo en un

ojo y CSU en el ojo contralateral. No se observaron diferencias significativas en estos

parámetros entre el grupo de animales con ojos intactos y el grupo tratado con vehículo. A las 3

semanas, la administración de CSU no indujo cambios significativos en ninguno de los

parámetros analizados (datos no mostrados), en tanto que a las 6 semanas de hipertensión ocular

crónica se observó una leve (pero significativa) reducción de la amplitud de la onda a, la onda b

y los POs. La disfunción retiniana fue más evidente luego de 10 semanas de hipertensión ocular

y continuó su progresión a las 15 semanas de tratamiento. Esta disminución fue

significativamente mayor a las 10 y 15 semanas de tratamiento con CSU, respecto del grupo

tratado durante 6 semanas.

Resultados

86

Figura 40. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el ERG escotópico. Se representa la amplitud

de la onda a, b y POs del ERG de animales con ojos intactos o inyectados semanalmente con CSU en un

ojo y vehículo en el ojo contralateral durante 6, 10 ó 15 semanas. El tratamiento con CSU indujo una

disminución significativa de los tres parámetros analizados en todos los intervalos. A las 10 y 15 semanas

de hipertensión ocular, el efecto del CSU sobre la amplitud de la onda a y los POs fue significativamente

mayor que a las 6. A las 15 semanas, la caída en la amplitud de la onda b fue significativamente mayor

que a las 6 y 10 semanas de tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 15 ojos/grupo), *

p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p < 0,01 vs. ojos con 6 semanas

de tratamiento con CSU y # p < 0,05 vs. ojos con 10 semanas de tratamiento con CSU, test de Tukey.

En la Figura 41 se muestran registros electrorretinográficos representativos de ojos

inyectados con CSU o vehículo durante 6, 10 ó 15 semanas. El tratamiento con CSU no afectó

significativamente las latencias de las ondas a y b y de los POs en ninguno de los intervalos

analizados (datos no mostrados).

Resultados

87

Figura 41. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el ERG escotópico. Se muestran registros

representativos de ojos de animales inyectados con vehículo (línea gris llena) o CSU (línea punteada)

durante 6, 10 ó 15 semanas.

Con el fin de evaluar la actividad de toda la vía visual (desde los fotorreceptores a la

corteza visual) se registraron potenciales visuales evocados (VEPs), a las 3, 6 y 15 semanas de

hipertensión ocular. Se observó una disminución significativa en las amplitudes de los

componentes P1-N2 y N2-P2 en los ojos inyectados con CSU durante 6 ó 15 semanas en

comparación con los ojos inyectados con vehículo (Figura 42). No se observaron cambios en los

VEPs a las 3 semanas de hipertensión ocular (datos no mostrados). Los VEPs en ojos intactos no

difirieron significativamente de los registrados en ojos inyectados con vehículo durante 3 (datos

no mostrados), 6 ó 15 semanas (Figura 42). No se observaron diferencias significativas en las

latencias de los componentes de los VEPs entre los grupos experimentales (datos no mostrados).

Resultados

88

Figura 42. Efecto de la hipertensión ocular sobre la amplitud de los VEPs. Panel A: A las 6 y 15 semanas

de tratamiento con CSU, las amplitudes promedio de los componentes P1-N2 y N2-P2 de los VEPs

disminuyeron significativamente. Se representan las medias ± EE (n = 8 animales/grupo), * p < 0,05 y **

p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Student. Panel B: Se muestran registros representativos

de todos los grupos experimentales: ojos intactos (control, línea negra), ojos inyectados con vehículo

(línea gris llena) o con CSU (línea punteada). En el registro control se señalan los componentes P1, P2 y

N2.

En la Figura 43 se muestran imágenes representativas de retinas en sección transversal de

un ojo tratado con vehículo o con CSU por 10 semanas. Aunque el espesor total de la retina y de

la CPI, la CNI y la CNE no difirió entre los grupos experimentales, se observó una disminución

significativa en el número de células en la CCG en los ojos inyectados con CSU durante 10

semanas (Figura 43, Tabla 2).

A B

Resultados

89

Figura 43. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la morfología retiniana. Se muestran secciones

transversales de retinas de un ojo inyectado con solución salina (A) y un ojo inyectado con CSU durante 10

semanas (B). Nótese la disminución del número de células en la CCG en el ojo inyectado con CSU, en tanto

que la estructura general de la retina fue similar en ambos grupos. Hematoxilina-eosina.

A las 3 ó 6 semanas de tratamiento con vehículo o CSU no se observaron alteraciones en

la morfología de la retina y a las 15 semanas los resultados fueron esencialmente similares a los

observados a las 10 semanas de tratamiento (datos no mostrados).

10 semanas de tratamiento vehículo CSU

Nº de células en la CCG/100 m 9,2 ± 0,5 5,9 ± 0,7** Espesor total (µm) 132,0 ± 7.0 129,0 ± 6,8 Espesor de la CPI (µm) 32,7 ± 4,6 31,6 ± 4,2 Espesor de la CNI (µm) 25 ± 2,8 23,3 ± 2,3 Espesor de la CNE (µm) 37,1 ± 3.0 35,5 ± 4,7

Tabla 2. Número de células en la CCG y espesor total de la retina y de sus capas. Se representan las

medias ± EE, ** p 0,01 (n = 5 retinas/grupo) vs. grupo inyectado con vehículo, test de Student.

Con el objeto de analizar el efecto de la hipertensión ocular crónica específicamente

sobre las CGRs, se evaluó la inmunorreactividad para Brn3a en cortes transversales de retina.

Como se muestra en la Figura 44, el número de células Brn3a(+) no se modificó

significativamente luego de 6 semanas de hipertensión ocular, en tanto que a las 10 semanas de

glaucoma experimental, se observó una reducción significativa en este parámetro, que fue

similar a la observada luego de 15 semanas de hipertensión ocular.

Resultados

90

Figura 44. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el número de células Brn3a(+). En el panel

izquierdo se muestran imágenes representativas de retinas de animales con 6, 10 ó 15 semanas de

tratamiento con vehículo o CSU y en el panel derecho, la cuantificación del número de células Brn3a(+).

Este parámetro disminuyó significativamente a las 10 y 15 (pero no a las 6) semanas de tratamiento con

CSU. Se representan las medias ± EE (n = 5 retinas/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo,

a: p < 0,01 y b: p < 0,05 vs. CSU durante 6 semanas, test de Tukey.

Por una limitación en la disponibilidad de animales, en los experimentos cuyos resultados

se describirán a continuación se evaluaron dos intervalos de hipertensión ocular crónica: una

etapa temprana, es decir a las 6 semanas de tratamiento (en forma previa a la caída en el número

de CGRs) y una etapa avanzada de glaucoma experimental, es decir a las 15 semanas de

tratamiento con CSU (a posteriori de la caída en este parámetro).

En la siguiente serie de experimentos, se examinó el transporte axonal anterógrado desde

la retina al CS y al NGL, a través de la inyección intravítrea de CTB. En una primera instancia,

se examinaron las retinas de ojos inyectados con CTB para corroborar la incorporación de la

toxina en las CGRs de los grupos experimentales. En ambos intervalos, se observó

cualitativamente que las CGRs mantuvieron la capacidad de captación de la toxina (Figura 45).

Resultados

91

Figura 45. Incorporación de CTB en las CGRs de animales inyectados con vehículo o CSU por 6 ó 15

semanas. En secciones transversales de retina se observó marca para CTB, particularmente en los cuerpos

y los axones de las CGRs (detalle). Barras de escala: 50 m.

Sin embargo, se observó una disminución en el transporte de CTB ya a las 6 semanas de

hipertensión ocular en la porción del NO proximal a la retina (Figura 46).

Figura 46. Transporte de CTB en animales inyectados con vehículo o CSU por 6 semanas. En el panel

izquierdo se muestran cortes longitudinales representativos de 4 NOs/grupo y en el derecho se representa

el % de marca de CTB en función de la distancia a la retina. En el NO de ojos inyectados con vehículo, se

observó acumulación de la toxina en la porción más cercana a la retina (0 - 400 m, región amielínica),

que decayó progresivamente al alcanzar la zona de transición (400 - 600 m) y la región mielinizada del

NO. En el NO de ojos inyectados con CSU por 6 semanas se observó un perfil de decaimiento similar de

CTB en función de la distancia a la retina, aunque la marca fue notablemente menor en toda su extensión.

En cuanto a los núcleos cerebrales, el transporte de CTB disminuyó en el CS contralateral

a ojos hipertensos ya a partir de las 6 semanas de tratamiento con CSU. A las 15 semanas de

tratamiento, se observó ausencia casi completa de marca de CTB en el CS, como se muestra en

Resultados

92

intacto

la Figura 47. Resultados similares se obtuvieron en cuanto al transporte de CTB al NGL, como

se muestra en la Figura 48.

Figura 47. Transporte anterógrado de CTB en animales con ojos intactos o inyectados semanalmente con

vehículo en un ojo y CSU en el ojo contralateral durante 6 ó 15 semanas. Microfotografías representativas

de 5 animales/grupo que muestran el patrón de transporte de CTB hacia las capas superficiales (SZ y

SGS) del CS en cortes coronales. En el CS contralateral al ojo inyectado con vehículo (Veh), no se

observaron signos de alteración con respecto a los controles no inyectados, en tanto que en el CS

contralateral a ojos inyectados con CSU, se observó una marcada reducción de las áreas marcadas con

CTB, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento. Nótese la representación del disco óptico en el

CS, indicada por las flechas blancas.

Resultados

93

Figura 48. Transporte anterógrado de CTB al NGL. Microfotografías representativas de 5

animales/grupo del patrón de transporte de CTB al intergeniculado (IG), NGL dorsal (NGLd) y ventral

(NGLv) en cortes coronales. En el NGL contralateral a ojos inyectados con CSU, se observó una marcada

reducción en la marca de CTB, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento.

A continuación se evaluó el estado de los terminales presinápticos de las CGRs, a través

de la inmunodetección de VgluT-2 en el CS. Este parámetro no se modificó en forma evidente ni

a las 6 ni a las 15 semanas de hipertensión ocular, como se muestran en la Figura 49.

Figura 49. Análisis de la inmunorreactividad para VgluT-2 en el CS de animales inyectados con vehículo

en un ojo y CSU en el ojo contralateral. En el panel izquierdo se muestran imágenes representativas de la

inmunorreactividad para VgluT-2. En el panel derecho se muestra la cuantificación del % de área

inmunopositiva para VgluT-2, que no difirió significativamente entre los grupos experimentales en

ninguno de los intervalos estudiados. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).

Resultados

94

2.1.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico

En la siguiente serie de experimentos se analizó la morfología y ultraestructura del NO de

ojos inyectados con vehículo o CSU. En cortes semifinos de NO proximal, se cuantificó el área

transversal y el número total de axones y se determinó la distribución del número de axones en

función del área axonal. El glaucoma experimental indujo una disminución moderada pero

significativa del número total de axones a las 6 semanas, que progresó a las 15 semanas de

hipertensión ocular, mientras que el área del NO disminuyó significativamente sólo a las 15

semanas (Figura 50).

Figura 50. Efecto del glaucoma experimental sobre el área transversal del NO y el número de axones a

las 6 ó 15 semanas de tratamiento. En el panel superior se muestran imágenes representativas de cortes

semifinos transversales de la porción proximal del NO (azul de toluidina). En el panel inferior se muestra

la cuantificación del área transversal del NO y del número de axones. El CSU indujo una reducción

significativa del número de axones tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento, en tanto que el

área del NO disminuyó significativamente sólo a las 15 semanas. Se representan las medias ± EE (n = 5

nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. NOs de

ojos inyectados con CSU por 6 semanas, test de Tukey.

Resultados

95

Con el fin de determinar la susceptibilidad diferencial a los efectos deletéreos del

glaucoma en términos del tamaño de los axones, se analizó la distribución de los axones en

función del área axonal (Figura 51). A las 6 semanas, sólo los axones de mayor área (> 1,5 m2)

fueron afectados significativamente por la hipertensión ocular crónica, en tanto que a las 15

semanas se redujo significativamente el número de axones de todos los rangos de área evaluados.

Figura 51. Distribución del número de axones en función del área axonal. A las 6 semanas de

hipertensión ocular, se redujo significativamente el número de axones grandes (entre 1,5 - 2,5 m2 y > 2,5

m2), en tanto que a las 15 semanas disminuyó significativamente el número de axones de todos los

tamaños analizados. Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs.

NOs de ojos inyectados con vehículo, test de Student.

En la Figura 52 se muestran microfotografías representativas de NOs de ojos control o

con 6 ó 15 semanas de hipertensión ocular. Los axones del NO de los ojos inyectados con

vehículo por 6 ó 15 semanas presentaron una forma uniforme (redondeada/oval) y un tamaño

variable, con niveles moderados de glía perivascular y del neuropilo. En el NO de los ojos

tratados con CSU durante 6 semanas, se observaron algunos axones degenerados (áreas densas

de mielina), axones con distensiones y distorsiones que se apartaron de la morfología

característica de axones normales, así como signos de gliosis, evidenciados por un aumento en la

distancia entre los haces de axones del nervio. A las 15 semanas de hipertensión ocular, los

Resultados

96

efectos fueron más marcados y se evidenciaron por una pérdida global de la uniformidad e

integridad axonal (menor número total de axones, mayor número de axones degenerados) y

claros signos de gliosis reactiva (Figura 52).

Figura 52. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la estructura del NO. Se muestran

microfotografías representativas de cortes transversales del NO proximal, luego de 6 ó 15 semanas de

tratamiento con CSU o vehículo (azul de toluidina). Nótese la distribución homogénea de los axones en

todo el campo, con contenido glial moderado, que se corresponde con un nervio sano. Luego de 6

semanas de hipertensión ocular, se observó una menor densidad de axones, algunas fibras en

degeneración y procesos gliales más numerosos y de mayor tamaño. A las 15 semanas, el efecto del

glaucoma fue más marcado, con evidentes signos de gliosis reactiva. En estos nervios, la mayoría de los

axones presentaron degeneración axonal, siendo escasos los axones con apariencia normal. Imágenes

representativas de 5 NOs/grupo. Barra de escala: 25 m.

A nivel ultraestructural, se observó que los NOs de ojos inyectados con vehículo por 6 ó

15 semanas presentaron una estructura conservada, en la que haces de axones se encontraron

delimitados por finos procesos astrocitarios de citoplasma electrón-lúcido. A mayor aumento, las

Resultados

97

vainas de mielina presentaron una apariencia normal, compacta y muy electrón-densas, rodeando

el axoplasma sin alteraciones evidentes, con fibras del citoesqueleto (microtúbulos y

neurofilamentos) y organelas (principalmente mitocondrias). A las 6 semanas de hipertensión

ocular, la arquitectura global del NO fue similar a la de los NOs de ojos inyectados con vehículo,

con fibras en apariencia normales a bajo aumento. A mayor magnificación, entre fibras normales

se encontraron algunos axones con mielina fragmentada, axones con áreas de mielina

distorsionada y vacuolizada, en las que las lamelas de las vainas se observaron descompactadas.

En baja proporción, se observaron axones completamente degenerados sin axoplasma, en los que

la mielina formó una masa electrón-densa y redondeada. A las 15 semanas de hipertensión

ocular, las alteraciones ultraestructurales fueron más marcadas: el NO presentó una estructura

desorganizada, gruesos procesos astrocitarios intercalados entre los haces de fibras nerviosas con

distinto grado de degeneración y fue frecuente distinguir células microgliales en las

proximidades de axones degenerados. Las células microgliales se reconocieron por poseer

núcleos con forma arriñonada o con una leve escotadura, heterocromatina perinuclear y

citoplasma moderadamente electrón-denso, con vacuolas, lisosomas y áreas de debris, y se

distinguieron de los oligodendrocitos, con núcleos de forma circular u ovoide de gran tamaño

con escaso citoplasma perinuclear levemente electrón-denso, y de los astrocitos, con núcleos

ovoides eucromáticos (Figura 53 y 54). En este estadío, prevalecieron las fibras con mielina

descompactada y axones con degeneración densa de dos tipos: acúmulos de mielina condensada

(como se observó a las 6 semanas) y otros en los que el axoplasma aparentemente fue

reemplazado por un material granular indefinido y electrón-denso. En menor proporción, se

identificaron axones con mielina fragmentada con exposición del axoplasma al medio

extracelular y axones con degeneración laxa (watery degeneration), en el que el contenido

axoplásmico (citoesqueleto y organelas) fue reemplazado por un material amorfo y en apariencia

laxo y claro.

Resultados

98

Figura 53. Análisis ultraestructural del NO proximal. Se muestras imágenes representativas a distintos

aumentos de los NOs de ojos inyectados con vehículo o CSU durante 6 ó 15 semanas. A las 6 semanas de

hipertensión ocular, la estructura general del NO fue similar a la de los NOs correspondientes a ojos

inyectados con vehículo. Sin embargo, intercalados entre axones con apariencia normal, se observaron

axones con áreas de mielina descompactada (flechas negras), axones con ruptura de las vainas (flechas

blancas) y algunos axones completamente degenerados (estrellas blancas). A las 15 semanas, se

observaron procesos astrocitarios (A) más gruesos, así como células microgliales (Mi) y axones con

distinto grado de degeneración. Además, se observaron axones cuyo axoplasma fue reemplazado por una

masa homogénea granular y electrón-densa (asteriscos blancos) y minoritariamente, algunas fibras con

contenido axoplásmico alterado, ausencia del citoesqueleto y organelas (estrellas negras). Ol:

oligodendrocito. Imágenes representativas de 4 NOs/grupo. Barras de escala: 6 m, 1,5 m y 400 nm

para la primera, segunda y tercera fila, respectivamente.

Resultados

99

A B C

Figura 54. Detalles al MET de células microgliales en NOs de animales con 15 semanas de hipertensión

ocular. Paneles A y B: Se muestran dos células microgliales en diferentes estados de activación, con

axones degenerados en su interior (estrellas blancas y negras), localizados en las proximidades de axones

con degeneración densa (asteriscos blancos) y laxa (Ad). Nótese la diferencia de contrastes entre el

citoplasma microglial (electrón-denso) y el neuropilo (electrón-lúcido), que facilitó la identificación de

los límites celulares. Panel C: Se muestra un detalle del área señalada en (B) en la que se observan dos

axones degenerados (estrellas negras) en el interior de citoplasma microglial, delimitado por su membrana

plasmática (mp). Nótese en B-C la presencia de múltiples vacuolas (v) y otras organelas electrón-densas

(posiblemente lisosomas), indicativas de un estado microglial fagocítico. f: filamentos intermedios de

astrocitos; Nu: núcleos. Barras de escala: 1 m (A-B) y 0,4 m (C).

Los resultados de la distribución de frecuencias de las líneas intraperiódicas (Li) de los

NOs de animales con 6 ó 15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU, se muestran en la

Figura 55. Debido a la presencia de axones degenerados en los animales con hipertensión ocular,

sólo fue posible analizar en estos grupos los axones normales remanentes y los axones con

degeneración leve, que intercalaron focos de mielina descompactada y mielina compacta, en los

que las Li fueron claramente identificadas. El glaucoma experimental a las 15 (pero no a las 6)

semanas indujo un corrimiento de la distribución de frecuencias hacia la izquierda, es decir,

hacia axones con vainas de mielina más delgadas.

Resultados

100

Figura 55. Efecto del glaucoma experimental sobre la distribución de frecuencias del número de líneas

intraperiódicas de los axones del NO proximal. En el panel superior se muestran fotografías

representativas utilizadas para la cuantificación manual del número de líneas intraperiódicas (Li) de las

vainas de mielina (VM) de axones normales a levemente degenerados (con algunos focos de mielina

descompactada en los que aún pueden contarse las Li). En el panel inferior se muestran histogramas

representativos de la distribución de frecuencias del número de Li de los axones de los NOs en animales

con 6 ó 15 semanas de CSU en un ojo y vehículo en el ojo contralateral. La hipertensión ocular por 15

(pero no 6) semanas indujo el corrimiento de la distribución de frecuencias hacia la izquierda. Al:

axolema; Ap: axoplasma; M: mitocondria: Nf: neurofilamentos; Np: neuropilo. Barras de escala: 200 nm.

En la Figura 56 se muestra la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 (un marcador de

células fagocíticas) en cortes transversales de NO proximal y la cuantificación de los resultados

obtenidos. Los animales tratados con vehículo por 6 ó 15 semanas, presentaron niveles

prácticamente indetectables de ED1. El glaucoma crónico indujo un aumento significativo en

ambos parámetros, tanto a las 6 como a las 15 semanas. En cuanto a la inmunomarcación para

ED1, el efecto de la hipertensión ocular fue significativamente mayor a las 15 que a las 6

semanas.

Resultados

101

Figura 56. Efecto del glaucoma crónico sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 en cortes

transversales de NO proximal. En el panel superior se muestran imágenes representativas de la

inmunomarcación para Iba-1, ED1 y núcleos coloreados por DAPI en NOs de ojos con 6 ó 15 semanas

de hipertensión ocular. En el panel inferior se muestra la cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). Los

NOs de los ojos inyectados con CSU durante 6 ó 15 semanas presentaron niveles de Iba-1 y ED1

significativamente mayores que los observados en los nervios de los ojos inyectados con vehículo. El

efecto de la hipertensión ocular sobre el área ED1(+) a las 15 semanas fue mayor que a las 6, en tanto que

el área Iba-1(+) se redujo leve, pero significativamente a las 15 respecto de las 6 semanas de tratamiento.

Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), * p < 0,01 y ** p < 0,01 vs. NOs de ojos

inyectados con vehículo, a: p < 0.01 vs. NOs de ojos inyectados con CSU por 6 semanas, test de Tukey.

Resultados

102

En estos mismos nervios se analizó la expresión de GFAP y de la cadena pesada del

neurofilamento fosforilado (pNF-H) (Figura 57). Los nervios control presentaron niveles

moderados de GFAP con un perfil filamentoso y un área positiva para pNF-H en forma de

puncta, con distribución homogénea. En contraste, los nervios de animales con 6 y 15 semanas

de hipertensión ocular, presentaron un área GFAP(+) significativamente mayor y un área pNF-H

(+) significativamente menor que la observada en NOs de ojos inyectados con vehículo.

Figura 57. Efecto del glaucoma crónico sobre la inmunorreactividad para GFAP y pNF-H. En el panel

superior se muestran NOs representativos a las 6 ó 15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En el

panel inferior se muestra la cuantificación del área GFAP(+) y pNF-H(+). Tanto a las 6 como a las 15

semanas de tratamiento se observó un aumento significativo en la inmunoreactividad para GFAP y una

disminución significativa en el área pNF-H(+). Se representan las medias ± EE (n = 5 nervios/grupo), **

p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, test de Tukey.

Resultados

103

2.1.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del colículo

superior

La siguiente serie de experimentos tuvo por objeto analizar las consecuencias del

glaucoma experimental crónico sobre distintas poblaciones gliales (microglía, astrocitos,

oligodendrocitos), axones y neuronas del CS. El estado de la microglía se evaluó a través de los

marcadores moleculares: Iba-1 e isolectina GSA (Figura 58 y 59). A las 6 y 15 semanas de

hipertensión ocular se observó un aumento en el número de células Iba-1(+), pero no en la

relación contenido de Iba-1/célula. El aumento en el número de células microgliales a las 15

semanas de hipertensión ocular fue significativamente mayor que a las 6 semanas de tratamiento

con CSU, lo que se reflejó en un aumento en la inmunorreactividad para Iba-1, que sólo resultó

significativo a las 15 semanas de hipertensión ocular (Figura 58).

Resultados

104

B C D

A

Figura 58. Estudio de la inmunorreactividad para Iba-1 en el CS. Panel A: Se muestran imágenes

representativas de los sectores medial, medio-lateral y lateral del CS. Nótese la hipertrofia microglial, más

evidente a las 15 semanas de hipertensión ocular. Barra de escala: 50 µm. Paneles B, C y D: Se muestran

los resultados de la cuantificación de la inmunorreactividad para Iba-1 (% del total), del número de

células Iba-1(+) y la inmunorreactividad para Iba-1/célula, respectivamente. A las 6 y 15 semanas de

hipertensión ocular, se observó un aumento en el número de células Iba-1(+) coliculares, que se

correspondió con un aumento en la expresión global de Iba-1, pero no con un aumento en la expresión de

este marcador/célula. En todos los casos se promediaron los resultados obtenidos en los tres sectores. Se

representan las medias ± EE (n = 6 animales /grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos

inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas,

test de Tukey.

Resultados

105

En concordancia con estos resultados, se observó un aumento en la tinción para GSA en

el CS contralateral a ojos hipertensos, como se observa en la Figura 59.

Figura 59. Análisis histoquímico para isolectina GSA en el CS. Se muestran imágenes representativas en

los sectores medial, medio-lateral y lateral del CS. A las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular se observó

una marcada respuesta microglial en el CS contralateral al ojo con hipertensión ocular crónica. Nótese el

fenotipo “en reposo” de la microglía quiescente en el grupo con vehículo, comparado con la morfología

hipertrofiada típica de células microgliales activadas en el CS que recibió aferencias del ojo

glaucomatoso. Imágenes representativas de 6 animales /grupo. Barra de escala: 50 µm.

Utilizando el programa IMARIS®, se realizó un análisis detallado de la morfología

microglial en dos áreas retinorreceptivas del CS: el CS medial, que recibe aferencias de la retina

superior, y el CS lateral, que recibe aferencias de la retina inferior. Para ello fue necesario

realizar una reconstrucción tridimensional (como se describió en Materiales y Métodos), con el

fin de incluir las prolongaciones características de las células gliales. En la Figura 60 se muestran

las reconstrucciones tridimensionales en dos planos (z-stacks) obtenidas a partir de CS

inmunomarcados para Iba-1. Este procedimiento, que suprime la luz fuera de foco, se traduce en

Resultados

106

imágenes más nítidas que las que se obtienen por microscopía de fluorescencia convencional.

Este análisis indicó que a las 6 semanas de hipertensión, la activación microglial comenzó en la

porción lateral del CS y luego de 15 semanas, progresó y se extendió hacia la región medial. El

análisis cuantitativo de los distintos parámetros se muestra en la Figura 61.

Figura 60. Estudio de la complejidad morfológica de células inmunomarcadas para Iba-1. Se muestran

imágenes representativas del CS medial y lateral a las 6 ó 15 semanas de tratamiento. En los cuatro

cuadrantes de la Figura, la primera columna representa los z-stack de las imágenes confocales, la tercera

(en fondo gris) el análisis de los filamentos microgliales (en azul) con el software IMARIS y la del medio,

la superposición de las dos columnas antes mencionadas. A las 6 semanas de tratamiento con CSU, se

observó una marcada activación microglial en la región lateral del CS que progresó hacia la porción

medial a las 15 semanas de hipertensión. Nótese la hipertrofia celular y la detección de mayor número de

ramificaciones en el CS contralateral a ojos glaucomatosos. Barra de escala: 50 µm.

Resultados

107

Figura 61. Análisis cuantitativo de la complejidad microglial. Se tomaron en cuenta la suma del largo

(A), área (B) y volumen (C) de los procesos microgliales Iba1(+) de las imágenes confocales z-stack, así

como el número total de los puntos de ramificación (D), de los segmentos de los filamentos (E) y puntos

terminales de los mismos (F). A las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó un aumento

significativo de todos los parámetros analizados en la porción lateral del CS, que se extendió a la región

medial del CS a las 15 semanas de tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 6

CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p

< 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, test de Tukey.

En la siguiente serie de experimentos, se evaluó la inmunorreactividad colicular para

ED1. Sólo luego de 15 semanas de hipertensión ocular se observaron células microgliales

ED1(+) en el CS contralateral a ojos hipertensos (Figura 62)

Resultados

108

Figura 62. Inmunodetección de células ED1(+) en el CS. En el panel superior se muestran

microfotografías representativas de la inmunorreactividad para ED1 en el CS de un animal con 6 ó 15

semanas de tratamiento con vehículo o CSU. Las flechas blancas indican la presencia de células ED1(+).

En el panel inferior se muestran detalles de los sectores medial y lateral del CS contralateral a ojos

inyectados con CSU o vehículo durante 15 semanas. Sólo en este período se observó la presencia de

células ED1(+) en el CS contralateral al ojo glaucomatoso. Imágenes representativas de 4 animales

/grupo.

En la Figura 63 se muestran imágenes representativas de la inmunomarcación para GFAP

en el CS de animales con ojos intactos, o de animales que recibieron vehículo en un ojo y CSU

en el ojo contralateral durante 6 ó 15 semanas. Los resultados obtenidos demostraron una

marcada respuesta astroglial a las 15 semanas de hipertensión ocular, que ocupó toda la

extensión del CS en sentido medio-lateral, las capas superficiales (visuales) y la capa SGI del CS

en sentido dorso-ventral. Dada la presencia de astrocitos perivasculares y con el objeto de

minimizar las diferencias entre animales y entre experimentos, todas las comparaciones se

normalizaron al CS contralateral, por lo que se incluyeron dos grupos adicionales: animales con

ambos ojos intactos (control) y animales con un ojo intacto y otro inyectado con vehículo por 6 ó

15 semanas (vehículo). A las 15 semanas de hipertensión ocular se observó un aumento

Resultados

109

significativo en el área GFAP(+), respecto al grupo intacto y al grupo inyectado con vehículo,

que no difirieron estadísticamente entre sí (Figura 63).

Figura 63. Análisis de la inmunorreactividad para GFAP en el CS. En el panel izquierdo se muestran

imágenes representativas en secciones coronales. A las 15 semanas de hipertensión ocular, se observó una

marcada respuesta astroglial en el CS contralateral al ojo glaucomatoso, localizada principalmente en el

límite entre el CS superficial y profundo. En el panel derecho se muestra la cuantificación de la

inmunomarcación para GFAP respecto del área total del CS, relativa a la marca del CS contralateral. La

hipertensión ocular crónica indujo un aumento significativo en este parámetro a las 15 semanas de

tratamiento con CSU. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), ** p < 0,01 vs. grupo control (C),

a: p < 0,01 vs. vehículo (V)), test de Tukey.

La complejidad astroglial en imágenes confocales se analizó con el programa IMARIS,

como ya se describió. En la Figura 64 se muestran imágenes representativas y en la Figura 65, el

análisis cuantitativo de los resultados obtenidos. Este estudio permitió detectar una activación

astrocitaria temprana, moderada en la porción lateral y mayor en la región medial del CS. A las

15 semanas de hipertensión ocular, se observó una marcada gliosis reactiva.

C: Control/ Control

V: Vehículo/ Control

G: CSU/ Vehículo

Resultados

110

Figura 64. Estudio de la complejidad celular de astrocitos GFAP(+). Se muestran imágenes

representativas del CS medial y lateral a las 6 ó 15 semanas de tratamiento: z-stacks, análisis de los

filamentos (en azul con fondo gris) y la superposición de ambos. A las 6 semanas de hipertensión ocular,

se observó una marcada respuesta astroglial en la porción medial del CS y más moderada en el sector

lateral, mientras que a las 15 semanas se observó una gliosis reactiva astrocitaria manifiesta en ambas

regiones. Barra de escala: 100 µm.

Resultados

111

Figura 65. Análisis cuantitativo de la complejidad celular astrocitaria. Se analizaron los mismos

parámetros que en la Figura 61. A las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó una marcada

respuesta astrocitaria en la porción medial del CS (evidenciado por un aumento significativo de todos los

parámetros analizados) y una respuesta astrocitaria más leve en la porción lateral (evidenciada sólo por el

aumento en la suma promedio del largo de los filamentos). A las 15 semanas de hipertensión ocular, se

observó un aumento mayor de todos los parámetros analizados, que se extendió hacia la porción lateral

del CS. Se representan las medias ± EE (n = 6 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a

ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6

semanas, test de Tukey.

Con el objeto de analizar el efecto de la hipertensión ocular sobre las sub-poblaciones de

oligodendrocitos coliculares, se realizaron estudios inmunohistoquímicos utilizando marcadores

de estadios diferenciales de este tipo celular. El estudio inmunohistoquímico para NG2 (que

permite identificar CPOs y preMOs (polidendrocitos)), reveló un aumento marcado de este

parámetro con una cinética y un perfil espacial similar al observado para Iba1 (Figura 66). Las

cuantificaciones de los diferentes parámetros analizado por IMARIS se muestran en la Figura 67.

Los niveles de NG2 aumentaron significativamente en la porción lateral del CS a las 6 semanas,

y en la porción medial y lateral a las 15 semanas de glaucoma experimental.

Resultados

112

Figura 66. Estudio de la complejidad celular de los polidendrocitos coliculares. Se muestran imágenes

representativas del análisis por IMARIS de la inmunomarcación para NG2 en el CS contralateral a ojos

inyectados con vehículo o CSU durante 6 ó 15 semanas. La inmunorreactividad para NG2 aumentó en el

CS lateral en un estadío temprano de hipertensión ocular y en el CS medial y lateral, luego de 15 semanas

de glaucoma experimental. Barra de escala: 50 m.

Resultados

113

Figura 67. Análisis cuantitativo de la complejidad celular de los polidendrocitos. Se analizaron los

mismos parámetros que en la Figura 61. A las 6 semanas de hipertensión ocular se observó una marcada

respuesta NG2(+) en la porción lateral del CS, a excepción de la suma del volumen de los filamentos que

no resultó significativa. A las 15 semanas, se observó un aumento significativo en todos los parámetros,

tanto en la porción medial como en la porción lateral del CS, con excepción del área y el volumen de los

filamentos del sector medial del CS que no difirieron significativamente del vehículo. Se representan las

medias ± EE (n = 6 CS/grupo), ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p <

0,05 y b: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, test de Tukey.

Los resultados de la inmunorreactividad para O1 en los distintos sectores y capas de

mayor densidad axonal del CS se muestran en las Figuras 68 y 69. A las 6 semanas de

hipertensión ocular, se observó un aumento de este parámetro en la región medial y lateral del

CS que se localizó en el SO superficial y en el SGI que persistió a las 15 semanas de

hipertensión ocular y se extendió desde sus extremos hacia el sector medio-lateral del colículo.

Resultados

114

Figura 68. Análisis inmunohistoquímico para O1. En el panel superior se muestran imágenes

topográficas representativas del CS de animales que recibieron vehículo o CSU en el ojo contralateral por

6 ó 15 semanas. En el panel inferior se muestran detalles de los sectores y capas analizados. Se observó

un claro aumento en la inmunorreactividad para O1 en el sector medial y lateral del CS a las 6 semanas de

hipertensión ocular, que se extendió medio-lateralmente en etapas más tardías de glaucoma experimental.

Barras de escala: 1mm (panel superior) y 50 m (panel inferior).

Resultados

115

Figura 69. Análisis cuantitativo de la inmunomarcación para O1 en el CS. Se determinó el área O1(+) en

las porciones medial, medio-lateral y lateral de las capas SO y SGI. El glaucoma experimental por 6 ó 15

semanas indujo un aumento significativo de este parámetro en casi todas las capas y sectores analizados,

con excepción del sector medio-lateral, en el que la inmunomarca para O1 aumentó significativamente en

e1 SO sólo a las 15 semanas de hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE (n = 8 CS/grupo), * p

< 0, 05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test de Student.

La superposición de estas microfotografías con las del transporte de CTB, indicó que las

capas intermedias adyacentes a las regiones del CS con pérdida de marca de la toxina

coincidieron con aquellas en las que se observó sobreexpresión de O1 (Figura 70).

Resultados

116

Figura 70. Superposición de la marca de CTB con la marca para O1 en el CS de animales con 6 ó 15

semanas de tratamiento. Las fechas denotan las áreas O1(+), adyacentes a las capas coliculares

retinorreceptivas con ausencia de marca para CTB, tanto en animales con 6 como con 15 semanas de

hipertensión ocular. Barra de escala: 400 µm.

A continuación, se analizaron los niveles coliculares de MBP. Como se muestra en la

Figura 71A, no se observaron diferencias en la inmunorreactividad para MBP entre los grupos

experimentales en ninguno de los intervalos analizados. Estos resultados fueron confirmados por

un estudio de Western blot para dos isoformas (21 y 18,5 kDa) de la proteína (Figura 71B).

Resultados

117

Figura 71. Análisis de los niveles de MBP en el CS por inmunofluorescencia y Western blot. Panel A: Se

muestran imágenes representativas de las capas coliculares con mayor densidad de axones mielinizados.

No se observaron diferencias en la inmunorreactividad para MBP entre los grupos experimentales en

ninguna de las capas analizadas. Panel B: Determinación de los niveles de las isoformas de MBP de 21 y

18,5 kDa por Western blot. En el panel inferior se muestran geles representativos. En el panel superior se

muestra la cuantificación de la densidad óptica de cada una de las isoformas en relación a los niveles de

-actina. No se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales, en ninguno de los

intervalos analizados para ninguna isoforma. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).

A

B

Resultados

118

A

B

En la siguiente serie de experimentos, se analizó el contenido lipídico en las capas de

mayor densidad axonal del CS a través de la marcación con Red Oil. En la Figura 72 se muestran

detalles de los sectores y capas analizados con un procedimiento análogo al de la Figura 68.

Figura 72. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el contenido lipídico del CS. Panel A: A la

izquierda, se muestra un corte coronal de cerebro coloreado con Red Oil (Barra: 1 mm) y a la derecha,

una magnificación de la imagen a nivel del CS. Los recuadros indican las áreas de las capas SO y SGI

analizadas (Barra de escala: 400 µm). Panel B: Se muestran detalles de las capas y sectores luego de 6 ó

15 semanas de tratamiento con vehículo o CSU. La hipertensión ocular indujo una reducción del

contenido lipídico del SGI en todos los sectores analizados del CS, tanto a las 6 como a las 15 semanas de

tratamiento. En el SO este efecto fue más moderado y restringido a la porción lateral del CS para ambos

períodos. Barra de escala: 50 µm.

Resultados

119

Los resultados obtenidos indicaron una pérdida del contenido lipídico principalmente en

el SGI, tanto a las 6 como a las 15 semanas de hipertensión ocular crónica. El SO resultó la capa

menos afectada y sólo se observó una disminución significativa del contenido lipídico en la

porción lateral del CS en ambos intervalos (Figura 73).

Figura 73. Cuantificación de la tinción con Red-Oil a nivel del CS. En el SO, el tratamiento con CSU

durante 6 ó 15 semanas indujo una reducción significativa de la marca de Red Oil en la porción lateral.

Esta disminución fue más extendida en el SGI, y a las 6 semanas abarcó las áreas medial, medio-lateral y

lateral, pero sólo las dos últimas a las 15 semanas de glaucoma experimental. Se representan las medias ±

EE (n = 6 CS/grupo), * p < 0, 05 y ** p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test

de Student.

Resultados

120

A B

A continuación, se analizó la ultraestructura de los axones de las CGRs que ingresan por

el tracto óptico a nivel de la porción lateral del CS. A las 15 semanas de hipertensión ocular se

observó una profunda desorganización de la ultraestructura de la región lateral del CS a nivel del

neuropilo y de los axones, que presentaron formas irregulares, frecuentes sectores de mielina

descompactada, con separación de las lamelas de las vainas. En otros casos, se observaron

acúmulos de mielina (Figura 74).

Figura 74. Estudio ultraestructural de la porción lateral del CS. Panel A: Se muestran imágenes

representativas de CS que recibieron aferencias del ojo tratado con vehículo o CSU por 15 semanas.

Barras de escala (de izquierda a derecha): 4µm; 1 µm; 0,4µm y 0,4µm. Panel B: Se esquematiza el

plano de corte parasagital utilizado para obtener cortes ultrafinos de axones que ingresan a este nivel al

CS desde el tracto óptico. Nótese la cantidad de axones mielinizados y el escaso neuropilo en el CS

contralateral al ojo inyectado con vehículo (A: fila superior). A mayor aumento, se observaron axones

principalmente en corte transversal (redondeados/ovoides) y algunos en corte longitudinal, en los que la

mielina presentó una estructura compacta y el interior del axón se encontró preservado, observándose en

el axoplasma neurofilamentos, microtúbulos y mitocondrias (M). La porción lateral del CS con aferencias

del ojo hipertenso (B: fila inferior), presentó una menor densidad de axones a expensas de una mayor

extensión del neuropilo, que en muchos casos presentó espacios que no resultaron electrón-densos

(asteriscos). En algunos casos, los axones presentaron formas irregulares con mielina descompactada

(puntas de flecha negras) y en otros casos, se observaron acúmulos de mielina en axones degenerados o

en degeneración (puntas de flecha blancas). Imágenes representativas de 4 CS/grupo.

Resultados

121

A continuación, se determinó el estado axonal y neuronal en diversos sectores del CS, a

través de un estudio de inmunofluorescencia para pNF-H y NeuN, respectivamente. En la Figura

75 se muestran microfotografías representativas de la inmunorreactividad para pNF-H en

imágenes topográficas del CS y por sectores, en las dos capas de mayor densidad axonal. La

cuantificación de los resultados se muestra en la Figura 76. La inmunorreactividad para pNF-H,

se redujo significativamente a las 15 (pero no 6) semanas de glaucoma crónico en casi todos los

sectores de las dos capas analizadas, con excepción del sector medial en el SGI, en donde la

reducción del área pNF-H(+) no resultó significativa.

Figura 75. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre la inmunorreactividad para pNF-H en el CS. En

el panel superior se muestran imágenes topográficas representativas de animales que recibieron vehículo

o CSU en el ojo contralateral por 6 ó 15 semanas. En el panel inferior se muestran detalles del SO y SGI

en todos los sectores (medial, medio-lateral y lateral). A las 6 semanas de hipertensión ocular, la

inmunorreactividad para pNF-H no difirió entre los grupos experimentales, en ninguno de los sectores y

Resultados

122

en ninguna de las capas, en tanto que las 15 semanas, este parámetro se redujo en todas las áreas

analizadas. Barra de escala: 50 m.

Figura 76. Cuantificación de la inmunorreactividad para pNF-H en el CS. El área pNF-H(+) se redujo

significativamente a las 15 (pero no 6) semanas de glaucoma crónico en todos los sectores analizados del

SO y en el sector medio-lateral y lateral del SGI. Se representan las medias ± EE (n = 6 CS/grupo). ** p <

0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con vehículo, test de Student.

A las 15 semanas de hipertensión ocular, el número de células NeuN(+) no se modificó

significativamente en ninguna de las áreas evaluadas (Figura 77). Sin embargo, en la porción

lateral del CS se observó cualitativamente el encogimiento de algunas neuronas.

Resultados

123

Figura 77. Estudio de la inmunorreactividad para NeuN en el CS de animales con 15 semanas

hipertensión ocular. En el panel izquierdo se muestran imágenes representativas en la porción medial y

lateral del CS (Barra de escala: 50 m). En el panel derecho se muestra la cuantificación del número de

células NeuN(+). No se observaron diferencias significativas en este parámetro entre los grupos

experimentales, en ninguno de los sectores analizados. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo).

2.1.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano

En la siguiente serie de experimentos, se analizó la expresión de diferentes marcadores

gliales en la retina de ojos hipertensos. Los estudios que se describirán a continuación se

realizaron luego de 3 y 6 semanas de glaucoma experimental. Se determinó la

inmunorreactividad para Iba1, ED1, GFAP y nestina en cortes transversales de retinas.

En la Figuras 78 se muestran imágenes representativas de la inmunorreactividad para Iba-

1 y ED1 y la cuantificación de los resultados obtenidos. En la retina interna (CCG y CPI) de

animales que recibieron vehículo o CSU en el ojo contralateral por 3 semanas, se observó

inmunorreactividad para Iba-1 en un número moderado de células microgliales con finos

Resultados

124

Iba-1

procesos, en tanto que a las 6 semanas de hipertensión ocular, aumentó el número de células Iba-

1(+) con citoplasma hipertrofiado. No se observaron niveles apreciables de ED1 en las retinas

que recibieron vehículo o CSU por 3 semanas, en tanto que luego de 6 semanas de hipertensión

ocular, los niveles de ED1 aumentaron en forma ubicua, principalmente en la CCG, CPI, CPE y

EP. A las 6 (pero no 3) semanas, la hipertensión ocular indujo un aumento significativo del área

Iba1(+) y ED1(+), que fue significativamente mayor a las 6 que a las 3 semanas de

administración de CSU (Figura 78).

Figura 78. Efecto de la hipertensión ocular sobre la expresión de Iba-1 y ED1 retinianos a las 3 ó 6

semanas de tratamiento con vehículo o CSU. En el panel superior se muestran imágenes representativas

de cortes transversales de retinas. La hipertensión ocular por 6 (pero no 3) semanas indujo un aumento

marcado en la inmunorreactividad de Iba-1 en la retina interna y de ED1 con distribución ubicua. En el

Resultados

125

panel inferior se muestra la cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La hipertensión ocular por 6 (pero

no 3) semanas aumentó significativamente los niveles de Iba-1 y ED1. Se representan las medias ± EE

(n = 5 retinas/grupo). ** p < 0,01 vs. retinas de animales inyectados con vehículo y a: p < 0,01 vs. retinas

de animales inyectados con CSU por 3 semanas, test de Tukey.

A continuación, se analizaron los niveles retinianos de GFAP y nestina. Los resultados se

muestran en las Figuras 79 y 80, respectivamente. En los animales tratados con vehículo, la

inmunorreactividad para GFAP se restringió a los astrocitos de la capa de fibras. En cambio,

tanto a las 3 como a las 6 semanas de hipertensión ocular, se observó un aumento en la

inmunorreactividad para GFAP en los procesos de las células de Müller, que se extendieron

desde la capa de fibras a la CPE (Figura 79).

Figura 79. Efecto del glaucoma experimental sobre la expresión retiniana de GFAP. En las retinas de

ojos inyectados con vehículo, se observó la presencia de GFAP en los astrocitos de la capa de fibras, en

tanto que en las retinas de ojos con 3 y 6 semanas de hipertensión ocular, se observó inmunorreactividad

para GFAP en los procesos de las células de Müller. Imágenes representativas de 4 retinas/grupo.

Se observó expresión de nestina en la capa de fibras en las retinas de todos los grupos

experimentales, en tanto que en animales con 6 semanas de hipertensión ocular, se observó

inmunorreactividad para nestina también en procesos de células de Müller (Figura 80).

Resultados

126

Figura 80. Efecto del glaucoma experimental sobre la expresión de nestina en retinas de ojos con 3 ó 6

semanas de hipertensión ocular. Se muestran imágenes representativas de cortes transversales. En todos

los grupos, la inmunorreactividad para nestina se localizó en la capa de fibras y la CCG, en tanto que en

retinas con 6 semanas de hipertensión ocular también se observaron procesos de células de Müller

nestina(+). Imágenes representativas de 4 retinas/grupo.

2.1.4. Tratamiento con minociclina

Los resultados presentados hasta aquí demuestran una marcada respuesta microglial a

nivel de la retina, el NO proximal y el CS en etapas tempranas de hipertensión ocular. Sobre la

base de estos resultados, en la siguiente serie de experimentos se administró minociclina (MINO)

o vehículo (solución salina, (SS)), en forma intraperitoneal, a partir de la cuarta semana de

hipertensión ocular, diariamente, durante dos semanas. En la Figura 81 se muestra el efecto de la

MINO sobre la PIO. El tratamiento con MINO no afectó este parámetro tanto en ojos

normotensos como hipertensos.

Figura 81. Efecto de la MINO sobre la PIO. La administración de MINO no modificó la PIO de los ojos

tratados con vehículo (veh) o CSU. SS: solución salina. Se representan las medias ± EE (n = 5

Resultados

127

A

B

ojos/grupo). ** p < 0,01 vs. ojos de animales inyectados con vehículo, test de Tukey.

A continuación, se analizó el efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y

ED1 en retinas de ojos hipertensos y se cuantificó el área Iba-1(+) y ED1(+) (Figura 82). La

MINO no previno el aumento en los niveles retinianos de Iba-1, pero evitó completamente el

aumento en los niveles retinianos de ED1 inducido por la hipertensión ocular.

Figura 82. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1. Panel A: Se muestran

microfotografias representativas de retinas para cada grupo experimental. Panel B: Se muestra la

cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La MINO previno el aumento en la inmunorreactividad para

ED1 inducido por la hipertensión ocular, pero no afectó la inmunorreactividad para Iba-1. Se representan

las medias ± EE (n = 4 retinas/grupo), * p < 0,05 vs. ojos de animales inyectados con vehículo, a: p < 0,05

vs. ojos inyectados con CSU en animales que recibieron SS i.p, test de Tukey.

Resultados

128

A

B

El efecto de la MINO sobre las alteraciones inducidas por el glaucoma experimental en el

NO proximal se muestran en las Figuras 83 y 84. La MINO previno parcial, pero

significativamente el aumento del área Iba-1(+) y ED1(+) en el NO inducido por la hipertensión

ocular (Figuras 83).

Figura 83. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 en el NO proximal. Panel

A: Se muestran microfotografías representativas del NO en corte transversal. Panel B: Se muestra la

cuantificación del área Iba-1(+) y ED1(+). La MINO redujo significativamente el aumento en la

inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 inducido por la hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE

(n = 4 nervios/grupo), ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. NOs de ojos

inyectados con CSU en animales tratados con solución salina (SS) i.p., test de Tukey.

Resultados

129

A

B

Asimismo, la MINO previno el aumento en el área GFAP(+) y la disminución de la

inmunorreactividad para pNF-H inducidos por la hipertensión ocular (Figura 84).

Figura 84. Efecto de la MINO sobre la inmunorreactividad para GFAP y pNF-H en el NO. Panel A: Se

muestran imágenes representativas. Panel B: Se muestra la cuantificación del área GFAP(+) y pNF-H (+).

La minociclina per se redujo significativamente la inmunorreactividad para GFAP en NOs de ojos

inyectados con vehículo y previno completamente el aumento de este parámetro en NOs de ojos

hipertensos. La MINO previno completamente la disminución en la inmunorreactividad para pNF-H

inducida por hipertensión ocular. Se representan las medias ± EE (n = 4 nervios/grupo), ## p < 0,01 vs.

NOs de ojos inyectados con vehículo de animales tratados con SS, ** p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados

con vehículo de animales tratados con SS o MINO, a: p < 0,01 vs. NOs de ojos inyectados con CSU de

animales tratados con SS, test de Tukey.

Resultados

130

A continuación, se determinó el efecto de la MINO sobre las células microgliales y

astrocitos del CS. Como se muestra en la Figura 85, la MINO previno el aumento en la

inmunorreactividad para Iba-1 inducido por la hipertensión ocular en el sector lateral del CS. En

la Figura 86 se muestra la cuantificación por IMARIS. La MINO previno completamente el

aumento en todos los parámetros analizados, a excepción de la suma del volumen de los

filamentos Iba-1(+), en la que el efecto de la MINO fue parcial.

Figura 85. Efecto de la MINO sobre la complejidad de la microglía del CS. Se muestran imágenes

representativas de la porción medial y lateral del CS de animales tratados con vehículo o minociclina. En

los cuatro cuadrantes de la Figura, la primera columna representa los z-stack de las imágenes confocales,

la tercera (en fondo gris) el análisis de los filamentos microgliales (en azul) con el software IMARIS y la

del medio, la superposición de las dos columnas antes mencionadas. La MINO previno la activación

microglial inducida por CSU en la región lateral del CS. Barra de escala: 50 µm.

Resultados

131

Figura 86. Análisis cuantitativo de la complejidad microglial. Se analizaron los mismos parámetros que

los descriptos en las Figura 61. La MINO previno el aumento inducido por la hipertensión ocular de todos

los parámetros. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS

contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,05 y b: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos

inyectados con CSU de animales tratados con SS, test de Tukey.

En las Figuras 87 y 88 se muestra el efecto de la MINO sobre la reactividad astrocitaria

inducida por 6 semanas de hipertensión ocular en el CS. La MINO previno el aumento en la

inmunorreactividad para GFAP en la porción medial y lateral del CS y el aumento de todos los

parámetros evaluados en ambos sectores del CS. En el sector lateral del CS, la MINO previno

parcialmente el aumento inducido por la hipertensión ocular de todos los parámetros evaluados.

En el sector medial, la MINO previno completamente el aumento de la suma de la longitud de

los filamentos, el número de puntos de ramificación, el número total de segmentos y de puntos

terminales. La suma del área y el volumen disminuyeron parcialmente con el tratamiento con

MINO en este sector.

Resultados

132

Figura 87. Estudio de la complejidad de la morfología celular en astrocitos inmunomarcados para GFAP.

Se muestran imágenes representativas de la porción medial y lateral del CS de animales tratados con o

vehículo o MINO: z-stacks, análisis de los filamentos (en azul con fondo gris) y la superposición de

ambos. La MINO previno la activación astrocitaria inducida por CSU en la región medial y lateral del CS.

Barra de escala: 50 µm.

Resultados

133

Figura 88. Análisis cuantitativo de la complejidad celular astrocitaria. Se analizaron los mismos

parámetros que en la Figura 61. La MINO previno parcialmente el aumento de todos los parámetros a

nivel de la porción lateral del CS y del aumento de la suma del área y el volumen de los procesos

GFAP(+) de la porción medial del CS y evitó completamente el aumento en el número total de los puntos

de ramificación, de los segmentos de los filamentos y los puntos terminales GFAP(+) de la porción

medial del CS. Se representan las medias ± EE (n = 5 CS/grupo), * p < 0,05 y ** p < 0,01 vs. CS

contralateral a ojos inyectados con vehículo, a: p < 0,01 vs. CS contralateral a ojos inyectados con CSU

de animales tratados con SS, test de Tukey.

Finalmente, se determinó el transporte anterógrado de CTB a las 6 semanas de

hipertensión ocular en animales tratados con MINO. La minocilina previno las alteraciones en el

transporte axonal inducidas por la hipertensión ocular (Figura 89).

Resultados

134

Figura 89. Efecto de la MINO sobre el transporte anterógrado al CS. Se muestra la reconstrucción del CS

de animales inyectados bilateralmente con CTB de un animal intacto, un animal con 6 semanas de

hipertensión unilateral y un animal con hipertensión ocular unilateral tratado con MINO. La MINO

previno la caída del transporte inducida por la hipertensión ocular.

2.2. Sistema visual no formador de imagen

Con el objeto de analizar la función del sistema visual no formador de imagen en el

modelo de glaucoma experimental inducido por CSU, en la primera serie de experimentos se

evaluó el número de células melanopsina(+) en retinas de ojos con 15 semanas de hipertensión

ocular. En la Figura 90 se muestran imágenes representativas de retinas en montaje plano

inmunomarcadas para melanopsina. A las 15 semanas, la hipertensión ocular crónica indujo una

disminución significativa del número total de CGRsm (1374 ± 74 y 763 ± 146 células

melanopsina(+) en ojos inyectados con vehículo o CSU, respectivamente; ** p < 0,01, test de

Student, n = 4 ojos/ grupo). Estos resultados fueron confirmados por Western blot, como se

Resultados

135

muestra en la Figura 91. Luego de 15 semanas de hipertensión ocular, se observó una

disminución significativa y comparable en los niveles retinianos de Brn3a y melanopsina.

Figura 90. Estudio de la inmunorreactividad para melanopsina en retinas de ratas inyectadas con vehículo

o CSU durante 15 semanas. En el panel superior se muestra un esquema de la distribución de células

melanopsina(+) en retinas de ojos inyectados con vehículo (A) o CSU (B) y las áreas de las que se

tomaron los detalles (C) y (D) del panel inferior, respectivamente. La melanopsina se localizó en el soma

celular, en axones y dendritas. Luego de 15 semanas de tratamiento con CSU (B, D) se observó un menor

número de CGRs melanopsina(+) respecto a los ojos inyectados con vehículo (A, C). S: superior, I:

inferior, N: nasal, T: temporal.

Figura 91. Análisis de los niveles proteicos de melanopsina y Brn3a en retinas con hipertensión ocular

crónica unilateral por 6 ó 15 semanas. En el panel de la derecha se muestran las medias ± EE de los

Resultados

136

niveles de estas proteínas relativos a los niveles de -actina, y en el de la izquierda se muestran Western

blots representativos (n = 5 retinas/grupo). A las 15 (pero no a las 6) semanas de tratamiento con CSU,

tanto los niveles de melanopsina como los de Brn3a disminuyeron significativamente, respecto del grupo

inyectado con vehículo, ** p < 0,01 vs. ojos inyectados con vehículo, test de Tukey.

Con el objeto de evaluar las proyecciones de las CGRsm, se evaluó el transporte

anterógrado de CTB a los NSQ y el NPO. Los resultados obtenidos indicaron un déficit en el

transporte anterógrado de CTB desde la retina a los NSQ luego de 6 ó 15 semanas de

hipertensión ocular (Figura 92). Un perfil similar se observó a nivel del NPO, como se muestra

en la Figura 93.

Figura 92. Transporte anterógrado de CTB a los NSQ. Se muestran secciones coronales a nivel de

los NSQ enmarcados con línea punteada de un animal representativo de cada grupo (4

animales/grupo). El transporte de CTB fue menor en los NSQ de animales con 6 ó 15 semanas de

hipertensión ocular.

Figura 93. Transporte anterógrado de CTB al NPO luego de 6 ó 15 semanas de glaucoma experimental.

Se muestran imágenes representativas (4 animales/grupo) en cortes coronales para cada grupo

experimental. La hipertensión ocular crónica indujo una reducción del transporte de CTB, tanto a las 6

como a las 15 semanas de tratamiento con CSU.

Resultados

137

Finalmente, se evaluó el reflejo pupilar consensual en animales que fueron inyectados

con CSU o vehículo durante 15 semanas, en tanto que en ambos casos, el ojo contralateral

permaneció intacto. Como se muestra en la Figura 94, un estímulo de 1200 lux, indujo una

disminución en la contracción de la pupila de ojos contralaterales a ojos hipertensos.

Figura 94. Efecto de la hipertensión ocular crónica sobre el reflejo pupilar. El tratamiento con CSU por 6

ó 15 semanas indujo una reducción significativa en el porcentaje de contracción pupilar inducido por un

estímulo de 1200 lux. Se muestran las medias ± EE (n = 5 ojos/grupo), ** p < 0,01 vs. ojos inyectados

con vehículo, test de Tukey.

Discusión

138

DISCUSIÓN

En este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y

crónico sobre el sistema visual consciente y las áreas de proyección retinianas, así como sobre el

sistema visual no formador de imagen. Se discutirán a continuación los resultados obtenidos en

función de los objetivos planteados.

1. Modelo experimental de glaucoma agudo

El glaucoma agudo, una forma menos frecuente de la enfermedad que el glaucoma de ángulo

abierto, es consecuencia de una elevación abrupta y pronunciada en la PIO, que causa dolor

ocular intenso, su desarrollo es mucho más rápido, sus consecuencias suelen ser más

devastadoras sobre la visión y por lo tanto, requiere atención médica de urgencia. El aumento de

PIO en la cámara anterior es un modelo frecuentemente utilizado para la investigación de la

isquemia retiniana (Fernandez y col., 2009; Rosenbaum y col., 2001), pero también ha sido

utilizado como modelo experimental de glaucoma agudo, cuya etiología es esencialmente de

naturaleza isquémica. Esta última hipótesis se basa en la observación de que en animales en los

que se induce un aumento pronunciado de la PIO, incluso por intervalos relativamente breves (en

el rango horas), se produce un daño retiniano similar al que se observa en el glaucoma agudo

humano. En este contexto, con el fin de inducir un glaucoma agudo experimental, se aumentó la

PIO a 70 mm de Hg durante 90 min. La elección de estas condiciones experimentales se basó en

trabajos de otros autores (Bui y col., 2005; Fortune y col., 2011; Kong y col., 2009; Yang y col.,

2011). Los resultados obtenidos avalan la hipótesis de que en estas condiciones experimentales,

la HOA reproduce características centrales del glaucoma agudo humano, particularmente una

pérdida irreversible de la visión, como lo demuestran los resultados obtenidos en cuanto a la

estructura y función retiniana, similares a los obtenidos por otros autores (Kim y col., 2013). En

nuestras condiciones experimentales, la HOA provocó una caída significativa en la amplitud de

las ondas a y b del ERG y de los POs junto con marcadas alteraciones histológicas, que

Discusión

139

persistieron sin cambios evidentes incluso luego de 2 semanas de esta maniobra. Según Lafuente

y colaboradores (2002), la muerte de las CGRs luego de 45 min de un aumento agudo en la PIO

es máxima entre los 7 y 14 días post-HOA. Si bien las otras capas retinianas también fueron

susceptibles a la HOA, el estudio inmunohistoquímico contra la proteína Brn3a (un marcador

específico de CGRs) (Nadal-Nicolás y col., 2009), demostró que este tipo celular resultó el más

vulnerable, como se confirmó por la detección de células apoptóticas (TUNEL(+)) únicamente

en la CCG. El daño inducido por la HOA también se manifestó a nivel del transporte axonal,

como lo evidenció una alteración notable en la marca de CTB en el CS contralateral al ojo

expuesto al aumento agudo de la PIO. La HOA impactó significativamente sobre la estructura

del CS, donde se observaron alteraciones micro- y macrogliales evidentes ya a los 7 días post-

tratamiento, con resultados similares luego de 2 ó 4 semanas post-aumento de la PIO.

Estudios previos han demostrado que la transección del NO, la enucleación o la inyección

intravítrea de NMDA provocan astrogliosis en el CS (McLoon, 1986; Rao y Lund, 1989;

Schmidt-Kastner y col.,1993; Tanaka y col., 2009), junto con la sobre-expresión de antígenos

microgliales, como el complejo mayor de histocompatibilidad II (Rao y Lund, 1989) y la

integrina -M/-2 (OX-42/CD11b) (Hernandes y Britto, 2014). Si bien aún quedan por evaluar

los cambios a nivel de las neuronas coliculares, los resultados obtenidos confirman una de las

hipótesis centrales de este trabajo, que es el impacto del glaucoma sobre las áreas de proyección

retiniana, en particular en las áreas retinorreceptivas del CS. Como ya se mencionó, el glaucoma

agudo desencadena una pérdida brusca e irreversible de la visión y por lo tanto, considerando la

clara afectación de la retina, las alteraciones a nivel cerebral podrían resultar “menos

significativas” en cuanto a convertirse en un blanco terapéutico necesario. Sobre la base de los

resultados obtenidos, es factible que los efectos de la HOA sobre las áreas de proyección

retiniana sean una consecuencia de un déficit en el input sináptico, ya evidenciado a los 7 días de

tratamiento, aunque no se puede descartar formalmente un efecto directo de la HOA sobre los

Discusión

140

centros cerebrales visuales. En este sentido, el conjunto de alteraciones observadas en el modelo

de glaucoma agudo ocurrieron en una forma “demasiado acelerada” y sincrónica (al menos en la

ventana temporal analizada), como para discriminar exhaustivamente la secuencia espacio-

temporal de los eventos. De acuerdo a estos resultados, es tentador especular que en la ceguera

producida por este tipo de afección, probablemente contribuyan todas las estructuras

involucradas (la retina, el NO y el CS), aspecto que no había sido previamente examinado.

Considerando la velocidad y magnitud de estos cambios, no resultó pertinente una evaluación

más detallada en estas condiciones experimentales. En cambio, se obtuvieron resultados

inesperados en cuanto a la evaluación del sistema visual no formador de imagen, como se

discutirá más adelante.

2. Modelo experimental de glaucoma crónico

En una primera serie de experimentos, se desarrolló un modelo de glaucoma crónico

experimental a través de la inyección de CSU en la cámara anterior. Los resultados obtenidos

indican que una única inyección de CSU en la cámara anterior del ojo de rata aumentó

significativamente la PIO en comparación con los ojos inyectados con vehículo, en forma

dependiente de la dosis. Una inyección única de una solución de CSU al 40% indujo una

hipertensión ocular que persistió durante 7 días, alcanzando valores similares al control en el 8vo

día post-inyección. Aunque el destino intraocular del CSU es aún desconocido, el lento descenso

de la PIO observado después de una inyección única, sugiere que el CSU podría salir de la

cámara anterior a través del flujo de humor acuoso y/o ser degradado por una actividad de

condroitinasa local.

Con el fin de mantener un aumento sostenido de la PIO, característico del glaucoma

crónico de ángulo abierto humano, se realizaron inyecciones semanales de CSU. La PIO de los

ojos tratados semanalmente con CSU alcanzó un nivel de estado estacionario similar al

provocado por una inyección única de CSU, que fue significativamente mayor que la PIO de los

Discusión

141

ojos inyectados con vehículo y se prolongó a lo largo de toda la duración del estudio. Se ha

demostrado que inyecciones repetidas de CSU (9 mg/ojo) en la cámara anterior de ojos de gato

aumentan la PIO en 4 a 7 mm de Hg por encima de la de los ojos control (Fei y col., 1984), en

tanto que en ojos de ratas se observó un incremento de casi un 100% (~ 10 mm de Hg) en ojos

inyectados con CSU al 40% (8 mg/ojo). Dado que la cámara anterior del ojo de rata es más

estrecha, la mayor hipertensión ocular provocada por CSU en la rata que en el gato podría

atribuirse al hecho de que las concentraciones intracamerales “reales” de CSU en el ojo de rata

podrían ser superiores a las alcanzadas en el ojo de gato. Además, no puede descartarse una

menor capacidad de remoción de CSU en la cámara anterior del ojo de la rata.

La eficacia del CSU para aumentar la PIO en la rata fue similar a la obtenida a través de

inyecciones de AH, como se describió previamente en nuestro laboratorio (Benozzi y col.,

2002). Sin embargo, para alcanzar una hipertensión ocular similar, fue necesaria una mayor

concentración de CSU (40%) que de AH (1%). El dominio de AH es dependiente de la

concentración y forma una red polimérica continua a una concentración de 1 mg/ml. Por el

contrario, el dominio de CSU es limitado y adquiere una configuración de “cepillo para botellas”

sin formar una red polimérica. Además, numerosas moléculas de CSU se unen a una sola

columna vertebral de AH para formar el agregado de un proteoglicano típico (Lau y col., 2013).

Por lo tanto, es esperable que la dosis de CSU necesaria para aumentar la PIO sea mucho mayor

que la de AH. Por otra parte, además de las diferencias estructurales, diferencias en el turnover

de estos dos GAGs podrían explicar esta observación. A pesar de las concentraciones

relativamente altas de CSU necesarias para inducir una hipertensión ocular sostenida, no se

observaron signos de inflamación en la cámara anterior de los ojos inyectados crónicamente con

CSU.

Se ha sugerido que los GAGs pueden reducir el diámetro funcional de los canales de flujo

a través de los espacios esclero-corneales inter-trabeculares profundos y/o regular el flujo a

Discusión

142

través de la membrana basal juxtacanalicular. Por lo tanto, es posible que el CSU inyectado en

forma intracameral actúe de manera similar al CSU endógeno (es decir, impidiendo el flujo

normal de humor acuoso). En concordancia con estos resultados, se ha demostrado que la

inhibición de la enzima que cataliza la biosíntesis de CSU induce un aumento en el flujo de

salida de humor acuoso en ojos humanos y porcinos in vitro (Keller y col., 2011).

La hipertensión ocular desempeña un rol causal, aunque no necesariamente exclusivo, en

la pérdida visual glaucomatosa. De hecho, no todos los modelos experimentales de hipertensión

ocular crónica causan las mismas alteraciones en el sistema visual. Por lo tanto, los siguientes

experimentos se realizaron con el fin de evaluar las consecuencias de la hipertensión ocular

crónica inducida por inyecciones semanales de CSU sobre la función e histología retiniana.

Diversas evidencias indican que algunos componentes del ERG pueden ser afectados en

modelos experimentales de glaucoma. En un modelo de glaucoma crónico inducido por oclusión

de tres venas epiesclerales en ratas, se demostró una disminución significativa de la amplitud de

las ondas a y b del ERG (Bayer y col., 2001a). Cambios similares en el ERG de flash se

demostraron en el ratón DBA/2J (Bayer y col., 2001b) y en ojos inyectados crónicamente con

AH en la cámara anterior (Moreno y col., 2005a). Por otra parte, Viswanathan y colaboradores

(2000) demostraron cambios en el ERG que se correlacionan con las respuestas en el ERG

pattern en un modelo de glaucoma en monos inducido por aplicación de láser en el trabeculado.

Asimismo, se ha descripto una reducción significativa en la amplitud de la onda b del ERG

escotópico en ratas Brown Norway con inyección de solución salina hipertónica en una vena

epiescleral (Chauhan y col., 2002). En concordancia con estos resultados, inyecciones crónicas

de CSU indujeron una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG

escotópico, que fue evidente ya a las 6 semanas de tratamiento. Además, la reducción adicional

de estos parámetros después de 10 y 15 inyecciones semanales de CSU, sugiere que la

hipertensión ocular crónica provocó una disfunción retiniana progresiva, una característica

Discusión

143

compatible con el glaucoma crónico humano. Un perfil similar se obtuvo en el registro de los

POs en ojos con hipertensión ocular inducida por CSU. Si bien el origen de los POs no ha sido

concluyentemente elucidado, es posible que esta señal se origine en las vías de feedback

neuronal en la retina interna, especialmente en la CPI y principalmente a partir de las células

amácrinas, aunque también podrían contribuir las CGRs y las células bipolares (Wachtmeister,

1998). En conjunto, los resultados obtenidos demuestran una alteración funcional retiniana

significativa y progresiva, que resultó evidente en etapas tempranas de hipertensión ocular (es

decir, a partir de las 6 semanas tratamiento con CSU).

Los VEPs reflejan la actividad de todas las células de la vía óptica desde los

fotorreceptores a la corteza visual, incluyendo a las CGRs y sus axones. En humanos se ha

demostrado que el glaucoma crónico afecta los VEPs, provocando tanto reducciones en la

amplitud (Papst y col., 1984), como aumentos en la latencia (Towle y col., 1983). Sin embargo,

resultados más recientes indican sólo cambios muy sutiles en la latencia de los VEPs asociados

al daño glaucomatoso (Grippo y col., 2006). Los resultados obtenidos en esta Tesis indican

alteraciones significativas en la amplitud (pero no en la latencia) de los componentes P1-N2 y

N2-P2 de los VEPs, que fueron evidentes a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular.

En cuanto a la arquitectura de la retina, se observó un daño significativo limitado a la

CCG en los ojos inyectados con CSU a partir de las 10 semanas de tratamiento. En este sentido,

la diminución en la inmunorreactividad para Brn3a resultó evidente a las 10 y 15 (pero no 6)

semanas de hipertensión ocular, de manera tal que en este modelo experimental y al menos con

las herramientas utilizadas en este trabajo, las alteraciones funcionales (ERG y VEPs)

precedieron a las alteraciones estructurales. En suma, estos resultados indican que inyecciones

semanales de CSU indujeron una elevación moderada y sostenida de la PIO, que provocó

alteraciones significativas sobre la función de la retina (ERG) y de la vía visual (VEPs), así

como sobre la histología retiniana, que reproducen características centrales del glaucoma crónico

Discusión

144

de ángulo abierto en humanos. Asimismo, junto con las evidencias que demuestran mayores

niveles de CSU en la red trabecular de pacientes con glaucoma de ángulo abierto (Knepper y

col., 1996), estos resultados sugieren que el aumento de los niveles de CSU podría desempeñar

un papel clave en la desregulación de la PIO característica de esta forma de glaucoma.

Aunque el glaucoma ha sido concebido como una enfermedad limitada al ojo, los axones

de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En el sistema

visual, como en otros sistemas cerebrales, la función y supervivencia neuronal depende de las

conexiones con otras neuronas. En este sentido, se ha demostrado una reducción marcada en la

densidad de fibras retinianas procedentes de ojos con glaucoma experimental en el NGLd y el

CS (Drouyer y col., 2008). Si bien la caída en los VEPs a las 15 semanas de hipertensión ocular

podría claramente asociarse a la disminución en el número de CGRs observadas en este período,

la alteración de este parámetro a las 6 semanas de hipertensión ocular, podría atribuirse a una

alteración post-retiniana y/o a una alteración retiniana funcional (pero no histológica).

Asimismo, sobre la base de los resultados obtenidos, es posible que las inyecciones crónicas de

CSU, además de las CGRs, puedan afectar también la estructura y función del NO, como lo

sugiere la alteración en el transporte anterógrado desde la retina al CS y al NGL que fue ya

evidente a las 6 semanas de hipertensión ocular. Resultados similares se describieron en un

trabajo relativamente reciente (Crish y col., 2010), en el que se analizó el transporte anterógrado

de CTB al CS luego de 2 semanas de hipertensión ocular inducida por inyección intracameral de

microesferas de poliestireno en ratas y en el modelo espontáneo de glaucoma (ratón DBA/2J).

En ambos modelos se corroboró la captación activa de CTB en las CGRs. Sin embargo, luego de

sólo dos semanas de hipertensión ocular, el transporte anterógrado en ratas se redujo en un 50 -

60%, en tanto que en ratones DBA/2J, se observó un déficit del transporte anterógrado al CS a

partir de los 3 - 5 meses de edad en algunos animales y, a los 8 - 10 meses, la mayoría de ellos

tuvieron un déficit significativo de este parámetro, que fue prácticamente completo a los 12

Discusión

145

meses (Crish y col., 2010), con la particularidad de que en este modelo experimental, la pérdida

de CGRs es un evento relativamente tardío que ocurre aproximadamente a los 12 meses de edad

(Libby y col., 2005a, 2005b; Schlamp y col., 2006; Reichstein y col., 2007).

La alteración del transporte axonal en el glaucoma fue descripta por primera vez en los

años 70 (Anderson y Hendrickson, 1974; Minckler y col., 1976, 1977). Desde entonces, se ha

prestado particular atención a la cabeza del NO, que según el “paradigma biomecánico del

glaucoma” podría constituir un “cuello de botella” y ser el sitio más vulnerable a la obstrucción

del flujo axoplásmico, debido a la compresión mecánica de los axones (Burgoyne y col., 2005;

Chidlow y col., 2011; Holländer y col., 1995; Quigley y Addicks, 1980; Quigley y col., 1981).

Sobre la base de esta hipótesis, algunos autores atribuyen la apoptosis de las CGRs a la pérdida

de factores de neurotróficos (principalmente BDNF) derivados retrógradamente desde los

núcleos de proyección central (Pease y col., 2000; Quigley y col., 2000). De hecho, los axones

de las CGRs podrían ser efectivamente más vulnerables a efectos compresivos considerando que

a nivel de la lámina cribosa (o lámina glial en roedores) son amielínicos (revisado por Whitmore

y col., 2005). En algunos modelos experimentales de glaucoma (Bosco y col., 2011; Son y col.,

2010), se han descripto cambios marcados en la reactividad glial a nivel de la cabeza del NO en

etapas tempranas, así como en la ultraestructura de los astrocitos “fortificados” por densas fibras

de filamentos del citoesqueleto, que podrían transducir la hipertensión ocular que opera a este

nivel del NO en el glaucoma (Dai y col., 2011). Se ha postulado que la glía reactiva en la cabeza

del NO altera la composición de la MEC de la lámina (Fuchshofer y col., 2005; Guo y col.,

2005), posiblemente a través de la liberación de citoquinas inflamatorias desde los astrocitos y la

microglía (Bosco y col., 2011; Hernandez, 2000; Tezel y col., 2001; Yuan y Neufeld, 2000), y

por la muerte de oligodendrocitos post-laminares (Nakazawa y col., 2006) que proveerían un

soporte trófico, además de la envoltura aislante en la porción mielinizada del NO (revisado por

Nave, 2010). Aunque no permiten determinar fehacientemente el sitio primario de injuria axonal,

Discusión

146

nuestros resultados demuestran que la disminución del transporte anterógrado es una

manifestación temprana en la porción proximal del NO a la altura de la lámina glial y que

consecuentemente, podría ser responsable de la reducción de la marca de CTB en el CS y el

NGL. Concomitantemente con un déficit en el transporte anterógrado, las proyecciones de los

terminales presinápticos de las CGRs se conservaron, como lo demostró la inmunomarcación

para VgluT-2 en el CS, en forma similar a lo descripto en el modelo de ratones DBA/2J, incluso

en etapas muy tardías de la enfermedad (15 - 22 meses de edad) (Calkins, 2012; Crish y Calkins

2011; Crish y col., 2010, 2013).

Aunque el mecanismo patogénico involucrado en el modelo de glaucoma del ratón

DBA/2J se asocia con la atrofia del iris, la dispersión de pigmento y el desarrollo de sinequias

anteriores periféricas que provocan el cierre progresivo del ángulo irido-corneal (Bouhenni y

col., 2012), lo que difiere marcadamente de los eventos inducidos por las inyecciones de CSU, la

alteración en el transporte axonal desde la retina al CS parece ser una manifestación temprana de

la enfermedad en ambos modelos experimentales. En este sentido, nuestros resultados suman

evidencias a una concepción del glaucoma crónico según la cual, los axones de las CGRs son un

sustrato temprano del daño glaucomatoso, eventualmente anterior a la disminución de los somas.

En este paradigma, la alteración somática podría ser consecuencia (y no causa, como se supuso

originalmente) de la lesión axonal, aunque aún no se dispone de evidencias contundentes

respecto a los mecanismos involucrados en el daño axonal. Si bien como ya se señaló, la

mencionada teoría biomecánica podría explicar la alteración axonal, esta concepción del

glaucoma no provee una interpretación aceptable para la forma de glaucoma de presión normal,

en la que el daño glaucomatoso es similar, pero cursa con una PIO normal, lo que probablemente

sugiera la existencia de mecanismos adicionales y/o alternativos de daño axonal y somático. En

todo caso, por ahora no es posible descartar formalmente que un deterioro subletal de la CGRs

podría afectar la provisión del sustento necesario para sus axones, lo que resultaría en una muerte

Discusión

147

progresiva desde el axón hacia el cuerpo celular; incluso no es posible descartar que las

alteraciones somáticas y axonales inducidas por la hipertensión ocular crónica sean eventos

independientes entre sí. Al presente, no se dispone de herramientas sólidas (específicamente,

marcadores de daño somático) que permitan evaluar estas alternativas. Asimismo, como se

discutirá más adelante, en este trabajo de Tesis hemos demostrado alteraciones gliales en la

retina de ojos hipertensos, también en etapas tempranas de glaucoma experimental inducido por

CSU, que podrían desempeñar un papel activo en la neuropatía glaucomatosa. Sin detrimento de

estas consideraciones, los resultados presentados en este Tesis avalan al NO como un blanco

temprano de daño en el glaucoma crónico experimental, como se discutirá con mayor detalle a

continuación.

2.1. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel del nervio óptico

El análisis histológico del NO demostró un correlato estructural con la disminución del

transporte anterógrado de CTB en la porción proximal del NO. El glaucoma experimental indujo

una disminución moderada pero significativa del número de axones a las 6 semanas, que

progresó a las 15 semanas de hipertensión ocular. De hecho, es posible que la severidad del daño

observado a las 15 semanas explique la reducción del área transversal del NO observada en este

período.

La distribución de los axones en función del área axonal permitió determinar la

susceptibilidad diferencial de los axones más grandes (> 1,5 m2), que ya fueron afectados a las

6 semanas, en tanto que a las 15 semanas de hipertensión ocular se afectó el número de axones

de todos los rangos de área evaluados. Parece poco probable que este resultado pueda atribuirse a

un encogimiento del axoplasma, ya que no se observó un corrimiento hacia axones más

pequeños en la distribución del área axonal. En concordancia con estos resultados, se ha

demostrado una pérdida preferencial de los axones más grandes del NO en otros modelos de

Discusión

148

glaucoma experimental en primates y ratas (Glovinsky y col., 1991; Levkovitch-Verbin y col.,

2002; Moreno y col., 2005a). Resultados preliminares de la cuantificación de axones en la

porción distal del NO que deben confirmarse con experimentos adicionales, indicaron una

preservación de axones en esta porción del NO a las 6 semanas de hipertensión ocular (control:

3103 ± 84; CSU: 2920 ± 62, p = 0,12, test de Student), y una caída significativa de este

parámetro a las 15 semanas de hipertensión ocular (control: 3192 ± 62; CSU: 2506 ± 151, p <

0,01, test de Student), lo que podría sugerir que el daño a nivel distal ocurre más lentamente que

a nivel proximal. Estos resultados difieren de los obtenidos por el grupo de Crish y

colaboradores, que postulan una progresión deletérea desde el axón hacia el cuerpo celular

(mecanismo de dying-back) en el modelo de ratón DBA/2J (Crish y col., 2010; 2013; Dengler-

Crish y col., 2014) y en el modelo de hipertensión ocular inducido por la inyección de

microesféras en la cámara anterior de ratas (Crish y col., 2010, 2013). Sin embargo, los estudios

de estos autores han sido principalmente funcionales, pero no estructurales, lo que dificulta la

comparación entre los resultados mencionados y los obtenidos en este trabajo de Tesis, sumado a

las diferencias inherentes al modelo experimental utilizado en cada caso.

El análisis ultraestructural permitió analizar el citoesqueleto de los axones, la presencia y

estado de las organelas (principalmente mitocondrias), así como el grado de compactación de la

mielina y los componentes gliales del NO. Las alteraciones ultraestructurales observadas en

función del patrón de degeneración del axoplasma se clasificaron según la presencia de signos de

desintegración focal del citoesqueleto, degeneración laxa (watery degeneration) o degeneración

densa (dark degeneration). La degeneración laxa se caracterizó por una expansión del axolema,

desintegración del citoesqueleto, pérdida de microtúbulos con preservación relativa de los

neurofilamentos, ausencia total o parcial de organelas y reemplazo del axoplasma, en la mayoría

de los casos, por un material amorfo y en apariencia laxo y claro. La degeneración densa se

clasificó en dos subtipos, según se observaran axones en los que el axoplasma aparentemente fue

Discusión

149

reemplazado por un material granular indefinido y electrón-denso, o según se encontraran

completamente degenerados y sin axoplasma, en los que la mielina formó una masa electrón-

densa y redondeada. Estos tres patrones de degeneración se observaron simultáneamente en los

dos intervalos analizados, aunque a las 15 semanas de hipertensión ocular, las alteraciones

ultraestructurales fueron más marcadas y aparentemente prevaleció la forma de degeneración

densa. Además de estos patrones de degeneración axonal, se observaron axones con alteraciones

en la mielina de varios tipos (axones con mielina fragmentada con/sin exposición del axoplasma

al medio extracelular, axones con áreas de mielina distorsionada y vacuolizada en las que las

lamelas de las vainas se observaron descompactadas o la combinación de ellos). Estas

alteraciones ultraestructurales comparten características con el proceso de degeneración

Walleriana (Carbonell y col., 1991; Liu y Shen, 1985; Narciso y col., 2001; Saggu y col., 2010),

que puede ser desencadenado por noxas de poder deletéreo moderado (lo que podría

homologarse con la situación particular del glaucoma crónico (Salinas-Navarro y col., 2009), así

como con modelos de daño más agresivo, tales como el pinzamiento (crush) (Narciso y col.,

2001) o axotomía (Ma y col., 2013; Waller 1850) del NO. El daño en la mielina podría sugerir la

contribución de componentes extra-axonales en la degeneración axonal inducida por la

hipertensión ocular crónica. Una interpretación posible para la descompactación de la mielina (y

el subsecuente aumento del espesor de la vaina), es la deslaminación leve debida a la ruptura de

los enlaces estructurales entre proteínas de las láminas individuales, que fue evidente al examinar

la mielina a mayor aumento.

El número de Li de las vainas de mielina provee información acerca del grado de

mielinización de los oligodendrocitos (Payne y col., 2012). Como ya se mencionó, en los grupos

con hipertensión ocular sólo fue posible analizar los axones normales remanentes y los axones

con degeneración leve, que intercalaron focos de mielina descompactada y mielina compacta en

los que las Li fueron claramente identificadas. Sin embargo, exceptuando estas salvedades, a las

Discusión

150

15 semanas de glaucoma experimental se observó un corrimiento de la distribución de

frecuencias de las Li hacia axones con vainas de mielina más delgadas. La ausencia de un

corrimiento en la distribución de frecuencias a las 6 semanas de hipertensión ocular

probablemente indique que pocos axones (los más grandes y menos numerosos) fueron sujetos a

fenómenos desmielinizantes en relación al total, como lo demostró la distribución de los axones

en función del área axonal.

En términos gliales, la ultraestructura del NO de ojos hipertensos presentó un arreglo

desorganizado, con gruesos procesos astrocitarios intercalados entre los haces de fibras nerviosas

con distinto grado de degeneración. Fue frecuente distinguir células microgliales en las

proximidades de axones degenerados y en algunos casos se observaron en su interior debris y

axones en degeneración. Estos resultados son compatibles con un aumento en el número de

células fagocíticas en modelos de degeneración Walleriana (Saggu y col., 2010), en los que se

observa la presencia de astrocitos y células microgliales invadiendo la vaina de mielina a nivel

de las Li , así como la fagocitosis de las lamelas debilitadas por la ruptura de los enlaces que las

mantienen compactadas (Liu y Shen, 1985; Narciso y col., 2001).

Las observaciones al microscopio electrónico se corroboraron con estudios de

inmunomarcación para Iba-1, ED1 y GFAP, cuyos niveles aumentaron significativamente en el

NO proximal, tanto a las 6 como a las 15 semanas de hipertensión ocular. En particular, la

inmunorreactividad para ED1 aumentó entre 12 y 20 veces respecto al grupo control, en tanto

que los niveles de Iba-1 resultaron 3 ó 2 veces mayores al control a las 6 y 15 semanas de

tratamiento, respectivamente. Por otra parte, la inmunorreactividad para GFAP aumentó 1,6

veces a las 6 semanas y permaneció elevada hasta las 15 semanas de hipertensión ocular.

La reducción significativa de la inmunorreactividad para pNF-H inducida por la

hipertensión ocular es consistente con las observaciones de la pérdida de transporte anterógrado

a las áreas de proyección y con el daño estructural del citoesqueleto axonal.

Discusión

151

Se ha demostrado un aumento en la reactividad astrocitaria junto con alteraciones en otras

poblaciones gliales tanto en NOs de ratones DBA/2J, como en ratas con hipertensión ocular

crónica (Son y col., 2010). Son y colaboradores (2010) demostraron un aumento en la expresión

del ARNm para vimentina (una proteína característica de astrocitos), ya desde etapas tempranas

de la enfermedad (3 meses) y un aumento en la actividad microglial fagocítica (que coincidió

con una disminución tardía en el número de oligodendrocitos PLP(+), a los 10 meses de edad. En

ratas con hipertensión ocular inducida por fotocoagulación con láser de la red trabecular, se

observó un aumento temprano del ARNm para vimentina en el NO ya a los 10 días del

tratamiento, que se mantuvo elevado hasta los 29 días post-cirugía. En ambos modelos

experimentales se observó una disminución en la inmunorreactividad para pNF-H, que en el

ratón DBA/2J fue aproximadamente de un 80% a los 10 meses de edad y en las ratas, cercano al

100% a los 29 días post-cirugía (Son y col., 2010). Asimismo, en un estudio post-mortem del NO

de un paciente con glaucoma primario de ángulo abierto y pérdida significativa del campo visual

en ambos ojos, se demostró una marcada disminución en la inmunorreactividad para pNF-H en

comparación con NOs de cuatro individuos control (Gupta y col., 2006). En concordancia con

estos resultados, en el modelo de glaucoma utilizado en esta Tesis se demostró una reducción de

~ 50% y ~ 60% en la inmunorreactividad de pNF-H a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular

crónica, respectivamente. En suma, estos resultados avalan el concepto de que la estructura

axoglial del NO constituye un blanco temprano de daño glaucomatoso.

2.2. Efecto del glaucoma crónico experimental sobre la estructura axoglial del colículo superior

Se ha demostrado que una lesión unilateral del NO induce cambios en la población de

células gliales del CS contralateral (Rao y Lund, 1989; Schmidt-Kastner y col., 1993). En

concordancia, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis indican que el glaucoma

experimental inducido por CSU indujo alteraciones microgliales, macrogliales y

oligodendrogliales significativas en el CS contralateral a ojos con hipertensión ocular. La

Discusión

152

respuesta de la microglía en el área retinorreceptiva del CS (evaluada por tinción para GSA e

inmunorreactividad para Iba-1), fue un evento temprano que precedió a la pérdida de CGRs. Ya

a las 6 semanas de la hipertensión ocular, se observaron numerosas células microgliales con

somas y procesos hipertrofiados en el CS contralateral a ojos hipertensos. Análogamente, en un

modelo experimental de glaucoma en monos, se ha descripto activación microglial en las capas

del NGL que reciben aferencias de ojos hipertensos (Imamura y col., 2009).

Las células microgliales constituyen la “primera línea de defensa” que responden

rápidamente frente a una lesión cerebral (Hanisch y Kettenmann, 2007; Kreutzberg, 1996; Streit,

2002; Van Rossum y Hanisch, 2004). En base a hallazgos morfológicos, la activación microglial

fue originalmente descripta como un proceso estereotipado y gradual (Kreutzberg, 1996; Streit,

2002). Sin embargo, esta concepción ha sido cuestionada en los últimos años (Hanisch y

Kettenmann, 2007). Varios estudios han demostrado que la microglía ramificada no se encuentra

necesariamente en estado de reposo, como se asumió originalmente, sino que éstas son células

mótiles que mueven constantemente sus procesos y de esta forma, actúan como “centinelas” del

microambiente que las rodea (Davalos y col., 2005; Haynes y col., 2006; Nimmerjahn y col.,

2005; Vinet y col., 2012). Por lo tanto, esta nueva concepción asume que la microglía es activa

aún en condiciones normales, pero puede cambiar su morfología y función en respuesta a un

determinado estímulo (Vinet y col., 2012). En una primera etapa, las células microgliales dirigen

sus procesos hacia la lesión, antes de la retracción de sus procesos y su conversión en células

móviles, capaces de migrar al sitio de la lesión (Davalos y col., 2005; Haynes y col., 2006;

Nimmerjahn y col., 2005). La respuesta microglial a una noxa también puede involucrar

proliferación celular (Hailer y col., 1999; O’Donnell y col., β00β). A las 6 semanas de

hipertensión ocular, los resultados obtenidos podrían sugerir que las células microgliales

proliferaron/migraron en el CS contralateral a ojos hipertensos, como lo demuestra el aumento

en el número de células Iba-1(+), sin cambios en la relación del contenido de Iba-1/célula. Si

Discusión

153

bien el análisis de la complejidad celular por IMARIS reveló un aumento en el número total de

puntos de ramificación, número de segmentos de los filamentos y puntos terminales de los

filamentos, este resultado no necesariamente debe interpretarse en detrimento del concepto

clásico de activación microglial (hipertrofia y retracción de procesos), sino que también podría

reflejar la mayor cantidad de células Iba-1(+). En este sentido, resulta esperable que un mayor

número de células correlacione con una mayor cantidad de procesos/filamentos gliales. Si bien

en el análisis convencional, el porcentaje de área inmunorreactiva para Iba-1 sólo aumentó

significativamente a las 15 semanas de hipertensión ocular, el análisis de IMARIS indicó

alteraciones significativas en la morfología microglial aun en etapas más tempranas de

hipertensión ocular. Es posible que esta discrepancia se deba a que las imágenes obtenidas por

microscopía de fluorescencia convencional procesadas por ImageJ captaran principalmente los

somas y procesos primarios, excluyendo los procesos secundarios de ramificación, más

fácilmente identificables a las 15 semanas de glaucoma experimental, etapa en la cual la

hipertrofia de los cuerpos y los procesos fue más marcada y los niveles de Iba-1 fueron

significativamente mayores que a las 6 semanas de tratamiento.

El análisis de la complejidad celular reveló que la respuesta microglial estuvo definida

espacio-temporalmente; se inició en la porción lateral del CS (a las 6 semanas de hipertensión

ocular) y progresó hacia la porción medial a las 15 semanas de tratamiento. Dado que la

microglía activada puede polarizarse en distintos fenotipos (pro-inflamatoria, M1) o anti-

inflamatoria, M2), la activación microglial asociada a procesos neurodegenerativos puede

resultar beneficiosa en una respuesta aguda o deletérea en un estado crónicamente activado,

capaz de promover y exacerbar procesos neurodegenerativos (Anthony y Pitossi, 2013; Mosser y

Edwards, 2008). Durante el desarrollo de la presente Tesis, se intentó tipificar a la microglía

mediante el uso de marcadores específicos de cada estado de polarización, utilizando

condiciones que fueron exitosamente utilizadas por la Dra. Laura A. Pasquini (IQUIFIB, Dpto.

Discusión

154

de Química Biológica, FFyB, UBA/CONICET) en otras áreas cerebrales. Sin embargo, en

nuestras condiciones experimentales, no fue posible obtener una inmunomarcación reproducible

para los antígenos iNOS (característico del fenotipo M1) y arginasa o receptor de manosa

(característicos del fenotipo M2) a nivel del CS.

ED1 es una proteína de membrana predominantemente presente en lisosomas y

fagolisomas y correlaciona con la capacidad fagocítica de las células microgliales activadas

(Damoiseaux y col., 1994). Esta proteína también se localiza en la superficie celular, donde

interviene en el reconocimiento célula-célula, debido a que en la síntesis de proteínas

lisosomales de membrana, algunas de las vacuolas del complejo de Golgi se fusionan con la

membrana plasmática y luego son recicladas por endocitosis. La actividad fagocítica de las

células microgliales sólo fue evidente en el período más avanzado de glaucoma crónico, en el

que presumiblemente estas células podrían estar involucradas en la fagocitosis de debris

celulares, evento que precede a la diferenciación celular de oligodendrocitos, que proliferan en

respuesta a procesos inflamatorios (Greenwood y Butt, 2003; Lytle y col., 2009; Miron y col.,

2013; Zai y Wrathall, 2005). Se ha demostrado que la microglía ED1(+) es más numerosa en

cultivos neuronales sometidos a desmielinización inducida por anticuerpos anti-glicoproteína de

la mielina (Defaux y col., 2009). Además, se ha descripto la presencia conjunta de células

ED1(+) e iNOS(+) en focos de lesión inflamatoria inducido por la administración in vivo de LPS

(Felts y col., 2005) o por el tratamiento de células microgliales en cultivo incubadas con mielina

de rata (Pinteaux-Jones y col., 2008). En suma, los resultados de estos trabajos avalan la

asociación de la respuesta fagocítica con una respuesta inflamatoria, es decir, típicamente M1.

Los astrocitos constituyen otra de las poblaciones gliales que se activan frente a distintas

formas de daño del SNC. La activación astroglial se caracteriza principalmente por la

sobreexpresión de GFAP. De hecho, el aumento en los niveles de GFAP es un sello distintivo en

lesiones del SNC tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob

Discusión

155

(Eng y col., 2000), entre otras. Estudios previos han demostrado que la enucleación (Hernandes

y Britto, 2014; McLoon, 1986; Rao y Lund, 1989) o la inyección intravítrea de NMDA (Tanaka

y col., 2009) provocan astrogliosis en el CS. Análogamente a lo descripto en el modelo de

glaucoma agudo ya discutido, una hipertensión ocular aguda de 110 mm de Hg durante 75 min

induce un aumento temprano (3 días) en la expresión de GFAP, tanto en el NGL como en el CS

de ratas (Zhang y col., 2009), y se ha demostrado que en primates, la transección del NO o la

hipertensión ocular moderada durante 14 a 58 días provoca un aumento robusto en la expresión

de GFAP en las láminas del NGL del ojo tratado y una moderada activación astrocitaria en las

columnas de dominancia del ojo tratado en la CV1 (Lam y col., 2009). Sin embargo, los efectos

de la hipertensión ocular crónica sobre los niveles coliculares de GFAP no habían sido

previamente examinados. En este trabajo de Tesis, se demostró una marcada respuesta astroglial

a las 15 semanas de hipertensión ocular, que ocupó toda la extensión del CS en sentido medio-

lateral, las capas superficiales y la capa SGI del CS en sentido dorso-ventral. Esta distribución

fue similar a la descripta en nuestro y otro modelo de HOA (Zhang y col., 2009), así como en

modelos de enucleación y transección del NO (Hernandes y Britto, 2014; McLoon, 1986; Zhang

y col., 2009). Comparando la respuesta microglial con la respuesta astroglial del CS, nuestros

resultados parecen indicar que la microglía podría ser una de las primeras poblaciones celulares

en detectar un déficit en el input sensorial en esta estructura. En este sentido, además de una gran

plasticidad funcional, las células microgliales se caracterizan por un bajo umbral de activación

(Graeber, 2010) y son capaces de responder incluso a estresores de baja intensidad que afectan al

SNC, ya sea de forma directa o indirecta (Kreutzberg, 1996).

Si bien no se observaron diferencias significativas globales en la inmunorreactividad para

GFAP a las 6 semanas de hipertensión ocular, el estudio sectorial del CS a través del análisis de

imágenes confocales, permitió detectar una activación astrocitaria significativa en la región

medial y más moderada en la porción lateral del CS en este período. Un estudio similar a las 15

Discusión

156

semanas de hipertensión ocular, confirmó los resultados obtenidos previamente por microscopía

de fluorescencia convencional. Además, este análisis aportó información respecto a la

complejidad morfológica de los astrocitos coliculares, que progresó con el tiempo de

hipertensión ocular. Las diferencias en la magnitud de la respuesta a las 6 y a las 15 semanas de

glaucoma crónico podrían interpretarse como diferentes estadíos de un mismo proceso o bien a

dos respuestas astrocitarias diferentes. Trabajos de otros autores (Pekny y col., 2007;

Valamanesh y col., 2013) coinciden en la descripción de dos estadíos de gliosis, con funciones

bien definidas. En las primeras etapas de la lesión, los astrocitos reactivos pueden participar en

procesos de neuroprotección (liberando factores neurotróficos y moléculas antioxidantes) y en

una etapa posterior, la desregulación en la homeostasis de iones y agua, así como la incapacidad

para remover neurotransmisores podría contribuir a la muerte neuronal. Además, la formación de

la cicatriz glial podría delimitar la inflamación al epicentro de la lesión, proteger las redes

neuronales aledañas (Faulkner y col., 2004; Herrmann y col., 2008; Okada y col., 2006; Wanner

y col., 2013) e inhibir fenómenos de plasticidad en el SNC, como el crecimiento de nuevas

neuritas o la reconexión de vías afectadas (Wanner y col., 2013). Cualitativamente, la morfología

de los astrocitos coliculares luego de 15 semanas de hipertensión ocular presentó signos típicos

de una cicatriz glial que comprendió astrocitos hipertrofiados, procesos filamentosos

entrelazados y territorios celulares individuales relativamente más pequeños. Además de

astrocitos, la cicatriz glial se compone de un core de células proinflamatorias CD16/32(+) o

ED1(+) (Horn y col., 2008; Kigerl y col., 2009) y una población grande y heterogénea de células

inmaduras que expresan marcadores comúnmente asociados a progenitores (incluidos nestina,

vimentina, y NG2) (Busch y col., 2010; Lytle y col., 2006; Zai y Wrathall, 2005) y se considera

que la polarización dinámica de diferentes poblaciones celulares en diferentes etapas post-lesión,

“orquesta” la formación de una cicatriz estructuralmente en capas (Hughes y col., 2013). En este

sentido, considerando que la inflamación es una característica central en varios desórdenes

Discusión

157

neurodegenerativos caracterizados por desmielinización y dada la participación de las células

NG2(+) en la formación de la cicatriz glial y también en fenómenos de remielinización, se

analizó el efecto de la hipertensión ocular sobre las sub-poblaciones de oligodendrocitos

coliculares, un aspecto que no había sido previamente explorado en el glaucoma experimental.

Como se mencionó en la Introducción, los oligodendrocitos coliculares se encuentran en

diferentes estadíos de diferenciación: células precursoras de oligodendrocitos (CPO),

oligodendrocitos premielinizantes, oligodendrocitos mielinizantes inmaduros (OMi) y

oligodendrocitos mielinizantes maduros (OMm), que pueden ser caracterizados por la expresión

diferencial de marcadores específicos. Los resultados obtenidos indicaron alteraciones

significativas de los oligodendrocitos coliculares, tanto en etapas tempranas como tardías de

glaucoma crónico experimental. En particular, se observó un aumento en la inmunorreactividad

para NG2 en la porción lateral del CS a las 6 semanas de hipertensión ocular y en la porción

medial y lateral a las 15 semanas de glaucoma experimental, que resultó en un perfil espacio-

temporal similar al observado para Iba-1. La glía de tipo NG2(+) (polidendrocitos) forma parte

de la población de CPO, debido a su capacidad de dar origen a oligondendrocitos mielinizantes y

no mielinizantes. Sin embargo no todas las células NG2(+) se diferencian a oligodendrocitos; por

ejemplo, en las primeras etapas post-natales, algunas de estas células se diferencian a astrocitos,

capacidad que pierden gradualmente en etapas post-natales más avanzadas (revisado por

Nishiyama y col., 2014). Los polidendrocitos proliferan y sufren cambios morfológicos en

respuesta a una amplia variedad de estresores del SNC, que además de procesos desmielinizantes

incluyen lesión de la médula espinal (Jones y col., 2002; McTigue y col., 2001), isquemia

(Zhang y col., 2013), lesión por excitotoxicidad (Bu y col., 2001; Wennström y col., 2004) o

infección viral (Levine y col., 1998). El curso temporal de su activación y su morfología reactiva

o el grado de proliferación varía dependiendo de la naturaleza del daño. Si bien aún no se conoce

la relevancia funcional de estos cambios morfológicos y proliferativos, los cambios observados

Discusión

158

en la morfología de las células coliculares NG2(+) en respuesta a la hipertensión ocular

descriptos en la presente Tesis, podrían participar como causa o consecuencia de la progresión

del daño glaucomatoso a nivel central.

Las células NG2(+) exhiben una relación espacial muy cercana a la de los procesos de

astrocitos y el soma microglial, que se vuelve más pronunciada en respuesta a una lesión. En

lesiones agudas, la respuesta de las células NG2(+) ocurre tempranamente (alrededor de las 24 h)

(Horky y col., 2006; Simon y col, 2011; Watanabe y col., 2002), con un curso temporal similar

al de la respuesta microglial y en forma previa a la astrogliosis reactiva (revisado por Nishiyama

y col., 2014). Los resultados obtenidos en cuanto al curso temporal de la respuesta de los

polidendrocitos en relación a la activación micro y astroglial del CS inducida por la hipertensión

ocular, son compatibles con estos antecedentes.

Al presente, se desconoce de qué manera los tres tipos de glía reactiva se comunican entre

sí y conforman eventualmente una respuesta concertada, específicamente adaptada a cada tipo de

lesión. La proliferación de los polidendrocitos depende de diversos factores como la edad, la

localización en el SNC y el nicho germinal del que provienen. Asimismo, se ha sugerido que el

microambiente induce una proliferación diferencial de los polidendrocitos, que es mayor en la

sustancia blanca del cuerpo calloso y el cerebelo comparado con la sustancia gris adyacente (Hill

y col., 2013). Se ha sugerido que un ambiente “más oxidante” de la sustancia blanca proveería de

una mayor concentración de Ca2+ intracelular a las células NG2(+), que están más

despolarizadas. Además, se ha postulado que el comportamiento proliferativo diferencial en

diferentes regiones del SNC podría reflejar diferencias en la funcionalidad de los astrocitos,

diferencias en el estado rédox del microambiente celular ante condiciones fisiológicas, como un

aumento en la respiración celular por aumento en la actividad neuronal, o ante condiciones

patológicas como la hipoxia y la inflamación, que inducen daño oxidativo (revisado por Hill y

Nishiyama, 2014). Evidencia reciente ha demostrado que la actividad neuronal promueve la

Discusión

159

proliferación y diferenciación de las CPO y el remodelamiento de la microestructura de la

mielina, y sugiere que cambios adaptativos en las células formadoras de la mielina representan

un tipo de plasticidad neuronal (Gibson y col., 2014). Paradójicamente, se ha demostrado que la

pérdida de axones y oligodendrocitos en modelos de daño axonal o de desmielinización también

promueven la proliferación de CPO, que en algunos casos generan nuevos oligodendrocitos

(Greenwood y Butt, 2003; Lytle y col., 2009; Zai y Wrathall, 2005) y se ha asociado la

activación microglial en procesos inflamatorios con la proliferación y diferenciación de CPO

(Miron y col., 2013). En este sentido, se analizó el comportamiento de otras poblaciones

oligodendrogliales, a través del estudio de la inmunorreactividad para O1 (característico de OMi

y OMm) y para MBP (característico del último estadío de diferenciación oligodendroglial

(OMm)). El OMi es una célula de morfología multipolar compleja, post-mitótica que carece de

las moléculas presentes en las vainas de mielina. La inmunorreactividad para O1 aumentó en la

porción medial y lateral a las 6 y 15 semanas de hipertensión ocular en las dos capas de mayor

densidad axonal del CS, el SO y el SGI. Las capas SO y SGI adyacentes a las regiones del CS

con pérdida del transporte de CTB coincidieron con aquellas en las que se observó

sobreexpresión de O1, tanto a las 6 como a las 15 semanas de tratamiento. Al presente, la

mayoría de los trabajos que investigaron las consecuencias de un déficit en el input retiniano

sobre núcleos cerebrales visuales (por enucleación o lesiones del NO) se han enfocado en los

astrocitos o en la microglía, y hasta la realización de este trabajo, no se habían examinado las

consecuencias de la hipertensión ocular crónica sobre las poblaciones de oligodendrocitos. Una

interpretación posible de nuestros resultados es que la deprivación del input retiniano afecte en

forma directa componentes de la mielina de las capas del CS de mayor densidad axonal, o de

forma indirecta a través de la activación microglial y que a su vez, constituya una señal para la

proliferación de CPO y diferenciación a oligodendrocitos mielinizantes. En anomalías de la

mielina o en procesos de desmielinización del SNC, es esperable un proceso de remielinización

Discusión

160

que involucra cambios en las poblaciones de oligodendrocitos. La remielinización que ocurre en

respuesta a un proceso desmielinizante se produce a través de la activación de progenitores de

oligodendrocitos en la lesión, que forman nuevos oligodendrocitos y permiten recuperar la

función de aislamiento de la mielina. Sin embargo, el proceso de remielinización se vuelve

progresivamente limitado. Células progenitoras de oligodendrocitos en la lesión, por razones

desconocidas, pierden gradualmente la capacidad de formar oligodendrocitos mielinizantes

(Fernandez y col., 2012). En el CS contralateral a ojos hipertensos, las células precursoras

NG2(+) mostraron una apariencia morfológica alterada, con somas hipertróficos y múltiples

procesos, que se acompañaron por un aumento en la inmunorreactividad para O1, característico

de OM, que podrían quedar arrestados en el estadío OMi. Si bien las consecuencias de la

alteración morfológica de estas células en la progresión de la enfermedad debe ser examinado

más exhaustivamente, es posible que estas células reactivas contribuyen a un estado de

remielinización, pero que la pérdida concomitante de la función y estructura axonal, así como el

aumento en la reactividad microglial podrían provocar una falla para completar la diferenciación

a OMm, lo que resulta en células aberrantes que se acumulan en sitios adyacentes a la lesión, una

situación similar a la observada en modelos crónicos de lesión de la sustancia blanca. En este

contexto, se evaluaron tanto los niveles proteicos como la inmunorreactividad para MBP, como

el contenido lipídico del CS, a fin de determinar el estado de los OMm y de las proteínas y

lípidos de la mielina. Llamativamente, los niveles proteicos y la inmunorreactividad para MBP

no se afectaron significativamente en los períodos estudiados. Aún no disponemos de una

interpretación clara para estos resultados; sin embargo se ha sugerido que durante la

desmielinización, una mayor exposición de epitopes podría aumentar la inmunorreactividad para

antígenos de la mielina, compensando “artificialmente” una caída en los niveles de esta proteína.

Por otra parte, la ausencia de cambios en los niveles proteicos de dos de las isoformas de MPB

probablemente se deba al hecho de haber utilizado homogenatos de toda la estructura del CS,

Discusión

161

con lo que podrían enmascararse fenómenos locales. En contraste, la tinción con Red Oil indicó

una pérdida del contenido lipídico en el sector lateral del SO, tanto a las 6 como a las 15 semanas

de hipertensión ocular crónica, que fue más extendida en el SGI, pues a las 6 semanas y 15

semanas de glaucoma experimental abarcó todos los sectores del CS analizados, exceptuando la

porción medial del SGI a las 15 semanas. La tinción con Red Oil ha sido ampliamente validada

para la determinación de gotas lipídicas en músculo esquelético, corazón e hígado (Mehlem y

col., 2013) y aunque es menos utilizada para el estudio de enfermedades desmielinizantes del

SNC (Prins y col., 2013; Tsiperson y col., 2010), ha permitido detectar un aumento en el

volumen de desmielinización en el estriado de ratas a las que se les administró un adenovirus que

expresa Il-1 (Murta y col., 2012), y se ha demostrado una disminución en el contenido lipídico

tanto en la corteza, el hipocampo y tallo encefálico a los 28 días de un daño axonal traumático

difuso (Wen y col., 2014). En este sentido, a pesar de los resultados obtenidos respecto a los

niveles de MBP, las alteraciones observadas a través de la tinción con Red Oil, podrían

considerarse un indicio (indirecto) de desmielinización o al menos de alteraciones sutiles de la

mielina inducidas por la hipertensión ocular crónica. Las alteraciones en la mielina en la porción

lateral del CS (por donde las fibras retinianas ingresan al CS desde el tracto óptico) fueron

confirmadas por MET. La hipertensión ocular indujo una desorganización evidente de la

ultraestructura del CS lateral a las 15 semanas de hipertensión ocular, que se evidenció a nivel

del neuropilo y de los axones. Estos últimos presentaron formas irregulares, muchas veces con

sectores de mielina laxa y separación de las lamelas de las vainas. En otros casos, se observaron

acúmulos de mielina que correspondieron a axones en degeneración. A nivel del neuropilo, las

alteraciones adquirieron la forma de ampollas (blebs), que no parecerían un artefacto de técnica

porque alrededor de ellas se observaron axones y porque muchas de ellas presentaron un

contenido amorfo electrón-lúcido, que podrían corresponder a áreas del parénquima más

Discusión

162

debilitadas y edematosas. En un futuro próximo, se planea realizar un estudio similar en períodos

más tempranos de hipertensión ocular.

El estado axonal y neuronal en diversos sectores del CS se analizó a través de un estudio

de inmunofluorescencia para pNF-H y NeuN (un marcador específico de neuronas),

respectivamente. La inmunorreactividad para pNF-H se redujo significativamente a las 15 (pero

no 6) semanas de glaucoma crónico en casi todos los sectores analizados, con excepción del

sector medial en el SGI. Sin embargo, el número de neuronas NeuN(+) se preservó aún a las 15

semanas de tratamiento, aunque la evidencia cualitativa de reducción del diámetro neuronal

podría considerarse un índice de atrofia neuronal, que deberá ser confirmada en estudios

cuantitativos complementarios.

Diversos estudios han demostrado que la pérdida de neuronas coliculares frente a noxas

retinianas es un evento relativamente tardío y muy posterior a la caída de los somas de las CGRs.

En un modelo de lesión retiniana inducida por inyección intravítrea de NMDA en ratones, que

provoca una reducción significativa en el número de células en la CCG a partir del día 1 post-

inyección (Ito y col., 2008), se detectó una pérdida neuronal significativa recién a los 90 días en

el CS (Tanaka y col., 2009). En un modelo de HOA en ratas, 4 semanas post-tratamiento no

fueron suficientes para inducir pérdida neuronal en el dNGL o el CS (Zhang y col., 2009). En

modelos de glaucoma en primates, la disminución de la densidad celular en el NGL es también

un evento muy tardío (Ito y col., 2009; Sasaoka y col., 2008; Yücel y col., 2000, 2001, 2003). En

este contexto, es posible que la pérdida de neuronas coliculares ocurra en períodos aún más

prolongados de hipertensión ocular que los analizados en este trabajo.

Si bien las alteraciones a nivel neuronal fueron claramente menores (al menos con las

técnicas utilizadas), cabe señalar que aproximadamente el 90% de células del SNC son células

gliales, que mantienen una relación íntima con las neuronas y desempeñan un papel crucial en la

regulación del entorno que las rodea. Disfunciones gliales, especialmente de astrocitos y

Discusión

163

microglía han adquirido una relevancia creciente como “actores clave” en la patogenia de

diversos trastornos del SNC (De Keyser y col., 2008), como la epilepsia (Binder y Steinhauser,

2006; Tian y col., 2005), la esquizofrenia (Matute y col., 2005) y la enfermedad de Alzheimer

(Kuchibhotla y col., 2009; Mrak y Griffinbc, 2001), entre otras. En este contexto, las alteraciones

gliales en el CS descriptas en este trabajo de Tesis podrían extender las consecuencias

conceptuales de una disfunción glial central también al glaucoma. Sin embargo, aún no resulta

posible establecer si las alteraciones axogliales del CS, son consecuencia de cambios subletales

en las CGRs o de la glía y los axones del NO (en períodos tempranos), de la pérdida de CGRs y

sus axones (en etapas avanzadas de glaucoma), o son consecuencia directa del aumento de la

PIO, transducido al CS a través de mecanismos aún desconocidos.

El hecho de que la mayoría de los cambios tempranos hayan ocurrido prevalentemente en

la porción lateral del CS, fue un hallazgo sorprendente. Si bien en este trabajo de Tesis no se

realizó un análisis espacial detallado y cuantitativo del déficit del transporte a las áreas

retinorreceptivas del CS, en el modelo de axonopatía distal en el ratón DBA/2J y en ratas adultas

con dos semanas de hipertensión ocular, se demostró que la reducción del transporte activo sigue

un patrón retinotópico que se asemeja a la pérdida de la visión en el glaucoma crónico humano,

es decir, desde la periferia al centro, y hacia la representación del disco óptico en el CS de

roedores (Crish y col., 2010). Aunque en nuestras condiciones experimentales no fue posible

elucidar el perfil de avance de la pérdida del transporte anterógrado, dado que ya a las 6 semanas

de hipertensión ocular la caída fue aproximadamente de un 80 - 95%, resultó llamativa la

preservación de la marca para CTB en la región rostro-medial del CS. De hecho, en los animales

con HOA a los 7 días de tratamiento, el transporte también se preservó en esta pequeña región.

Por distintos métodos y en distintas especies de roedores se ha demostrado que la porción rostro-

medial recibe proyecciones ipsilaterales (Isenmann y col., 1999; Lund, 1965; Rao y Lund, 1989;

Rodger y col., 2005). En este contexto, la respuesta glial diferencial del sector lateral del CS

Discusión

164

podría tener un sustento anatómico. Es posible especular que la porción medial del CS

contralateral al ojo con glaucoma crónico que recibe escasas aferencias del ojo control, tenga un

ambiente menos nocivo que la porción lateral, y por lo tanto sea menos susceptible al estrés

inducido por la hipertensión ocular en etapas tempranas. En este sentido, Drouyer y

colaboradores (2008) han descripto una pérdida del transporte de CTB en la porción lateral del

CS en ratas con 17 semanas de hipertensión ocular inducida por cauterización de venas

epiesclerales, y sugieren que las proyecciones de la retina inferior están más afectadas que las de

la retina superior (Siminoff y col., 1966). Queda pendiente realizar un análisis de estas

características en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU.

2.3. Efecto del glaucoma crónico experimental a nivel retiniano

Habiendo demostrado cambios gliales tempranos a nivel del NO y el CS, se analizaron

los efectos de la hipertensión ocular crónica sobre las diferentes poblaciones gliales de la retina.

La inmunorreactividad para Iba-1 y ED1 aumentó significativamente a las 6 pero no a las 3

semanas de hipertensión ocular. Este resultado sugiere una marcada activación microglial que se

extendió a todas las capas de la retina y presentó características fagocíticas, en forma previa a la

caída de los somas de las CGRs. Estos resultados concuerdan con los de otros autores, que a

través del estudio de perfiles de expresión génica, asocian las alteraciones retinianas de ratones

DBA/2J a una respuesta inmune innata (Steele et al., 2006), e incluso sugieren su participación

en el inicio de la enfermedad (Fan et al., 2010). En este sentido, Bosco y colaboradores (2011)

demostraron que los niveles proteicos y del ARNm de Iba-1 aumentan significativamente ya a

los tres meses de edad en el ratón DBA/2J, siendo máximos en la retina central y en el NO

proximal, en tanto que en etapas más tardías, estos parámetros se encuentran aumentados en la

retina periférica. Asimismo, Levkovitch-Verbin y colaboradores (2014) demostraron que a los 14

días de hipertensión ocular inducida por cauterización con láser de la red trabecular, aumenta el

número de células Iba-1(+) y ED1(+) en la retina de ratas. Sin embargo, en contraste con lo

Discusión

165

observado en nuestro modelo de glaucoma crónico experimental, el grupo de Bosco (2011)

demostró un rol marginal para ED1 en las retinas de los ratones DBA/2J. Probablemente, estas

diferencias podrían atribuirse a las diferencias entre los modelos experimentales, que incluyen la

magnitud de la hipertensión ocular (que en el modelo DBA/2J es más variable entre animales e

incluso entre los ojos de un mismo animal), a la diferencia entre especies e incluso a la edad de

los animales, entre otros factores.

A las 3 semanas de hipertensión ocular se observó un aumento en la inmunorreactividad

para GFAP en los procesos de las células de Müller, que cualitativamente fue mayor a las 6

semanas de tratamiento. Las células de Müller atraviesan todo el espesor de la retina y contactan

con células bipolares, horizontales, amácrinas, fotorreceptores, células microgliales y astrocitos.

Sobre la base de esta distribución particular, se ha sugerido que las células de Müller se

encuentran topográficamente “bien posicionadas” para monitorear la homeostasis retiniana y

contribuir a la estructura y función de la retina (Goldman, 2014). Es posible que esta disposición

les provea la capacidad de constituir blancos propicios para responder rápidamente ante distintas

noxas, como la hipertensión ocular (Inman y Horner, 2007). En este sentido, no resulta

sorprendente que en nuestro modelo de glaucoma experimental, el aumento en los niveles de

GFAP en las células de Müller (un reconocido indicador de daño retiniano), haya sido uno de los

primeros eventos en respuesta a la hipertensión ocular crónica, incluso anterior a los cambios en

la reactividad microglial. En concordancia con estos resultados, en la retina del ratón DBA/2J se

ha descripto un aumento temprano en la reactividad astrocitaria y de las células de Müller

seguidos por una activación microglial más lenta (Buckingham y col., 2008; Crish y col., 2010;

Howell y col., 2007; Inman y Horner, 2007; Jakobs y col., 2005; Libby y col., 2005; Schlamp y

col., 2006; Son y col., 2010; Stevens y col., 2007). Asimismo, se ha demostrado que la HOA

induce un aumento en la expresión de GFAP en las células de Müller (Woldemussie y col., 2004;

Xue y col., 2006a; Zhang y col., 2009) y nestina (Xue y col., 2006a).

Discusión

166

La nestina es una proteína que forma parte de la familia de filamentos intermedios y fue

originalmente descripta como un marcador de células progenitoras neurales durante el desarrollo

(Lendhal y col., 1990). Evidencias más recientes indican que esta proteína también se expresa en

células progenitoras en el adulto en diversos tejidos en condiciones normales o patológicas

(Fröjdman y col., 1997; Hoffman, 2007; Sejersen y Lendhak, 1993; Yamada y col., 2009). A

diferencia de lo que ocurre en la retina de mamíferos, las células de Müller de los peces poseen

la capacidad de regenerar íntegramente la retina luego de un daño (tóxico, mecánico o por

radiación) y restaurar la visión (Goldman, 2014). Sin embargo, las células de Müller de

mamíferos conservan la capacidad de responder ante diferentes situaciones de daño como el

glaucoma (Xue y col., 2006a), la transección del NO (Xue y col., 2006b), el daño por láser

Kohno y col., 2006), o el desprendimiento de retina (Luna y col., 2010), a través de la expresión

de nestina. En el modelo de hipertensión ocular crónica inducido por CSU, la expresión de

nestina en células de Müller fue evidente a las 6 (pero no 3) semanas de tratamiento

Estos resultados avalan el concepto de que la activación glial retiniana podría ser también

un evento temprano, que antecede a la pérdida de CGRs. En conjunto, los resultados obtenidos

en esta Tesis indican que el glaucoma experimental indujo una activación microglial temprana y

consistente en todas las áreas visuales estudiadas (retina, NO y CS). Sobre la base de estos

resultados, los experimentos que se discutirán a continuación tuvieron por objetivo analizar el

efecto de la inhibición de la reactividad microglial sobre las alteraciones inducidas por el

glaucoma experimental crónico.

2.4. Tratamiento con minociclina

La minociclina (MINO) es una tetraciclina de segunda generación con potentes efectos

antimicrobianos y anti-inflamatorios. Diversas dosis y vías de administración de MINO han sido

utilizadas en modelos experimentales de neurodegeneración. En este trabajo de Tesis, se optó por

Discusión

167

el protocolo utilizado por Guasti y colaboradores (2009) en un modelo de lesión del nervio

espinal en el que la MINO fue eficaz en reducir la respuesta microglial.

La MINO administrada a partir de la cuarta semana de hipertensión ocular crónica, no

modificó la PIO, análogamente a lo descripto en el modelo DBA/2J (Bosco y col., 2008) y en un

modelo de hipertensión ocular inducido por cauterización con láser de la red trabecular en ratas

(Levkovitch-Verbin y col., 2006; 2014). Sin embargo, aunque no afectó los niveles retinianos de

Iba-1, la MINO previno completamente el aumento en los niveles retinianos de ED1 inducido

por el inyecciones crónicas de CSU. En concordancia con nuestros resultados, Levkovitch-

Verbin y colaboradores (2014) demostraron que la MINO administrada diariamente a partir de 3

días antes de la fotocoagulación con láser, previene el aumento en el número de células

fagocíticas, pero no el aumento en el número total de células microgliales. Resultados

preliminares que deben ser confirmados, parecen indicar que el tratamiento con MINO reduce la

expresión de nestina (pero no de GFAP) en los procesos de las células de Müller. Se ha descripto

un comportamiento similar en las células de Müller de ratones DBA/2J tratados con MINO

durante 25 semanas (a partir de 1,5 meses de edad, en forma previa a la activación microglial,

que ocurre a los 3 meses) (Bosco y col., 2008). En este modelo experimental, la MINO no

modificó la activación astrocitaria y de las células de Müller (evaluada a través de los niveles

proteicos y de ARNm de GFAP), pero redujo significativamente la activación microglial.

A nivel del NO, la MINO previno parcial, pero significativamente el aumento en el área

Iba-1(+) y ED1(+) y evitó completamente el aumento en el área GFAP(+) y la disminución de la

inmunorreactividad para pNF-H inducidos por la hipertensión ocular, un aspecto que no había

sido previamente examinado. Nuestros resultados sugieren que la MINO a nivel del NO previene

el daño glaucomatoso sobre los axones de las CGRs a través de un mecanismo que inhibe tanto

la reactividad microglial y la actividad fagocítica como la astrogliosis reactiva, eventos que

podrían estar causalmente vinculados entre sí. Los efectos de la MINO sobre la preservación de

Discusión

168

la inmunorreactividad para pNF-H avalan el efecto neuroprotector de la MINO sobre los axones

de las CGRs.

A nivel del CS, la MINO evitó la respuesta microglial inducida por la hipertensión ocular

en la porción lateral del CS a las 6 semanas de tratamiento, a excepción de la suma del volumen

de los filamentos Iba-1(+), en la que el efecto de la MINO fue parcial. Asimismo, la MINO

previno el aumento en la inmunorreactividad para GFAP en la porción medial y lateral del CS y

el aumento de todos los parámetros evaluados en ambos sectores del CS. Finalmente, la MINO

previno la reducción del transporte axonal al CS inducida por la hipertensión ocular, efecto que

no había sido previamente demostrado, y que a la luz de los resultados obtenidos podría ser

interpretado sobre la base de los efectos de la MINO a nivel retiniano y del NO. A nivel del CS,

los resultados sugieren que la MINO podría tener un efecto directo, indirecto o la combinación

de ambos. Por un lado, debido a que fue administrada sistémicamente y es capaz de atravesar la

barrera hemato-encefálica, la MINO podría ejercer efectos anti-inflamatorios directos sobre el

CS; por otro, la reducción de las alteraciones en los axones de las CGRs y de la respuesta

microglial en el NO podría prevenir el déficit en el input visual al CS e indirectamente, la

respuesta glial inducida por la hipertensión ocular observada en esta estructura a las 6 semanas

de tratamiento. Dado que la microglía puede regular la mielinización, los oligodendrocitos o

ambos, no es posible descartar que la MINO afecte positivamente a los polidendrocitos y la

mielina, aspectos que se analizarán en un futuro próximo. En suma, estos resultados sugieren que

la MINO administrada en forma intraperitoneal durante 2 semanas, fue efectiva en prevenir

algunas de las alteraciones sobre la vía visual inducidas por la hipertensión ocular crónica. En

este contexto, aunque aún queda pendiente el análisis del número de CGRs en respuesta a la

MINO en ojos glaucomatosos, es posible postular que la respuesta microglial temprana en las

estructuras visuales analizadas, podría participar activamente en la patogénesis del glaucoma. En

Discusión

169

este sentido, estos resultados podrían sugerir el uso de MINO como una nueva estrategia

terapéutica para el tratamiento del glaucoma.

3. Sistema visual no formador de imagen en el glaucoma agudo y crónico

Los resultados obtenidos en el modelo de glaucoma agudo indican que las CGRsm

resultaron funcional y estructuralmente protegidas, incluso en un contexto de un extensivo daño

retiniano, como el observado a las 4 semanas post-HOA. En esta serie de experimentos, se optó

por un período de 4 semanas después de la HOA con el fin de maximizar el daño funcional e

histológico de la retina, y descartar la posibilidad de una protección transitoria (o una muerte

retardada) de las CGRsm. A las 4 semanas post-HOA, se confirmó una disfunción retiniana

altamente significativa y marcadas alteraciones de la estructura de la retina. Aunque la proteína

Brn3a fue considerada un marcador para toda población de CGRs, recientemente se ha

demostrado que la subpoblación de CGRsm no expresan esta proteína (Jain y col., 2012). A las 4

semanas post-HOA, se observó una disminución significativa en el número de células Brn3a(+),

en tanto que no se observaron cambios en el número de células melanopsina(+). Este resultado

fue avalado a través de la determinación de los niveles proteicos de Brn3a y melanopsina

retinianos por Western blot, que demostró una disminución significativa en los niveles de Brn3a,

y la persistencia en los niveles de melanopsina. En concordancia con estos resultados, se ha

demostrado un aumento en la supervivencia de CGRsm en comparación con el resto de las

CGRs luego de la transección del NO (Li y col., 2008; Robinson y Madison, 2004). Por otra

parte, en trabajos recientes de nuestro laboratorio se demostró que, concomitantemente con una

disminución significativa en el número de células Brn3a(+), el número de CGRsm y los niveles

de melanopsina no se alteran en etapas avanzadas de retinopatía diabética experimental

(Fernandez y col., 2013). Otras evidencias de la robustez de las CGRsm proviene de estudios

sobre toxicidad inducida por el tratamiento con ácido kaínico (Sakamoto y col., 2005) o NMDA

(DeParis y col., 2012). Además, se ha demostrado una preservación relativa de las CGRsm en

Discusión

170

dos trastornos mitocondriales hereditarios que causan ceguera: la neuropatía óptica hereditaria de

Leber y la atrofia óptica dominante (La Morgia y col., 2010). En contraposición con estos

resultados, se ha demostrado una degeneración progresiva de las CGRsm en un modelo de

retinitis pigmentosa autosómica dominante (ratas P23H) (Esquiva y col., 2013) y en ratas

distróficas del Royal College of Surgeons (Vugler y col., 2008), y se demostró una reducción

comparable de CGRsm y de las CGRs convencionales con el envejecimiento en retinas humanas

(La Morgia y col., 2010) y modelos animales (Semo y col., 2003). En suma, estos resultados

junto a resultados obtenidos en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU (como se

discutirá más adelante) indican que la robustez de las CGRsm no parecería un fenómeno general,

sino que depende de la naturaleza del daño.

Con algunas excepciones, la mayoría de los trabajos mencionados han evaluado la

preservación de las CGRsm por Western blot y/o inmunohistoquímica, pero relativamente pocos

estudios han investigado la preservación de la capacidad funcional del sistema visual no

formador de imagen en enfermedades retinianas. En este contexto, estudios conductuales

demuestran que la función del reloj circadiano es normal en ratones con degeneración avanzada

de los fotorreceptores clásicos (Freedman y col., 1999), y en algunos seres humanos ciegos

(Klerman y col., 2002). Análogamente a los resultados discutidos más arriba, a las 4 semanas

post-HOA se observó un déficit casi total en el transporte anterógrado de CTB al CS y al NGL

contralaterales, en tanto que no se observaron cambios evidentes en el transporte de CTB desde

la retina de ojos sometidos a HOA a los NSQ o al NPO. Considerando que la mayoría de células

que proyectan a los NSQ y al NPO son melanopsina(+) (Gooley y col., 2003; Hattar y col.,

2006), estos resultados avalan la preservación de los axones de las CGRsm frente al daño

inducido por HOA.

Además de la preservación del soma y los axones de las CGRsm, los resultados obtenidos

demuestran que la funcionalidad de las CGRsm también se preservó en retinas de ojos sometidos

Discusión

171

a HOA. El reflejo pupilar difiere en función de la intensidad de luz y su longitud de onda, de

manera tal que las condiciones de estimulación utilizadas pueden producir respuestas pupilares

que reflejan la fototransducción mediada principalmente por bastones, conos, o melanopsina. En

ese sentido, existe consenso en que las respuestas desencadenadas por melanopsina se producen

en niveles de iluminación elevados, y que a menor intensidad de luz, los conos y los bastones

regulan la contracción pupilar (Grozdanic y col., 2007; Lucas y col., 2003). Cuando los ojos se

estimularon con luz de alta intensidad, el reflejo pupilar consensual a ojos sometidos a HOA, se

conservó en su totalidad, lo que es compatible con la preservación del transporte anterógrado de

CTB desde las retinas de ojos sometidos a HOA al NPO, que proyecta al núcleo de Edinger-

Westphal y controla la contracción de la pupila (Young y Lund, 1998). En contraste, con una luz

de baja intensidad, la HOA indujo una disminución significativa en el reflejo pupilar consensual,

consistente con la disminución de la onda a del ERG escotópico inducida por la HOA, que

refleja la respuesta de los fotorreceptores. Asimismo, los resultados obtenidos sugieren que los

circuitos neuronales en los que participan las CGRsm resultaron considerablemente “insensibles”

al glaucoma agudo aun en etapas tardías post-HOA. Estos resultados difirieron marcadamente de

las observaciones obtenidas en el modelo de glaucoma crónico inducido por CSU. La

hipertensión ocular crónica indujo una disminución significativa en el número de CGRsm (~

45%) y en los niveles de melanopsina (~ 50%) que fue similar a la observada para el número de

CGRs Brn3a(+) (~ 35%) y los niveles de Brn3a (~ 45%), respectivamente, lo que sugiere que las

CGRsm fueron similarmente vulnerables a los efectos deletéreos de la hipertensión ocular

crónica que el resto de las CGRs. Estos resultados fueron avalados por el estudio del transporte

anterógrado retiniano, que demostró una disminución evidente en la marca de CTB, tanto en las

áreas formadoras de imagen, como en el IG, los NSQ y el NPO. Análogamente, Drouyer y col.

(2008) demostraron una reducción en el transporte de CTB a estas estructuras, y una

disminución comparable en los niveles de ARNm de melanopsina (~25%) y de Thy-1 (~20%)

Discusión

172

(otro marcador específico de CGRs) a las 17 semanas de hipertensión ocular inducida por

fotocoagulación con láser de las venas epiesclerales. Asimismo, en concordancia con estos

resultados, se demostró una pérdida significativa de CGRsm y una reducción significativa en los

niveles de ARNm de melanopsina en ratas Wistar en el mismo modelo de glaucoma (Wang HZ y

col., 2008). En contraste con estos resultados, Li y colaboradores (2006), utilizando un modelo

experimental de glaucoma inducido por la fotocoagulación de las venas epiesclerales y límbicas

en ratas Sprague-Dawley demostraron que las CGRsm son resistentes incluso después de 12

semanas de hipertensión ocular. Por lo tanto, parece posible que el modelo experimental, así

como la cepa de rata o el intervalo de hipertensión analizado, podría explicar esta discrepancia.

Diversas líneas de evidencia demuestran defectos en el reflejo pupilar en pacientes con

glaucoma crónico de ángulo abierto (Kaback y col., 1976; Kohn y col., 1979; Prywes, 1976). Sin

embargo, un número muy reducido de estudios han examinado el reflejo pupilar en modelos

experimentales de glaucoma crónico en ratas. En ese sentido, se demostró un déficit significativo

del reflejo pupilar que se correlaciona con los valores de PIO en ratas Brown Norway con

glaucoma experimental crónico inducido por la cauterización de 3 venas vorticosas y 2 venas

epiesclerales (Grozdanic y col., 2003). En ratas con 6 ó 15 semanas de glaucoma crónico

experimental inducido por inyecciones semanales de CSU se observó una disminución del

reflejo pupilar inducido por luz de alta intensidad, una observación que es compatible con la

disminución de la marca de CTB en el NPO, observada en ambos períodos de hipertensión

ocular. Cabe señalar que si bien no se observaron cambios en los niveles de melanopsina y en el

número de CGRsm en ojos inyectados con CSU durante 6 semanas, la disminución significativa

del reflejo pupilar fue evidente incluso en este período de hipertensión ocular. Estos resultados

sugieren que el reflejo pupilar podría ser un indicador no invasivo y sensible de la disfunción del

sistema visual no formador de imagen, dado que este parámetro reveló una alteración en un

momento en el que los niveles de melanopsina no se modificaron. En suma, estos resultados

Discusión

173

indican una alteración significativa del sustrato neuronal en particular y del sistema visual no

formador de imagen en general, en el glaucoma crónico experimental.

Aún queda por analizar las diferencias entre ambos modelos de glaucoma con respecto al

sistema visual no formador de imagen. Al respecto, cabe señalar que los resultados obtenidos en

el estudio del efecto de la HOA sobre el sistema visual no formador de imagen, fueron

sorprendentes. Considerando la magnitud del daño retiniano observado en estas condiciones

experimentales, el resultado más previsible hubiera sido una afectación significativa de las

CGRsm en particular y del sistema visual no formador de imagen en general. Si bien no puede

descartarse que estos cambios puedan ocurrir en etapas aún más avanzadas post-HOA, los

resultados obtenidos sugieren que las CGRsm resultaron considerablemente “insensibles” a la

HOA, incluso en un intervalo en el que ya tuvieron lugar alteraciones muy notables de la

estructura y función visual. Sobre la base de este estudio experimental, se podría predecir que a

pesar de una baja visión, pacientes con glaucoma agudo, podrían retener el sustrato neuronal y la

funcionalidad del sistema visual no formador de imagen, lo que les permitiría evitar las

consecuencias de la desincronización de su sistema circadiano. En este sentido, los resultados

obtenidos en el modelo de glaucoma agudo apoyan el concepto de que las CGRsm son funcional

y morfológicamente diferentes de la CGRs “tradicionales” y que pueden disponer de una

resistencia intrínseca para sobrevivir después de una HOA y deletérea. Algunos mecanismos han

sido implicados en la robustez de las CGRsm, particularmente, el polipéptido hipofisario

activador de la adenilato ciclasa (PACAP) que se expresa en las CGRsm (Hannibal y col., 2006)

y la enzima fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) (Li y col., 2008), aunque existe evidencia que

desafía la participación de estas señales (DeParis y col., 2012; Perganta y col., 2013). En todo

caso, es evidente que los mecanismos que contribuyen a la robustez de las CGRsm en el

glaucoma agudo no son similarmente eficientes en el modelo de glaucoma crónico, por razones

aún elusivas. Sin embargo, si bien en términos generales, las formas aguda y crónica del

Discusión

174

glaucoma comparten los mismos blancos celulares en el sistema visual, es posible que los

mecanismos patogénicos involucrados en cada caso difieran de manera significativa. Mientras el

glaucoma agudo es una disfunción esencialmente isquémica, el componente isquémico en el

modelo crónico parecería menos relevante o al menos sólo un aspecto patogénico parcial de la

enfermedad. En este sentido, es posible postular que las CGRsm podrían ser resistentes a la

isquemia retiniana, como lo avala su robustez frente a la retinopatía diabética (Fernandez y col.,

2013), pero no a los otros mecanismos de daño (mecánico, neuroquímico, etc.) involucrados en

la forma crónica de la enfermedad. También en este sentido, es necesario considerar el curso

temporal que difiere marcadamente entre ambos modelos, es decir, es posible que las CGRsm

sean capaces de resistir frente a una noxa intensa pero aguda, y sean susceptibles frente a un

daño moderado, pero persistente. La robustez de las CGRsm frente a la HOA también podría ser

también interpretada en términos evolutivos. Los mecanismos del reloj circadiano y la vía de

sincronización desde la retina en vertebrados representan un sistema que ha conferido ventajas

adaptativas a sus portadores, permitiéndoles adaptarse a las fluctuaciones ambientales periódicas

(luz y temperatura, por ejemplo) y coordinar procesos fisiológicos en momentos ambientales

óptimos. Además, el sistema circadiano es capaz de amortiguar cambios sutiles o extremos y

persistir en ausencia de señales ambientales (Bell-Pedersen y col., 2005; Duguay y Cermakian,

2009; Hotta y col., 2007; Peirson y col., 2009). Considerando el rol central de las CGRsm en la

fisiología circadiana, parecería probable que la presión evolutiva haya contribuido a la

preservación de este sistema fotosensible proporcionándole a través de años de selección natural,

la capacidad para resistir a distintas presiones de selección (pero no necesariamente a todas,

como al glaucoma crónico). En todo caso, resulta particularmente atractiva la posibilidad de

identificar los mecanismos involucrados en la resistencia de las CGRsm frente al daño inducido

por glaucoma agudo, considerando que a partir de la manipulación de estos mecanismos podría

Discusión

175

ser posible proveer nuevos enfoques terapéuticos para la protección de estas células, así como de

las CGRs en su conjunto, particularmente en el glaucoma crónico.

Como ya se mencionó, el “escenario” fue notablemente diferente en el glaucoma crónico

experimental con respecto al glaucoma agudo, en el que se observó una afectación significativa

de las CGRsm y sus axones. Como se muestra en este trabajo de Tesis, el glaucoma crónico

podría provocar alteraciones no sólo visuales, sino también en funciones visuales no formadoras

de imagen. Trastornos del sistema circadiano pueden provocar falta de concentración, menor

rendimiento, disminución de habilidades cognitivas, coordinación psicomotora pobre y dolores

de cabeza, entre muchos otros. Existen diversas estrategias terapéuticas para restablecer el

equilibrio circadiano. Por lo tanto, a través de la identificación de los trastornos circadianos en el

glaucoma crónico, estos resultados podrían contribuir a mejorar la calidad de vida de los

pacientes con esta enfermedad ocular.

4. Consecuencias conceptuales de los resultados obtenidos y perspectivas futuras

El objetivo central de este trabajo fue examinar las consecuencias del glaucoma sobre el

sistema visual en general, más allá de los reconocidos efectos a nivel retiniano (específicamente

la pérdida de CGRs) y las comparativamente menos exploradas consecuencias a nivel del NO.

Para ello, en una primera instancia se utilizó un modelo experimental que remeda la situación

clínica del glaucoma agudo humano, que como ya se mencionó, no resultó una herramienta

adecuada para la descripción de la secuencia temporal de eventos deletéreos en la retina, el NO y

el CS por su rápida evolución. En cambio, en el modelo de glaucoma crónico utilizado en este

trabajo, que tiene ventajas comparativas con otros modelos de glaucoma crónico de ángulo

abierto, se obtuvieron indicios de significación respecto al efecto de la hipertensión ocular sobre

estructuras visuales post-retinianas. En este sentido, en el curso de esta Tesis se han demostrado

alteraciones axo-gliales significativas en la retina, el NO y el CS, algunas de las cuales incluso

precedieron a la muerte de las CGRs, que es considerado el signo patognomónico de la

Discusión

176

enfermedad. Es muy probable que una lesión del SNC no consista en cambios independientes en

las diferentes clases de células que lo componen, sino más bien, es plausible que las

interacciones entre las neuronas, los axones y las células gliales también se alteren en detrimento

de las demandas fisiológicas y las funciones del sistema nervioso. En este sentido, aunque aún

no estamos en condiciones de establecer si el daño glaucomatoso ocurre inicialmente en los

somas de las CGRs, sus axones o en los componentes gliales de la retina, el NO o el CS, nuestros

resultados podrían sugerir que la comunicación multidireccional entre todos estos “actores del

sistema visual” puede ser negativamente afectada por la enfermedad. Esta concepción más

holística del glaucoma podría tener consecuencias de transferencia clínica, de manera tal que las

terapias de nueva generación deberían tener en cuenta las alteraciones en las distintas estaciones

de relevo del procesado visual al momento de elegir un tratamiento exitoso. A partir de estos

resultados (a pesar de estar en una etapa experimental), resulta evidente que un tratamiento será

efectivo si y sólo si permite evitar o al menos reducir la progresión del daño glaucomatoso a

nivel de la vía visual en su conjunto. También desde esta nueva perspectiva, es posible predecir

que una terapéutica anti-glaucomatosa eficiente debería involucrar una estrategia compleja, dada

la multiplicidad de los eventos deletéreos y de los componentes celulares afectados. Como ya se

mencionó, al presente, la principal estrategia terapéutica para el glaucoma está dirigida a

disminuir farmacológica o quirúrgicamente la PIO. Los resultados obtenidos en esta Tesis

podrían proveer una interpretación racional a la evidencia de que el éxito del tratamiento (en

términos de protección de la función visual) sea por ahora muy limitado, como lo sustenta el

hecho de que el glaucoma sigue siendo una de las principales causas de ceguera irreversible, a

pesar de los constantes esfuerzos invertidos en mejorar las estrategias para reducir la

hipertensión ocular.

Desde una perspectiva terapéutica y considerando que la activación microglial fue un

aspecto consistente en todas las áreas visuales evaluadas, se analizó el efecto de la minociclina.

Discusión

177

El efecto de la minociclina sobre la activación microglial (un evento central en las enfermedades

neurodegenerativas en general y eventualmente también en el glaucoma), así como su efecto

beneficioso en distintos modelos de enfermedad neurológica y su buena tolerancia para su uso en

humanos, acredita la potencialidad terapéutica de la minociclina para su consideración en el

tratamiento del glaucoma. En este sentido, si bien aún quedan diversos aspectos por analizar, los

resultados obtenidos avalan el uso de minociclina, (eventualmente en conjunto con hipotensores

oculares y compuestos neuroprotectores) para el tratamiento de esta enfermedad, pero además,

estos resultados aportan evidencias sobre la participación microglial en el daño glaucomatoso,

análogamente a lo descripto en otros procesos neurodegenerativos.

Otro de los aspectos analizados en esta Tesis fue el estudio del sistema visual no

formador de imagen en ambas formas de glaucoma experimental. También en este sentido,

quedan aún muchos interrogantes por contestar, como las causas de la resistencia de las CGRsm

al glaucoma agudo y de su susceptibilidad al glaucoma crónico, así como los mecanismos

involucrados en la protección y el daño de estas células, respectivamente. Sin embargo, estos

resultados avalan la importancia de incluir al sistema visual no formador de imagen en el marco

del estudio de enfermedades oftalmológicas en general y del glaucoma en particular. El papel

central de la retina en el sistema generador de ritmos circadianos y las consecuencias

considerables de las alteraciones circadianas sobre la salud humana, acreditan la importancia de

evaluar este sistema y desarrollar estrategias terapéuticas para el tratamiento frente a un mal

funcionamiento o pérdida de las CGRsm. En suma, si bien en el intento de incorporar nuevos

conceptos sobre la neuropatía glaucomatosa, esta Tesis muy probablemente haya generado más

preguntas que respuestas (como corresponde a cualquier trabajo científico), los hallazgos de este

trabajo generan genuinas expectativas de que las nuevas respuestas que surjan de los nuevos

interrogantes contribuyan en forma significativa a mejorar la calidad de vida de los pacientes con

glaucoma.

Bibliografía

178

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