FABRICATION AND CHARACTERIZATION OF 3D PRINTED 

POLY(CAPROLACTONE) SCAFFOLDS WITH BIMODAL 

POROSITY FOR LOCAL DRUG DELIVERY AND TISSUE 

RECONSTRUCTION APPLICATIONS 

Hoang Phuc Dang 

B.Eng. (Biomedical Engineering) 

 

Submitted in fulfilment of the requirements for the degree of 

Doctor of Philosophy 

 

School of Chemistry, Physics and Mechanical Engineering 

Science and Engineering Faculty 

Queensland University of Technology 

2020 

 

Keywords 

Screw melt extrusion, porogen leaching, bimodal porosity, tissue reconstruction, local 

drug delivery, chemotherapy 

Abstract 

Tissue  reconstruction  of  large/critical‐size  defects  requires  scaffolds  that  are  able  to 

support tissue regeneration. In addition, tissue inflammation and disease recurrence are major 

challenges  after  implantation.  Therefore,  there  is  an  urgent  need  to  develop  new  types  of 

scaffolds able to deliver drugs locally to prevent inflammation and disease recurrence as well as 

support tissue reconstruction. 

This PhD project focused on the fabrication and characterisation of a new type of three‐

dimensional (3D) scaffold having macroscale porosity generated from the printing pattern and 

intra‐strut microscale porosity to be used as a dual‐function scaffold for local drug delivery and 

tissue reconstruction. The applications of  the scaffold  for  local drug delivery as well as  tissue 

regeneration were demonstrated in vitro and in vivo. 

The fabrication of bimodal porous scaffolds utilising screw melt extrusion and porogen 

leaching techniques was described. Physicochemical and in vitro characterisation demonstrated 

that the bimodal porous scaffold had greater surface area and faster degradation compared with 

conventional 3D‐printed scaffolds without microscale porosity. 

The application of the bimodal porous scaffold in drug delivery was characterized. The 

scaffold demonstrated different release profiles in vitro when loaded with drugs having different 

charge and hydrophilic/hydrophobic properties. Drugs with more charge had more interaction 

with  the  scaffold;  hence,  burst  release was  reduced  and  release was  sustained.  Conversely, 

uncharged hydrophilic drugs had less interaction with the scaffold, and hence released faster and 

might benefit from hydrogel coating. The antimicrobial effects and chemotherapeutic effects of 

drug–loaded  scaffolds were  demonstrated,  and  showed  that  antibiotic–loaded  scaffolds  and 

chemotherapeutic  agent–loaded  scaffolds  maintained  their  bioactivity  after  fabrication  and 

could be used for infection prevention and anti‐cancer applications. 

The bimodal porous scaffold was further investigated as a local drug implant in a mouse 

orthotopic breast cancer model. Results demonstrated that the  local treatment slowed down 

tumour recurrence progression and reduced systemic cytotoxicity compared with a conventional 

systemic administration method. In vivo and ex vivo bioluminescence imaging demonstrated that 

doxorubicin  (DOX)–loaded  scaffolds  reduced  tumour  growth  compared with  the  control  and 

intravenous injection (I.V.) treatment. Weight monitoring confirmed that DOX–loaded scaffolds 

had less cytotoxicity compared with I.V. treatment. Immunohistological staining was performed 

to validate the chemotherapeutic effect and evaluate the cytotoxicity of the treatment. Overall, 

DOX–loaded scaffolds were shown to be a potential substitute for systemic administration of 

chemotherapeutic agents to improve treatment efficiency and reduce systemic toxicity. 

Last, the application of the bimodal porous scaffold in tissue regeneration demonstrated 

its ability to support new bone formation at the defect area in a rat critical‐size calvarial defect 

model.  The  scaffold  demonstrated  a  similar  level  of  new  bone  formation  and  inflammatory 

response  to  biomimetic  calcium  phosphate  (CaP)‐coated  scaffolds,  which  was  confirmed  by 

micro‐computed tomography scanning and immunohistochemical staining. Further, the porous 

scaffold was shown to have additional space inside struts for extracellular substance infiltration, 

which could support and provide additional space for tissue formation. 

In summary, in my PhD studies, I investigated the fabrication and validation of a new type 

of 3D‐printed scaffold with macro/microscale porous structure for local drug delivery and tissue 

reconstruction application. The scaffold was proved  to provide  superior  treatment  for breast 

cancer  in a mouse model compared with a  systemic administration method as  it used  lower 

quantities of drugs, reduced tumour recurrence and reduced toxicity. The scaffold was also able 

to enhance tissue reconstruction in vivo in a rat model. 

List of Publications 

Peer‐reviewed journal articles related to this thesis 

1. Luke E. Visscher*, Hoang Phuc Dang*, Mark A. Knackstedt, Dietmar W. Hutmacher, 

and Phong A. Tran. "3D printed Polycaprolactone scaffolds with dual macro‐

microporosity for applications in local delivery of antibiotics." Materials Science and 

Engineering: C 87 (2018): 78‐89. * Contributed equally. 

2. Hoang Phuc Dang, Tara Shabab, Abbas Shafiee, Quentin C. Peiffer, Kate Fox, Nhiem 

Tran, Tim R Dargaville, Dietmar Werner Hutmacher and Phong A Tran. “3D printed 

dual macro‐, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug 

delivering function” Biofabrication 11 (2019): number 3. 

3. Hoang Phuc Dang, Cedryck Vaquette, Tara Shabab, Román A. Pérez, Ying Yang, Tim 

R. Dargaville, Dietmar W. Hutmacher, Abbas Shafiee, Phong A. Tran. “3D printed 

scaffolds with dual macro‐, micro‐scale porous networks for bone tissue 

regeneration” (submitted to Biomaterials Journal) 

4. Hoang Phuc Dang, Abbas Shafiee, Tim R. Dargaville, Christoph A. Lahr and Phong A. 

Tran. “Delivery of doxorubicin from the implanted bimodal porous 

polycaprolactone scaffolds decreased systemic cytotoxicity and breast tumour 

recurrence progression in mice” (under supervisor revision and targeted to submit 

to Advanced Functional Materials Journal) 

Peer‐reviewed journal articles unrelated to this thesis 

5. Phong A. Tran, Hiep T. Nguyen, Philip J. Hubbard, Hoang Phuc Dang, and Dietmar W. 

Hutmacher. "Mineralization of plasma treated polymer surfaces from super‐saturated 

simulated body fluids." Materials Letters 230 (2018): 12‐15. 

Peer‐reviewed book chapter unrelated to this thesis 

6. Mina Mohseni, Nathan J. Castro, Hoang Phuc Dang, Tan Dat Nguyen, Hieu Minh Ho, Minh 

Phuong Nam Tran, Thi Hiep Nguyen, and Phong A. Tran. "Adipose tissue regeneration: 

Scaffold—Biomaterial strategies and translational perspectives." In Biomaterials in 

Translational Medicine, pp. 291‐330. Academic Press, 2019. 

Conference presentations (Oral and Poster) 

7. Hoang Phuc Dang, Phong A Tran and Dietmar W Hutmacher. “The use of 3D printed 

microporous‐strut polycaprolactone scaffolds for targeted local delivery of 

chemotherapeutic agent for breast cancer application” The 7th International 

Conference in Vietnam on the Development of Biomedical Engineering 2018. (oral 

presentation) 

8. Hoang Phuc Dang, Tara Shabab, Abbas Shafiee, Cedryck Vaquette, Ying Yang, Tim R. 

Dargaville, Dietmar W. Hutmacher and Phong A. Tran. “Biomimetics multiscale 

porous scaffolds for bone tissue engineering” the Biomimetics in Bioengineering 

Conference 2019. (interactive poster presentation) 

9. Hoang Phuc Dang, Abbas Shafiee, Dietmar W. Hutmacher and Phong A. Tran. “Local 

delivery of doxorubicin loaded scaffolds decreasing breast tumor progression and 

systemic cytotoxicity” the TERMIS‐AP + ABMC7 2019 Congress. (oral presentation) 

10. Hoang Phuc Dang, Cedryck Vaquette, Abbas Shafiee, Dietmar W. Hutmacher and 

Phong A. Tran. “Dual Scale Macro/micro Porous Scaffolds for Bone Tissue 

Regeneration” the TERMIS‐AP + ABMC7 2019 Congress. (poster presentation) 

Table of Contents 

Keywords ................................................................................................................................................. ii 

Abstract .................................................................................................................................................. iii 

List of Publications .................................................................................................................................. v 

Table of Contents .................................................................................................................................. vii 

List of Figures .......................................................................................................................................... x 

List of Tables ......................................................................................................................................... xvi 

List of Supplementary Figures ............................................................................................................. xvii 

List of Supplementary Tables ............................................................................................................... xix 

List of Abbreviations .............................................................................................................................. xx 

Statement of Original Authorship ...................................................................................................... xxiii 

Acknowledgments .............................................................................................................................. xxiv 

Note to the reader ................................................................................................................................... i 

1 CHAPTER 1:  INTRODUCTION ....................................................................................................... 2 

1.1  Background .................................................................................................................................. 2 

1.2  Literature Review ......................................................................................................................... 3 1.2.1  3D printing technology in biomedical application ............................................................ 3 1.2.2  Porosity in 3D printed scaffolds ........................................................................................ 4 1.2.3  Bimodal porosity ............................................................................................................... 5 1.2.4  3D printed polycaprolactone in tissue reconstruction application and local drug 

delivery application .......................................................................................................... 7 1.2.4.1 Additive manufactured 3D polycaprolactone ................................................................... 7 1.2.4.2 3D printed polycaprolactone in tissue reconstruction application .................................. 7 1.2.4.3 3D printed polycaprolactone in local drug delivery application ....................................... 8 

1.3  Research Gap ............................................................................................................................... 8 

1.4  HypothesIs and objectives ......................................................................................................... 10 

1.5  Scope of study and thesis Outline .............................................................................................. 10 

2 CHAPTER 2:  3D PRINTED POLYCAPROLACTONE SCAFFOLDS WITH DUAL MACRO‐MICROPOROSITY FOR APPLICATIONS IN LOCAL DELIVERY OF ANTIBIOTICS .............................................................. 13 

2.1  Abstract ...................................................................................................................................... 16 

2.2  Introduction ............................................................................................................................... 16 

2.3  Materials and Methods .............................................................................................................. 19 

2.4  Results ........................................................................................................................................ 26 2.4.1  Scaffold manufacturing and characterization................................................................. 26 2.4.2  Degradation test. ............................................................................................................ 30 2.4.3  Loading and release of antibiotics and its bioactivity. .................................................... 32 2.4.4  Biocompatibility testing .................................................................................................. 37 

2.5  Discussion .................................................................................................................................. 38 

2.6  Conclusion .................................................................................................................................. 42 

3 CHAPTER 3:  3D PRINTED DUAL MACRO‐, MICROSCALE POROUS NETWORK AS A TISSUE ENGINEERING SCAFFOLD WITH DRUG DELIVERING FUNCTION...................................................... 44 

3.1  Abstract ...................................................................................................................................... 47 

3.2  Introduction ............................................................................................................................... 48 

3.3  Materials and Methods .............................................................................................................. 51 3.3.1  Scaffold fabrication ......................................................................................................... 51 3.3.2  Scaffold characterization ................................................................................................ 52 3.3.3  Drug loading, characterization and in vitro release ........................................................ 53 3.3.4  Antimicrobial assay ......................................................................................................... 55 3.3.5  In vitro chemotherapeutic effect .................................................................................... 55 3.3.6  Statistical analysis ........................................................................................................... 56 

3.4  Results ........................................................................................................................................ 56 3.4.1  Material preparation, extrusion and scaffold characterization ...................................... 56 3.4.2  Micropores partially reduced compression Young’s modulus of scaffolds .................... 58 3.4.3  In vitro drug release ........................................................................................................ 59 3.4.4  Loading and release of doxorubicin as a water‐soluble and positively charged drug .... 59 3.4.5  Loading and release of paclitaxel as model insoluble non‐charged drug ....................... 63 3.4.6  Loading and release of Cefazolin as model water‐soluble, negatively charged drug –

PLGA overcoat can lead to sustained release ................................................................. 66 3.4.7  In vitro bioactivity of drug–loaded scaffolds .................................................................. 69 3.4.7.1 Antimicrobial effect of Cefazolin–loaded scaffolds ........................................................ 69 3.4.7.2 Effect of pMPCL scaffolds loaded with chemotherapeutic drugs against cancer cells ... 70 

3.5  Discussion .................................................................................................................................. 72 

3.6  Conclusion .................................................................................................................................. 76 

4 CHAPTER 4:  DELIVERY OF DOXORUBICIN FROM THE IMPLANTED BIMODAL POROUS POLYCAPROLACTONE SCAFFOLDS DECREASED SYSTEMIC CYTOTOXICITY AND BREAST TUMOUR RECURRENCE PROGRESSION IN MICE ........................................................................................... 77 

4.1  Abstract ...................................................................................................................................... 80 

4.2  Introduction ............................................................................................................................... 81 

4.3  Materials and Methods .............................................................................................................. 84 4.3.1  Scaffold fabrication ......................................................................................................... 84 4.3.2  Drug loading ................................................................................................................... 84 4.3.3  In vitro chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds against breast cancer

  85 4.3.4  In vitro drug release ........................................................................................................ 86 4.3.5  Application of doxorubicin–loaded scaffolds in preventing breast cancer recurrence 

and metastasis ................................................................................................................ 86 4.3.5.1 Cell culture ...................................................................................................................... 86 4.3.5.2 Tumour establishment.................................................................................................... 86 4.3.5.3 Treatment ....................................................................................................................... 87 4.3.5.4 In vivo drug release in blood ........................................................................................... 88 4.3.5.5 Histology and immunohistochemistry staining .............................................................. 88 4.3.5.6 Statistical analysis ........................................................................................................... 89 

4.4  Results ........................................................................................................................................ 89 4.4.1  Scaffold characterization ................................................................................................ 89 4.4.2  Drug loading ................................................................................................................... 91 4.4.3  In vitro chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds against breast cancer

  92 4.4.4  Drug release behaviour of doxorubicin–loaded bimodal scaffolds ................................ 92 4.4.5  Application of doxorubicin–loaded scaffolds in preventing breast cancer recurrence 

and metastasis ................................................................................................................ 93 

4.4.5.1 Doxorubicin concentration in peripheral blood ............................................................. 93 4.4.5.2 Cytotoxicity of doxorubicin–loaded scaffolds. ................................................................ 93 4.4.5.3 Chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds ........................................... 97 

4.5  Discussion ................................................................................................................................ 102 

4.6  Conclusion ................................................................................................................................ 106 

5 CHAPTER 5:  3D PRINTED SCAFFOLDS WITH DUAL MACRO‐, MICRO‐SCALE POROUS NETWORKS FOR BONE TISSUE REGENERATION ............................................................................................. 108 

5.1  Abstract .................................................................................................................................... 111 

5.2  Introduction ............................................................................................................................. 111 

5.3  Materials and Methods ............................................................................................................ 113 5.3.1  Preparation and characterization of the porogen, mPCL films and mPCL‐porogen films

  113 5.3.2  Fabrication and characterization of mPCL scaffolds ..................................................... 114 5.3.3  Physicochemical characterization................................................................................. 116 5.3.4  Tensile strength characterization ................................................................................. 117 5.3.5  Accelerated degradation .............................................................................................. 118 5.3.6  In vitro hematoma model ............................................................................................. 118 5.3.7  Cell culture study .......................................................................................................... 119 5.3.8  Protein adsorption ........................................................................................................ 120 5.3.9  Cell proliferation ........................................................................................................... 120 5.3.10 In vivo study .................................................................................................................. 121 5.3.11 Statistical analysis ......................................................................................................... 122 

5.4  Results ...................................................................................................................................... 123 5.4.1  Scaffold manufacturing ................................................................................................ 123 5.4.2  Porogen leaching .......................................................................................................... 124 5.4.3  Physicochemical properties .......................................................................................... 124 5.4.4  Tensile strength ............................................................................................................ 127 5.4.5  Microscale porosity accelerated degradation of mPCL scaffolds ................................. 127 5.4.6  In vitro hematoma model ............................................................................................. 130 5.4.7  Multiphasic scaffolds enhanced protein adsorption in vitro ......................................... 132 5.4.8  Multiphasic scaffolds had better support for cell proliferation in vitro ........................ 133 5.4.9  In vivo study .................................................................................................................. 133 

5.5  Discussion ................................................................................................................................ 139 

5.6  Conclusion ................................................................................................................................ 143 

6 CHAPTER 6: CONCLUSION AND FUTURE DIRECTIONS ............................................................... 144 

6.1  Conclusion ................................................................................................................................ 144 

6.2  Limitations and Future Directions ............................................................................................ 145 6.2.1  Chapter 2 ...................................................................................................................... 146 6.2.2  Chapter 3 ...................................................................................................................... 147 6.2.3  Chapter 4 ...................................................................................................................... 147 6.2.4  Chapter 5 ...................................................................................................................... 147 

APPENDICES .............................................................................................................................. 149 

BIBLIOGRAPHY .......................................................................................................................... 160  

List of Figures 

Figure 1. (a) home‐built screw melt exutrsion device. (b) Schematic of fabrication process of PCL scaffolds using SME and salt leaching techniques. ......................................................................................... 20 

Figure 2. Schematic of accelerated degradation experiment .................................................................... 23 

Figure 3. Scaffold characterization. Overview images (insets) and SEM images of scaffolds at increasing magnifications for microporous scaffolds ((a1)‐(a3)), normal scaffolds (solid strut, (b1)‐(b3)) and GelMA coated microporous scaffolds ((c1)‐(c3)) and GelMA coated solid scaffolds ((d1)‐(d3)). Scale bars = 500 μm for (a1)‐(d1); 200 μm for (a2)‐(d2); 50 μm for (a3)‐(d3). Micro CT images of e) microporous scaffold and f) solid scaffold at two representative cross sectional planes. Microporosity analyzed by measuring in 2D slice images from micro CT is c.a. 41%. Circular non‐interconnected pore present in the solid scaffolds (f) are believed to result from air entrapment during the extrusion process. g) The leaching process of mPCL over 14 days indicating complete leaching of porogen was achieved. Scaffolds were dissolved in chloroform to make solutions of 10 %( w/v). Any porogen remained in the scaffold would give rise to the solution absorbance which was measured with a spectrophotometer. ............................................................................................ 27 

Figure 4. Physicochemical characterization of microporous mPCL scaffolds compared with mPCL scaffolds showing mean + SEM for: a)& b) AFM imaging and surface roughness analysis showing non‐significant difference in topography; c) contact angles demonstrating similar hydrophilicity as expected from surface hydrolysis of mPCL during leaching d) porosity determined using scaffold dimensions, weight and mPCL density (n=4). Total porosity was significantly higher for microporous scaffolds at 80±1% compared with 62±0.3% for the solid scaffolds. e) surface areas measured with gas adsorption and analyzed with B.E.T method was also significantly higher for the microporous group (data is average of 2 measurements) and f) compressive modulus (MPa) over three compressing ‐ relax cycles (n=3) showing non‐significantly lower values for microporous scaffolds. g) Mean Zeta potential for solid and microporous scaffolds showing both having negative surface charges with no significant difference as expected from the same post‐printing treatment procedure to both scaffolds. (* p < 0.05). ........................................................................................................ 29 

Figure 5. Accelerated degradation test. mPCL and microporous mPCL scaffolds were immersed in NaOH 2M in a shaker incubator (at 37oC, 121 rpm) for 48 hours. SEM imaging revealed the substantial increase in porosity both on the surface and cross section of the microporous scaffold (scale bars = 100 μm). (e): GPC analysis showed results of molecular weight changes after the test; mPCL scaffolds exhibited slight increase in Mw likely due to the removal of amorphous/less crystalline region during the degradation from the scaffolds. The reduction in Mw of microporous scaffolds is attributed to the bulk erosion as seen in SEM images on the surface and cross section of the scaffolds. ....................................................................................................................................... 31 

Figure 6. Characterization of Cefazolin release kinetics from scaffolds. [A]: comparison of Cefazolin non‐cumulative release profiles for GelMA coated microporous mPCL and solid mPCL over the first 6 hours and next 7 days reported as mean±SEM  (n=9)  a) The released Cefazolin concentrations showed dose dependence in both normal and microporous scaffolds. The microporous scaffolds also showed consistently higher release up to day 6 (comparing within the same dose group). b) The total Cefazolin amount released at each time point (in μg) was consistently higher for microporous compared with normal scaffolds for 3 consecutive days. [B]. Comparison of Cefazolin release profiles in PBS for microporous mPCL scaffolds with and without GelMA coating (n=9) at high loading dose a) total release from scaffolds with a reduced burst release for GelMA coated scaffolds which released significantly less in the first 6 hours and b) release at each time point presented as percentage of total released, with the GelMA coated scaffolds showing a more gradual release indicating a reduced burst release. ................................................................................................................... 33 

Figure 7. Antimicrobial activity of Cefazolin on S. aureus. [A] Effects of Cefazolin on planktonic S. aureus growth. a) Characterization of S. aureus growth demonstrating a typical growth curve of the bacteria including an initial lag phase (3 hours) followed by log growth phase (8 hours) (n=3). The stationary phase was not tested in this experiment. Bacteria in the log growth phase were then used for subsequent antibiotic testing experiments. b) Growth curves of S. aureus treated with increasing concentrations of Cefazolin, demonstrating the MIC50 = 0.1 ppm and MIC90=0.8 ppm where 50% and 80% of bacterial growth was inhibited respectively (n=3) [15]. [B] Bioactivity of Cefazolin eluates collected at different time points from microporous mPCL scaffolds loaded with Low, Medium   and High Dose of Cefazolin determined as CFU normalized by that of untreated control. Data = mean ± SEM (N=3 repeats with 3 replicates in each repeat). The eluates demonstrated dose‐dependent antimicrobial activity from which MIC90 of eluted Cefazolin was calculated to be c.a 0.7 to 1.3 ppm, and an MIC50 of c.a. 0.3ppm which are similar to those of fresh Cefazolin in [A]b). ......................... 36 

Figure 8. In vitro testing of biocompatibility and activity. Alamarblue assay on 3T3 fibroblast cells. a) Standard curve correlating fluorescence intensity (excitation: 544 nm, emission: 590 nm) and fibroblast cell number (data = mean± SEM, n=3) showing strong correlation (R2=0.999). b) Fibroblast cell number (data = mean± SEM, N=3) after 24 hour treatment with different concentrations of Cefazolin indicating no cytotoxicity of Cefazolin concentration of up to 100ppm. c) Agar diffusion test of Cefazolin–loaded microporous scaffolds (without GelMA coating) showing dose‐dependent zone of inhibition on S. aureus. * p<0.05, data = mean ± S.E.M (n= 8). d) In vitro blood clot formation on scaffolds. No significant difference in blood clot weight formed in presence of microporous PCL scaffold without (PCL scaffold) and with high dose of Cefazolin (PCL Scaffold with Cefazolin) compared with control group without scaffold (blood only) (n=5). .................................................. 37 

Figure 9. Scanning electron microscopy (SEM) images showing surface pores on both non‐porous (nMPCL) and microporous (pMPCL) scaffolds (A, B, E, F) yet only pMPCL scaffold showed porous struts (G, H) compared with solid struts in nMPCL (C, D). The majority of intra‐strut micropores in pMPCL show interconnection with surrounding pores (arrows in G, H) and the surface pores on nMPCL are only artifacts of the extrusion (arrow in D). .......................................................... 56 

Figure 10. Intra‐strut micropores reduced compression Young’s modulus of polycaprolactone (MPCL) scaffolds. (A): Effective compression Young’s modulus (data are expressed as mean ± s.e.m, n=9) showed no significant difference in the 0‐10% compression range. At 10‐15% and 15‐20% range, the micropores significantly reduced Young’s modulus of pMPCL. (B): SEM images of non‐microporous (nMPCL) and microporous (pMPCL) after the compression test showing the collapse of some micropores during the compression. ** is p<0.01 and from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. ........................................................................................................ 59 

Figure 11. DOX immobilized only on surface of nMPCL but both on surface and in intra‐strut pores of pMPCL. (A): bright field images of nMPCL and pMPCL before and after DOX–loading at 10 µg/mg. (B): Cross‐sections of nMPCL and pMPCL showing auto‐fluorescence of DOX on the surface of nMPCL and inside the struts of pMPCL. (C): FT‐IR spectra of DOX–loaded onto MPCL at increasing 3 loading doses (Low, Medium and High Doses). ................................................... 61 

Figure 12. Intra‐strut micropores reduced burst release and prolonged release profile of drug–loaded microporous polycaprolactone (pMPCL) scaffolds. Drug release from scaffolds–loaded with increasing doses of DOX (Low, Medium and High doses) in PBS at pH 7.4 and pH 5.5 (data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). pMPCL had less burst release and more prolonged elution compared with nMPCL. The release from DOX–loaded scaffolds increased under acidic conditions (pH 5.5). ...................................................................................................................... 62 

Figure 13. Characterization of PTX–loaded pMPCL scaffolds. (A): Representative SEM micrographs of PTX–loaded pMPCL showing thin fiber ‐like morphology of immobilized PTX on the surface and inside micropores (white arrows) and their EDX analysis showing atomic C% (white numbers) higher than those of MPCL (85±1% for PTX and 75±1% for MPCL, data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). (B): XPS analysis of PTX–loaded scaffolds showing N1s peaks from PTX even after 20 seconds of in situ ion beam etching for partial removal. (C): FT‐IR spectra of MPCL, PTX–loaded pMPCL scaffold (MPCL‐PTX) and PTX confirming the immobilization of PTX on MPCL scaffolds. ....................................................................................................................................... 64 

Figure 14. Microporous structure prolonged and increased release of immobilized PTX on pMPCL. Drug was immobilized from solutions at 3 increasing doses (low, medium and high doses) by soak loading. Release at the first time point (24 hours) from pMPCL scaffolds was similar with nMPCL of the same dose but became significantly higher at later time points (data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). ................................................................................................ 65 

Figure 15. Immobilization of CEF on nMPCL and pMPCL scaffolds and the application of a PLGA overcoat layer. (A) and (B): SEM and EDX mapping of CEF–loaded scaffolds showing drug immobilized only on surface of nMPCL and also within pores inside the struts in pMPCL scaffolds. (C): SEM micrographs of drug–loaded pMPCL scaffolds with PLGA overcoat layers and EDX analysis showing differentiation of PLGA from the MPCL underneath which has less O content. ........................................................................................................................................ 67 

Figure 16. Release of CEF from nMPCL and pMPCL scaffolds and the barrier effects of PLGA overcoat layers. (A): release profiles of scaffolds loaded with the drug at increasing doses (Low, Medium and High doses). (B): Release profiles of pMPCL scaffolds loaded with the drug at high dose with and without PLGA coating and model fitting of the release profiles. PLGA coating significantly slowed down the release of the CEF previously immobilized on the scaffolds. The pMPCL scaffolds showed first‐order like release and the application of the PLGA overcoat sustained the release further and achieved near zero‐order kinetic. ................................................................. 68 

Figure 17. Cefazolin immobilized on microporous scaffolds retained its bioactivity. Zone of inhibition of CEF–loaded pMPCL scaffolds against S. aureus showing increasing zone diameter with increasing loading dose. pMPCL scaffolds without drug were used as control. Data are expressed as mean ± s.e.m (n=6). * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. ................................................................................................................................ 70 

Figure 18. DOX and PTX immobilized on microporous scaffolds retained their bioactivity. (A): Metabolic activity of breast cancer (MDA‐MB‐231) cells in 3D culture treated with PTX–loaded scaffolds. Cells were encapsulated in methacrylated gelatin (GelMA) hydrogels and cultured in 24 well plate and PTX–loaded pMPCL scaffolds were then placed in the wells as treatment groups and Alamar Blue assay was performed on day 2, 5 and 8 of the treatment (data are expressed as mean ± s.e.m, n=8). (B): Bioactivity of DOX–loaded scaffolds. Cells were seeded in 24‐well plate, scaffolds were placed in the wells as treatment groups and intracellular DNA amounts were quantified after 2 days of treatment using PicoGreen assay (data are expressed as mean ± s.e.m, n=8). The results showed the effect of chemotherapeutic agent–loaded pMPCL scaffolds. * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. 71 

Figure 19. Bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds fabricated using the screw melt extrusion method with interconnected pores. A: Representative bright field microscopic image of pmPCL scaffold. B and C: SEM micrographs of cross section of pmPCL scaffold strut before (B) and after (C) the porogen was leached out. D: µ‐CT micrograph of pmPCL scaffold after leaching. Black and white arrows: microscale pores on the surface of the strut. ............................................................................................................................................. 90 

Figure 20. Loading of doxorubicin (DOX) on bimodal porous medical grade polycaprolactone scaffolds (pmPCL), dose‐dependent chemotherapeutic effect on breast cancer cells and in vitro linear sustained release of the loaded DOX. A: stereomicroscopic representative image of DOX–loaded pmPCL scaffold. B and C: representative images of surface (B) and cross section (C) of DOX–loaded pmPCL scaffold strut from spinning disc confocal microscope. Arrow: scaffold surface. D: Fourier‐transform infrared spectra of pmPCL scaffold, DOX and DOX–loaded pmPCL scaffold (DOX/pmPCL). E: in vitro cell viability of MDA‐MB‐231 breast cancer cell line at 2, 5 and 7 days of treatment with DOX–loaded pmPCL scaffolds at Low Dose (0.4 µg DOX/mg scaffold), High Dose (10 µg DOX/mg scaffold) and DOX in solution (Free DOX). Data are expressed as mean ± SEM (n=6). F and G: cumulative release of DOX–loaded from pmPCL at Low Dose (2 µg DOX/scaffold) and High Dose (8 µg DOX/scaffold) groups in PBS in the first 30 hours (F) and in 28 days (G). Data are expressed as mean ± SEM (n=3 scaffolds from 3 independent experiments). ** is p<0.01; One‐way ANOVA and Tukey post hoc test. ...................................... 91 

Figure 21. The doxorubicin (DOX) was only detected in the peripheral blood of animals received the I.V. injection and reduced the body weight at week 1 post‐treatment. A: The concentration of DOX in the peripheral blood at day 1, 7 and 28 post‐treatment. B: Animal weight fold increment compared with the weight of animal at the time the treatment started. Data are expressed as mean ± SEM (n=6). ns: data is not statistically significant; @: Control group was significantly different from Low Dose and High Dose (p<0.01); #: Control group was significantly higher than Low Dose (p,0.01); * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. .... 94 

Figure 22. Cytotoxic effects in heart and liver of animals receiving intravenous (I.V.) doxorubicin (DOX) and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, low dose and no DOX.  Implantation of DOX‐loaded pmPCL scaffolds had similar mild cytotoxic effects on the liver and less cardio‐cytotoxicity compared with I.V. injection of DOX. A: H&E staining (top row) and Masson’s trichrome staining (middle row) of liver; congested central vein percentages measured from H&E staining and fibrotic tissue percentages measured from Masson’s trichrome staining of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. B: Masson’s trichrome staining of heart (top and middle rows), and fibrotic tissue percentages measured from Masson’s Trichrome staining of the Control, I.V, Low Dose and High Dose groups. Data are expressed as mean ± SEM (n=6 mice for each group). ns: data is not statistically significant; * is p<0.05 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. .............................................................. 96 

Figure 23. Tumour recurrence in animals treated with intravenous (I.V.) doxorubicin (DOX) and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, low dose and no DOX. Local drug delivery reduced the local tumour recurrence. A: Representative in vivo bioluminescence images of mice at days 0, 7, 14, 21 and 28 post treatment in Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg dose), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. B: quantitative in vivo IVIS signal over 21 days of treatment. C: ex vivo IVIS signal of local cancer recurrence at day 28 post treatment. Data are expressed as mean ± SEM (n=6 mice in each group). # is statistically significant compared with Control group, p<0.05; ns: data is not statistically significant; * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. ................................................................................... 98 

Figure 24. Local drug delivery reduced the number and volume of the highly proliferative and vascularized local recurrent tumours. The representative bright field (A), H&E staining (B) and anti‐NuMA (human specific marker) staining images (C) of the recurrent tumour at the primary tumour site of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. ................................. 99 

Figure 25. Tumour metastasis in animals receiving intravenous (I.V.) doxorubicin (DOX) and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, low dose and no DOX. Doxorubicin (DOX)–loaded bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds effectively reduced the breast tumor metastasis in lungs. Morphology (top row), anti‐NuMA staining (middle row), organ weight normalized to body weight, total flux from ex vivo BLI imaging, tumour cell count and micrometastasis count from NuMA staining images using ImageJ software of lung of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. Arrows: tumour metastasis foci. The organs were weighted after fixation and normalized to the body weight of the animal at day 28. Data are expressed as mean ± SEM (n=6 mice in each experimental group). ns: data is not statistically significant; * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. ........................................................................................ 101 

Figure 26. The increased porogen concentration resulted in the higher intra‐strut microscale porosity, surface area and negatively charged group density. A and B:  Representative SEM micrographs of strut’s surface and cross‐section, respectively. C: 3D reconstructed AFM micrographs of strut’s surface with their root‐mean‐square surface roughness (RMS). D: Representative µ‐CT micrographs 

of scaffolds with their pore area. E: Intra‐strut porosity (determined from µ‐CT scans), surface area (measured by gas adsorption), water contact angles and surface charged group density (measured through TBO assay). RMS was measured from AFM scans of 20x20‐µm2 areas on struts’ surface. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 17% and 44% porogen, respectively. The scaffolds were extruded with the optimum flow rate and temperature to achieve the “superflow” extrusion state, create smooth and defect‐free struts [225]. As a result of the “superflow” state, only a small number of porogen was located at the surface of the struts; therefore, the surface porosity was significantly lower than intra‐strut porosity. .................................................................................................... 125 

Figure 27. Microscale porosity accelerated degradation of mPCL scaffolds. A and B: Representative SEM micrographs from cross‐section (A) and surface (B) of nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 at 0, 24 and 48 hours in the accelerated conditions. C, D and E: Mass loss percentage (C), crystallinity measured from DSC (D) and molecular weight measured from GPC (E) of scaffolds after 48 hours of degradation. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 17% and 44% porogen, respectively. All microscale porous scaffolds showed evidence of degradation after 24 hours both on strut’s surface (rougher and enlarged pores) and throughout cross section (more small interconnected pores). After 48 hours, nmPCL showed only surface degradation; whereas, pmPCL44 degraded throughout the strut’s cross section. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. ............................................................................................................................... 128 

Figure 28. In vitro blood clotting experiments. A and B: SEM micrographs of cross‐section (A) and surface (B) of hematoma encapsulated scaffolds. C: Wet weight of hematoma. D and E: TGF‐ß1 (D) and PDGF AB (E) release from hematoma after 24 hours incubation in the culture medium. F: Cell proliferation results (MTT assay) of MC3T3‐E1 cultured with hematoma supernatant after 1 and 3 days. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant, * is p<0.05 and ** is p<0.01, from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, calcium phosphate coated nmPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. ............................................. 131 

Figure 29. Increased protein adsorption on pmPCL44 was observed compared with nmPCL and nmPCL/CaP. Metabolic activities of MC3T3‐E1 cells on nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 scaffolds after 1, 3 and 5 days. Results were normalized to control scaffold (nmPCL) at day 1. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant, * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, calcium phosphate coated nmPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. .......................................................................... 132 

Figure 30. Bimodal porous scaffolds had a similar osteoconductivity compared with calcium phosphate coated scaffolds. A: µ‐CT‐based 3D reconstructed images of new bone formation at calvarial defects and their bone volume. nmPCL/CaP and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. B: H&E staining at calvarial defects (boxed) of nmPCL/CaP and pmPCL44 with arrows showed microtissue inside the pmPCL44 struts. ob: old bone; nb: new bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; and dm: dura‐side membrane; black arrow: infiltrated extracellular materials. C: Histomorphometrical analysis of bone area percentage and stroma tissue area percentage measured from scanned H&E stained slides using the Osteomeasure Analysis System. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. ............................................................................................................................................. 134 

Figure 31. Validation of new bone formation via immunohistological staining with osteoblast key markers, ALP (A) and Col I (B) at week 8 after scaffold implantation. Nonporous medical grade polycaprolactone ( nmPCL/CaP) and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. Both nmPCL/CaP and pmPCL44 groups demonstrated similar levels of ALP and Col I expression. ob: old bone; nb: new bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; and dm: dura‐side membrane. .................................................................................................................................. 136 

Figure 32. Confirmation of blood vessel formation via immunohistological staining for CD31 (A) and vWF (B) at 8 weeks after scaffold implantation in rat critical size calvarial defect model. nmPCL/CaP and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. The blood vessel formation was confirmed by positive staining for CD31 and vWF as indicated with brown color. ob: old bone; nb: new bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; dm: dura‐side membrane; and black arrows: blood vessel. .......................................................................................................................................... 137 

Figure 33. Immunohistological staining showed the presence of M1 macrophages (CD68+ and iNOS+) much less than M2 macrophages (CD68+ and CD163+) within the defect areas in both nmPCL/CaP (A) and pmPCL44 (B) groups. nmPCL/CaP and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively.  ob: old bone; nb: new bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; and dm: dura‐side membrane. Black arrows demonstrate positive cells (brown color). .............................................. 139 

 

List of Tables 

Table 1. Loading doses of doxorubicin (DOX) on bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds. ....................................................................................................................................... 85 

Table 2. Treatment groups for in vivo implantation. ................................................................................ 87 

Table 3. Porogen concentration in mixture with mPCL to make scaffolds. .............................................. 113 

Table 4. Ultimate tensile strength, Young's modulus, and elongation at break of single struts with different porosity. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 17% and 44% porogen, respectively. ..................... 127 

Table 5. Surface area of scaffolds measured by gas adsorption analysis. (data = mean ± s.e.m; n=3). *** is p < 0.001. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, calcium phosphate coated nmPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. .................................................................................................................. 130 

 

   

List of Supplementary Figures 

Figure S1.  Rheology testing of mPCL and mPCL‐porogen for printing process showing amplitude sweep tests (a1‐a3) and temperature sweep (b1‐b3). For amplitude tests, temperature was kept constant at 110°C and angular frequency at 10 rad/sec. Each data point is the average of three experimental repeat (N=3); the error bars correspond to SD. For temperature sweep the temperature was varied from 125°C to 35°C. Strain was kept constant at 1% and angular frequency at 10 rad/sec. Each point is the average of three experimental repeat (N=3); the error bars correspond to SD. .................... 149 

Figure S2. Microporous mPCL scaffolds – after compression – relaxation cycles in mechanical testing ... 150 

Figure S3. mPCL scaffolds – after compression – relaxation cycles in mechanical testing ........................ 150 

Figure S4. Morphology of nMPCL and pMPCL. (A): Representative bright field microscopic images of nMPCL and pMPCL. (B): AFM micrographs of surface of struts on nMPCL and pMPCL scaffolds and their root‐mean‐square surface roughness (RMS, data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). (C) and (D): SEM and microCT images showing surface pores (short arrows) and connection to the inside pores through interconnectivity (long arrows). (E): Intra‐strut micropore size class distribution on surface and cross‐section of nMPCL and pMPCL. Data are expressed as mean ± s.e.m, n=6. .......... 151 

Figure S5. Schematic of interaction between DOX and MPCL molecules. ............................................... 152 

Figure S6. Drug loading efficiency of DOX, PTX and CEF on nPCL and pPCL. Data are expressed as mean ± s.e.m, n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. ................................ 153 

Figure S7. Pore size distribution of bimodal porous medical grade polycaprolactone scaffolds. data were expressed as mean ± SEM, n = 4. .................................................................................................. 153 

Figure S8. In vivo IVIS images of the control (A, bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (B, I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), low dose and high dose (C and D, DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. ............... 154 

Figure S9. Doxorubicin (DOX) –loaded bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds effectively reduced the breast tumor metastasis in liver and spleen. A and B: Morphology, organ weight normalized to body weight and total flux from ex vivo BLI imaging of liver (A) and spleen (B) of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. The organs were weighed after fixation and normalized to the body weight of the animal at day 28. Data are expressed as mean ± SEM (n=6 mice in each experimental group). ns: data is not statistically significant; * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. ............................................................................ 155 

Figure S10. Porogen size class and viscoelasticity of MPCL and MPCL‐porogen films. A and B: Representative size class distribution by volume acquired by light scattering. C: SEM micrograph showing the morphology of PBS porogen. D, F and H: Storage modulus (G'), loss modulus (G'') and loss tangent result from amplitude sweep rheological measurement of PCL and porogen‐PCL composites at a temperature of 110°C and an angular frequency of 10 rad/sec. E, G and I: Storage modulus (G'), loss modulus (G'') and loss tangent (tan δ) results from temperature sweep rheological measurements at a strain of 1% and an angular frequency of 10 rad/sec. ..................................... 157 

Figure S11. Validation of complete leaching of porogen. A: SEM micrographs of pMPCL44 before (left) and after (right) leaching. B: EDX analysis results of pPCL44 scaffolds after 0, 7 and 14 days leached in NaOH 0.01M in shaking incubator. C: EDX analysis results of all PCL scaffolds after leaching. D: UV‐Vis absorbance results of remained porogen percentage after leaching. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. *: p<0.05 and **: p<0.01 from One‐way ANOVA test and Tukey post‐hoc test. ......... 158 

Figure S12. Degradation of pMPCL compared with nMPCL. The crystalline/amorphous ratios of nPCL and pPCL44 scaffolds after 12, 24, 36 and 48 hours of degradation (A). GPC determination of molecular 

weight and polydispersity of nPCL and pPCL44 scaffolds after 48 hours of accelerated degradation (B and C). Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. ............................................................................................................................... 158 

Figure S13. Representative SEM micrographs at low (A) and high (B) magnification showing surface morphology of nPCL/CaP scaffold. ................................................................................................ 159 

 

 

List of Supplementary Tables 

Table S1. List of primary antibodies used for immunohistochemically staining and their antigen retrieval conditions. ................................................................................................................................... 156 

 

List of Abbreviations 

ABS     Acrylonitrile butadiene styrene 

AFM     Atomic force microscopy 

ALP     Alkaline phosphatase 

ANOVA     Analysis of variance 

APS     Ammonium persulfate 

BET     Brunanuer, Emmett and Teller 

BLI     Bioluminescent imaging 

BSA     Bovine serum albumin 

CaP     Calcium‐phosphate  

CEF     Cefazolin 

CFU     Colony forming units 

Col I     Collagen type I  

DL     Desolvation line 

DMEM     Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 

DMSO     Dimethyl sulfoxide 

DNA     Deoxyribonucleic acid 

DOD     Drop on demand 

DOX     Doxorubicin 

DSC     Differential scanning calorimetry 

ECM     Extracellular matrix 

EDTA    Ethylenediaminetetraacetic acid 

EDX     Energy‐dispersive X‐ray spectroscopy 

ELISA     Enzyme‐linked immunosorbent assay 

EPR     Enhanced permeability and retention 

FBS     Fetal bovine serum 

FDM     Fused deposition modelling 

FT‐IR     Fourier transform infrared spectroscopy 

GelMA     Gelatin methacryloyl 

GPC     Gel permeation chromatography 

H&E     Hematoxylin‐eosin 

HPLC     High performance liquid chromatography 

IHC     Immunohistochemical 

I.V.     Intravenous 

IVIS     In vivo imaging system 

LCMS     Liquid chromatography–mass spectrometry 

MBG     Mesoporous bioactive glass 

MIC     Minimum inhibitory concentration 

Mn     Number‐average molecular weight 

mPCL     Medical grade poly(ε‐caprolactone) 

MTT     3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyl tetrazolium bromide 

Mw     Weight‐average molecular weight 

NIPS     non‐solvent induced phase separation 

PBE     Phosphate buffered EDTA  

PBS     Phosphate buffered saline 

PCL     Poly(ε‐caprolactone) 

PD     Polydispersity 

PDGF‐AB    Platelet‐derived growth factor AB 

PEO    poly(ethylene glycol) 

PLGA     Poly(lactic‐co‐glycolic acid) 

PLLA     Poly(L‐lactic acid) 

PPAA     Polyacrylic acid 

PTX     Paclitaxel 

PU     Polyurethane 

RMS     Root‐mean‐square 

RT     Room temperature 

SBF     Simulated body fluid 

SEM     Scanning electron microscopy 

SME    Screw melt extrusion 

SLS     Selective laser sintering 

SRM     Selected reaction monitoring 

STL     Stereolithography 

TBO     Toluidine Blue O 

TCP     Tricalcium phosphate 

TE     Tissue engineering 

TEMED     Tetramethylethylenediamine 

TGF‐β     Transforming growth factor‐β 

‐CT     Micro‐computed tomography 

UHPLC     Ultra‐high performance liquid chromatography 

UTS     Ultimate tensile strength 

UV     Ultraviolet 

vWF     von Willebrand Factor 

XPS     X‐ray photoelectron spectroscopy   

Statement of Original Authorship 

The  work  contained  in  this  thesis  has  not  been  previously  submitted  to  meet 

requirements for an award at this or any other higher education institution. To the best of my 

knowledge and belief, the thesis contains no material previously published or written by another 

person except where due reference is made. 

QUT Verified Signature

 

Acknowledgments 

First,  I would  like  to  thank my supervisory  team, Distinguished Professor Dietmar W. 

Hutmacher, Associate Professor Tim Dargaville, Dr Phong A. Tran and Dr Abbas Shafiee. Thanks 

for  being  patient  with  my  inexperience,  and  the  guidance  and  knowledge  in  design  and 

performing the experiment. I would like to thank Distinguished Professor Dietmar W. Hutmacher 

for his motivation. I always felt inspired after discussions with him. I would like to thank Associate 

Professor Tim Dargaville for emotional support after I finished my second year. 

Next,  I  would  like  to  thank  QUT  for  giving  me  the  QUTPRA  scholarship  and  the 

opportunity to pursue my research interest in Australia. I would like to thank the staff from the 

Central Analytical Research Facility (CARF), Institute for Future Environment (IFE) and Medical 

Engineering Research Facility (MERF) at QUT for their technical support, training and guidance. 

I would like to thank Dr Mohit Chhaya, the first person I met and who trained me to 

fabricate scaffolds. I would like to thank my friends Johann, Triet, Tara, Margaux and Jane for 

sharing  my  feelings  and  lots  of  coffee  and  drinks.  I  would  like  to  acknowledge  the  use  of 

professional editing service from Elite Editing TM (South Australia, Australia) to edit my thesis.  

Last but not least, I would like to thank my wife Van for supporting me during my stressful 

and difficult times and my daughter Thanh for being my motivation for what I am doing. Without 

any of them, I believe I could not have made it this far. 

 

 

Note to the reader 

Chapters  2  and  3  have  minor  changes  and  from  the  published  papers  to  reduce 

confusion, fit into the thesis and follow the feedbacks of examiners. 

 

   

  Page 2 

  Page 2 

1Chapter 1:  Introduction 

1.1 BACKGROUND 

Tissue engineering using scaffold implants is a promising approach to treat large‐volume 

tissue defects,  such as  those  resulting  from  removal of bone or breast  tissue with neoplasm 

removal [1, 2]. The scaffolds give initial support for cell recruitment, attachment and proliferation 

as well as blood vessel penetration and neovascularisation [3, 4]. However, scaffold implantation 

has the risk of post‐surgery complications such as biofilm formation and infection [5]. 

Post‐implantation infection occurs in 1.2% of hip/knee replacement patients and 15% of 

breast implant patients [6‐8]. Systemic administration of antibiotics before and after implantation 

is the current approach to prevent post‐implantation infection. However, delivery efficiency is 

exceedingly low as only a small amount of antibiotic reaches the target site, which may lead to 

devastating side effects as the drug may accumulate in other undesired tissues [9]. Moreover, 

frequent exposure of bacteria to antibiotics at less than minimum inhibitory concentration may 

lead to antibiotic resistance [10]. 

In the case of patients undergoing tumour removal, local cancer recurrence occurs in 11–

12% of primary bone cancer patients and 10.2% of breast cancer patients [11, 12]. Similar to 

antibiotics in infection prevention, chemotherapeutic agents are commonly used systemically to 

prevent cancer recurrence. However, Harasym et al. used a mouse model to demonstrate that 

only 10% of the drug accumulates at the target site [13]. Therefore, 85–90% of the administered 

drug circulates in the blood system, accumulates in other organs and may cause systemic toxicity 

[12‐14]. In addition, there is a limited amount of a drug that a patient can tolerate during his/her 

lifetime. 

  Page 3 

  Page 3 

Local drug delivery methods have been introduced as a promising approach to improve 

the drug delivery efficacy and reduce the risk of drug resistance and systemic cytotoxicity. Shim 

et  al.  mixed  tobramycin  with  poly‐e‐caprolactone/poly(lactic‐co‐glycolic  acid)  to  fabricate 

antibiotic‐loaded  scaffolds  for  local  delivery  purposes.  However,  heat  exposure  during  the 

fabrication process may affect the activity of the antibiotic [14‐16]. Conversely, many applications 

of local chemotherapeutic delivery have been successfully commercialized, such as Viadur® to 

prevent prostate cancer and Zoladex® to prevent endometriosis and breast cancer in women [17‐

20]. However, these implants are limited to a small volume and cannot be used as a scaffold for 

tissue regeneration. 

Given the current challenges and the high potential of local drug delivery, modification 

of three‐dimensional (3D)‐printed scaffolds to enable them to serve as both a framework for 

tissue reconstruction and a drug carrier for local drug delivery may be a promising solution. We 

proposed a new approach to incorporate microscale porosity into solid struts of conventional 

macroscale porous scaffolds. The  intra‐strut microscale porosity can  increase scaffold–protein 

adsorption, stimulate cell attachment, and support cell penetration and vascularisation [21, 22]. 

Moreover, the microscale porosity can increase the interconnectivity of scaffolds, generating a 

more  complex  structure, which  can  alter  drug  loading  efficiency  and  affect  the  drug  release 

profile. 

1.2 LITERATURE REVIEW 

1.2.1 3D printing technology in biomedical application 

3D printing technology is a very useful technique to fabricate 3D scaffolds with complex 

architecture. Recently, 3D‐printed scaffolds have been manufactured and used as a carrier for 

local drug delivery application [23, 24]. 3D‐printed scaffolds can be classified into different groups 

according to their fabrication mechanism. The first group is photo‐crosslink polymers, in which 

the polymers crosslink when exposed to a specific light source. The polymers can be in powder 

  Page 4 

  Page 4 

form and spread on a collecting plate (stereolithography [STL]) or dissolved in solvent, displaced 

on a collecting board and then crosslinked (material jetting or drop‐on‐demand method [DOD]). 

The second group is thermal crosslink polymers, in which the materials melt and bind to each 

other when exposed to a thermal source such as laser (selective laser sintering [SLS]). The last 

group is molten polymers. The polymer filaments are fed into the printer, melted and discharged 

onto a collecting plate (fused deposition modelling [FDM]); the polymers rapidly cool down and 

solidify,  forming  the  3D  structure.  Another method  using melting  of  polymers  is  screw melt 

extrusion (SME), in which the polymers in any shape or form are melted in the heating chamber, 

which connects directly to the extruder. The extruder extrudes materials with the screwing core 

as well as compressed air and moves along X, Y and Z axes to form the 3D constructs. 

Among  these methods,  SME  is  versatile  and  can  be  easily modified  to  fabricate  and 

characterize new types of material/scaffold. This technique can be applied to any type of material 

that can be melted into liquid form and has suitable viscosity for printing. 

1.2.2 Porosity in 3D printed scaffolds 

One of  the  key  parameters when designing  3D  scaffolds  is  porosity.  The  porosity  of 

scaffolds  can  affect  the  interactions  between  the  scaffold  and  the  drugs,  proteins  and  cells. 

Macroscale pores (pores with the longest dimension of 100–1000 µm) are usually generated by 

the printing pattern and play important roles in cell and tissue infiltration as well as blood vessel 

ingrowth and neovascularisation [3, 22]. Conversely, microscale pores (pores with the longest 

dimension of 1–100 µm) play essential roles in protein adsorption and cell attachment, migration 

and  proliferation.  They  also  interact  with  extracellular  substances  and  enhance 

neovascularisation. Microscale pores usually cannot be designed by the printing pattern because 

the  precision  of  the  technique  is  limited  to  0.1 mm.  They  are  usually  generated  by  other 

techniques, such as porogen leaching and foam casting. Samavedi et al. showed that microscale 

pores  can provide more  surface area  for protein  adsorption,  cell  attachment  and osteogenic 

  Page 5 

  Page 5 

differentiation  [21].  Moreover,  microscale  porosity  plays  an  important  role  in  haematoma 

formation, which is the first critical step following tissue damage and an important process in 

wound healing and tissue regeneration [25‐27]. 

1.2.3 Bimodal porosity 

Macroscale porosity and microscale porosity can be combined to take advantage of both 

structures.  Wei  et  al.  showed  that  successful  bone  tissue  repair  requires  a  combination  of 

macroscale porosity, microscale porosity and interconnectivity to support cell penetration and 

vascularisation [22]. Other studies showed that macroscale porosity can support cell penetration, 

infiltration  and  in‐growth  as  well  as  blood  vessel  ingrowth;  whereas,  microscale  porosity 

enhanced cell attachment and proliferation, blood vessel  infiltration, protein penetration and 

mineralization [28‐30]. The addition of microscale porosity into macroscale porous scaffolds can 

increase bone density and uniformity.   

The method of fabricating bimodal porous scaffolds can be classified into two groups: 

moulding‐based and extrusion‐based methods. In the first group, the materials, which consist of 

a combination of polymers and pore‐forming polymers/particles, are moulded. Then, the pore‐

forming  materials  are  removed  via  a  leaching  process.  Last,  the  samples  are  dried  out  or 

lyophilized  to  obtain  the  final  structure.  Zhang  et  al.  fabricated  calcium  silicate/calcium 

phosphate scaffolds by applying this method and using 500 μm NaCl particles as the porogen. 

The scaffolds were loaded with recombinant human bone morphogenetic protein‐2 (RhBMP‐2) 

and showed support for myoblastic precursor cell attachment and proliferation [31]. Wei et al. 

used a process of moulding, leaching and drying with a 400–500 μm NaCl porogen to fabricate 

micro/macro  magnesium  calcium  phosphate  scaffolds.  The  scaffolds  had  increased  cell 

attachment, proliferation and ALP (alkaline phosphatase) activity compared with scaffolds with 

macropores only [22]. Besides calcium phosphate (CaP), other materials can be used with this 

method. Salerno et al. melt‐mixed polycaprolactone (PCL) with thermoplastic gelatin  (TG), air 

  Page 6 

  Page 6 

blowed  the  material  to  create  micropores  and  finally  leached  TG  to  create  interconnected 

micropore channels [32]. The construct demonstrated support for human mesenchymal stem 

cells  (hMSCs)  attachment.  Akkouch  et  al.  utilized  a  collagen/hydroxyapatite/poly(lactide‐co‐

caprolactone)  composite,  in  which  collagen  served  as  the  pore‐forming  material  and  was 

extracted by dissolving in water, to fabricate bimodal porous scaffolds that showed increased 

osteoblast cell growth [33]. The benefit of bimodal porous scaffolds was also demonstrated in 

vivo.  Yan  et  al.  fabricated  silk  fibroin/calcium  phosphate  scaffolds  using  500–1000 μm  NaCl 

particles as the porogen [34]. The scaffolds improved the new bone formed in rat femur defects. 

In the second group of fabrication method, which is extrusion based, the materials are 

rearranged/mixed before extrusion. After extrusion, either  into  filaments or 3D scaffolds,  the 

pore‐forming materials are removed by leaching or solvent exchange to achieve the final bimodal 

porous structure. Reignier et al. blended PCL with poly(ethylene oxide) (PEO) and NaCl crystals 

before extrusion through a non‐restrictive extrusion die and leaching in water [35]. The scaffolds 

showed complete  leach‐out of NaCl, but  there was  some PEO entrapped.  Further,  the  study 

demonstrated that NaCl was not a good porogen as the 100–700 μm particles were broken into 

two ranges of less than 10 μm and more than 100 μm, which makes it hard to control the pore 

size as desired. Ahn et al. took a different approach by adding the materials layer by layer in the 

feeding  chamber  before  printing  [36].  CaP/camphene  was  placed  at  the  bottom  and  then 

camphene was placed as a thick  layer on top. When extruded  into filaments, CaP/camphene 

came  out  first  before  gradually  mixing  with  camphene,  creating  a  camphene  gradient.  The 

camphene  in the constructs was removed by sublimation, creating a bone‐like structure with 

gradient porosity. Kim et al. took another approach to fabricate bimodal porous scaffolds by using 

a non‐solvent‐induced phase separation (NIPS)‐based 3D plotting technique [37]. PCL was mixed 

with  hydroxyapatite  (HA)  particles  in  tetrahydrofuran  (THF).  The  mixture  was  extruded  by 

pressurized air through a fine nozzle into an ethanol bath. The exchange between ethanol and 

  Page 7 

  Page 7 

THF created a phase separation and resulted in microporous PCL/HA composite filaments. The 

scaffolds demonstrated increased ALP activity of osteoblast cells. 

1.2.4 3D printed polycaprolactone in tissue reconstruction application and local 

drug delivery application 

1.2.4.1 Additive manufactured 3D polycaprolactone 

Among methods  to  fabricate  3D  scaffold,  Additive  biomanufacturing  (ABM)  holds  a 

promising potential. Using this method, we can create scaffolds with desired architecture and 

interconnected  macroscale  porous  networks.  ABM  can  also  be  used  combined  with  other 

techniques  to  fabricate  multiscale  porous  construct  for  various  applications.  [38‐41].  ABM 

combined  with  sintering  method  was  used  to  fabricate  titanium  –  polyvinyl  alcohol  (PVA) 

scaffolds [38]. ABM combined with non‐solvent induced phase separation (NIPS)‐based plotting 

was used to fabricate PCL/hydroxyapatite scaffolds [37].  

Besides method, polymer is another important factor in scaffold fabrication. In this study, 

medical grade polycaprolactone polymer was used because of its previous succeed in using for 

FDA‐approved medical devices and versatile properties for printing and modification [58‐61]. The 

material has low melting temperature (60oC), biocompatible and biodegradable.  

1.2.4.2 3D printed polycaprolactone in tissue reconstruction application 

ABM has been extensively studied for application in tissue engineering as implants to 

support  new  tissue  formation  [23,  42‐44].  thanks  to  its  ability  to  fabricate  complex  porous 

structure  with macropores  for  vascularization  [45,  46].  Yet,  the  ideal  scaffolds  require  both 

macroscale pores as well as microscale pores to support tissue regeneration and remodelling [47‐

51]. The conventional method to address this issue include moulding combined with salt leaching, 

use of sacrificed material or gas foaming to create dual scale porous structure [32, 52‐55]. Though 

these methods can achieve having macroscale and microscale pores in single constructs, there 

was  limited  controls over  the  shape,  size and porosity. Therefore, ABM was employed. ABM 

  Page 8 

  Page 8 

combined  with  sintering  method  was  used  to  fabricate  titanium  –  polyvinyl  alcohol  (PVA) 

scaffolds [38]. ABM combined with non‐solvent induced phase separation (NIPS)‐based plotting 

was used to fabricate PCL/hydroxyapatite scaffolds [37].  

1.2.4.3 3D printed polycaprolactone in local drug delivery application 

Biodegradable scaffolds, beside  the primary  role of supporting new tissue  formation, 

were proposed to be used as a local drug reservoir to deliver drug locally [23, 42‐44]. The use of 

locally delivered antibiotics  for surgical site prophylaxis or  locally delivered chemotherapeutic 

agents for post‐surgery recurrent cancer prevention is a promising approach for scaffold‐based 

tissue engineering applications [23, 56]. The conventional method of preparing local drug delivery 

device used mixing methods, in which, the bioactive agents were mixed prior to manufacturing. 

Since the manufacturing involving heating, heat labile drugs can be affected and their bioactivities 

may be reduced or lost. [14‐16].  Furthermore, the drug release in these cases depend on the 

degradation  of  the  device  and may  lead  to  treatment  resistant  due  to  frequent  delivery  of 

underdosed drugs. 

Despite the fact that PCL scaffolds have been extensively developed, they are mainly 

design as a single‐function scaffolds to serve as either TE or DDS but not both. For diseases that 

require a large volume of native tissue resection and post‐surgery treatment, the dual function 

scaffolds are indeed add much more benefit for the treatment.  

1.3 RESEARCH GAP 

It  is  well  known  that  the  regeneration  of  large‐volume  tissue  defects  requires 

biocompatible implants with adjunct treatments to prevent complications or disease recurrence. 

Regarding the biocompatible implants, bimodal porous scaffolds are promising as the scaffolds 

have  the advantages of both macroscale and microscale pores. However,  recent methods  to 

fabricate the scaffolds still face challenges. The moulding‐based methods limit the construct to 

the  mould  shape  and  size.  In  addition,  NaCl  is  unsuitable  as  a  porogen  for  formation  of 

  Page 9 

  Page 9 

macropores as it cannot maintain its size and shape after mixing, and micropores created by a 

sintering or  lyophilisation  process  are hardly  controllable.  In  the  case of  the  extrusion‐based 

method,  the macropores can be controlled by the printing pattern; however,  the micropores 

fabrication  is  not  fully  optimized.  The use of  PEO  as  a  pore‐forming material  leaves  residual 

material, and the use of the NIPS method leads to uncontrolled microscale porosity. 

Regarding  the  adjunct  treatments  to  be  used  with  the  implants,  antibiotics  and 

chemotherapeutic  agents  have  been  commonly  used  to  prevent  infection  and  tumour 

recurrence;  however,  they  also  have  systemic  side  effects  and  toxicity.  As mentioned  in  the 

previous section, local drug delivery is a promising approach to prevent complications, reduce 

systemic toxicity and enhance drug concentration at the site of implantation. 3D‐printed scaffolds 

can serve as drug depots [23, 56]; however, existing methods in this area rely on mixing drugs 

and biomaterials before manufacturing the mixture into scaffolds [23, 57, 58]. A major limitation 

of direct mixing is that drug bioactivities can be altered by temperature and harsh solvents. For 

example,  biological  activity  loss of more  than 10%  for  vancomycin  and 20%  for heparin was 

reported when they were mixed with CaP for ink‐jet printing into 3D structures [57]. In addition, 

being embedded inside the solid material, the drug is only released when the material degrades, 

which might take a long time, necessitating much higher drug loading to have therapeutic effects 

[59], which might create undesirable consequences such as persistent inflammation or treatment 

resistance. Research groups have tried to address this issue by adding ingredients to the drug 

biomaterial mixture, such as HA [59], cellulose [60] and chitosan [57], to facilitate fluid infiltration 

and thus drug elution. This approach is cumbersome and requires further improvement. 

Overall, there is a need for a new type of scaffold implant in which the microscale and 

macroscale  porosities  can  be  controlled,  and  drugs  can  be  loaded  without  altering  drug 

bioactivities. 

  Page 10 

  Page 10 

1.4 HYPOTHESIS AND OBJECTIVES 

Hypothesis: The introduction of microscale pores with controlled pore size into the solid 

struts  of  3D‐printed macroscale  porous  scaffolds  will  increase  the  scaffold  surface  area  and 

overall  porosity  to  (1)  support  protein  adsorption,  cellular  function  and  eventually  tissue 

formation and (2) efficiently adsorb drugs and control their release for anti‐infection and anti‐

cancer applications. 

The hypothesis has been examined by achieving the following research objectives: 

Objective 1: Fabricate and characterize bimodal porous PCL scaffolds. 

Objective  2:  Investigate  the  loading  and  release  and  bioactivities  of  antibiotics  and 

chemotherapeutic agents from the scaffolds. 

Objective 3: Investigate the application of drug‐loaded bimodal porous scaffolds to treat 

breast cancer in vivo. 

Objective  4:  Investigate  the  application  of  bimodal  porous  scaffolds  for  tissue 

reconstruction in vivo. 

1.5 SCOPE OF STUDY AND THESIS OUTLINE 

The ultimate goal of this thesis is to demonstrate the versatility of the biomodal porous 

scaffolds in various applications. As such this study was designed based on the viable product and 

used it for a breath spectrum of application. Due to the limited timeframe of a PhD, this study  

could not be able to go in dept characterization and optimization for each specific application. 

Specifically, the feasibility of the new fabrication method using porogen‐polymer composites was 

investigated; yet  the optimized settings  to fabricate scaffolds  for specific needs, such as  local 

antibiotic  delivery  or  breast  tissue  reconstruction,  were  not  studied.  Properties  of  scaffolds 

including  mechanical  properties,  physical  properties  and  degradation  properties  were 

characterized; yet the long‐term stability in term of structure and mechanical properties was not 

characterized. For local drug delivery studies, different models drugs were used to characterize 

  Page 11 

  Page 11 

the drug  release profile, bioactivities of  the  loaded drugs;  yet  the  studies only proposed  the 

interaction  between  drugs  and  polymers  and  the  model  fitting  for  each  model  drug  to 

characterize their release kinetic and diffusion was excluded from this studies. For local delivery 

of chemotherapeutic drug to prevent breast cancer recurrence and metastasis, the drug loaded 

scaffolds were used to compared with the conventional intravenous injection method; yet the 

doses to achieve the most effective treatment were not optimized.  

This report contains six chapters arranged as follows. 

Chapter  1  introduces  the  background  about  large  tissue/critical‐size  tissue  defects, 

current  challenges of methods  used  to prevent  infection  and  cancer  recurrence,  a  literature 

review about 3D‐printed scaffolds in biomedical applications, requirements of porosity in tissue 

reconstruction and drug delivery, and the challenges with current methods to fabricate bimodal 

porous scaffolds, and proposes a novel approach, the hypothesis and the research objectives of 

this thesis and the thesis outline. 

Chapter 2  talks about preliminary  investigations of  scaffold  fabrication and antibiotic 

delivery using cefazolin as a drug model. Drug  loading methods and drug delivery profiles of 

antibiotic‐loaded  PCL  scaffolds  were  evaluated.  The  antimicrobial  properties  of  drug‐loaded 

scaffolds were demonstrated in vitro. 

Chapter 3 further talks about characteristics of the bimodal porous scaffolds and release 

behaviours of antibiotic and chemotherapeutic drugs with different characteristics and under 

different  conditions.  The  antimicrobial  and  chemotherapeutic  properties  of  drug‐loaded 

scaffolds were demonstrated in vitro. 

Chapter  4  talks  about  the  use  of  doxorubicin  (DOX)‐loaded  scaffolds  as  a  local 

chemotherapeutic implant in a mouse orthotopic breast cancer model. The chemotherapeutic 

effects of the treatment against local recurrence and metastasis were evaluated. The cytotoxic 

effects of the treatment were characterized and compared with a conventional intravenous (I.V.) 

systemic administration method. 

  Page 12 

  Page 12 

Chapter 5 talks about the use of bimodal porous scaffolds for tissue reconstruction. The 

interactions  between  the  scaffold  and  the  proteins,  haematoma  and  osteoblast  cells  were 

characterized. Benefits derived from the scaffold tissue reconstruction were demonstrated in a 

rat critical‐size defect model. 

Chapter 6 summarizes the research findings and gives suggestions for future research. 

 

  Page 13 

  Page 13 

2Chapter 2:  3D printed Polycaprolactone 

scaffolds with dual macro‐microporosity for 

applications in local delivery of antibiotics 

Luke E. Visscher a, *, Hoang Phuc Dang b, c, *, Mark A. Knackstedt d, Dietmar W. Hutmacher b, c, Phong 

A. Tran b, c 

 

Published in Journal Materials Science and Engineering: C 87 (2018): 78‐89. 

a   School of Medicine, University of Queensland, QLD, Australia 

b   ARC Centre  in Additive Biomanufacturing, Queensland University  of  Technology, Musk 

Avenue, Kelvin Grove, Brisbane, Queensland 4059, Australia 

c   Queensland University of Technology (QUT), Brisbane, Queensland, Australia 

d  Australian National University, Canberra, Australia 

*  contributed equally 

   

  Page 14 

  Page 14 

The authors listed below have certified that: 

1. They  meet  the  criteria  for  authorship  in  that  they  have  participated  in  the  conception, 

execution, or interpretation, of at least that part of the publication in their field of expertise; 

2. They take public responsibility  for  their part of the publication, except  for the responsible 

author who accepts overall responsibility for the publication; 

3. There are no other authors of the publication according to these criteria; 

4. Potential conflicts of  interest have been disclosed to  (a) granting bodies,  (b)  the editor or 

publisher of journals or other publications, and (c) the head of the responsible academic unit, 

and 

5. They agree to the use of the publication in the student’s thesis and its publication on the QUT’s 

ePrints site consistent with any limitations set by publisher requirements. 

In the case of this chapter: 

Published paper: 

Luke E. Visscher, Hoang Phuc Dang, Mark A. Knackstedt, Dietmar W. Hutmacher and Phong A. 

Tran. “3D printed Polycaprolactone scaffolds with dual macro‐microporosity for applications in 

local delivery of antibiotics.” Materials Science and Engineering: C 87 (2018): 78‐89. 

 

Contributor  Statement of contribution 

Hoang Phuc Dang 

Conducted experiments and data analysis, wrote manuscript Signature 

Date: 

Luke E. Visscher  Conducted experiments and data analysis, wrote manuscript 

Mark A. Knackstedt  Conducted experiments 

Dietmar W. Hutmacher  Experimental design, aided manuscript preparation 

Page 15 

Page 15 

Phong A. Tran 

Experimental design, aided data analysis and manuscript 

preparation 

Principal Supervisor Confirmation 

I have sighted email or other correspondence from all Co‐authors confirming their 

certifying authorship 

 Phong Tran     06/02/2020  

Name  Signature  Date 

QUT Verified Signature

  Page 16 

  Page 16 

2.1 ABSTRACT 

Advanced  scaffolds  used  in  tissue  regenerating  applications  should  be  designed  to 

address  clinically  relevant  complications  such  as  surgical  site  infection  associated  surgical 

procedures. Recognizing that patient‐specific scaffolds with local drug delivery capabilities are a 

promising  approach,  we  combined  3D  printing  with  traditional  salt‐leaching  techniques  to 

prepare a new type of scaffold with purposely designed macro‐ and micro‐porosity. The dual 

macro/micro porous scaffolds of medical‐grade polycaprolactone (mPCL) were characterized for 

their porosity, surface area, mechanical properties and degradation. The use of these scaffolds 

for  local  prophylactic  release of  Cefazolin  to  inhibit S.  aureus  growth was  investigated  as  an 

example of  drug delivery with  this  versatile  platform.  The  introduction of microporosity  and 

increased surface area allowed for loading of the scaffold using a simple drop loading method of 

this heat‐labile antibiotic and resulted in significant improvement in its release for up to 3 days. 

The Cefazolin released from scaffolds retained its bioactivity similar to that of fresh Cefazolin. 

There were no cytotoxic effects in vitro against 3T3 fibroblasts at Cefazolin concentration of up 

to 100 µg/ml and no apparent effects on blood clot formation on the scaffolds in vitro. This study 

therefore presents a novel type of scaffolds with dual macro‐ and micro‐porosity manufactured 

by a versatile method of 3D printing combined with salt‐leaching. These scaffolds could be useful 

in  tissue  regeneration  applications where  it  is  desirable  to  prevent  complications  using  local 

deliver of drugs. 

2.2 INTRODUCTION 

Scaffold‐based tissue engineering inherits a similar risk of surgical site infection as any 

other implant based treatment. The use of implanted foreign body in surgery has been shown to 

reduce the minimal infecting dose of S. aureus up to 1000 fold for formation of a permanent 

abscess [61]. In fact, implants are recognized as a major contributing factor to these infections 

because  of  the  formation  of  bacterial  biofilms,  a  self‐secreted  polysaccharide  matrix  which 

  Page 17 

  Page 17 

adheres to implant surfaces and protects the embedded bacteria from the immune system and 

systemically administered antibiotics [5]. Surface modification and local delivery of antimicrobial 

agents has been proposed as a promising approach in preventing biofilm formation [62‐66]. 

Infections  associated with  implants  occur  at  significant  rates  (e.g.  0.8‐1.2%  for  total 

hip/knee replacement [6], 5‐15% for several breast implants [7, 8]). They represent a challenging 

problem and burden on healthcare systems in terms of morbidity, mortality and treatment costs 

across  all  surgical  disciplines.  The  two  commensal  bacteria  normally  found  on  patient’s  skin 

Staphylococcus  aureus  (S.  aureus)  and  Staphylococcus  epidermidis  (S.  epidermis)  have  been 

identified as key pathogens in many of these infections [6]. Surgical site prophylaxis is currently 

the standard approach for infection prevention with systemic antibiotic administration before 

and  after  surgery.  However,  this  mode  of  administration  leads  to  low  local  antibiotic 

concentrations  in  the  desired  tissue  and  side  effects  such  as  organ  toxicity  and  altered  host 

microbiome[9].  It may  also  promote  the  development  of  antibiotic  resistance  in  commensal 

bacteria  in  the body, which can then themselves cause disease or spread their resistance via 

plasmid transmission [10].  

The  use  of  locally  delivered  antibiotics  for  surgical  site  prophylaxis  is  a  promising 

approach  for  scaffold‐based  tissue  engineering  applications.  Traditional  methods  of  mixing 

antibiotic powder with polymers before manufacturing the mixture into cement for implantation 

are simple but have major disadvantages when heat‐ or solvent labile antibiotics are used [14, 

15].  A large number of commonly used antibiotics including all of the Cephalosporin family, which 

are the mainstay of surgical site prophylaxis, have markedly reduced activity when exposed to 

heat  [16].   The same analysis also applied to  local scaffold‐based delivery of other drugs and 

molecules  such  as  DNA,  growth  factors  or  chemotherapy  drugs.  Therefore,  it  is  clear  that 

advanced scaffold technologies should have scaffold fabrication methods that are independent 

from the drug  loading process and  that  the  latter  should be designed  to allow for  in‐theatre 

  Page 18 

  Page 18 

preparation. These criteria are important for the clinical translation of these scaffolds as they 

permit treatment personalized to specific patients and surgical scenarios. 

We hypothesized that microporous architecture in a scaffold would increase its surface 

area and facilitate the incorporation and retention of drug from its solution through simple drop 

or soak loading methods. 3D printing and screw melt extrusion (SME) techniques have emerged 

as  powerful  tools  to  create  patient‐specific  scaffolds  with  macro‐porous  architectures  and 

mechanical  properties  suitable  for  cellular  infiltration,  vascularization,  tissue  formation  and 

remodelling. SME is particularly versatile in terms of input materials and has been used to make 

scaffolds with local drug delivery capability by modifying the input materials [59]. For example, 

Hollander et al. made indomethacin‐PCL feeding filament by thermal extrusion before printed to 

make T‐shaped scaffolds for drug delivery application in intrauterine system [67] . Yet the main 

limitation of mixing  the  input materials with drugs  is  that  the drugs have  to  go  through  the 

material and scaffold fabrication processes, which often involve elevated temperature and/or 

harsh chemicals, which can inactivate and/or degrade drugs/antibiotics. In this study, we thus 

focus on employing SME technique to create scaffolds having intra‐bar/strut microporosity which 

would allow for loading of heat/chemical sensitive drugs. However, introducing microporosity 

into these scaffolds been reported only by a  limited number of  research groups and for only 

certain specific materials [68, 69].  

Here, we used a simple concept of combining SME with salt‐leaching and developed a 

new type of 3D printed scaffold with dual micro‐and macro‐porosity that offers versatile drug 

loading and  controlled  release  capabilities.  The objective of  this  study  is  to demonstrate  the 

feasibility of using PCL scaffolds with macroscale and microscale porosity for antibiotic delivery 

to prevent infection and the potential of combining the new scaffolds with coating method to 

control  the  loading  and  burst  release  of  the  chemotherapeutic  and  antibiotic  agents.  We 

employed  our  home‐built  screw  melt  extrusion  device  (Figure  1a)  instead  of  coupling  the 

commercialized extruder [70]. Our device has a larger feeding chamber that feeds directly into 

  Page 19 

  Page 19 

the extruder nozzle and mobilized nozzle and collecting board, it can be used for any materials 

provided that they have low viscosity to print. The device changed from 2 step process, extruding 

material filaments and then printing the scaffolds from the filaments, to 1 step process, printing 

the scaffolds directly from the molten composite. We used polycaprolactone as a model polymer 

because of its proven applications in many FDA‐approved medical devices, and its low melting 

temperature  (60oC)  but  the  manufacturing  method  is  designed  as  applicable  to  other 

thermoplastic materials to fit various applications. Cefazolin was selected as a model antibiotic 

because  it  is  commonly  used  for  prophylaxis  against  S.  aureus  infection  and  is  particularly 

sensitive  to  elevated  heat  and  organic  solvents  making  it  unsuitable  for  commonly  used 

techniques [71]. 

2.3 MATERIALS AND METHODS 

Scaffold Design & Manufacturing: Medical grade poly(ε‐caprolactone) (mPCL; Mn =70 

kDa, Mw =120 kDa, Polydispersity = 1.69, in pellet form; from Purasorb PC12 Corbion, Purac) was 

used to 3D print scaffolds. In order to achieve microporosity, mPCL was dissolved in chloroform 

(Sigma Aldrich, St Louis) and mixed with phosphate buffered saline (PBS)  particles that had been 

ground from PBS tablets (Sigma Aldrich, St Louis), and sieved to size less than 75 μm at a weight 

ratio of 5:4 (PCL: PBS). The porogen‐mPCL suspension in chloroform was then solvent‐casted to 

create composite porogen‐mPCL films which were  left  in a fume hood to dry and stored in a 

desiccator  (Figure  1b).  The porogen‐mPCL  composite  films were used  to  3D print  constructs 

50mm x 50mm x 2mm in a laydown pattern of 0/60/120° as reported elsewhere[72]. Briefly, PCL‐

porogen films were heat up to 110oC for 30 mins and then screw‐extruded through a metal nozzle 

of  gauge  2  (inner  diameter  of  0.33 mm).  The  x‐y movement  of  the motorized  stage  and  z‐

movement of the nozzle was computer‐controlled to produce 3 dimensional scaffolds with bar 

diameter of 0.3 mm and bar distance of 1 mm. The scaffolds were then left in deionized water 

for 4 weeks to allow leaching of the porogen to produce macroporous scaffolds with microporous 

  Page 20 

  Page 20 

intrastrut/bar architecture (hereafter referred to as “microporous scaffold”). mPCL only was also 

used to make scaffolds with solid strut/bar (hereafter referred to as “solid scaffold”) as reference 

using the same manufacturing process. Both types of scaffolds were then treated with 1M NaOH 

for  30  minutes  on  an  orbital  shaker  to  improve  their  hydrophilicity.  Polycaprolactone  is  a 

polyester  which  is  hydrolyzed  by  strong  base  such  as  sodium  hydroxide  and  this  hydrolysis 

introduces carboxylic and hydroxyl groups to the surface therefore increases the hydrophilicity. 

A 5‐mm biopsy punch was used to produce scaffolds of 5 mm diameter x 1.5 ‐2 mm thickness as 

samples for experiments. Samples were sterilized by ethanol followed by UV irradiation.  

 

Figure 1. (a) home‐built screw melt exutrsion device. (b) Schematic of fabrication process of PCL 

scaffolds using SME and salt leaching techniques. 

 

After leaching of mPCL over 14 days, scaffolds were dissolved in chloroform to 10% (w/v) and 

the solution’s cloudiness was measured at 600 nm using a spectrophotometer (Beckman 

(b)

(a)

Temperature control unit

Voltage (speed) control unit

Collecting board

Nozzle

Heating coils

Feeding chamber

Pressurized airExtruding unit

  Page 21 

  Page 21 

Coulter Inc., California, US). The amounts of porogen residual were determined using the 

standard curve made from porogen mixture in mPCL 1% solution in chloroform. 

Cefazolin Loading: Scaffolds were loaded with Cefazolin (Sigma‐Aldrich, St Louis) via a “solution 

drop loading” technique. Cefazolin was first dissolved in 67% ethanol to give solutions of 745 

ppm, 1340 ppm and 3350 ppm. In a biosafety cabinet, scaffolds were placed in a 96‐well plate 

16±0.3 mg scaffold each well and 5 μL droplet of solution was dropped onto each scaffold and 

let dry. This loading process was repeated 3 times with at least 30 minutes in between to give 

total loading doses of 11.17 μg (Low Dose), 20.1 μg (Med Dose) and 50.25 μg (High Dose) per 

scaffold. 

GelMA  Coating:  The  scaffolds  were  dip‐coated  using  2%(w/v)  gelatin  methacrylate  (GelMA) 

solution which was prepared as per a protocol published previously[73]. gelMA was prepared at 

low concentration to achieve low viscosity that make it easily penetrate into the inner structure 

of  the  scaffolds.  The  GelMA  adsorbed  on  the  scaffolds  was  then  chemically  crosslinked  by 

ammonium  persulfate  (APS)  and  Tetramethylethylenediamine  (TEMED;  Thermo  Fisher 

Scientific). An additional group (n=9) of each of the High Dose Solid and Microporous scaffolds 

were left uncoated for comparison. 

SEM  Imaging:  The  scaffolds  were  gold‐sputter  coated  and  examined  using  scanning 

electron  microscopy  (Zeiss  Sigma  VP  Field  Emission  SEM)  operating  at  5‐10  kV.  X‐ray 

microtomography  (micro  CT)  imaging  was  conducted  to  characterize  the  scaffold 

microarchitecture. X‐rays were generated by a GE‐Phoenix xs 180nf micro‐focus X‐ray source and 

radiographs captured on a 3000x3000 silicon flat panel detector. X‐ray tube settings were 80 kV 

and  110  microAmps  and  reconstruction  undertaken  using  a  helical  cone‐bean  filtered  back 

projection method [74]. The voxel size of the images was 2.2 m. 

Porosity: The porosity was first calculated from the scaffold’s dimensions, weight and 

PCL density. The total volume of a PCL cylindrical scaffold was calculated using the dimensions 

  Page 22 

  Page 22 

measured with Vernier callipers, and the volume of PCL was calculated from scaffold’s weight 

based on density of the mPCL (1.145 g/cm3 as per supplier). The porosity was calculated as below 

and reported as mean ± s.e.m (n=4): 

  𝑝𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑡𝑦

, in which: 

total scaffold volume =π x height x (diameter/2)2 

mPCL volume = scaffold weight/mPCL density. 

The porosity of the microporous scaffolds was also determined from micro CT data by 

segmentation and image analysis of the 2D tomographic images. Each voxel of the sample was 

assigned a phase based on the X‐ray attenuation corresponding to each voxel in the image. The 

solid scaffold gives a strong bimodal distribution of attenuations associated with solid PCL and 

open porosity between the struts. The microporous scaffold has additional porosity inside the 

struts and bars.  

Surface Area: The specific surface areas of the mPCL and microporous‐mPCL scaffolds 

were measured by a surface area and porosity analyser (Tristar II 3020 Surface Area Analyser, 

Micromeritics, Ottawa).  Surface area was measured by performing N2‐adsorption–desorption 

experiments at 77 K. The sampling tubs were immersed in liquid nitrogen and the samples were 

degassed under N2 flow before analysis. Surface areas were calculated using Brunauer–Emmet–

Teller (B.E.T) model. 

Mechanical Testing: Scaffold’s compressive modulus was determined using Instron 5567 (Instron, 

Massachusetts) uniaxial testing system with a 5kN load cell and maximum displacement of 15% 

(n=3). 

Zeta Potential: A SurPASS electrokinetic analyzer (Anton Paar) was used for surface zeta 

potential measurements of  scaffolds.  In each  zeta potential  recording,  two  identical  samples 

were attached to the adjustable gap cell to face each other with a 100 µm gap between them. 

The streaming current was measured between two Ag/AgCl electrodes placed at both sides of 

the samples. The measurements were performed using 1 × 10−3 m KCL solution as the electrolyte. 

  Page 23 

  Page 23 

The VisioLab interface calculated the zeta potential from the streaming current measurements 

according to the Fairbrother–Mastin approach (1) 

 (1) 

Where dU/dp  is  the  slope of  the  streaming  current  versus pressure, η  is  the viscosity of  the 

electrolyte, ε is the dielectric constant of the electrolyte, ε0 is the vacuum permittivity and KB is 

the specific electrical conductivity of the electrolyte solution outside the capillary system. 

Accelerated degradation: PCL is a polyester of slow hydrolysis‐based degradation rate; 

therefore,  we  compared  degradation  properties  of  the  PCL  scaffolds  using  accelerated 

degradation in NaOH (Figure 2). Samples were placed in NaOH 2M solution and incubated at 37oC 

in shaking incubator at 200 rpm. The samples were recovered, washed with miliQ water and dried 

in  vacuum  until  stable  weights.  The  molecular  weight  of  samples  was  determined  by  gel 

permeation chromatography (GPC). 

Gel permeation chromatography: GPC was used to study the change in molecular weight 

of PCL scaffolds after degradation in NaOH solution. Samples were dissolved in Chloroform with 

a concentration of 0.5%w/v and the solutions were filtered with a 0.22 μm filter. The molecular 

weights of samples were measured by Waters 1515 Isocratic HPLC Pump (Waters, Milford, MA) 

equipped with Waters 2487 Dual Absorbance detector. Chloroform was used as a mobile phase 

at  a  flow  rate  of  1  mL/min.  10  μL  of  sample  was  injected  for  each  measurement  and  the 

measurement was run for 40 minutes. 

    

Figure 2. Schematic of accelerated degradation experiment 

 

  Page 24 

  Page 24 

Cefazolin release from scaffold: Release of Cefazolin from scaffolds was tested in sterile 

PBS with the PBS volume/scaffold weight ratio of 10 μL/mg in a shaker incubator set at 37°C and 

225 rpm.  The eluate was collected and replaced with fresh sterile PBS every hour for the first 6 

hours and then every day for 7 days. The concentration of the Cefazolin in eluate was determined 

by measuring absorbance at 272nm using a spectrophotometer (x‐Mark, BioRad, California) and 

a standard curve of known Cefazolin concentrations.  

Biocompatibility Testing: Cytotoxicity was tested using murine embryonic 3T3 fibroblasts 

(CCL‐92, ATCC, VA, USA) and AlamarBlue assay. A standard curve was first created by culturing 

cells  to  70‐80%  confluence  in  complete  Modified  Eagle  Medium  (αMEM,  Thermo  Fischer 

Scientific) which was supplemented with 10%v/v fetal bovine serum (FBS, Sigma‐Aldrich) and 1% 

penicillin–streptomycin  (PS, Sigma‐Aldrich), cells were seeded  in wells of a 96‐well plate with 

decreasing density in 100 μL complete αMEM. The plates were incubated at 37°C for 12 hours, 

then the culture medium removed and 100 μL of 10% Alamarblue in complete αMEM was added 

for a further 4 hour incubation after which 50 μL from each well was transferred to a black 96‐

well plate and fluorescence intensity was measured using a plate reader (Polarstar Optima, BMG 

Labtech, Ortenberg) with excitation of 544 nm and emission of 590 nm.  For Cefazolin cytotoxicity 

testing, the cells were seeded in a 96‐well plate at a density of 104 cells in 100 μL complete αMEM 

and cultured for 24 hours at 37°C, culture media was removed and replaced with serially diluted 

solutions of Cefazolin in complete αMEM . The plate was incubated for 24 hours at 37°C, then 

medium removed and 100uL 10% Alamarblue in αMEM added, after a further 4 hours incubation 

the  fluorescence  intensity  of  the  solution was measured  as  above.    Cells  treated with  100% 

Phenol  and  culture  media  only  serve  as  positive  and  negative  controls.  Experiments  were 

repeated 3 times with n=3 replicates in each repeat (n=3). 

Antibiotic  Bioactivity  Testing:  S.  aureus  (ATCC29213)  was  used  for  the  experiments. 

Growth of the bacteria was first characterized. Bacteria colonies were selected from agar plates 

and  inoculated  into  10  ml  Lysogeny  Broth  (LB)  and  incubated  for  12‐16  hours  on  a  shaker 

  Page 25 

  Page 25 

incubator  set  at  37°C  and 225  rpm.  The  absorbance at  600 nm  (OD600)  of  100 μL  bacterial 

suspension  was  measured  and  correlated  to  the  number  of  colony  forming  units  (CFU) 

determined  by  the  agar  plate  spreading  and  counting method.  From  the  overnight  culture, 

bacteria were diluted to 5x108 CFU/mL in LB and incubated in a shaker incubator at 37°C 225 rpm 

and the OD600 and CFU counts were determined every hour for 6 hours to characterize the early 

log phase bacterial growth. The late log phase growth of bacteria was characterized by diluting in 

1:1 double strength cation‐adjusted Muller‐Hinton Broth (2xCAMHB, with 40 mg/L of CaCl2 and 

20 mg/L of MgCl2) and PBS, and plating in a 96‐well plate to give 100 μL of 5x106  CFU/ml per well, 

the plate was then incubated at 35°C statically and the OD600 measured and CFU counted by 

plating method every hour for 8 hours.   

The minimum  inhibitory  concentration  (MIC)  of  fresh  Cefazolin  to  kill  50%  and  90% 

(MIC50 and MIC90) of late log phase S. aureus was determined by adding 5x105 CFU bacteria into 

each well of a 96‐well plate followed by adding serially diluted Cefazolin solutions and cultured 

for 12‐16 hours 35°C statically. PBS solution was used as a negative control. Testing the bioactivity 

of  the Cefazolin  in  the eluates  released from scaffolds was carried out using this protocol by 

diluting eluates in double strength CAMHB containing 5x105 CFU bacteria and incubating for 8 

hours  in a shaker  incubator at 35°C, 225 rpm. The absorbance at 600 nm (OD 600) was then 

measured  and  the  CFU/ml  was  calculated  from  the  pre‐established  standard  curve  and 

normalized by that of PBS only negative control. 

Agar diffusion testing: S. aureus was plated on Mueller‐Hinton agar, and scaffolds 

(square, 2 mm x 2 mm x 1.5 mm) loaded with Low Dose, Medium and High doses of Cefazolin 

were placed and gently pressed to have stable contact with agar to allow for diffusion of drug 

into the agar. The plates were incubated at 37oC for 12 hours and zones of inhibition were 

measured with a ruler. 

Blood Clot  Formation:  Sheep whole blood was  freshly  collected  into Vacuette®  tube 

(Greiner Bio‐one, Kremsmünster) 3.5mL 9NC coagulation sodium citrate 3.2% and stored at 4oC. 

  Page 26 

  Page 26 

Blood and CaCl2 0.2M were warmed to 37oC for 1 hour prior to experiments. 190 µL blood was 

added into each 2‐mL Eppendorf tube and a scaffold of known weight was added to the tube. 

Then 10 µL of CaCl2 0.2M was added to each tube and gently mixed. The tubes were incubated 

for 2 hours. Finally the clots were gently collected from the tubes and weighed. Solid scaffolds 

and microporous scaffolds loaded with High Dose Cefazolin was compared with a control group 

of no scaffolds (n=5). 

 Statistical Analysis: Data were reported as mean ± SEM unless otherwise indicated, and 

statistical significance between groups was determined by two‐tailed student’s t test. 

2.4 RESULTS 

2.4.1 Scaffold manufacturing and characterization 

The  SEM  images  were  taken  at  3  magnifications  to  show  the  morphology  of  PCL 

scaffolds,  the  cross  sections  and  surfaces  of  the  struts  and  bars.  SEM  imaging  showed  clear 

presence of pores in micrometre scale within the microporous scaffold struts (Figure 3a and c) as 

the result of the salt‐leaching process compared with solid struts of the normal mPCL scaffolds 

(Figure 3b and d). 

  Page 27 

  Page 27 

 

Figure  3. Scaffold  characterization. Overview  images  (insets)  and  SEM  images of  scaffolds  at 

increasing magnifications for microporous scaffolds ((a1)‐(a3)), normal scaffolds (solid strut, (b1)‐

(b3)) and GelMA coated microporous scaffolds ((c1)‐(c3)) and GelMA coated solid scaffolds ((d1)‐

(d3)). Scale bars = 500 μm for (a1)‐(d1); 200 μm for (a2)‐(d2); 50 μm for (a3)‐(d3). Micro CT images 

of  e) microporous  scaffold  and  f)  solid  scaffold  at  two  representative  cross  sectional  planes. 

Microporosity analyzed by measuring in 2D slice images from micro CT is c.a. 41%. Circular non‐

interconnected pore present in the solid scaffolds (f) are believed to result from air entrapment 

during the extrusion process. g) The leaching process of mPCL over 14 days indicating complete 

leaching of porogen was achieved. Scaffolds were dissolved in chloroform to make solutions of 

10 %( w/v). Any porogen remained in the scaffold would give rise to the solution absorbance 

which was measured with a spectrophotometer. 

 

The majority of micropores have relatively similar sizes ranging from c.a. 20 μm to c.a. 70 

μm with few particularly larger pores which were likely the result of porogen aggregation during 

  Page 28 

  Page 28 

the  sample making processes. Microporosity was  further  characterized using micro‐CT which 

interestingly  showed  occasional  spherical  pores  in  the  solid  scaffolds  (Figure  3e  and  f).  The 

presence of these spherical pores in the struts and bars of the solid 3D scaffolds was previously 

documented by our  group  and  is  likely  the  result  of  air  bubbles  entrapped during  the melt‐

extrusion process, they are sparse and not interconnected. GelMA coating is visible as only a thin 

material at the edge of the struts, most noticeable where the struts fuse (Figure 3c and d). The 

leaching process demonstrated the progression of the removal of porogen during immersion and 

was complete after 14 days (Figure 3g). This conclusion is also supported by examination of the 

cross  sections  of  14  days  leached  scaffolds with  SEM and micro  CT  showing  the  absence  of 

porogen particles (Figures 3 a1 and e). 

The surfaces of microporous mPCL and mPCL scaffolds were found similar in terms of 

microscopic morphology,  roughness (Figure 4a and b). The surface charges of  these scaffolds 

were  also  not  different  (Figure  4g).  The  measured  similar  contact  angles  (Figure  4c)  were 

therefore expected. 

The  overall  porosity  (i.e.,  the  total  of  microporosity  and  macroporosity)  of  the 

microporous  scaffolds  calculated  using  mPCL  density  and  scaffold  dimensions  was  80±1% 

compared with 62±0.3% for the solid scaffolds (Figure 4d). Since the two types of scaffolds were 

made using the same parameters of the 3D printing process, they were assumed to have the 

same macroporosity; the microporosity within the scaffold struts in the microporous scaffold was 

then calculated to be approximately 47%. This is in good agreement with the total microporosity 

of 41±11% obtained from analysis of microCT images. 

  Page 29 

  Page 29 

 

Figure 4. Physicochemical characterization of microporous mPCL scaffolds compared with mPCL 

scaffolds showing mean + SEM for: a)& b) AFM imaging and surface roughness analysis showing 

non‐significant difference in topography; c) contact angles demonstrating similar hydrophilicity 

as  expected  from  surface  hydrolysis  of  mPCL  during  leaching  d)  porosity  determined  using 

scaffold dimensions, weight and mPCL density (n=4). Total porosity was significantly higher for 

microporous scaffolds at 80±1% compared with 62±0.3% for the solid scaffolds. e) surface areas 

  Page 30 

  Page 30 

measured with gas adsorption and analyzed with B.E.T method was also significantly higher for 

the microporous group (data is average of 2 measurements) and f) compressive modulus (MPa) 

over  three  compressing  ‐  relax  cycles  (n=3)  showing  non‐significantly  lower  values  for 

microporous scaffolds. g) Mean Zeta potential for solid and microporous scaffolds showing both 

having negative surface charges with no significant difference as expected from the same post‐

printing treatment procedure to both scaffolds. (* p < 0.05). 

 

 Surface  Area:  The  specific  surface  area  of  the  microporous  scaffolds  was  also 

significantly  higher  for  the microporous  scaffolds at  4887±88  cm2/g  compared with 1260±76 

cm2/g of the solid scaffolds (Figure 4e). 

Mechanical  Testing:  The  microporous  scaffolds  showed  lower  (non‐significant) 

compressive modulus compared with the solid mPCL scaffolds with the largest difference for the 

first  cycle  of  compression‐relaxing  experiment  (Figure  4f).  This  is  expected  as  the  intra‐strut 

micropores  would  make  the  microporous  scaffolds  softer  which  could  be  beneficial  for 

applications  such  as  in  soft  tissue  regeneration  where  it  is  desirable  to  have  scaffolds 

mechanically similar to the native soft tissue. 

2.4.2 Degradation test. 

The  accelerated  degradation  test  demonstrated  increased  porosity  in  microporous 

scaffolds evident on scanning electron microscope imaging around the perimeter and centrally 

within the struts (Figures 5b1, b2, d1 and d2). The molecular weight increased for the solid mPCL 

is attributed to the removal of amorphous/less crystalline regions of the polymer in the first steps 

during degradation. In contrast, a decrease in Mw was seen for the microporous mPCL and this 

is attributed to the fact that the increased surface areas and porosity accelerated the degradation 

and has led to bulk erosion in the case of these scaffolds (Figure 5e). This conclusion is supported 

  Page 31 

  Page 31 

by the stark difference in morphologies of mPCL and microporous mPCL scaffolds both on the 

surface and in the cross sections in the SEM images (Figure 5 a, b, c and d) 

   

Figure 5. Accelerated degradation test. mPCL and microporous mPCL scaffolds were immersed in 

NaOH 2M  in  a  shaker  incubator  (at  37oC,  121  rpm)  for  48 hours.  SEM  imaging  revealed  the 

substantial increase in porosity both on the surface and cross section of the microporous scaffold 

(scale bars = 100 μm). (e): GPC analysis showed results of molecular weight changes after the 

test; mPCL scaffolds exhibited slight increase in Mw likely due to the removal of amorphous/less 

  Page 32 

  Page 32 

crystalline region during the degradation from the scaffolds. The reduction in Mw of microporous 

scaffolds is attributed to the bulk erosion as seen in SEM images on the surface and cross section 

of the scaffolds. 

 

Weight loss measurement showed negligible reduction for mPCL scaffolds and almost 

linear reduction of c.a. 65% in 48 hours in NaOH 2M.  

This degradation data indicated that the microporous scaffolds facilated the degradation 

of PCL which is preferable in many regenerative applications such as for soft tissue where the 

current slow rate (~ up to 2 years for complete degradation) is a limitation for PCL. 

2.4.3 Loading and release of antibiotics and its bioactivity. 

Cefazolin release: Both types of scaffolds showed capability to load and subsequently 

release  Cefazolin.  Microporous  scaffolds  demonstrated  a  clear  dose‐dependent  release 

characteristic while solid scaffolds showed no significant difference between the Medium Dose 

and High Dose  in most of the time points tested which  is likely due to a smaller surface area 

compared with microporous mPCL scaffolds (Figure 6[A]).  

  Page 33 

  Page 33 

 

Figure  6.  Characterization  of  Cefazolin  release  kinetics  from  scaffolds.  [A]:  comparison  of 

Cefazolin non‐cumulative release profiles for GelMA coated microporous mPCL and solid mPCL 

  Page 34 

  Page 34 

over the first 6 hours and next 7 days reported as mean±SEM  (n=9)  a) The released Cefazolin 

concentrations  showed  dose  dependence  in  both  normal  and  microporous  scaffolds.  The 

microporous scaffolds also showed consistently higher release up to day 6 (comparing within the 

same  dose  group).  b)  The  total  Cefazolin  amount  released  at  each  time  point  (in  μg)  was 

consistently higher for microporous compared with normal scaffolds for 3 consecutive days. [B]. 

Comparison of Cefazolin release profiles in PBS for microporous mPCL scaffolds with and without 

GelMA coating (n=9) at high loading dose a) total release from scaffolds with a reduced burst 

release for GelMA coated scaffolds which released significantly less in the first 6 hours and b) 

release at each time point presented as percentage of total released, with the GelMA coated 

scaffolds showing a more gradual release indicating a reduced burst release. 

 

The Cefazolin concentration the eluates from Cefazolin–loaded microporous scaffolds 

ranged from a mean of c.a. 25 ppm in the first hour for the High Dose group to 0.25 ppm at day 

7  for  the  Low Dose  group  (Figure  6[A]‐a).  The High  Dose microporous  scaffolds  produced  a 

concentration above the MIC90 for 4 consecutive days. The microporous scaffolds also released 

significantly more drug than the solid scaffolds for 3 days (Figure 6[A]‐b). The mean release per 

scaffold  increased with  loading concentration at  the time points  tested. The porous scaffolds 

demonstrated an initial ‘burst release’ in the first few hours followed by a sustained release over 

7  days.  Importantly,  the  microporous  scaffolds  with  GelMA‐coating  exhibited  a  lower  burst 

release (Figure 6[B]‐a) (i.e., release in the first 6 hours) compared with scaffolds without GelMA 

coating.  

Loading efficacy: Loading efficacy was calculated as the ratio of total amount released to 

the original drop–loaded Cefazolin amount. The loading efficacy was significantly higher for the 

GelMA coated microporous scaffolds at 4.10.2, 5.60.5, 7.00.4% for High Dose, Med Dose and 

Low Dose respectively compared with 1.50.1, 4.20.3 and 5.50.5% for the solid scaffolds. The 

High Dose uncoated scaffolds showed higher loading efficacy of 7.41.7% and 17.61% for solid 

  Page 35 

  Page 35 

and microporous respectively but this was mostly seen as a burst release in the first hours with 

reduced subsequent release. 

Bioactivity Testing: The S. aureus strain showed typical initial lag phase followed by logarithmic 

early and late growth phase (Figure 7[A]‐a) which would typically be followed by a stationary 

phase however this was not tested in our study. Testing using fresh Cefazolin solution showed 

an MIC90 of c.a. 0.8 ppm and an MIC50 of c.a. 0.1 ppm (Figure 7[A]‐b).  Bioactivity of Cefazolin 

eluates collected at different time points from microporous mPCL scaffolds loaded with Low 

Dose, Medium Dose and High Dose demonstrated dose‐dependent antimicrobial activity 

(Figure 7[B]) from which MIC90 of eluted Cefazolin was calculated to be approximately from 0.7 

to 1.3 ppm, and an MIC50 of c.a. 0.3 ppm which is similar to that of fresh Cefazolin (Figure 7[A]‐

b). The antimicrobial activity of the microporous scaffold loaded with Cefazolin was also 

demonstrated through the zone of inhibition experiment (Figure 8c) which showed a dose‐

dependent zone of inhibition on the loading doses. 

 

  Page 36 

  Page 36 

 

Figure 7. Antimicrobial activity of Cefazolin on S. aureus. [A] Effects of Cefazolin on planktonic S. 

aureus growth. a) Characterization of S. aureus growth demonstrating a typical growth curve of 

the bacteria including an initial lag phase (3 hours) followed by log growth phase (8 hours) 

(n=3). The stationary phase was not tested in this experiment. Bacteria in the log growth phase 

were then used for subsequent antibiotic testing experiments. b) Growth curves of S. aureus 

treated with increasing concentrations of Cefazolin, demonstrating the MIC50 = 0.1 ppm and 

MIC90=0.8 ppm where 50% and 80% of bacterial growth was inhibited respectively (n=3) [15]. 

[B] Bioactivity of Cefazolin eluates collected at different time points from microporous mPCL 

scaffolds loaded with Low, Medium   and High Dose of Cefazolin determined as CFU normalized 

by that of untreated control. Data = mean ± SEM (N=3 repeats with 3 replicates in each repeat). 

The eluates demonstrated dose‐dependent antimicrobial activity from which MIC90 of eluted 

Cefazolin was calculated to be c.a 0.7 to 1.3 ppm, and an MIC50 of c.a. 0.3ppm which are similar 

to those of fresh Cefazolin in [A]b). 

  Page 37 

  Page 37 

2.4.4 Biocompatibility testing 

Metabolic activity (shown to correlate well with cell number Figure 8a) assays showed 

slight increase in cells treated with low Cefazolin concentration (< 1 ppm) and remained high for 

concentrations up to 100 ppm (Figure 8b). This is in agreement with other studies which show 

limited toxicity of Cefazolin below 100 ppm[75]. 

Formation of a stable blood clot in macroporous scaffolds after implantation has been 

recognized  recently  by  several  groups  as  important  for  subsequent  cellular  infiltration  and 

vascularization [76, 77]. Here we observed no detrimental effects of microporosity and Cefazolin 

loading on this process as indicated by similar clot weights (Figure 8d).  

 

Figure 8. In vitro testing of biocompatibility and activity. Alamarblue assay on 3T3 fibroblast cells. 

a) Standard curve correlating fluorescence intensity (excitation: 544 nm, emission: 590 nm) and 

fibroblast  cell  number  (data  =  mean±  SEM,  n=3)  showing  strong  correlation  (R2=0.999).  b) 

  Page 38 

  Page 38 

Fibroblast  cell  number  (data  =  mean±  SEM,  N=3)  after  24  hour  treatment  with  different 

concentrations of Cefazolin indicating no cytotoxicity of Cefazolin concentration of up to 100ppm. 

c)  Agar  diffusion  test  of  Cefazolin–loaded  microporous  scaffolds  (without  GelMA  coating) 

showing dose‐dependent zone of inhibition on S. aureus. * p<0.05, data = mean ± S.E.M (n= 8). 

d) In vitro blood clot formation on scaffolds. No significant difference in blood clot weight formed 

in presence of microporous PCL scaffold without (PCL scaffold) and with high dose of Cefazolin 

(PCL Scaffold with Cefazolin) compared with control group without scaffold (blood only) (n=5). 

 

2.5 DISCUSSION 

It  is  being  recognized  that  tissue  engineering  scaffolds  should  be  designed  to  have 

multiple functions to (i) facilitate cellular attachment, infiltration and vascularization and also (ii) 

prevent  complications  such  as  infection  to  ensure  successful  treatment  outcomes  [78,  79]. 

Criterion (i) has been realized by using scaffold surface treatment and scaffold’s macro‐porosity 

with  interconnected  pores  of  around  300  µm  or  above  which  is  known  to  be  crucial  in 

vascularization of implanted scaffolds in regeneration of clinically relevant volume of tissue [80]. 

Solid‐free  form  fabrication  techniques  such  as  SME  are  emerging  techniques  that  allow  for 

generation of patient‐ specifically shaped constructs with such properties [81]. Criterion (ii) has 

been  often  realized  using  drug‐delivery  approach  where  drugs  (such  as  antibiotics, 

chemotherapeutics) are incorporated into the raw materials during the scaffold preparation [82, 

83]. Yet, major limitations of this method include instability issue of the drugs and lack of control 

on specificity in dosing. 

This  study aimed  to develop a  versatile  scaffold platform  to enable  loading of drugs 

independently from scaffold fabrication process. A traditional porogen leaching technique was 

combined with SME to produce polymeric scaffolds with a macroporous struts/bars structure 

that have intra‐strut/bar microporosity. The method of porogen leaching to create porogen was 

  Page 39 

  Page 39 

chosen over other pore making methods thanks to its versatile properties. The main goal of this 

study is to modify the PCL scaffolds, which have been previously proven to have good promise 

for tissue reconstruction, to have the second function – drug delivery. The use of salt leaching can 

utilize the  intra‐strut volume to the PCL struts. Compared with other method, the microscale 

pores inside the strut can be easily generated by a simple leaching process and pore size and 

porosity  of  the  intra‐strut  structure  can  be  easily  altered  by  changing  size,  shape  and 

concentration of porogen. 

The introduction of microporosity in macroporous polycaprolactone scaffolds allowed 

for rapid and specific loading of model drug Cefazolin and its efficient release in a dose dependent 

manner. This study therefore demonstrated the proof‐of‐principle that drugs such as antibiotics 

could be  readily  loaded  to  scaffolds using  simple  solution‐based,  in‐operation‐theather‐ready 

loading method,  and  its  release  could be  controlled and  tailored  for different applications  in 

surgical site infection prophylaxis.  

A number of factors have been recognized to control the loading and release kinetics of 

water soluble drugs such as Cefazolin from carrier devices [84‐86]. In this study, the loading of 

microporous scaffolds was correlated with increased surface area, hydrostatic forces and surface 

etching with  NaOH.  The microporous  intrastrut/bar  architecture was  shown  to  increase  the 

release efficacy with significantly more Cefazolin released for 3 days, and a greater overall total 

release. This is clinically relevant in the context of inhibiting the growth of bacteria introduced at 

surgery for tissue engineering applications where there are often constraints such as on scaffold 

weight and volume. These  results also suggest  that  the drug  release profile  could be  further 

controlled by varying the microporosity and/or pore size through porogen concentration and size 

during scaffold manufacturing. 

The use of a GelMA barrier coating was shown to dampen the initial burst release, which 

is  recognized  as  undesirable  in  many  cases  because  of  the  potential  local  toxicity  and/or 

subsequent release of sub‐therapeutic antibiotic levels. The combination of microporosity and 

  Page 40 

  Page 40 

GelMA coating showed a smaller initial burst release over a few hours followed by an extended 

release over the next few days. This release profile is highly desirable for an antibiotic eluting 

device so as to target the risk of infection during initial inoculation and continue to prevent latent 

infection [85].  The use of the GelMA is analogous to the barrier coating on a reservoir type drug 

eluting device. These systems often include a drug‐containing polymer core and a drug free top 

layer that acts as a rate‐limiting barrier leading to sustained drug release [87]. A small initial burst 

release can also be observed in these systems due to the migration of the drug into the top layer 

after preparation [84]. In this study, GelMA was chosen because of its versatility in production 

and biological properties; it has been shown to encourage cellular adhesion and proliferation and 

it can be readily photon – or chemically cross‐linked [88]. 

The  released  Cefazolin  showed  high  retention  of  bioactivity  which  highlights  an 

important advantage over traditional systemic administration of sustained local delivery systems 

where drug degradation in aqueous solution is greatly reduced[89]. In our experiments, there 

was only slight decrease in MIC50 and MIC90 of Cefazolin released from scaffolds indicating that 

the scaffold‐bound Cefazolin retained its bioactivity even when the scaffolds were immersed in 

PBS. Another important advantage of scaffold‐based local delivery is that peak concentration of 

Cefazolin  around  the  scaffold  is  obtained  immediately  after  implantation,  which  would  be 

effective in targeting bacteria inoculated during surgery. Reports in the literature show that after 

systemic administration it takes up to 2 hours for tissue concentration of Cefazolin to reach peak 

and the pharmacokinetics of single dose resulted in peak tissue concentrations of up to 24 ppm 

with a half‐life of only 3 hours resulting in concentrations dropping below the MIC for S. aureus 

in under 24 hours [90].  

There are few reports in the literature focusing on local delivery of water soluble drugs 

such as Cefazolin from polycaprolactone vehicles. One such study used PCL incorporating foam 

pads made by freeze drying a solution of PCL and Cefazolin applied at the interface of a metal pin 

to prevent infection in a rabbit tibia model [91]. This report showed strong  in vitro release of 

  Page 41 

  Page 41 

Cefazolin in the first day followed by more gradual release in days 2 and 3 and negligible release 

afterward. The application of a Cefazolin–loaded pad in the rabbit reduced the rate of S. aureus 

detection in the surgical wound. This Cefazolin‐PCL foam is potentially useful but this method of 

incorporating Cefazolin has several limitations including limited solubility, potential degradation 

of Cefazolin in the solvent and no system for achieving exact doses for specific scaffolds. The 

method of blending/mixing PCL with a drug is perhaps the most common approach reported in 

the  literature  to make drug delivery  systems  (scaffolds, meshes, membranes etc.).  Teo et al. 

blended Gentamicin sulphate with PCL and tricalcium phosphate (TCP) and extruded the mixture 

to create mesh capable of local delivery of gentamicin to prevent wound infection [92]. However, 

the  elevated  temperature used  in  such  thermal  blending  process  has  the  potential  to  cause 

significant  drug  degradation.  Another  group  3D  printed  PCL/PLGA  scaffolds  loaded  with 

tobramycin  and  demonstrated  bactericidal  activity  against  S.  aureus  in  vitro  and  successful 

treatment of established bone infection in a rat model[14]. This experiment was aimed at treating 

infection and used Tobramycin  a  known heat  stable  antibiotic,  however  this  antibiotic  is not 

appropriate for prophylactic use and there are no antibiotics commonly used to prevent infection 

which are heat stable [16]. Cryomilling could also be used for blending but it is an energy‐intensive 

and lengthy process and obtaining the exact drug dosing for specific scaffolds is still challenging. 

Here we developed a new strategy to independently control the scaffold manufacturing and drug 

loading  processes.  Our  novel  scaffolds  with  micropores  and  increased  surface  area  offer  a 

versatile platform for drug incorporation using a simple solution soak/drop loading method and 

allow for specific dosing to suit different needs. 

Both the microporous scaffolds with and without Cefazolin showed no apparent adverse 

effects on blood clot formation. The formation of a haematoma after the surgical implantation of 

a tissue engineering scaffold and establishment of a blood clot are recognized as essential for 

cellular recruitment and the regeneration process in tissue engineering [93]. The stabilized clot 

acts as a supporting matrix for cell migration, provides growth factors and pre‐cursor cells and 

  Page 42 

  Page 42 

facilitates  the  formation  of  a  vascular  network  [93].  It  is  therefore  imperative  that  a  tissue 

engineering construct does not impede blood clot formation as was demonstrated with these 

scaffolds. 

A  limitation  in  our  experimental  procedure was  the  fact  that  our methods  of  drop‐

loading of antibiotic onto scaffolds and dip coating with GelMA has not been optimized, which is 

believed to have resulted in low overall loading efficacy (less than 10%). This drop loading method 

was used so as to devise an in‐theatre‐preparation method which would allow Cefazolin to be 

loaded onto previously  prepared microporous  scaffold with  specific  dosing based on patient 

characteristics  and  surgical  scenario.  This  would  also  be  more  versatile  than  pre‐produced 

antibiotic–loaded scaffolds and negates issues with antibiotic stability in storage. Soak loading 

microporous scaffolds in antibiotic solution may be a more preferable method to achieve more 

consistent  and  uniform  loading.  Further,  the  dip  coating  process  of  GelMA  has  not  been 

optimized as significant drug loss occurred during this rather inefficient process. Hence, future 

experiments will focus on optimising these loading and coating methods. Beside loading method, 

the release profile should also be modelized to deeply understand the release kinetic and the 

applied drugs.  

2.6 CONCLUSION 

3D printed scaffolds with  intra‐strut microporosity were created by combining  screw 

melt  extrusion  and  salt‐leaching  methods  for  applications  in  tissue  engineering.  The 

microporosity allowed for loading and subsequent sustained release of Cefazolin using simple 

solution  drop  loading  method.  The  increased  surface  area  and  the  micropores  facilitated 

Cefazolin  loading with specific doses and the application of GelMA coating reduced the burst 

release allowing for more sustained release compared with scaffolds of solid struts. This type of 

scaffold  design  with  micro‐  and  macro‐porosity  is  promising  for  several  tissue  engineering 

  Page 43 

  Page 43 

applications where loading and local delivery of drugs, nanoparticles or small molecules is desired 

to achieve improved therapy outcome.   

  Page 44 

  Page 44 

3Chapter 3:  3D printed dual macro‐, 

microscale porous network as a tissue 

engineering scaffold with drug delivering 

function 

Hoang Phuc Dang a, b, Tara Shabab a, b, Abbas Shafiee b, c, Quentin C. Peiffer a, b, Kate Fox d, Nhiem 

Tran e, Tim R. Dargaville f, Dietmar Werner Hutmacher a, b and Phong A. Tran a, b, g 

 

Published in Biofabrication 11 (2019): number 3  

a   ARC Centre  in Additive Biomanufacturing, Queensland University of  Technology, Musk 

Avenue, Kelvin Grove, Brisbane, Queensland 4059, Australia 

b   Centre  in  Regenerative  Medicine,  Institute  of  Health  and  Biomedical  Innovation, 

Queensland University of Technology, Brisbane, Australia 

c   The University of Queensland, UQ Diamantina Institute, Translational Research Institute, 

Brisbane, Queensland, Australia 

d   Center for Additive Manufacturing, RMIT University, Melbourne, Victoria, Australia 

e   School of Science, RMIT University, Melbourne, Victoria, Australia 

f   Institute of Health and Biomedical Innovation, QUT, Brisbane, Queensland, Australia 

g   Interface  Science  and  Materials  Engineering  group,  School  of  Chemistry,  Physics  and 

Mechanical Engineering, QUT, Brisbane, Queensland, Australia 

 

   

Page 45 

Page 45 

The authors listed below have certified that: 

6. They  meet  the  criteria  for  authorship  in  that  they  have  participated  in  the  conception, 

execution, or interpretation, of at least that part of the publication in their field of expertise; 

7. They take public responsibility  for  their part of the publication, except  for the responsible

author who accepts overall responsibility for the publication; 

8. There are no other authors of the publication according to these criteria; 

9. Potential conflicts of  interest have been disclosed to  (a) granting bodies,  (b)  the editor or

publisher of journals or other publications, and (c) the head of the responsible academic unit, 

and 

10. They agree to the use of the publication in the student’s thesis and its publication on the QUT’s 

ePrints site consistent with any limitations set by publisher requirements. 

In the case of this chapter: 

Published paper: 

Hoang Phuc Dang, Tara Shabab, Abbas Shafiee, Quentin C. Peiffer, Kate Fox, Nhiem Tran, Tim R. 

Dargaville, Dietmar Werner Hutmacher and Phong A. Tran. “3D printed dual macro‐, microscale 

porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function.” Biofabrication 11 

(2019): number 3. 

Contributor  Statement of contribution 

Hoang Phuc Dang 

Conducted experiments, data analysis, prepared the first draft of 

manuscript Signature 

Date: 

Tara Shabab 

Conducted experiments and data analysis, manuscript 

preparation 

Page 46 

Page 46 

Abbas Shafiee  Aided data analysis  and manuscript preparation 

Quentin C Peiffer  Conducted experiments 

Kate Fox  Conducted experiments 

Nhiem Tran  Aided manuscript preparation 

Tim R Dargaville  Aided manuscript preparation 

Dietmar W. Hutmacher  Experimental design, aided manuscript preparation 

Phong A. Tran 

Experimental design, aided data analysis and manuscript 

preparation 

Principal Supervisor Confirmation 

I have sighted email or other correspondence from all Co‐authors confirming their 

certifying authorship 

 Phong Tran     06/02/2020  

Name  Signature  Date 

QUT Verified Signature

  Page 47 

  Page 47 

3.1 ABSTRACT 

Macroporous  scaffolds  are  important  in  tissue  engineering  therapy  for  regeneration of  large 

volume defects resulting from diseases such as breast or bone cancers. Another important part 

of the treatment of these conditions is adjuvant drug therapy where drugs are administered to 

prevent disease recurrence or surgical site infection. In this study, we developed a new type of 

macroporous scaffolds that have drug loading and release functionality to use in these scenarios. 

3D printing allows for building macroporous scaffolds with deterministically designed complex 

architectures for tissue engineering, yet they often have low surface areas thus limiting their drug 

loading  capability.  In  this  proof‐of‐concept  study,  we  demonstrated  that  microporosity 

introduced into macroporous scaffolds allowed for efficient loading of various clinical drugs using 

simple soak loading methods and sustained their release. Manufacturing of scaffolds having both 

macroporosity and microporosity remains a difficult task. We combined porogen leaching and 3D 

printing  to  achieve  this  goal.  Porogen  microparticles  were  mixed  with  medical  grade 

polycaprolactone (MPCL) and extruded into scaffolds having macropores of 0.7 mm in size. After 

leaching,  intra‐strut  micropores  were  realized  with  pore  size  of  20  –  70  μm  and  a  total 

microporosity of nearly 40%. Doxorubicin (DOX), paclitaxel (PTX) and cefazolin (CEF) were chosen 

as model  drugs  of  different  charges  and  solubilities  to  soak–load  the  scaffolds  and  achieved 

loading efficiency of over 80%. The microporosity was found to significantly reduce the burst 

release allowing the microporous scaffolds to release drugs up to 200, 500 and 150 hours for 

DOX, PTX and CEF, respectively. Finally, cell assays confirmed the bioactivities and dose response 

of  the  drug–loaded  scaffolds.  Together,  the  findings  from  this  proof‐of‐concept  study 

demonstrate a new type of  scaffolds with dual micro‐, macro‐porosity  for  tissue engineering 

applications with intrinsic capability for efficient loading and sustained release of drugs to prevent 

post‐surgery complications. 

  Page 48 

  Page 48 

3.2 INTRODUCTION 

Scaffold‐based  tissue  engineering  is  promising  in  regenerating  large  volume  tissue 

defects, such as those resulting from surgical removal of primary bone or breast tumors [1, 2, 42, 

94‐96]. As with other implanted devices, these scaffolds are prone to post‐surgery complications 

such as surgical site bacterial infections or bacterial biofilm formation on the scaffolds. In the case 

of patients receiving these scaffolds following tumor removal, cancer can recur because some 

cancer cells were incompletely removed [97‐101]. Therefore, current standard treatments still 

involve  systemic  administration  of  antibiotics  or  chemotherapeutic  agents  post‐surgery. 

However, systemic toxicity and low accumulation of the drug at the tumor site remain major 

limitations [102‐104]. In addition, side effects caused by the solvents that are required to dissolve 

poorly  soluble  drugs  prior  to  treatment  cause  further  burden  to  the  patients.  For  example, 

paclitaxel  (PTX), a chemotherapeutic agent commonly used to treat breast,  lung, and ovarian 

cancer, is solubilized in solvents such as Cremophor EL and dehydrated ethanol in the commercial 

product Taxol [105]. Cremophor EL has been clinically associated with serious side effects, such 

as hypersensitivity, nephrotoxicity, and neurotoxicity [106, 107]. Furthermore, the low efficiency 

of  systemic  treatments  may  result  in  multidrug  resistant  cancer  and  bacteria,  leading  to  a 

significantly higher mortality rate. 

Many delivery  systems have been developed  to  improve  the  localization and  reduce 

systemic toxicity of drugs. The existing systems can be divided into two groups based on their 

working mechanisms. The  first one  relies on systemic delivery of drug–loaded nanomaterials 

including polymers, lipids, dendrimers, and metals [108‐113]. These nanoparticles can reach and 

be retained in tumors by both passively diffusing through the leaky vasculature system of the 

tumors (enhanced permeability and retention [EPR] effect) and actively targeting by conjugated 

with cancer cell‐specific molecules such as antibodies, folic acid, transferrin, and lactobionic acid 

[114‐118]. Additionally, the nanoparticles can be engineered to respond to environmental stimuli 

such as pH, temperature, light, and sound waves to provide controlled release of the drug [119, 

  Page 49 

  Page 49 

120].  The  first  FDA  approved  nanomedicine  Doxil®  is  doxorubicin  (DOX)  encapsulated  in 

PEGylated  liposome  [121]  that  was  shown  to  significantly  reduce  cardio  cytotoxicity  while 

maintaining  the  chemotherapeutic  effect  compared  with  conventional  DOX  [122].  Similarly, 

nanoparticle‐based  PTX  treatments  have  demonstrated  lower  systemic  toxicity  and  better 

efficacy in combating breast, lung, and ovarian cancer compared with conventional formulation 

[106, 123‐126]. Despite the promising treatment efficacy with lower systemic toxicity, localization 

of drug is still challenging due to the removal and sequestration of nanoparticles by the body’s 

reticuloendothelial  system.  Recent  studies  have  suggested  that  the  EPR  effect works well  in 

rodents  but  not  in  human  [127].  A  retrospective  literature  analysis  by  Wilhelm  et  al. 

demonstrated  that only 0.7%  (median) of  the administered nanoparticle dose  is  found to be 

delivered to a solid tumor [128].  

The second group consists of drug depots that can be implanted intratumorally or in the 

areas adjacent to cancerous tissues. This strategy may provide better drug localization compared 

with  nanoparticle‐based  delivery  systems.  So  far,  a  wide  variety  of  drug–loaded  structures 

including gels, wafers, thin films, particles, and rods have been developed [129‐133]. These drug 

depots, which are mostly made from biodegradable natural or synthetic polymers, can provide 

sustained release of the drug into the tumor locally. Although natural polymers such as alginate, 

dextran, and chitosan are abundant in nature, they are usually poorly soluble in organic solvents, 

making  it  more  difficult  to  incorporate  water‐insoluble  drugs  such  as  PTX  [129,  134,  135]. 

Furthermore,  they  suffer  from batch  to batch  variation and  their natural  structures  limit  the 

ability to customize their compositions to influence the degradation rate and drug release kinetics 

[135, 136]. These weaknesses can be resolved by using synthetic polymers such as polyesters 

based  on  lactide,  glycolide,  and  caprolactone.  Polycaprolactone,  an  FDA  approved  synthetic 

polymer, is a promising candidate for the fabrication of drug depot. 

In the context of tissue engineering (TE) where biodegradable scaffolds are implanted to 

support formation of new tissue, it has been envisioned that these scaffolds could also act as a 

  Page 50 

  Page 50 

local  drug  reservoir  [23,  42‐44].  Yet  a  critical  requirement  for  TE  scaffolds,  particularly  for 

regeneration  of  large  volume  tissue,  is  an  interconnected  network  of  macropores  to  allow 

vascularization  [45,  46].  3D  printing  has  emerged  as  a  powerful  technique  to  achieve  this 

requirement and produce scaffolds of deterministically complex architectures. It has then been 

recently proposed that 3D printed scaffolds could also serve as drug depots  [23, 56]. Yet  the 

macroporosity  requirement,  hence  scaffold’s  low  surface  areas,  presents  a  challenge  for 

developing drug‐delivering TE scaffolds. As a result, most studies in this area demonstrated only 

simple scaffold geometries [44, 57] or lacking macroporosity [44, 137]. Importantly, most of the 

existing methods in this area relied on mixing of drugs and biomaterials before manufacturing 

the mixture into scaffolds [23, 57, 58]. A major limitation of the direct mixing of biomaterials and 

drugs is that it could affect drug’s bioactivities due to elevated temperature or harsh solvents. For 

example,  biological  activity  loss of more  than 10%  for  vancomycin  and 20%  for heparin was 

reported when they were mixed with calcium phosphate for ink‐jet printing into 3D structures 

[57]. In addition, being embedded inside the solid material, the drug will also only release when 

the material degrades which might take a long time, therefore will need much higher drug loading 

to have therapeutic effects [59] and might create undesirable consequences such as persistent 

inflammation or treatment resistance. Research groups have also tried to address this issue by 

adding to the drug‐biomaterial mixture some ingredients (such as hydroxyapatite [59], cellulose 

[60]  or  chitosan  [57])  to  facilitate  fluid  infiltration  and  thus  drug  elution.  This  approach  is 

cumbersome and requires further improvement. 

Our  work  was  based  on  3D  printed  scaffolds  with  large  interconnected  pores 

(approximately 0.7 mm) intended for regeneration of large volume tissue. We hypothesized that 

we could employ these scaffolds themselves as a drug delivery vehicle to have additional benefit 

of local delivery to prevent disease recurrence without systemic toxicity. We also hypothesized 

that  a  drug  immobilization  process  such  as  soak  loading  which  is  independent  of  scaffold 

preparation would allow for versatile drug immobilization and retain drug full bioactivity strength. 

  Page 51 

  Page 51 

Based on these hypotheses and inspired by the “sponge effect” where the small micrometer scale 

pores facilitate capillary force to effectively absorb and retain liquid, we devised a new type of 3D 

printed  scaffolds  having  micropores  that  were  loaded  with  drug  through  soak  loading.  We 

envisioned that our approach would eventually allow for  intraoperative  loading with patient‐

specific doses by surgeons. 

In  this  study,  we  demonstrated  the  proof  of  this  concept  using  polymeric  scaffolds 

manufactured by screw melt extrusion (SME) technique. Medical grade PCL was used because of 

its  biocompatibility  and  degradation,  from  which  many  FDA‐approved  devices  have  been 

prepared and our extensive experience with PCL and manufacturing of PCL scaffolds [58‐61]. We 

first mixed PCL with micro‐sized sodium phosphate‐based porogen particles, then manufactured 

3D scaffolds by extruding the molten mixture through a  fine nozzle  to obtain a scaffold with 

designed macro‐porosity. The scaffolds were then immersed in water to dissolute and leach out 

porogen particles to realize the micro‐porosity inside the struts and bars of the scaffolds. The 

physicochemical  properties  of  the  scaffolds  were  then  extensively  characterized  and  their 

capability to load and release of various clinical drugs used for cancer treatment and infection 

control was demonstrated. We used PCL and SME in this study yet this dual micro‐macro‐porous 

scaffold concept can be extended to other 3D printing materials and techniques. 

3.3 MATERIALS AND METHODS 

3.3.1 Scaffold fabrication  

The scaffolds were fabricated by combining SME and porogen leaching methods. Medical 

grade  PCL  (MPCL;  PURASORB®  PC12)  was  dissolved  in  chloroform  and mixed  with  porogen 

(grounded disodium hydrogen phosphate and sodium chloride salts, sieved to less than 38 μm). 

The mixture was cast on glass surfaces to form thin films (~ 150 µm thick) and dried in a fume 

hood for solvent evaporation. The dried films were used as input material to an SME machine 

Dual Bioextruder where the material was heated up to 100 ‐ 110oC and extruded through a nozzle 

  Page 52 

  Page 52 

to build 3D scaffolds [62] using a design that has 0 – 90o lay‐down pattern, strut diameter of 0.3 

mm and strut‐to‐strut spacing of was 0.6 mm. Scaffolds without microporosity (nMPCL) were 

prepared from MPCL (without porogen) and used as a control. The scaffolds were then immersed 

in NaOH 0.01 M solution in a shaker at 37oC for 14 days to leach out the porogen. Control scaffolds 

were immersed in the same way to keep the treatment consistent. We found that the amount of 

porogen needs  to  be high enough  for  its  complete  removal  through  leaching  yet  a  too high 

percentage of porogen would make extrusion impossible. The weight ratio of 5:4 (MPCL:porogen) 

was found to be optimal through our pilot testing. 

3.3.2 Scaffold characterization 

The surface and strut microporosity of scaffolds were imaged using scanning electron 

microscopy  (SEM)  and  atomic  force  microscopy  (AFM).  Briefly,  the  leached  scaffolds  were 

fractured in liquid nitrogen, and then the surface and cross‐section of struts were gold coated at 

30 mA  for  60‐75  seconds  using  a  Leica  EM  SCD005  gold  coater  (Leica Microsystems GmbH, 

Wetzlar, Germany) and  imaged using a Zeiss FESEM (Carl Zeiss AG, Germany) at accelerating 

voltage of 2 kV. The surface roughness of samples was quantified by scanning at different areas 

of  samples’  struts  (20x20  μm2)  using  an  NT‐MDT  Solver  SPM  apparatus  (NT‐MDT  Spectrum 

Instruments, Russia) equipped with uncoated Ted Pella Tap300‐G cantilevers (Ted Pella Inc., US) 

[138].  To  characterize microporous  structure  and micropore  distribution,  scaffolds were  also 

scanned using a μCT50 micro‐CT scanner (SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Switzerland) at a 

voltage of 45 kVp, a current of 133 μA and a voxel size of 5 μm. By measuring overall dimension 

(V) and weight (W) of scaffolds, intra‐strut porosity was calculated using the following equation 

and MPCL density (d) of 1.146 g/cm3 [139]): 

𝑃𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑡𝑦 % 𝑉 𝑊/𝑑

𝑉∗ 100 

Mechanical properties of scaffolds were evaluated using compression test. Samples (6 

mm diameter and 1.6 mm height) were prepared and compressed at a rate of 0.01 mm/s until 

  Page 53 

  Page 53 

reaching 20% compression using an Instron MicroTester 5848 instrument (Instron Ltd., UK). The 

Young’s modulus was calculated from the slope of the stress‐strain curve.  

To  characterize  the  surface  chemical  properties  of  MPCL  scaffolds,  the  density  of 

negatively charged groups on MPCL scaffold surfaces was quantified by Toluidine Blue O (TBO) 

assay as described elsewhere [65‐68]. MPCL scaffolds were cut into pieces of 5x5x1.5 mm3 and 

added into separate Eppendorf tubes. A volume of 2 mL TBO, 2 mM solution in NaCl 0.015 M at 

pH 11, was added to each tube. The tubes were degassed for 5 minutes and shacked at RT for 2 

hours. Scaffolds were washed twice with NaCl 0.015 M pH 11 and immersed in NaCl 0.015 M pH 

11 for 4 hours under shaking conditions at RT. The scaffolds were then washed with NaCl 0.015 

M pH 11 before placed in new Eppendorf tubes. A volume of 2mL of 70% acetic acid (v/v) solution 

was added to each tube. The tubes were degassed for 5 minutes and left at RT for 1 hour under 

shaking condition. The solutions were collected and read at 556 nm using a Bio‐Rad xMark™ 

microplate  absorbance  spectrophotometer  (Bio‐Rad, California, US).  The  amounts  of  TBO on 

scaffolds were quantified using the standard curve of TBO in 70% acetic acid solution. 

3.3.3 Drug loading, characterization and in vitro release 

Scaffolds were sterilized by immersing in 70% ethanol (v/v) with subsequent evaporation 

in a laminar flow hood followed by ultraviolet (UV) light exposure. Drug solutions of DOX, PTX and 

CEF were prepared  in 100% methanol, 100% ethanol and 90% ethanol  (v/v),  respectively. All 

drugs were loaded on scaffolds in 3 different doses: low dose (LD) = 0.4 µg/mg (drug/scaffold), 

medium dose, MD = 2 µg/mg and high dose, HD = 10 µg/mg. Scaffolds were immersed in drug 

solutions  in  2‐mL microcentrifuge  tubes  in  a  sterile  cabinet  until  solutions  were  completely 

evaporated.  Some CEF–loaded  scaffolds were  further  coated with poly(lactic‐co‐glycolic  acid) 

(PLGA) for sustained release of CEF, due to the high water solubility of CEF. PLGA (85:15, Mw of 

c.a.  66  kDa  from  Lakeshore  Biomaterials,  USA)  was  dissolved  in  acetonitrile  to  5%  w/v 

  Page 54 

  Page 54 

concentration.  Selected scaffolds were dip coated  in  the PLGA solution and dried  in a  sterile 

cabinet. 

Scaffolds  were  cryo‐fractured  and  analyzed  using  confocal  fluorescence  microscopy 

(Leica, Japan), SEM combined with EDX, Fourier transform infrared spectroscopy (FT‐IR) and X‐

ray photoelectron spectroscopy (XPS) to confirm the presence of drugs on scaffolds. FT‐IR spectra 

of MPCL scaffolds were collected by measuring at the setting of scan number of 64 and step of 

1cm‐1 over a  range  from 400  to 4000 cm‐1 wave number by Nicolet  FTIR  spectrophotometer 

(Nicolet  Analytical  Instruments,  US).  XPS  data  were  collected  in  a  Thermo‐Fisher  K‐Alpha 

spectrometer (10‐9 mbar) featuring a monochromated Al Kα X‐ray radiation source with a photon 

energy of 1486.7 eV at a power of 300 W using a 400 μm spot size and survey spectra measured 

at a 200 eV pass energy. High resolution spectra were measured at 50 eV pass energy. To restrict 

sample charging, the low energy electron flood gun was used. Survey spectra were attained at a 

pass energy of 200 eV, 10 ms dwell time and 0.1 eV step size. High resolution scans were attained 

at a pass energy of 50 eV, 50 ms dwell time and 0.1 eV step size. Three samples were used for 

both surveys and high resolution spectra with three spots average on each to determine the 

atomic concentration of each element. 

To  characterize  the  effect  of  pH on  the  release profile  of DOX–loaded  scaffolds,  the 

release kinetics were evaluated in PBS at pH 7.4 and pH 5.5 in the shaking incubator at 37oC and 

200 rpm. For PTX–loaded scaffolds, samples were placed in PBS (pH7.4) 0.1% w/v Tween 20 for 

the release because of insolubility of PTX in water. The release profile of CEF–loaded scaffolds 

was determined in PBS (pH 7.4).  

At each time point, the supernatant solutions were collected and replaced with fresh 

solutions. The absorbance of the collected solutions were respectively measured at 480 nm, 230 

nm and 272 nm for DOX, PTX and CEF using an xMark microplate absorbance spectrophotometer 

(Bio‐Rad, US) and the amounts of drug released in the solution were calculated using standard 

curves. 

  Page 55 

  Page 55 

3.3.4 Antimicrobial assay 

The antimicrobial activity of CEF–loaded scaffolds was evaluated by agar diffusion assay 

against S. aureus (ATCC 29213). Log phase S. aureus was plated on Mueller‐Hinton agar plates. 

Scaffolds were placed and gently pressed to have stable contact and allow drug diffusing into the 

agar. The plates were incubated at 37oC and inhibition zones were measured after 16 hours. 

3.3.5 In vitro chemotherapeutic effect 

MDA‐MB‐231 cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, 

US) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, US), 100 U/ml penicillin and 100 

µg/mL streptomycin (Gibco, US). When the cells were approximately 80% confluent, cells were 

collected  and  seeded  in  24‐well  plates  with  1.5x104  cells/well  cell  density.  After  overnight 

incubation, DOX–loaded scaffolds were placed individually  into each well and incubated for 2 

days. Then, picogreen assay was performed. In brief, scaffolds were collected, culture media were 

discarded and 300 μL proteinase K (Invitrogen, US) was added into each well and the plates were 

incubated at 37oC overnight. After that,  the cell‐proteinase K suspensions were collected and 

incubated at 56oC for 8 hours. The suspensions were diluted for 50 and 100 times in phosphate 

buffered EDTA (PBE) buffer (2.84 g Na2HPO4, 4.14 g NaH2PO4, and 1.86 g Na2EDTA dissolved in 

ultrapure water and adjusted to pH 7.1 using 6N NaOH) and transferred into black 96‐well plates. 

Picogreen 1X (Invitrogen, US) was added into each well at the volume ratio of 1:1 and incubated 

at RT under dark condition for 10 minutes. The plates were read at the excitation wavelength of 

480 nm and the emission wavelength of 520 nm using a POLARstar Optima plate‐reader (BMG 

Labtech, Germany).  

For PTX–loaded scaffolds, MDA‐MB‐231 cells were encapsulated in gelatin methacryloyl 

(GelMA) hydrogels as previously described [69] and cultured for 2 weeks. Then, the PTX–loaded 

scaffolds with LD, MD and HD were placed into each well and cell viability was assessed after 2, 5 

and 8 days using Alamar Blue assay (Invitrogen, US). Scaffolds without drug were used as control. 

  Page 56 

  Page 56 

3.3.6 Statistical analysis 

Data are expressed as mean ± standard error of means (s.e.m) and one‐way ANOVA test 

and Tukey post hoc test were used to assess differences. 

3.4 RESULTS 

3.4.1 Material preparation, extrusion and scaffold characterization 

In this study, porogen leaching method was used to create the micropores inside the 

struts of 3D printed scaffolds to obtain drug delivery functionality. SEM analysis confirmed the 

presence of micropores network within the struts, which were prepared with porogen mixed into 

the MPCL and subsequently leached out (Figure 9E‐H).  

 

Figure 9. Scanning electron microscopy (SEM)  images showing surface pores on both 

non‐porous  (nMPCL) and microporous  (pMPCL)  scaffolds  (A, B, E,  F) yet only pMPCL scaffold 

showed porous struts (G, H) compared with solid struts in nMPCL (C, D). The majority of intra‐

strut micropores in pMPCL show interconnection with surrounding pores (arrows in G, H) and the 

surface pores on nMPCL are only artifacts of the extrusion (arrow in D). 

 

  Page 57 

  Page 57 

Atomic force microscopy analysis revealed similarity of surface roughness of nMPCL and 

pMPCL (Appendices, Figure S4B). The difference in surface morphology of nMPCL and pMPCL was 

in macroscopic scale, hence did not strongly affect the surface roughness. The root‐mean‐square 

(RMS)  surface  roughness  of  pMPCL  (155±9  nm)  was  slightly  decreased  but  not  significantly 

different  from  that  of  nMPCL  (163±10  nm)  (Appendices,  Figure  S4B).  The  µCT  micrographs 

displayed the uniform distribution of micropores throughout the pMPCL struts (Figure 9H). There 

were also some pores on the surface of the struts in nMPCL scaffolds. These surface pores in non‐

porous scaffolds are identified as gaps between the surface PCL spherulites and thus are shallow 

pores (Figure 9D). In contrast, majority of surface pores on the porous scaffolds are formed from 

leaching of surface porogen and these surface pores created pathways for porogen embedded 

deeper  to  leach  out  (Appendices,  Figure  S4‐C,  D).  Surface  pores  in  pMPCL  scaffolds  were 

significantly  smaller  (mostly  ≤  5  µm2  in  cross‐section  area)  compared  with  intra‐strut  pores 

(mostly ≥ 100 µm2 in cross‐section area) (Appendices, Figure S4‐E).  

Intra‐strut volume porosity of pMPCL scaffolds was determined from measuring strut’s 

mass, dimension and calculated using the polymer’s density (1.146 g/cm3) [64] to be 31.7±1.5% 

(mean ± standard error of means (s.e.m), n=4). Struts from non‐microporous MPCL scaffolds have 

a measured density of  1.21± 0.02 g/cm3 which  is  close  to  the density of  1.146 g/cm3 of PCL 

material [58] therefore have zero intra‐strut porosity as expected and evident through SEM and 

micro‐CT images (Figure 9A‐D). 

Interestingly, the surface of pMPCL struts represented lower porosity than in the cross‐

section. This difference can be explained by the extrusion of the molten salt porogen‐polymer 

mixture through a nozzle in which the solid porogen particles would be pushed away from the 

nozzle wall to reduce friction. As a result, fewer pores were present on the strut surface. SEM and 

µCT analysis showed local interconnection of the micropores (Figure 9 G, H). Because these pores 

were formed through the leaching of porogen, they must be connected to some surface pores. 

This connection would allow drug loading by simply soaking in a drug solution. 

  Page 58 

  Page 58 

3.4.2 Micropores partially reduced compression Young’s modulus of scaffolds 

To characterize  the effects of micropores on mechanical property of MPCL scaffolds, 

compression test was performed. The compression Young’s moduli at strains of 0‐5%, 5‐10%, 10‐

15% and 15‐20% were 3.8±0.8 MPa, 10.2±0.9 MPa, 14.3±0.8 MPa and 13.0±0.9 MPa, respectively 

for nMPCL and 3.5±1.5 MPa, 12.4±0.2 MPa, 10.4±0.7 MPa and 7.2±0.4 MPa,  respectively  for 

pMPCL (Figure 10). There was a significant difference between nMPCL and pMPCL from 10% to 

20%  compression  (p<0.01)  which  can  be  explained  by  the  microporous  strut  pore  network 

contributing to a reduction in the material density and hence reduce the compressive modulus.  

 

  Page 59 

  Page 59 

 Figure  10.  Intra‐strut  micropores  reduced  compression  Young’s  modulus  of 

polycaprolactone  (MPCL)  scaffolds.  (A):  Effective  compression  Young’s  modulus  (data  are 

expressed as mean ±  s.e.m, n=9) showed no significant difference  in  the 0‐10% compression 

range. At 10‐15% and 15‐20% range, the micropores significantly reduced Young’s modulus of 

pMPCL.  (B):  SEM  images  of  non‐microporous  (nMPCL)  and  microporous  (pMPCL)  after  the 

compression test showing the collapse of some micropores during the compression. ** is p<0.01 

and from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. 

3.4.3 In vitro drug release 

The micropores also increased the negatively charged group density in pMPCL (7.8±0.2 

nmol/mg  compared  with  3.6±0.2  nmol/mg,  n=6),  which  was  measured  by  TBO  assay.  We 

hypothesized that the release kinetics would then depend on the charge properties of the loaded 

drugs. Therefore, we investigated the loading efficiency and release kinetics of three different 

drugs with different solubility and charge characteristics at physiological pH: DOX was chosen as 

a water‐soluble, positively charged drug; PTX as a nonsoluble and uncharged drug; and CEF as a 

soluble and negatively charged drug.  

3.4.4 Loading and release of doxorubicin as a water‐soluble and positively charged 

drug 

Doxorubicin  (DOX)  is  a  chemotherapeutic  agent  that  is  relatively  water‐soluble  (10 

mg/mL at 25oC) and is positively charged at physiological pH (pH 7.4), which is attributed to its 

aliphatic amine group with pKa around 9.93 [140]. DOX has been widely used to treat a number 

of cancers and is known to have severe cytotoxicity [141, 142]. Therefore, application of lower 

amount of drug using local delivery of DOX would be very beneficial for reducing the side effects. 

Here, three concentrations of DOX were loaded into the scaffolds by soaking – 0.4 µg 

drug/mg scaffold  (low dose), 2 µg/mg  (medium dose) and 10 µg/mg  (high dose). Bright‐field 

images  showed  relatively  even  distribution  of  DOX  on  the  surface  of  scaffolds  (Figure  11A). 

  Page 60 

  Page 60 

pMPCL  had  higher  drug  loading  efficiency  (approximately  95%)  compared  with  nMPCL 

(approximately 80%) determined by measuring the amount of  free drug remained after soak 

loading (Appendices, Figure S6). For nMPCL, DOX only distributed on struts’ surfaces (Figure 11B). 

In contrast, for pMPCL, DOX distributed not only on strut surface but also on intra‐strut micropore 

surface which was confirmed by the fluorescence of DOX in the confocal images (Figure 11B). 

Furthermore, the presence of DOX on MPCL was confirmed by FT‐IR (Figure 11C). The spectra of 

DOX–loaded MPCL scaffolds showed the signature peaks of DOX (1612 cm‐1 and 1577 – 1579 cm‐

1 for the aromatic ring structure) in addition to peaks from MPCL (1163 cm‐1  for symmetric COC 

stretching, 1239 cm‐1  for asymmetric COC stretching and 1721 cm‐1 for carbonyl stretching).  

  Page 61 

  Page 61 

 

Figure 11. DOX immobilized only on surface of nMPCL but both on surface and in intra‐

strut pores of pMPCL. (A): bright field images of nMPCL and pMPCL before and after DOX–loading 

at 10 µg/mg. (B): Cross‐sections of nMPCL and pMPCL showing auto‐fluorescence of DOX on the 

surface of nMPCL and inside the struts of pMPCL. (C): FT‐IR spectra of DOX–loaded onto MPCL at 

increasing 3 loading doses (Low, Medium and High Doses). 

 

DOX  was  found  to  immobilize  even  on  nMPCL  surface  and  this  immobilization  is 

attributed to hydrogen bonding or static attraction between the positively charged amine groups 

  Page 62 

  Page 62 

on DOX and the –COOH groups on PCL (Appendices, Figure S5). The carboxyl groups were likely 

created from ester cleavage of PCL in the scaffold surface by NaOH during the fabrication process. 

To characterize the release of these systems where strong electrostatic  interaction of 

DOX and MPCL is expected, the experiments were carried out in PBS at pH 7.4 and pH 5.5 where 

–COO‐ groups are expected to become protonated [143]. The release of DOX in PBS pH 7.4 at 

different doses showed similar trends (Figure 12). pMPCL significantly reduced the burst release 

of DOX from 0.09±0.02 µg/mg in LD nMPCL to 0.03±0.01 µg/mg in LD pMPCL and from 0.31±0.05 

µg/mg in MD nMPCL to 0.14±0.02 µg/mg at 1 hour time point. The pMPCL had a more sustained 

release profile for up to 120 hours compared with 48 hours for nMPCL. LD and MD of pMPCL 

were effectively reduced the burst release from 22.5% (nMPCL) of total release amount to 5% 

(pMPCL) and  from 15% (nMPCL)  to 7.5%  (pMPCL).  For HD,  the burst  releases of nMPCL and 

pMPCL were similar (20%) (Figure 12). 

 

 

 

Figure 12. Intra‐strut micropores reduced burst release and prolonged release profile of 

drug–loaded microporous  polycaprolactone  (pMPCL)  scaffolds.  Drug  release  from  scaffolds–

loaded with increasing doses of DOX (Low, Medium and High doses) in PBS at pH 7.4 and pH 5.5 

(data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). pMPCL had less burst release and more prolonged 

  Page 63 

  Page 63 

elution compared with nMPCL. The release from DOX–loaded scaffolds increased under acidic 

conditions (pH 5.5). 

 

Comparing the release of DOX–loaded scaffolds under different pHs, the total amount of 

DOX released in pH 5.5 was higher than in pH 7.4. Additionally, pMPCL groups with LD and MD of 

DOX still maintained the low level of DOX release; whereas the remaining groups had their burst 

release amounts increased. Furthermore, the release of DOX from pMPCL under acidic condition 

was sustained for 240 hours. The  increment of the total release amount of DOX under acidic 

condition  confirms  the expected electrostatic  interaction between  amine group on DOX and 

carboxyl groups on PCL resulted from ester cleavage during the scaffold preparation (i.e., leaching 

in NaOH 0.01M) (Appendices, Figure S5).  

3.4.5 Loading and release of paclitaxel as model insoluble non‐charged drug 

PTX  is  a  chemotherapeutic  agent  frequently  used  to  treat  ovarian,  lung,  and  breast 

cancers [144, 145]. PTX has zero net charge and poor water solubility at physiological pHs [146]. 

Therefore, Cremophor EL – a castor oil based formulation vehicle for poorly water‐soluble drug, 

has been used to dissolve PTX for systemic injection [147]. However, application of Cremophor 

EL results in further cytotoxicity to patient [106]. By delivering PTX locally using MPCL scaffolds as 

a drug reservoir, we aim to minimize/avoid its systemic cytotoxicity. 

The loading of PTX on MPCL scaffolds was confirmed by SEM, EDX, FT‐IR and XPS (Figure 

13). The immobilization of PTX on MPCL was indicated by changes in atomic ratio of oxygen and 

carbon  in  EDX  analysis  (Figure  13A).  MPCL  had  atomic%  Carbon/Oxygen  ratio  of  3.1±0.2; 

whereas, that of PTX was higher (6.1±0.7). XPS also confirmed the immobilization of PTX in the 

cross‐section of pMPCL by the presence of Nitrogen peak in XPS spectrum (Figure 13B). FT‐IR 

spectra of PTX–loaded pMPCL scaffolds showed both characteristic peaks of MPCL (1721 cm‐1, 

  Page 64 

  Page 64 

which corresponding to carbonyl groups of MPCL) and PTX (1635 cm‐1, which corresponding to 

C=O‐N groups of PTX) (Figure 13C).  

 

Figure  13.  Characterization  of  PTX–loaded pMPCL  scaffolds.  (A):  Representative  SEM 

micrographs of PTX–loaded pMPCL showing thin fiber ‐like morphology of immobilized PTX on 

the  surface and  inside micropores  (white arrows) and  their  EDX analysis  showing atomic C% 

(white  numbers)  higher  than  those of MPCL  (85±1%  for PTX and 75±1%  for MPCL,  data  are 

expressed as mean ± s.e.m, n=6). (B): XPS analysis of PTX–loaded scaffolds showing N1s peaks 

from PTX even after 20 seconds of in situ ion beam etching for partial removal. (C): FT‐IR spectra 

of MPCL, PTX–loaded pMPCL scaffold (MPCL‐PTX) and PTX confirming the immobilization of PTX 

on MPCL scaffolds.  

 

The elution of PTX from loaded scaffolds was then investigated. Overall, the release of 

PTX was monotonic and changed from near zero‐order kinetic in low dose to first‐order kinetic in 

  Page 65 

  Page 65 

high dose (Figure 14). Comparing release profiles of nMPCL and pMPCL, there was no difference 

in term of burst release in all doses, yet the PTX release was significantly higher in pMPCL after 

72 hours at medium and high doses and 400 hours for low dose. For nMPCL, the majority of the 

drug was released  in  the first 165 hours as demonstrated through the  initial big slope of the 

release profile. After  this period,  the  release was significantly  reduced  to nearly negligible as 

evident from the diminishing slopes. On the other hand, pMPCL showed the trend of increasing 

release up to 500 hours. 

 

Figure 14. Microporous structure prolonged and increased release of immobilized PTX 

on pMPCL. Drug was immobilized from solutions at 3 increasing doses (low, medium and high 

doses) by soak loading. Release at the first time point (24 hours) from pMPCL scaffolds was similar 

with nMPCL of  the  same dose but became  significantly higher at  later  time points  (data are 

expressed as mean ± s.e.m, n=6). 

 

As PTX is uncharged, it was expected that there are no strong interactions between PTX 

and MPCL and the release of PTX was purely dissolution in the case of nMPCL. In the case of 

pMPCL, the drug had to diffuse out of the microporous network; therefore, its release to the 

outside was prolonged. The burst release of PTX from MPCL scaffolds into PBS solution was low 

  Page 66 

  Page 66 

and similar for both nMPCL and pMPCL for the same reasons. Nonetheless, since pMPCL had 

more surface area, the total final release was confirmed to be higher.  

3.4.6 Loading and release of Cefazolin as model water‐soluble, negatively charged 

drug –PLGA overcoat can lead to sustained release 

Cefazolin (CEF) is a common antibiotic often used to prevent post‐surgery infection [148‐

151].  CEF  is  highly  water‐soluble  and  negatively  charged  at  physiological  pH  [152].  CEF  is 

traditionally administrated systematically yet it is well known that systemic administration of CEF 

is not effective against bacteria biofilm formed locally on the surface of implant. There is also a 

concern about increased risk of antibiotic resistance development after systemic administration. 

Hence, we investigated the immobilization of CEF directly onto scaffolds to eventually prevent 

bacterial infection at the surgical site. 

Successful  immobilization with  c.a.  80%  loading  efficacy  (Appendices,  Figure  S6) was 

confirmed by EDX. In nMPCL, the peaks of Na and S corresponding to Na and S in the CEF were 

only found on the surface (Figures 15A, B). In pMPCL, the peaks of Na and S were found in both 

the surface and cross‐section indicating that CEF was loaded not only on surface but also into the 

micropores of pMPCL scaffolds. 

  Page 67 

  Page 67 

 

Figure 15. Immobilization of CEF on nMPCL and pMPCL scaffolds and the application of 

a PLGA overcoat layer. (A) and (B): SEM and EDX mapping of CEF–loaded scaffolds showing drug 

immobilized only on surface of nMPCL and also within pores inside the struts in pMPCL scaffolds. 

(C):  SEM micrographs  of  drug–loaded  pMPCL  scaffolds  with  PLGA  overcoat  layers  and  EDX 

analysis showing differentiation of PLGA from the MPCL underneath which has less O content.  

 

The elution of CEF from non‐porous nMPCL was purely burst release as expected from 

the high water solubility and similar charge characteristics of CEF [83] (Figure 16A). Release of CEF 

from microporous pMPCL was  found significantly prolonged  to c.a. 170 hours.  In  the  first 24 

hours, the burst release of both nMPCL and pMPCL were at high level (70% and almost 100% for 

pMPCL and nMPCL, respectively). After the initial burst release, CEF was released gradually from 

pMPCL until reaching 100% after 170 hours. In MD groups, similar trends were observed for both 

nMPCL and pMPCL (75% and almost 100% of loaded drug amount released in the first 24 hours 

for pMPCL and nMPCL, respectively). 

  Page 68 

  Page 68 

 

Figure 16. Release of CEF from nMPCL and pMPCL scaffolds and the barrier effects of 

PLGA overcoat layers. (A): release profiles of scaffolds loaded with the drug at increasing doses 

(Low, Medium and High doses). (B): Release profiles of pMPCL scaffolds loaded with the drug at 

high dose with and without PLGA coating and model fitting of the release profiles. PLGA coating 

significantly slowed down the release of the CEF previously immobilized on the scaffolds. The 

pMPCL  scaffolds  showed  first‐order  like  release  and  the  application  of  the  PLGA  overcoat 

sustained the release further and achieved near zero‐order kinetic. 

 

To further regulate CEF release from pMPCL scaffolds, a biodegradable over‐coat layer 

of PLGA was applied to provide barrier effects to the CEF immobilized inside the micropores. The 

presence of PLGA coating on pMPCL was confirmed by its distinctive morphology and its higher 

oxygen content compared with PCL (Figure 16B). By applying the PLGA coating, the burst release 

of  pMPCL was  significantly  reduced  from 70%  to  30%  (Figure  16A  – High Dose).  After  burst 

release, PLGA‐coated scaffolds were showed to have zero‐order like release kinetic (Figure 16B). 

CEF has high water solubility and has a net negative charge [83]; hence its adsorption on 

nMPCL, which also have surface negatively charged groups, was likely very weak and hence it 

  Page 69 

  Page 69 

rapidly  released  into PBS by dissolution.  In pMPCL,  the unique  architecture with  low surface 

porosity and high intra‐strut porosity entrapped CEF inside the struts and slowed down its release 

to the outside of the scaffolds. In the time frame of the release studies, the drug release from 

pMPCL can be considered as from non‐degradable matrices and was found to begin with some 

burst release followed by first‐order like release kinetics. The release of CEF form pMPCL without 

coating was fitted in first‐order release kinetic with R2 of 0.98 (Figure 16B). When an overcoat 

layer of PLGA is applied to the microporous scaffolds, the system can be considered as a reservoir 

with an inert coating functioning as a rate‐controlling barrier. The diffusions in these cases are 

therefore more likely by Fickian driven mechanism, which meant the releasing rate remained 

constant for a sustained period. The release of CEF from PLGA coated pMPCL scaffolds was fitted 

in zero‐order release kinetic with R2 of 0.94. 

3.4.7 In vitro bioactivity of drug–loaded scaffolds 

The bioactivities of drug–loaded pMPCL scaffolds were performed to confirm that the 

drugs retained their activities.  

3.4.7.1 Antimicrobial effect of Cefazolin–loaded scaffolds 

Antimicrobial  activities  of  CEF–loaded  pMPCL  scaffolds  with  LD,  MD  and  HD  were 

characterized by agar diffusion assay. pMPCL without drug was used as control. Samples were 

placed on agar plates containing S. Aureus and incubated for 16 hours and the zones of inhibition 

were measured. Overall, when the doses increased from 0.4 µg/mg (drug/MPCL, LD) to 2 µg/mg 

(MD) and then 10 µg/mg (HD), the zone of inhibition significantly increased accordingly (Figure 

17). 

  Page 70 

  Page 70 

 

Figure 17. Cefazolin immobilized on microporous scaffolds retained its bioactivity. Zone 

of inhibition of CEF–loaded pMPCL scaffolds against S. aureus showing increasing zone diameter 

with  increasing  loading  dose.  pMPCL  scaffolds without  drug were  used  as  control.  Data  are 

expressed as mean ± s.e.m (n=6). * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey 

post hoc test. 

 

The dose‐dependent properties of CEF–loaded pMPCL over a broad working range from 

0.4 µg/mg  to 10 µg/mg could be beneficial.  Since  the volume of  the  scaffolds used  for each 

patient is different and the amount of antibiotics varies from patient to patient, therefore the 

large working range of concentrations give doctors the option to adjust the doses. 

3.4.7.2 Effect of pMPCL scaffolds loaded with chemotherapeutic drugs against 

cancer cells 

Cell  culture  on  bottom  of  well  plates  are  still  standard  condition  for  testing  drug 

bioactivity and 3D cell culture in hydrogels such as GELMA has recently been recognized as a more 

sophisticated tool to better mimic the cell‐ECM interactions in vivo. We have developed extensive 

expertise in using GelMA for 3D culture in our laboratories [73] and thus used it for testing of PTX. 

MDA‐MB‐231 were encapsulated inside GelMA hydrogels [153] and treated with drug–loaded 

pMPCL scaffolds. All PTX–loaded MPCL scaffolds reduced cell viability after 2 days of treatment 

  Page 71 

  Page 71 

yet no significant difference was found among the loading doses except at day 5 (Figure 18A). 

Medium and High dose groups showed a significantly stronger chemotherapeutic effect than Low 

dose group. After 8 days, all drug–loaded scaffolds completely killed all the cancer cells (Figure 

18A). 

 

 

Figure 18. DOX and PTX immobilized on microporous scaffolds retained their bioactivity. 

(A): Metabolic  activity  of  breast  cancer  (MDA‐MB‐231)  cells  in  3D  culture  treated with  PTX–

loaded  scaffolds.  Cells  were  encapsulated  in  methacrylated  gelatin  (GelMA)  hydrogels  and 

cultured  in  24 well  plate  and PTX–loaded pMPCL  scaffolds were  then placed  in  the wells  as 

treatment groups and Alamar Blue assay was performed on day 2, 5 and 8 of the treatment (data 

are expressed as mean ± s.e.m, n=8). (B): Bioactivity of DOX–loaded scaffolds. Cells were seeded 

in 24‐well plate, scaffolds were placed in the wells as treatment groups and intracellular DNA 

amounts were quantified after 2 days of treatment using PicoGreen assay (data are expressed as 

mean ± s.e.m, n=8). The results showed the effect of chemotherapeutic agent–loaded pMPCL 

scaffolds. * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. 

 

We also tested GelMA 3D culture for in vitro validation of DOX–loaded scaffolds, yet the 

specific binding of DOX (positively charged) to GelMA (negatively charged) [140, 154] was found 

interpreting  the  DOX’s  concentrations  on  cell  death.  Therefore,  we  used  the  traditional  cell 

culture  (on  bottom  of  well  plate)  for  testing  of  DOX–loaded  scaffolds.  DOX–loaded  pMPCL 

  Page 72 

  Page 72 

showed dose‐dependent chemotherapeutic effect against metastatic breast cancer cells, MDA‐

MB‐231 (Figure 18B). The DNA amounts of MDA‐MB‐231 cells treated with DOX–loaded scaffolds 

showed significant decrease in DNA levels from 269.5±26.2 ng/well for untreated control group 

to 116.5±14.5 ng/well for Low dose group and 44.5±10.1 ng/well for medium dose group and 

57.0±9.2 ng/well for high dose group. There was no significant difference between medium and 

high dose groups. 

The results from all drug–loaded pMPCL scaffolds confirmed the bioactivity of the drugs 

was maintained after being immobilized on the microporous scaffolds. 

3.5 DISCUSSION 

Our work was built upon the current scaffold‐based tissue engineering approach where 

a scaffold with an interconnected network of macropores is implanted to allow tissue formation, 

vascularization and tissue remodeling [45, 46].  We derived that the scaffolds themselves can be 

developed  to  have  local  drug‐delivery  capability  to  prevent  recurrence  of  diseases  or  other 

complications that affect tissue regeneration. Local drug delivery using implantable materials has 

been  recognized  as  a  promising  strategy  to  reduce  systemic  toxicity  and  enhance  drug 

concentration  at  the  site  of  implantation.  Various  materials  and  material  forms  have  been 

investigated for development of local drug delivery vehicles such as metals, polymers, ceramics, 

and hydrogels [129]. There are existing reports from other groups demonstrating the efficacy of 

local drug‐delivery approach, yet they mostly were based on monolithic scaffolds [44, 57] which 

lack interconnected macroporosity or designed complex internal architectures [44, 137]. 

Our  group  has  extensive  experience  in  polymer  scaffolds  prepared  via  additive 

manufacturing (i.e., 3D printing) which allows for well defined, interconnected macro‐pores and 

customized  architectures. We  aimed  to  build  upon  these  scaffolds  to  achieve  drug  delivery 

functionality.  Current  techniques  to  achieve  drug  delivery  from  3D  printed  scaffolds  rely  on 

mixing of drug with raw materials before printing [23, 57, 137] or absorbing drug to the scaffold’s 

  Page 73 

  Page 73 

surface that has been treated to have high surface areas (such as etching or coatings) [42, 155, 

156]. Inspired by the “sponge effects”, we hypothesized that introducing microporosity into these 

macroporous scaffolds would allow the scaffolds to soak up and retain drug from a drug solution. 

The novelty of our work is in (i) the generation of microporosity inside an interconnected 

macroporous  scaffold  and  (ii)  the  decoupling  of  scaffold  manufacturing  and  drug  loading. 

Interconnected macroporosity in scaffolds is important for tissue regeneration and is currently 

best achieved through 3D printing because of the ability in controlling scaffold’s architecture [45, 

46]. Therefore, we built our work upon the advantages of 3D printed scaffolds. To incorporate 

drugs to these scaffolds, we took a different approach than conventional drug‐mixing with raw 

materials or surface‐etching/modification of scaffolds followed by drug absorption. We reasoned 

that microporosity  would  play  important  roles  in  entrapping  drugs  from  a  solution  through 

increased  surface  area  and  capillary  actions.  This  immobilization  is  also  expected  to be non‐

specific  and  therefore  highly  versatile  and  would  allow  for  loading  of  patient‐specific  dose 

intraoperatively in the future. 

In  this  proof‐of‐concept  study,  we  created  microporosity  in  our  normal  3D  printed 

polycaprolactone  (PCL)  scaffolds  and  investigated  their  capability  in  drug  absorption  and 

sustained  release.    Micro‐sized  porogen  particles  were  mixed  with  PCL  and  extruded  via  a 

thermal‐extrusion process to build 3D scaffolds which were then immersed in water to leach out 

the porogen. We then obtained scaffolds that have macroporosity (from the lay‐down pattern of 

the struts and bars) and microporosity (from the voids created by porogen leaching).  

The melt‐extrusion and porogen leaching resulted in a very interesting feature in these 

scaffolds: the inside of the struts and bars have much larger and more pores compared with their 

surface. The surface pores in non‐porous scaffolds are identified as gaps between the surface PCL 

grains and thus are shallow pores (Figure 9D). On the contrary, the majority of surface pores on 

the  porous  scaffolds  are  formed  from  leaching  of  surface  porogen  and  these  surface  pores 

created  pathways  for  porogen  embedded  deeper  to  leach  out.  This  connection  allowed  for 

  Page 74 

  Page 74 

efficient drug entrapment from the solution (high loading efficacy of approximately 90%). The 

small  surface  pores  are  also  believed  to  be  important  in  the  reduced  burst  release  of  the 

entrapped drugs from the inner pores in the release experiments (Figures 12, 14 and 16). Solid 

PCL struts have a measured density of 1.21± 0.02 g/cm3 which is close to the density of 1.146 

g/cm3 of PCL material [139] indicating that no diffusion of the entrapped drugs through PCL is 

expected because of the high material density and this is in agreement with reports in literature 

concerning  impermeable  PCL  barrier    [157,  158].  Control  scaffolds  without  microporosity 

absorbed drug from solutions onto the outer surface of their struts and into the shallow surface 

pores and therefore released them much more quickly. 

We demonstrated that this novel microporous scaffold design allowed immobilization of 

three  clinical  drugs  of  different  physical  and  chemical  properties  including  cefazolin  (water‐

soluble,  negatively  charged  antibiotic),  doxorubicin  (water‐soluble,  positively  charged 

chemodrug) and paclitaxel (insoluble, uncharged chemodrug) with high loading efficacies using 

simple soak loading techniques. This result demonstrated the roles of the micropores in loading 

and release of the drugs. Finally, we demonstrated the bioactivities and dose response of the 

drug–loaded scaffolds in vitro. 

This study presented a concept that can be expanded to other 3D printed materials and 

techniques. Other polymers, ceramics, polymer‐ceramic composites, metals could be mixed with 

appropriate micro‐sized porogen and manufactured into 3D scaffolds using techniques such as 

extrusion,  laser sintering or photopolymerization. The concept of microporosity‐enabled drug 

loading and sustained release is envisioned to be extendable even to the emerging field of 4D 

printing where the printed scaffolds also change their structures over time under external stimuli 

[159, 160]. The stimuli‐triggered mechanical deformation in 4D printing has been exploited to 

encapsulate  and  release  drugs.  Current  designs  focus  strongly  on  using  pH,  temperature  or 

osmotic  pressure  changes  to  cause  swelling/de‐swelling  leading  to  folding  and  unfolding  of 

layered structures, therefore, capturing and releasing drug content [160‐162]. 

  Page 75 

  Page 75 

 We believe the dynamic nature of the 4D printed scaffolds could present a challenge to 

the introduction or maintaining of the microporosity because of the particular choice of scaffold 

design  or  materials  or  manufacturing  techniques.  However,  the  dynamic  nature  could  also 

present  a  great  opportunity  for  another  level  of  control  over  drug  entrapment  into  the 

micropores and its release. That the loaded drug could be released on‐demand is a feature of 

great  importance  in  many  applications.  These  smart materials  and  designs  present  another 

advanced approach in local drug delivery and highlighted its  importance in tissue engineering 

[159]. Our work aimed to address this important issue using an approach that is envisioned to 

complement the above mentioned 4D printing technologies. 

In the current study, the porogen’s size and percentage were chosen based on our pilot 

testing  to  achieve  printability  and  complete  porogen  leaching.  It  is  envisioned  that  these 

parameters would  significantly  influence  scaffold’s  characteristics  including  drug  loading  and 

release. This is a topic of our on‐going investigation. It is also believed that the surface pores play 

an important role in drug loading and release from the fluid dynamic point of views. We purposely 

prepared drug  loading  solutions  to have high concentration of alcohols  (such as ethanol and 

methanol) to allow better infiltration into the micropores. Our loading of drugs from solutions 

through soak loading is versatile and has potential to allow for intraoperative loading of patient‐

specific  doses,  yet  further  optimization  is  still  needed. We  believe  that  better  drug  solution 

penetration into the micropores would be achieved with applications of negative (i.e. vacuum 

assisted loading) or positive pressure (pressurized loading). Drug loading and delivery would also 

depend on the size and shape of the scaffolds. For example, the drug loading per scaffold and 

hence delivery dose would depend on  the  total  surface areas  and microporosity  and  thus  is 

strongly dictated by scaffold design. This  is an on‐going  investigation and optimization  in our 

group. The efficacy of the drug–loaded scaffolds in vivo is also a focus of our current work and 

the results will be communicated in our next report.  

  Page 76 

  Page 76 

3.6 CONCLUSION 

This study demonstrated our new concept in creating microporosity inside macroporous 

tissue engineering scaffolds to have the additional functionality of local drug delivery aiming at 

preventing post‐surgery complications. We used SME scaffolds as a proof of concept. Through 3D 

printing, we obtained scaffolds with highly interconnected macropores between the struts. By 

introducing porogen microparticles into the polymer before printing and leach them out after 

printing  we  created  macroporous  scaffolds  with  intra‐strut  microporosity.  The  printing  and 

leaching processes resulted in a very particular intra‐strut micropore network where the surface 

pores were much smaller in sizes and number than the inside. The micropore network formed 

through complete porogen leaching allowed for efficient loading of three clinically relevant drugs 

including chemotherapeutics (doxorubicin and paclitaxel) and antibiotic (cefazolin) via soaking in 

the drug solutions. The drugs were also found to penetrate deep into the micropore network and 

thus  their  release  was  significantly  reduced.  In  vitro  cancer  cell  culture  and  bacteria  assays 

confirmed  the bioactivity of  the drug–loaded scaffolds.  This new type of macro‐microporous 

scaffolds  is  envisioned  to  allow  for  simple  intraoperative  drug  loading  of  specific  doses  for 

applications in regenerating diseased tissue where the risks of complications such as surgical site 

infection or cancer recurrence exist. 

  Page 77 

  Page 77 

4Chapter 4:  Delivery of doxorubicin from the 

implanted bimodal porous polycaprolactone 

scaffolds decreased systemic cytotoxicity and 

breast tumour recurrence progression in mice 

Hoang Phuc Dang a, b, Abbas Shafiee a, c, Christoph A. Lahr a, b, Tim R. Dargaville a, b, Phong A. Tran 

a, b, d 

 

Manuscript under supervisor revision; Target Journal: Advanced Functional Materials  

a   Institute of Health and Biomedical Innovation (IHBI), Queensland University of Technology, 

Brisbane, Queensland, Australia 

b   ARC Centre in Additive Biomanufacturing, Queensland University of Technology, Brisbane, 

Queensland, Australia 

c   UQ Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 

Brisbane, Queensland, Australia 

d   Interface  Science  and Materials  Engineering  Group,  School  of  Chemistry,  Physics  and 

Mechanical Engineering, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia 

   

  Page 78 

  Page 78 

The authors listed below have certified that: 

11. They  meet  the  criteria  for  authorship  in  that  they  have  participated  in  the  conception, 

execution, or interpretation, of at least that part of the publication in their field of expertise; 

12. They take public responsibility  for  their part of the publication, except  for the responsible 

author who accepts overall responsibility for the publication; 

13. There are no other authors of the publication according to these criteria; 

14. Potential conflicts of  interest have been disclosed to  (a) granting bodies,  (b)  the editor or 

publisher of journals or other publications, and (c) the head of the responsible academic unit, 

and 

15. They agree to the use of the publication in the student’s thesis and its publication on the QUT’s 

ePrints site consistent with any limitations set by publisher requirements. 

In the case of this chapter: 

Manuscript under supervisor revision: 

Hoang  Phuc  Dang,  Abbas  Shafiee,  Christoph  A.  Lahr,  Tim  R.  Dargaville  and  Phong  A.  Tran. 

“Delivery  of  doxorubicin  from  the  implanted  bimodal  porous  polycaprolactone  scaffolds 

decreased systemic cytotoxicity and breast tumour recurrence progression in mice”. 

 

Contributor  Statement of contribution 

Hoang Phuc Dang 

Experimental design, conducted experiments and data analysis, 

wrote the first draft of manuscript Signature 

Date: 

Abbas Shafiee 

Performed experimental design, conducted experiment, 

supervised the project, performed data analysis and contributed 

in manuscript preparation 

Page 79 

Page 79 

Christoph A. Lahr  Conducted experiment 

Tim R Dargaville  Aided manuscript preparation 

Phong A. Tran 

Performed experimental design, supervised the project, 

performed data analysis and contributed in manuscript 

preparation 

Principal Supervisor Confirmation 

I have sighted email or other correspondence from all Co‐authors confirming their 

certifying authorship 

 Phong Tran     06/02/2020  

Name  Signature  Date 

QUT Verified Signature

  Page 80 

  Page 80 

4.1 ABSTRACT 

Breast  augmentation  combined with  systemic  chemotherapy  is  commonly  used  as  a 

conventional  method  to  regain  body  image  and  prevent  cancer  recurrence  after  neoplasm 

removal. However, this approach is limited due to the systemic cytotoxicity of chemotherapeutics 

and the risk of implant removal due to the cancer recurrence. The use of drug–loaded resorbable 

3D printed scaffolds is one strategy to locally deliver chemotherapeutic drugs and support breast 

tissue  regeneration;  however,  matching  the  drug  release  profile  to  the  degradation  of  the 

scaffolds is challenging. Here, we demonstrate novel 3D extruded scaffolds with bimodal porous 

structure—macroscale pores from the printing pattern and microscale pores inside the struts—

that  can  be  used  to  modulate  drug  release  and  degradation  profiles.  The  scaffolds  were 

manufactured  from  a  composite  of  a  medical  grade  polycaprolactone  (pmPCL)  and  salt 

microparticles  using  a  screw  melt  extrusion  (SME)  method  with  a  designed  macroscale 

architecture.  The  porogen  was  subsequently  leached  to  generate microscale  pores  with  an 

average size of 5—35 µm. In vitro tests demonstrated that DOX–loaded on the bimodal porous 

scaffolds had a linear sustained release profile of up to 28 days and that the DOX–loaded scaffolds 

possessed a dose‐dependent chemotherapeutic effect against the breast cancer cell line MDA‐

MB‐231. Using a mouse orthotopic breast cancer model, we demonstrated that the DOX–loaded 

scaffolds, despite using only 5 and 20% of the amount of the intravenous injection (i.v.) (or 2 and 

8 µg/scaffold/animal), significantly improved the treatment efficacy against breast cancer local 

recurrence and metastasis progression  in  lung,  liver and  spleen. Moreover,  the use of drug–

loaded  scaffolds  reduced  the  cardio—cytotoxicity  of  DOX  compared with  i.v.  administration. 

Overall,  this  study  showed  the  proof‐of‐concept  that  tissue  engineered  scaffolds  can  be 

manufactured  to  have  drug  delivery  functionality  using  microscale  porosity  for  potential 

applications such as breast tissue reconstruction after neoplasm removal.   

  Page 81 

  Page 81 

4.2 INTRODUCTION 

Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer in women worldwide [163‐165] 

and is often treated by mastectomy or lumpectomy combined with adjuvant chemotherapy or 

radiotherapy  [166‐173].  However,  attempts  to  completely  remove  the  neoplasm  surgically 

usually result in residual malignant cells, which may induce cancer local recurrence (45.5%) and 

metastasis (10.1–39.4%) [174]. Further, the use of adjuvant treatments including radiotherapy 

and chemotherapy may lead to unavoidable side effects and systemic cytotoxicity.  

  Recently, local chemotherapy has been introduced as a promising treatment for cancer 

patients.  Local  chemotherapy  aims  to  effectively  combat  cancer  by  delivering  the 

chemotherapeutic  agents  directly  into  the  malignant  tissues  and  to  reduce  the  side  effects 

associated  with  systematic  delivery.  To  date,  several  chemotherapeutic  implants  have  been 

commercialized  to  treat  prostate  cancer  (Viadur®  and  Vantas®),  malignant  glioma  (Gliadel® 

wafer), and endometriosis (Zoladex®) [17‐20, 175, 176].  

For breast cancer, a few local drug delivery methods have been developed to deliver the 

chemotherapy drug DOX utilising soft implants, such as hydrogel and electrospun scaffolds, as 

drug carriers to match the mechanical properties of the mammary tissue [177, 178]. For example, 

Seib et al. developed DOX–loaded silk hydrogel films and evaluated them in a mouse orthotopic 

breast  cancer  model.  After  6  weeks,  they  observed  a  significant  reduction  in  the  tumor 

recurrence compared with i.v. injection using the same dose [179]. Wu et al. combined DOX with 

polydopamine coated‐gold nanoparticles  in  thermoresponsive  supramolecular poly(N‐acryloyl 

glycinamide‐co‐acrylamide)  hydrogels  with  the  aim  of  having  both  thermal  and 

chemotherapeutic effects. Local injection of the hydrogel showed an increase in recurrence‐free 

survival  rate compared with  I.V.  injection  [177]. Qi et al. employed DOX–loaded hexapeptide 

hydrogel and showed reduced tumour progression and lung metastasis in animals subjected to 

local  delivery  compared  with  I.V.  injection  of  DOX  [178].  Application  of  DOX–loaded 

  Page 82 

  Page 82 

photothermal therapeutic hydrogels to reduce tumour recurrence in a mouse model mice by half 

compared with local injection of DOX [180].  

Thermoplastic scaffolds have also been developed to locally deliver chemotherapeutics 

to  reduce  tumour  recurrence.  Yuan  et  al.  encapsulated  DOX–loaded  mesoporous  silica 

nanoparticles into electrospun poly(lactic‐co‐glycolic acid) (PLGA) nanofibers and observed the 

sustained release of DOX over 120 days. In vivo data showed a significant increase in cancer cell 

apoptosis, as indicated by the increased level of caspase‐3 [181, 182]. Ding et al. showed poly‐

D,L‐lactide  electrospun  nanofibers–loaded  with  docetaxel,  one  of  the  commonly  used 

chemotherapeutic agents for breast cancer,  increased recurrence‐free survival rate compared 

with I.V. injection of docetaxel with the same doses [183]. 

  Despite promising preliminary outcomes from the hydrogels and electrospun implants, 

the scaffolds in the systems described above were mostly designed to serve solely as drug carriers 

and do not consider  the possibility of  tissue regeneration. Therefore,  in  the context of  tissue 

reconstruction for breast cancer patients, new type of implant should be able to support breast 

tissue regeneration and gain the body shape after surgery. Thus, it has been suggested that the 

next generation of scaffolds used in such reconstructive surgeries should be designed to both 

support tissue formation and deliver anti‐cancer drugs locally.  

 Additive  manufacturing  techniques  have  been  widely  employed  to  manufacture 

deterministically complex scaffolds for large—volume tissue regeneration [3]. The application of 

these  scaffolds  in drug delivery has also been demonstrated. For example, Min et al.  loaded 

isoniazid, an anti‐tuberculosis drug, on 3D‐printed mesoporous bioceramic scaffolds bound with 

poly (3‐hydroxybutyrate‐co‐3‐hydroxyhexanate) and demonstrated sustained release above the 

minimum inhibitory concentration for up to 12 weeks in rabbits [56]. Hollander et al. pre‐mixed 

polycaprolactone  (PCL)  with  indomethacin  before  extrusion  into  a  T  shape  structure  for 

intrauterine system application [184]. Recently, Ahangar et al. locally applied a 3D printed DOX–

loaded PCL disk to inhibit prostate cancer bone metastases [185]. The system had a linear release 

  Page 83 

  Page 83 

profile for 7 days in vitro. However, with the current approach of mixing bioactive agents with 

polymers/copolymers before printing using 3D printing (3DP) for drug delivery, the bioactivities 

of the loaded agents may be altered because of the elevated heat or chemicals used during the 

printing process and the release of the agents depends on the degradation rate of the polymers, 

which may be exceedingly low.  

Recently, we designed a research programme focusing on a new type of bimodal porous 

biodegradable polymeric scaffold that has dual microscale and macroscale porosity, prepared 

using a melt extrusion additive manufacturing technique in combination with salt leaching. Using 

PCL as a model polymer and simply mixing it with a phosphate salt microparticle porogen before 

extrusion, we  demonstrated  that we  can manufacture  scaffolds  of  deterministically  complex 

macroscale architecture that contain microscale pores of controlled size after salt leaching. We 

showed that the scaffold (1) supported bone tissue formation in a rat critical‐size calvarial defect 

model [186] and (2) was readily  loaded with antibiotics and chemotherapeutic drugs through 

simple soak loading to have extended drug release [41]. 

The central hypothesis in our research programme is that these scaffolds can be readily 

loaded with drugs that will release locally to prevent complications (such as cancer recurrence), 

and that after the drugs have been exhausted, tissue regeneration will occur with the support 

from the bimodal scaffold architecture. In the current study, we aimed to investigate the efficacy 

of these bimodal porous biodegradable scaffolds for local delivery of chemotherapeutic agent, 

DOX, to prevent/reduce cancer recurrence and the metastasis burden in vivo. We used pmPCL as 

a model  biodegradable  polymer  because  this material  has  been  commonly  used  for  implant 

products. The scaffolds were manufactured by extruding the pmPCL–porogen composite into 3D 

constructs,  and  then  the  porogen  was  leached  out  and  intra‐strut  microscale  porosity  was 

achieved. The bioactivities of DOX loading on pmPCL scaffolds were characterized in vitro and the 

application  of  DOX‐loaded  pmPCL  scaffolds  to  prevent/reduce  breast  cancer  recurrence  and 

metastasis was demonstrated in a mouse orthotopic breast cancer model. 

  Page 84 

  Page 84 

4.3 MATERIALS AND METHODS 

4.3.1 Scaffold fabrication 

The  bimodal  porous  pmPCL  scaffolds were  fabricated  as  described  elsewhere  [187]. 

Briefly, 38 μm porogen (microparticles grinded and sieved from phosphate buffered saline [PBS] 

tablets  [Dulbecco  A,  OXOID,  UK])  was  mixed  with  pmPCL  (PURASORB®  PC12,  Corbion, 

Netherlands) at a 5:4 weight ratio in chloroform, cast onto glass surfaces and left overnight for 

solvent evaporation. The composite was loaded into an in‐house built 3D printer—a computer‐

controlled SME device—as described elsewhere [187] and printed at 110°C with 0.3 mm struts, 

1 mm  inter‐strut  distance,  0.75 mm  thickness  and  0/90°  layout  pattern.  The  porogen  in  the 

printed constructs was leached out in NaOH (0.1 M) in 14 days. 

The  morphology  of  the  pmPCL  scaffolds  was  characterized  by  stereomicroscopy, 

scanning electron microscope (SEM) imaging and micro‐computed tomography (μ‐CT) scanning. 

For SEM imaging, samples were fractured in liquid nitrogen, gold coated and imaged using an 

SEM  (Zeiss  FESEM,  Carl  Zeiss  AG,  Oberkochen,  Germany).  For  μ‐CT  scanning,  X‐rays  were 

generated by a GE‐Phoenix xs 180 nf micro‐focus X‐ray source (General Electric, Massachusetts, 

US) and radiographs were captured on a 3000x3000 silicon flat panel detector. X‐ray tube settings 

were 80 kV, 110 μA and 2.2 μm voxel size. The 3D reconstruction was undertaken using a helical 

cone‐beam filtered back projection method. 

4.3.2 Drug loading  

To prepare the DOX‐loaded scaffolds, the pmPCL scaffolds were punched using a 6 mm 

biopsy punch, sterilized in ethanol 70% and left drying out overnight in sterile conditions. DOX 

(Sigma‐Aldrich, US) was dissolved in 100% methanol at different concentrations and added into 

Eppendorf  tubes  containing  the  sterile  scaffolds,  as  detailed  in  Table  1.  To  characterize  the 

chemotherapeutic effect in vitro, three doses of DOX were used for cell viability assays (Table 1). 

For  implantation study, DOX was  loaded on scaffolds at  two doses  (Table 1), which were 5% 

  Page 85 

  Page 85 

(2 ug/scaffold) and 20% (8 ug/scaffold) of the I.V. injection dose (2 mg/kg). DOX was loaded on 

pmPCL scaffolds by immersing the scaffolds in DOX solutions and leaving under sterile conditions 

overnight  for  drug  adsorption  and  solvent  evaporation.  The  drug‐loaded  scaffolds  were 

transferred to fresh tubes for further studies. 

Table  1.  Loading  doses  of  doxorubicin  (DOX)  on  bimodal  porous  medical  grade 

polycaprolactone (pmPCL) scaffolds. 

Experiment  Group  Drug loading concentration  Doses 

In  vitro  cell  viability 

assay 

Low Dose  20 µg/mL  0.4 µg DOX/mg scaffold 

High Dose  500 µg/mL  10 µg DOX/mg scaffold 

In  vitro  drug  release 

study & 

In  vivo  implantation 

study 

Low Dose  20 µg/mL  2 µg DOX/scaffold 

High Dose  100 µg/mL  8 µg DOX/scaffold 

 

The  loading  of  DOX  on  scaffolds  was  confirmed  by  stereomicroscopy,  fluorescence 

imaging  (Nikon  spectral  spinning  disc  confocal  microscope)  and  Fourier‐transform  infrared 

spectroscopy  (FT‐IR).  FT‐IR  analyses were  carried out with  a Nicolet  FTIR  spectrophotometer 

(Nicolet Analytical Instruments, US) at the following settings: scan number, 64; resolution, 1 cm‐

1; and wavenumber range, 4000–400 cm‐1. 

4.3.3 In vitro chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds against 

breast cancer  

To investigate in vitro chemotherapeutic effects of DOX‐loaded scaffolds against breast 

cancer, MDA‐MB‐231 cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Gibco, 

US) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 U/mL penicillin and 100 µg/mL 

streptomycin (Gibco). Cells were collected at 80% confluence and seeded in 24‐well plates with 

  Page 86 

  Page 86 

a cell density of 1.5 x 104 cells/well. After overnight  incubation, one DOX‐loaded scaffold was 

added into each well. A group with DOX in solution (Free DOX), at an amount equal to that loaded 

on the High Dose scaffolds, was used to compare different treatment methods and investigate 

the bioactivity of the loaded drug compared with the free drug. Cell viability was assessed at Days 

2, 5 and 7 post treatment using Alamar Blue assays (Invitrogen, US). Data were presented as the 

percentage of viable cells compared with the Control group (cells with no treatment). 

4.3.4 In vitro drug release  

Samples  were  placed  in  2 mL  Eppendorf  tubes  containing  200 μL  PBS.  Then,  the 

samples were placed in a shaking  incubator at 37°C at 200 rpm, and the release solutions 

were  completely  collected  and  refreshed  at  each  timepoint  for  measurement.  The 

absorbance  of  the  drug  releasing  solutions  was  measured  using  an  xMark  microplate 

absorbance  spectrophotometer  (Bio‐Rad,  US)  at  480 nm  wavelength,  and  the  released 

amounts were calculated using the standard curve. 

4.3.5 Application of doxorubicin–loaded scaffolds in preventing breast cancer 

recurrence and metastasis 

4.3.5.1 Cell culture 

Luciferase‐expressing  MDA‐MB‐231‐bo  (TxSA)  cells  were  cultured  in  DMEM, 

supplemented  with  10%  FBS,  100U/ml  penicillin  (Invitrogen)  and  100ug/mL  streptomycin 

(Invitrogen) until reaching 80% confluence.  

4.3.5.2 Tumour establishment 

The animal experiments were approved by the Animal Ethics Unit of the University of 

Queensland’s Animal Ethics Committees (approval number: AE21569). In this study, 28 female 

NOD‐SCID  IL2Rγnull  (NSG) mice  (4‐week‐old) were purchased  and housed  in  groups of  five  in 

individual cages at the Translational Research Institute (TRI, Brisbane, Australia) for 2 weeks prior 

to  the  experiment. Orthotopic  breast  tumour was  established  by  injecting  5 × 105  TxSA  cells 

  Page 87 

  Page 87 

suspended in 50 μL PBS into the fourth and fifth right mammary fat pads of the animals. The 

tumour  growth  was  monitored  by  bioluminescent  imaging  (BLI)  for  2  weeks.  Images  were 

acquired 10 minutes after intraperitoneal injection of 200 μL XenoLight D‐Luciferin Potassium Salt 

(PerkinElmer, US) at 1.5 mg/L using a Xenogen IVIS Spectrum (PerkinElmer, US). The total flux 

signals from cancer cells were quantified using the Living Image v4.5.2 software (PerkinElmer, 

US). 

4.3.5.3 Treatment 

Two weeks after inoculation, the tumours were resected. For the Control group (scaffold 

without drug), Low Dose and High Dose groups, the scaffolds were implanted at the resected site. 

For the I.V. group, DOX was administrated only one time by tail vein injection. The treatments 

(Table 2) were continued for 4 weeks, during which time the animals were weighed weekly and 

tumour  recurrence was monitored weekly  by  BLI  as  previously mentioned.  At  4 weeks  post 

treatment, the animals were euthanized; the implants and organs were retrieved. The tumour 

recurrence  and  cancer metastasis  were  determined  by  ex  vivo  BLI  as  described  before.  The 

samples were fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours at 4°C and placed in 80% ethanol for 

further analysis. 

Table 2. Treatment groups for in vivo implantation. 

Group  Treatment 

Control  Bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffold without 

drug 

I.V.  Intravenous tail vein injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg 

Low Dose  DOX–loaded pMPCL scaffold at 2 μg DOX/scaffold (5% of I.V. dose) 

High dose  DOX–loaded pMPCL scaffold at 8 μg DOX/scaffold (20% of I.V. dose) 

 

  Page 88 

  Page 88 

4.3.5.4 In vivo drug release in blood  

To evaluate the release behaviour of DOX from DOX‐loaded scaffolds, DOX concentration 

in  the  serum  harvested  from  peripheral  blood  was  quantified.  At  Days  1,  7  and  28  of  the 

treatment, a volume of 100 μL blood was collected from each mouse; then, samples were left at 

room temperature (RT) for 20 minutes and centrifuged at 350 × g for 5 minutes. The blood serum 

was collected and mixed with the internal control (vancomycin 0.002 μg/mL) at 1:1 volume ratio. 

Then, 20 μL of the mixture was added into 80 μL extraction solution (5 mM ammonium acetate 

pH 5 and acetonitrile at 2:3 volume ratio), vortexed, placed on ice for 10 minutes and centrifuged 

at 15000 × g  for 10 minutes. The supernatant was  collected and analysed using a Nexera X2 

UHPLC  system  coupled  to  a  triple  quadrupole  mass  spectrometer  (Shimadzu  LCMS‐8050, 

Shimadzu,  Japan).  The  separations were  carried out  at  a  flow  rate of  0.3 mL/minute using  a 

Kinetex® 2.6 μm EVO C18 100 Å LC  column 100 x 2.1 mm (Phenomenex,  Japan), with mobile 

phase  A  consisting  of  water/0.1%  formic  acid  and  mobile  phase  B  consisting  of  acetone 

nitrile/0.1% formic acid. The auto‐sampler was set at 5°C with an injection volume of 5 μL. DOX 

was ionized using a positive‐ion electrospray with nebulising gas flow of 3 L/minute, heating gas 

flow of 10 L/minute, drying gas flow of 10 L/minute, interface temperature of 300°C, desolvation 

line (DL) temperature of 250°C and heat block temperature of 400°C. Quantitative analysis was 

carried out using the selected reaction monitoring  (SRM) mass  transition from 544.20 m/z to 

397.00 m/z with a dwell time of 22 ms per ion and 1 ms delay between each measurement. 

4.3.5.5 Histology and immunohistochemistry staining 

Samples were sectioned at 5 μm thickness, deparaffinated in xylene, rehydrated through 

a series of ethanol (100%, 90% and 70%) and stained with haematoxylin–eosin (H&E, Sigma). For 

immunohistological analyses to detect the human breast cancer cells after transplantation, anti‐

nuclear‐mitotic apparatus protein antibody (NuMA, ab97585, Abcam, UK) was used. After the 

rehydration step, slides were placed in antigen retrieval buffer (Tris‐sodium citrate pH 6) and heat 

treated in a decloaking chamber at 95°C for 5 minutes. Then, the slides were incubated with H2O2 

  Page 89 

  Page 89 

for 5 minutes at RT, permeabilized with 0.1% Triton X‐100 for 5 minutes, blocked with 2% bovine 

serum albumin (Sigma‐Aldrich, US) at RT for 30 minutes and incubated with primary antibodies 

for 1 hour at RT. Then, slides were incubated with DAKO Envision+ Dual Link System HRP for 45 

minutes. Last, the slides were incubated with DAKO Liquid DAB+ Substrate Chromogen for colour 

development. 

Masson’s trichrome staining was performed for heart and liver sections to evaluate the 

level of fibrosis after treatment. Slides were deparaffinated and rehydrated as explained before. 

Then, slides were placed in 1.3% aqueous picric acid (Sigma‐Aldrich, US) at 60°C for 1 hour, and 

next placed in running tap water for 5 minutes. After that, the slides were stained with Weigert’s 

haematoxylin  (Acros  Organics,  US)  for  10  minutes  and  Ponceau‐Fuchsin  working  solution 

(Masson’s Red, Sigma‐Aldrich, US) for 5 minutes, and differentiated in phosphotungstic acid (PTA, 

Sigma‐Aldrich, US) for 6–10 minutes, with 1‐minute rinsing in water between each staining step. 

Last,  the slides were transferred to methyl blue (Alfa Aesar, US)  for 1–2 minutes to stain the 

collagen fibres blue. 

4.3.5.6 Statistical analysis 

Data are expressed as mean ± SEM. The significant differences between groups were 

analysed by one‐way ANOVA test and Tukey post hoc  test using SigmaPlot 13.0 software. 

Significant differences were  recorded when p < 0.05. *,  **, *** and ns  in  figures  indicate 

p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 and data not statistically significant, respectively. 

4.4 RESULTS 

4.4.1 Scaffold characterization 

Bright field images showed a uniform macroporous structure for the printed scaffolds 

(Figure 19A). The incorporated porogen microparticles (Figure 19B) were completely leached out, 

thereby creating microscale pores with a size of 1–100 µm (Figure 19C). The µ‐CT micrographs 

(Figure 19D) showed the uniform distribution of microscale pores throughout the scaffolds, with 

  Page 90 

  Page 90 

pore  area  of  5–840 μm2  (Supplementary  data,  Figure  S7).  Moreover,  the  SEM  and  µ‐CT 

micrographs showed that the large microscale pores were mainly located inside the struts (20–

70 µm), while smaller microscale pores were located close to the surface of the struts (2–10 µm) 

(Figure 19D, arrows). The pores inside the struts were interconnected, with open pores on the 

surface of struts indicating the interconnectivity of the microscale porous networks. 

 

Figure 19. Bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds fabricated 

using the screw melt extrusion method with interconnected pores. A: Representative bright field 

microscopic  image  of  pmPCL  scaffold.  B  and  C:  SEM micrographs  of  cross  section  of  pmPCL 

scaffold strut before (B) and after (C) the porogen was leached out. D: µ‐CT micrograph of pmPCL 

scaffold after leaching. Black and white arrows: microscale pores on the surface of the strut. 

 

  Page 91 

  Page 91 

4.4.2 Drug loading  

After loading of the scaffolds with DOX, they became red in colour (Figure 20A), indicating 

homogeneous and uniform distribution of the DOX in the scaffolds. The distribution of DOX was 

further measured by fluorescence imaging, which showed DOX both on the strut surface and 

inside the intra‐strut microscale pores (Figure 20B and C). The presence of DOX on the pmPCL 

scaffolds  was  also  validated  by  its  signature  peaks  (1612  cm‐1  and  1577–1579  cm‐1  for  the 

aromatic ring structure) in the FT‐IR spectrum (Figure 20D). 

 

 

 

Figure  20.  Loading  of  doxorubicin  (DOX)  on  bimodal  porous  medical  grade 

polycaprolactone scaffolds (pmPCL), dose‐dependent chemotherapeutic effect on breast cancer 

cells and in vitro linear sustained release of the loaded DOX. A: stereomicroscopic representative 

image of DOX–loaded pmPCL scaffold. B and C: representative images of surface (B) and cross 

section (C) of DOX–loaded pmPCL scaffold strut from spinning disc confocal microscope. Arrow: 

scaffold surface. D: Fourier‐transform infrared spectra of pmPCL scaffold, DOX and DOX–loaded 

pmPCL scaffold (DOX/pmPCL). E: in vitro cell viability of MDA‐MB‐231 breast cancer cell line at 2, 

5  and  7  days  of  treatment with DOX–loaded  pmPCL  scaffolds  at  Low Dose  (0.4  µg DOX/mg 

  Page 92 

  Page 92 

scaffold), High Dose (10 µg DOX/mg scaffold) and DOX in solution (Free DOX). Data are expressed 

as mean ± SEM (n=6). F and G: cumulative release of DOX–loaded from pmPCL at Low Dose (2 µg 

DOX/scaffold) and High Dose (8 µg DOX/scaffold) groups in PBS in the first 30 hours (F) and in 28 

days (G). Data are expressed as mean ± SEM (n=3 scaffolds from 3 independent experiments). ** 

is p<0.01; One‐way ANOVA and Tukey post hoc test. 

 

4.4.3 In vitro chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds against 

breast cancer  

An    in  vitro  cell  viability  assay with  the MDA‐MB‐231  breast  cancer  cell  showed  no 

significant difference in cell survival rate among groups at day 2 (58.9±11.0%, 56.2±21.9% and 

39.9±14.9% for Low Dose, High Dose and Free DOX groups, respectively, Figure 2E). At day 5, DOX 

loaded on  the  scaffolds maintained  its  dose‐dependent  chemotherapeutic  effect  against  the 

cancer cells, indicated by a significant decrease in cell viability from 22.7±5.1% in the Low Dose 

(0.4 µg/mg) group to 0.4±0.03% in the High Dose (10 µg/mg) group at day 5 (Figure 20E). There 

was also no statistically significant difference in terms of cell viability between the High Dose and 

Free DOX groups (0.9±0.7%). The dose‐dependent trend was maintained up to day 7. At day 7, 

High  Dose  DOX/pmPCL  groups  displayed  reduced  cell  viability  to  less  than  0.5%, which was 

significantly less than Low Dose (8.1±1.1%) (Figure 20E; p<0.01) but similar to Free DOX.  

4.4.4 Drug release behaviour of doxorubicin–loaded bimodal scaffolds 

The  drug  release  profile  of  DOX–loaded  scaffolds  was  investigated  prior  to  the 

implantation experiments. The doses used for drug release study were the same as those used 

for the in vivo implantation studies, which were 2 and 8 µg DOX/scaffold for Low Dose and High 

Dose, respectively. 

The drug  release  study  showed  that  in both  Low Dose and High Dose groups, DOX–

loaded on pmPCL scaffolds had a linear release profile for more than 28 days with constant rates 

  Page 93 

  Page 93 

of 0.1 and 0.4 ng/scaffold/hour for Low Dose and High Dose, respectively. The increase in the 

amount of the loaded drug did not prolong the release further but increased the amount of drug 

released from 0.04 µm/scaffold to 0.2 µm/scaffold after 1 hour, from 0.06 µm/scaffold to 0.3 

µm/scaffold after 24 hours (Figure 20F) and from 0.13 µm/scaffold to 0.53 µm/scaffold after 672 

hours (Figure 20G). Overall, the pmPCL scaffolds were able to release the DOX at a constant rate. 

4.4.5 Application of doxorubicin–loaded scaffolds in preventing breast cancer 

recurrence and metastasis 

4.4.5.1 Doxorubicin concentration in peripheral blood 

The  concentration  of  DOX  from  pmPCL  scaffolds  into  the  peripheral  blood  after 

implantation was quantified using HPLC‐MS by quantifying the level of DOX in the serum and 

compared with I.V. injection of DOX. HPLC‐MSC results showed the DOX level was only detectable 

in the I.V. group at day 1 and 7 after injection (Figure 21A). For animals treated with DOX–loaded 

scaffolds the concentration was below the limits of detection (was <1.5 ppb) (Figure 21A). Overall, 

the pmPCL scaffolds were able to release the DOX at a constant rate    in vitro   but for  in vivo 

experiment,  the  concentrations  of  DOX  in  the  blood  serum  was  limited  to  be  detected. 

Conversely, in I.V. group, DOX can be detected up to 7 days after injection. 

4.4.5.2 Cytotoxicity of doxorubicin–loaded scaffolds. 

The cytotoxicity of DOX–loaded scaffolds was evaluated by monitoring the changes in 

animal weight during the treatment as well as by histological and immunohistochemical staining. 

Regarding the weight, as showm in Figure 21B, significant weight loss was recorded in the I.V. 

group (animals that received one I.V. injection of DOX) compared with the other groups at week 

1 after treatment. At the second week, animal weight was increased in the I.V., Low Dose and 

High Dose groups, but less than that in the Control group. 

 

  Page 94 

  Page 94 

 Figure 21. The doxorubicin (DOX) was only detected in the peripheral blood of animals 

received  the  I.V.  injection  and  reduced  the  body  weight  at  week  1  post‐treatment.  A:  The 

concentration of DOX in the peripheral blood at day 1, 7 and 28 post‐treatment. B: Animal weight 

fold increment compared with the weight of animal at the time the treatment started. Data are 

expressed as mean ± SEM (n=6). ns: data is not statistically significant; @: Control group was 

significantly different from Low Dose and High Dose (p<0.01); #: Control group was significantly 

higher than Low Dose (p,0.01); * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post 

hoc test. 

 

With  histological  and  immunohistochemical  staining,  hematoxylin‐eosin  (H&E)  and 

Masson’s trichrome staining were performed to investigate the cytotoxic effects of DOX in liver 

and heart. In liver, histological analysis revealed no difference in the percentage of congested 

  Page 95 

  Page 95 

central veins among all  the groups  (Figure 22A). Further, Masson's  trichrome staining  results 

showed no  significant  difference  in  the  fibrotic  tissue area percentage  among all  the  groups 

(Figure 22A).  Taken together, no hepatotoxicity effects were detected in all of the experimental 

groups at day 28 of the treatment.  

In heart, Masson’s trichrome staining confirmed the presence of fibrotic tissue in all the 

experimental groups (Figure 22B; low and high magnifications). Quantification of fibrotic tissue 

area showed no statistically significant difference between the Control group and the treatment 

groups. However, both Low Dose and High Dose groups showed significantly less fibrotic tissue 

area than did the I.V. group (7.3±0.6% and 7.1±0.5% for Low Dose and High Dose, respectively, 

compared with 9.2±0.3% for I.V., Figure 22B). Taken together, the local delivery of DOX using 

pmPCL scaffolds reduced cardio cytotoxicity compared with the I.V. injection method. Overall, 

the  DOX–loaded  pmPCL  scaffolds,  containing  less  amount  of  DOX,  significantly  reduced  the 

cytotoxic  effects  compared with  I.V.  group, which was  indicated by  significant weight  loss  in 

animals at week 1 after I.V. injection of DOX as well as increased fibrotic tissue area percentage 

in the heart.  

  Page 96 

  Page 96 

 

Figure  22. Cytotoxic  effects  in  heart  and  liver  of  animals  receiving  intravenous  (I.V.) 

doxorubicin (DOX) and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, 

low dose and no DOX.  Implantation of DOX‐loaded pmPCL scaffolds had similar mild cytotoxic 

effects on  the  liver  and  less  cardio‐cytotoxicity  compared with  I.V.  injection of DOX. A: H&E 

staining (top row) and Masson’s trichrome staining (middle row) of liver; congested central vein 

percentages  measured  from  H&E  staining  and  fibrotic  tissue  percentages  measured  from 

Masson’s  trichrome  staining of  the Control  (bimodal porous medical  grade polycaprolactone 

  Page 97 

  Page 97 

(pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose 

and  High  Dose  (DOX–loaded  pmPCL  with  2  and  8  µg  DOX/scaffold,  respectively)  groups.  B: 

Masson’s  trichrome  staining  of  heart  (top  and middle  rows),  and  fibrotic  tissue  percentages 

measured from Masson’s Trichrome staining of the Control, I.V, Low Dose and High Dose groups. 

Data  are  expressed  as  mean  ±  SEM  (n=6  mice  for  each  group).  ns:  data  is  not  statistically 

significant; * is p<0.05 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. 

4.4.5.3 Chemotherapeutic effect of doxorubicin–loaded scaffolds 

In vivo BLI showed tumour recurrence in the Control and I.V. groups at 1 week earlier 

than  in  the  Low Dose and High Dose groups  (Figure 23A). At Day 14,  recurrent  tumour was 

detectable in the Control and I.V. groups using IVIS. At Day 21, tumour recurrence was detected 

in all groups, and recurrent tumours had enlarged at Day 28. Quantification of in vivo total flux 

normalized  to Day  0  of  the  treatment  showed  that  at Day  7,  only  the  Low Dose  group  had 

significantly reduced tumour growth (2.1 ± 0.2 fold increase, n = 6) compared with the Control 

group (6.0 ± 1.5 fold increase, n = 6) (Figure 23B). There was no statistically significant difference 

between the  I.V.  (19.9 ± 6.3  fold  increase, n = 10) or High Dose (3.0 ± 0.9  fold  increase, n = 6) 

group and the Control group. At Day 14, both Low Dose and High Dose groups (3.9 ± 1.4 and 

81.9 ± 53.5 fold increase, respectively) had significantly less tumour growth than did the Control 

group  (377.9 ± 98.3  fold  increase).  At  Day  21,  the  tumour  growth  in  the  Control  group was 

significantly greater than that in the treatment groups. Ex vivo total flux quantification of local 

recurrent tumours at Day 28 of the treatment showed that the recurrent tumours in the Control 

group (335.7 ± 125.3) were larger than in the I.V., Low Dose and High Dose groups (134.5 ± 103.5, 

21.7 ± 12.1 and 17.6 ± 5.9, respectively) (Figure 23C). Both Low Dose and High Dose groups had 

significantly less tumour growth than did the I.V. and Control groups. 

 

  Page 98 

  Page 98 

 

Figure  23. Tumour  recurrence  in  animals  treated with  intravenous  (I.V.)  doxorubicin 

(DOX) and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, low dose 

and no DOX. Local drug delivery reduced the local tumour recurrence. A: Representative in vivo 

bioluminescence images of mice at days 0, 7, 14, 21 and 28 post treatment in Control (bimodal 

porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds without drug),  I.V.  (I.V.  injection of 

doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg dose), Low Dose and High Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 

µg  DOX/scaffold,  respectively)  groups.  B:  quantitative  in  vivo  IVIS  signal  over  21  days  of 

treatment. C: ex vivo IVIS signal of local cancer recurrence at day 28 post treatment. Data are 

expressed as mean ± SEM (n=6 mice in each group). # is statistically significant compared with 

Control group, p<0.05; ns: data is not statistically significant; * is p<0.05 and ** is p<0.01 from 

one‐way ANOVA and Tukey post hoc test.  

 

  Page 99 

  Page 99 

Bright field images showed that the recurrent tumours in all groups were mature and 

vascularized (Figure 24A). Images from H&E staining (Figure 24B) showed that there was multiple 

tumour recurrence occurred locally in all animals in the Control group. The malignant tissues in 

the Control group had different stages of tumour development, some of the tumour tissue was 

dense, while some were loose at the centre. In the other groups, all animals exhibited only single 

local recurrent tumours. In the Low Dose and High Dose groups, the tumours only grew next to 

the scaffolds but did not encapsulate or infiltrate the inner pores of the scaffolds. NuMA staining 

(Figure 24C) images showed that positive cells were observed in all groups, indicating that the 

recurrent tumours were from the injected human breast cancer cells. Overall, the histological and 

immunohistochemical staining showed that all recurrent tumours were highly proliferative and 

vascularized with single recurrence occurred in all animals of the treatment groups and multiple 

recurrence occurred in all animal of the Control group.  

 

 

Figure 24. Local drug delivery reduced the number and volume of the highly proliferative 

and vascularized local recurrent tumours. The representative bright field (A), H&E staining (B) and 

anti‐NuMA (human specific marker) staining images (C) of the recurrent tumour at the primary 

tumour site of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds 

  Page 100 

  Page 100 

without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High Dose (DOX–

loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. 

 The chemotherapeutic effects of  the treatments on metastases were  investigated by 

weighing and ex vivo BLI analysis of different organs. In  lung, the macroscopic metastatic foci 

were only observed in the Control and I.V. groups (Figure 25, top row). The presence of metastatic 

cells in lung was confirmed by immunostaining using human specific NuMA antibody (Figure 25). 

Moreover, NuMA staining showed more tumour cells (stained brown) in the I.V. group than in 

the other groups (Figure 25, second row). The metastasis might have increased the weight of the 

lungs in the Control and I.V. groups compared with the Low Dose and High Dose groups (Figure 

25). Quantification of total flux showed that the Low Dose and High Dose groups had less signals 

than did the Control and I.V. groups, but the data were not statistically significant. NuMA staining 

revealed  that  the  tumour  cells  were  distributed  as  clusters/micrometastases  in  the  I.V.  and 

Control groups. In the other groups, there were more single tumour cells than micrometastases. 

Quantification of number of  tumour cells and micrometastases confirmed  that both  the Low 

Dose group and the High Dose group had significantly  less tumour cells and micrometastases 

compared with the I.V. group (Figure 25). There was no significant difference between the I.V. 

group and the Control group. Overall, it can be said that the local treatment using DOX‐loaded 

scaffolds significantly reduced breast tumour metastasis in lung compared with the I.V. injection 

method. 

In  liver, no noticeable difference  in  surface morphology was  found among all groups 

(Supplementary data, Figure S9A), which was confirmed by similarity in organ weight (Figure 25B, 

bottom row). Ex vivo total flux quantification showed similar trends with lung signals. In the Low 

Dose and High Dose groups, metastasis progression, which was indicated by total flux signal, was 

less than in the Control and I.V. groups. 

Last, analysis of spleen showed that animals in both the Low Dose group and the High 

Dose group had smaller spleen size than did those in the I.V. and Control groups (Supplementary 

  Page 101 

  Page 101 

data, Figure S9B). Regarding the ex vivo total flux quantification, the Low Dose and High Dose 

groups had smaller signals than did the Control and I.V. groups (Supplementary data, Figure S9B). 

Overall, the ex vivo BLI signal quantification showed that the Low Dose and High Dose 

groups reduced tumour progression in lung, liver and spleen compared with both the Control and 

the I.V. groups. Conversely, there was no statistically significant difference found between the 

I.V. group and the Control group. 

 

 

Figure 25. Tumour metastasis in animals receiving intravenous (I.V.) doxorubicin (DOX) 

and medical‐grade polycaprolactone (pmPCL) scaffolds loaded with high dose, low dose and no 

DOX.  Doxorubicin  (DOX)–loaded  bimodal  porous  medical  grade  polycaprolactone  (pmPCL) 

scaffolds effectively reduced the breast tumor metastasis in lungs. Morphology (top row), anti‐

NuMA staining (middle row), organ weight normalized to body weight, total flux from ex vivo BLI 

imaging, tumour cell count and micrometastasis count from NuMA staining images using ImageJ 

software  of  lung  of  the  Control  (bimodal  porous  medical  grade  polycaprolactone  (pmPCL) 

scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High 

  Page 102 

  Page 102 

Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. Arrows: tumour 

metastasis foci. The organs were weighted after fixation and normalized to the body weight of 

the animal at day 28. Data are expressed as mean ± SEM (n=6 mice in each experimental group). 

ns: data is not statistically significant; * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey 

post hoc test. 

4.5 DISCUSSION 

Adjuvant  systemic chemotherapy  is used  to eliminate  residual  cancerous  tissue after 

surgery but is known to be associated with systemic cytotoxicity [188]. Localized chemotherapy 

is a promising approach to enhance treatment effectiveness and reduce systemic toxicity. Several 

products  are  available  for  local  treatment  of  various  types  of  cancer,  such  as  subcutaneous 

implantation of Viadur® (leuprolide acetate implant) to treat prostate cancer, local implantation 

of Gliadel® wafer (carmustine implant) to treat malignant glioma and subcutaneous implantation 

of Zoladex® drug reservoir to treat endometriosis [17‐20, 175, 176]. However, the products in 

these methods are only  implanted  subcutaneously  in  the arm or abdomen area,  and have a 

simple structure and are monofunctional as a drug reservoir. Further, treatment for breast cancer 

is still under development. The use of implants as drug carriers is promising as it can provide the 

advantages  of  localized  therapy  as  well  as  the  tissue  reconstruction  function  of  scaffolds; 

however, little is known about using scaffolds as dual‐function devices for localized therapy and 

tissue regeneration, and existing studies mainly focus on bone cancer and bone regeneration. 

Therefore, we aimed to develop a dual‐function 3D‐printed scaffold with bimodal porosity as a 

local drug carrier and tissue‐supportive scaffold for breast cancer applications. 

In  this  study,  we  developed  a  drug‐loaded  scaffold  and  investigated  its  efficacy  in 

preventing cancer recurrence. The scaffolds were fabricated by the SME method combined with 

porogen leaching to achieve bimodal porosity. The combination of SME and porogen leaching 

gives more  control  over porosity.  The macroscale  pore  shape and  size  are  controlled by  the 

  Page 103 

  Page 103 

printing pattern, and the microscale pore shape and size are controlled by the input porogen. 

Further, as this method is based on molten polymer, the use of solvent can be removed, giving it 

a non‐toxic fabrication process. 

After fabrication, the scaffolds were loaded with DOX by using a soaking method, taking 

advantage of the capillary action of the microscale pores. Because the drug only adsorbs on the 

surface instead of being trapped inside a solid block of polymer, its release mechanism is not 

dependent on the degradation of the scaffold (PCL takes more than 2 years to degrade in vivo 

[189]). This means that after the drug is completely released, the scaffold still maintains its shape, 

and mechanical and material properties, to support tissue reconstruction. This feature is difficult 

to  achieve  by  conventional  methods  of  mixing  drug  with  biomaterials  before  making  into 

scaffolds reported in the literature [56, 184, 185]. 

In vitro cell viability assays showed that DOX‐loaded scaffolds showed a dose‐dependent 

chemotherapeutic effect in vitro against the breast cancer cell line MDA‐MB‐231. Yuan et al. also 

studied the chemotherapeutic effects of DOX‐loaded nanoparticles embedded in hydrogels  in 

vitro [181].  In their study, the drugs loaded on hydrogels were released for 72 hours and the 

release solution was used as the treatment for the cell viability study. MDA‐MB‐231 cells were 

seeded in 96‐well plates at 104 cells/well density and cultured with the drug release solution for 

24, 48 and 72 hours. Compared with their results, in which the cell viability of MDA‐MB‐231 cells 

reduced to only 50% after 72 hours of treatment, our results showed a better outcome. Another 

experiment  by  Seib  et  al.  studied  the  chemotherapeutic  effects  of  DOX‐loaded  silk  film  (40 

µg/film) in vitro [179]. In their study, MDA‐MB‐231 cells were seeded in the transwell insert at 

8000 cells/well and the film was placed at the bottom of each well. The treatment was carried 

out for 72 hours before MTT assays were performed. Compared with their results, our scaffolds 

showed less chemotherapeutic effect. However, it is worth noting that their dose was fivefold 

that  in our High Dose group.  In addition,  in both  studies,  the  experiments were designed  to 

characterize the effects of the release solution on cells, and not the direct contact of cancer cells 

  Page 104 

  Page 104 

with the implant. These designs were well suited for in vitro study. However, to correlate between 

in  vitro  and  in  vivo  results,  the  chemotherapeutic  effects  of  drug‐loaded  scaffolds  on  breast 

cancer cells via direct contact has to be considered. Therefore, the method of direct culture of 

DOX‐loaded scaffolds with breast cancer cells gives a better predictive result for in vivo study. 

After demonstration of the chemotherapeutic effects of DOX loaded on bimodal porous 

scaffolds against breast cancer in vitro, we demonstrated the application of DOX‐loaded scaffolds 

to prevent cancer recurrence and metastasis in vivo. 

Drug  release  characterisation  showed  that  DOX‐loaded  pmPCL  scaffolds  used  for 

implantation can release DOX at a constant rate for up to 28 days in vitro. This release behaviour 

is due to the effect of the intra‐strut microporous structure, which has been documented in our 

previous  study  [190].  This  effect  is  beneficial  as  it  can be used  to maintain  the drug  release 

amount at the effective concentration throughout the implantation experiment, as opposed to 

the single treatment in the I.V. group. Compared with other methods of loading drug by mixing 

directly in the polymer solution for electrospun scaffolds or making hydrogels [181, 191‐193], our 

method, besides having homogeneous distribution of drug throughout the scaffold, has a release 

profile that is independent of the scaffold degradation. Therefore, we can alter the release profile 

while maintaining the designed structure and properties of the scaffold for tissue regeneration. 

The DOX‐loaded scaffolds were then used in a mouse orthotopic breast cancer model. In 

our study, human breast cancer cells were injected into the mammary fat pad and inoculated for 

2 weeks. After that, the tumour was resected, and the scaffold was implanted at the resected 

site. The implantation of DOX‐loaded scaffolds was compared with I.V. injection of DOX in terms 

of chemotherapeutic effects against local recurrence and metastasis as well as systemic cytotoxic 

effects  on  organs.  It  is  important  to  mention  that  the  scaffolds  were  only  loaded  with  5% 

(2 μg/scaffold, Low Dose) and 20% (8 μg/scaffold, High Dose) of the amount of the I.V. injection 

dose (2 mg/kg). 

  Page 105 

  Page 105 

We  achieved  increased  treatment  efficiency  with  reduced  cytotoxicity  when  using 

scaffolds loaded with only 5% or 20% of the amount used in the I.V. injection group. Specifically, 

local drug delivery from the scaffolds significantly decreased the level of DOX circulated in the 

blood system, which reduced the systemic cytotoxicity. In the I.V. group, only a small percentage 

of the DOX accumulated at the target site; meanwhile, in the DOX‐loaded scaffold groups, the 

drug mainly released at the target site and only a fraction of the DOX was diffused into the blood 

system  and  circulated  in  the  body.  By  delivering  DOX  locally,  its  cardio‐cytotoxicity  was 

significantly decreased, which were indicated by the less development of fibrotic tissue area and 

in agreement with literature [194, 195]. In liver, the similarity in fibrotic tissue percentage, as well 

as congested central vein percentage, which were reported as side effects of systematic delivery 

of DOX [196, 197], among all groups can be explained by two reasons: first, the effect of DOX on 

liver is relatively mild, and second, the regeneration rate of liver tissue is higher than that in other 

organs. 

Regarding  the  chemotherapeutic  effect,  the  results  from BLI  showed  that  the  I.V. 

group with single administration of DOX had less chemotherapeutic effect to prevent cancer 

recurrence than did the DOX‐loaded scaffold groups, which had DOX release for more than 28 

days. The better chemotherapeutic effect of the local treatment groups can be explained by the 

maintenance of effective concentrations of DOX due to the sustained release of DOX from the 

scaffolds. Conversely, the I.V. group only had a short period of treatment (up to 7 days based on 

the  amount  detected  in  blood);  hence,  effective  concentrations  could  not  be maintained  to 

prevent tumour recurrence. Of note, in the BLI result, the insignificant differences among the 

Control,  I.V  and  DOX‐loaded  scaffold  groups  could  have  been  due  to  biological  and  surgical 

variations, which means that tumour recurrence might have been exhibited at different times in 

individual mice. Because of this limitation, we suggest using the starting point of local recurrence 

as the time to deliver the treatment and only choose the animals that have the least variation. 

Nevertheless, the present result reflects the real‐life application in which the scaffolds would be 

  Page 106 

  Page 106 

used  as  a  preventive  treatment  and  we  cannot  predict  which  patients  will  have  tumour 

recurrence. 

Regarding metastasis, it occurred at the highest level in lung, indicated by the presence 

of  micrometastasis  foci  on  the  surface.  Despite  the  fact  that  only  a  small  amount  of  DOX 

circulated in the blood system in the local treatment groups, the drug‐loaded scaffolds effectively 

reduced metastasis progression. It is likely that because the drug‐loaded scaffolds reduced the 

primary source of tumour cells at the primary site, their metastasis was reduced. 

In both case of preventing cancer recurrence and metastasis, the LD group was appeared 

to be more effective than HD group but not significant different. This can be explained as there 

was no difference in term of chemotherapeutic effect between LD (2ug/mg) and HD (8ug/mg) 

and the differences was due to variation. However, there was an alternative explanation that the 

systemic cytotoxicity of DOX released from scaffolds in HD group was higher than LD group, hence 

reduced  treatment  effectiveness.  The  latter  hypothesis  needs  further  investigation  in  future 

study to validate it. 

Finally, the bimodal porous scaffolds, after the completion of drug release (of which the 

releasing time varies from drug to drug and was expected to be less than 1 year), can maintain 

their  structure,  thanks  to  its  low  degradation  rate  (more  than  2  years),  to  support  tissue 

reconstruction.   When then scaffolds start  to degrade,  their by products were showed to be 

hemocompatible and non‐toxic, hence may not interfere with the tissue regeneration [198].  

In the current study, we only focused on the prevention of cancer recurrence. The tissue 

reconstruction aspect of these scaffolds is the focus of our future study. 

4.6 CONCLUSION 

In this study, a new type of 3D‐printed scaffold with intra‐strut porosity was introduced 

as a potential method to prevent breast cancer recurrence. DOX‐loaded bimodal porous scaffolds 

demonstrated chemotherapeutic effects against breast cancer MDA‐MB‐231 cells in vitro. In vivo 

  Page 107 

  Page 107 

implantation  of  DOX‐loaded  scaffolds  showed  a  significant  decrease  in  cardio‐cytotoxicity 

compared  with  the  I.V.  injection  method.  Further,  the  scaffolds  reduced  breast  tumour 

recurrence  and  metastasis  progression  compared  with  I.V.  injection.  Overall,  this  study 

demonstrated that local delivery using drug‐loaded scaffolds with only 5–20% of the I.V. injection 

dose can not only reduce cytotoxicity but also improve chemotherapeutic effects against tumour 

recurrence and metastasis. 

 

   

  Page 108 

  Page 108 

5Chapter 5:  3D printed scaffolds with dual 

macro‐, micro‐scale porous networks for 

bone tissue regeneration 

Hoang Phuc Dang a, b, Cedryck Vaquette c, Tara Shabab a, b, Román A. Pérez d, Ying 

Yang e, Tim R. Dargaville a, Dietmar W. Hutmacher a, b, Abbas Shafiee b, f, Phong A. Tran 

a, b, g 

Submitted to Biomaterials 

a   ARC Centre  in Additive Biomanufacturing, Queensland University of  Technology, Musk 

Avenue, Kelvin Grove, Brisbane, Queensland 4059, Australia 

b   Centre  in  Regenerative  Medicine,  Institute  of  Health  and  Biomedical  Innovation, 

Queensland University of Technology, Brisbane, Australia 

c  School of Dentistry, The University of Queensland, Brisbane, Queensland, Australia 

d  Institute of Bioengineering, School of Dentistry, Universitat  Internacional de Catalunya, 

Barcelona, Spain 

e   Australia‐China  Centre  for  Tissue  Engineering  and  Regenerative Medicine  (ACCTERM), 

Queensland University of Technology, Brisbane, Australia 

f   UQ Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 

Brisbane, Queensland, Australia 

g   Interface  Science  and Materials  Engineering  Group,  School  of  Chemistry,  Physics  and 

Mechanical Engineering, Queensland University of Technology, Brisbane, Australia 

   

  Page 109 

  Page 109 

The authors listed below have certified that: 

16. They  meet  the  criteria  for  authorship  in  that  they  have  participated  in  the  conception, 

execution, or interpretation, of at least that part of the publication in their field of expertise; 

17. They take public responsibility  for  their part of the publication, except  for the responsible 

author who accepts overall responsibility for the publication; 

18. There are no other authors of the publication according to these criteria; 

19. Potential conflicts of  interest have been disclosed to  (a) granting bodies,  (b)  the editor or 

publisher of journals or other publications, and (c) the head of the responsible academic unit, 

and 

20. They agree to the use of the publication in the student’s thesis and its publication on the QUT’s 

ePrints site consistent with any limitations set by publisher requirements. 

In the case of this chapter: 

Submitted manuscript: 

Hoang Phuc Dang, Cedryck Vaquette , Tara Shabab, Román A. Pérez, Ying Yang , Tim R. Dargaville, 

Dietmar W. Hutmacher , Abbas Shafiee and Phong A. Tran. “3D printed scaffolds with dual macro‐

, micros‐cale porous networks for bone tissue regeneration.” 

 

Contributor  Statement of contribution 

Hoang Phuc Dang 

Performed experimental design, conducted experiments, data 

analysis, and wrote the first draft of manuscript Signature 

Date: 

Cedryck Vaquette  Conducted experiments 

Tara Shabab  Conducted experiments  

Román A. Pérez   

Page 110 

Page 110 

Ying Yang  Conducted experiments 

Tim R Dargaville  Aided manuscript preparation 

Dietmar W. Hutmacher 

Performed experimental design, supervised the project, 

performed data analysis and contributed in manuscript 

preparation 

Abbas Shafiee 

Performed experimental design, conducted experiment, 

supervised the project, performed data analysis and contributed 

in manuscript preparation 

Phong A. Tran 

Performed experimental design, conducted experiment, 

supervised the project, performed data analysis and contributed 

in manuscript preparation 

Principal Supervisor Confirmation 

I have sighted email or other correspondence from all Co‐authors confirming their 

certifying authorship 

 Phong Tran     06/02/2020  

Name  Signature  Date 

QUT Verified Signature

  Page 111 

  Page 111 

5.1 ABSTRACT 

In this study, we combined 3D printing with porogen leaching to develop scaffolds with multiscale 

porosity and investigated their regenerative capacity in a rat calvarial defect model. The scaffolds 

were additively manufactured from medical grade polycaprolactone (mPCL) doped with porogen 

microparticles having  an average  size of  22 μm, which were  subsequently  leached  to  create 

microscale porosity. Morphological analysis revealed an interconnected macroscale porosity of 

about 60% with an average pore size of 700 µm and intra‐strut microscale pores with a porosity 

of nearly 40% and average pore size of 20–70  µm. The microscale porosity resulted in a 3‐fold 

increase in the scaffolds’ surface area, a 2‐fold enrichment in negatively charged surface groups, 

which  did  lead  to  significantly  increased  protein  adsorption  and  faster  hydrolysis‐driven 

degradation in vitro. Higher protein adsorption led to increased cell proliferation. An in vitro blood 

clot assay demonstrated an increased TGF‐β1 release. In a rat calvarial defect, bone formation 

was found in both the macro‐ and microscale pores and was at a similar level when compared 

with biomimetic calcium phosphate coated mPCL scaffolds. 

5.2 INTRODUCTION 

Scaffold‐guided  bone  regeneration  (SGBR)  [47,  48]  requires  a minimal  set  of  design 

requirements, of which the combination of a macro‐ and microscale porosity have been shown 

to affect tissue regeneration and remodeling [49‐51]. However, only a few techniques are able to 

achieve  reproducible  manufacturing  of  this  type  of  scaffold  porosity  designs.  Conventional 

approach uses molding and salt leaching where pores are created both from the molding and 

drying/lyophilization and from phase separation or solvent extraction or porogen leaching [32, 

52].  Using  this  approach,  Du  et  al.  fabricated  scaffolds  with  a  macro/microscale  porous 

architecture  by  casting  silk  fibroin  solution  in  Teflon  molds  together  with  paraffin  spheres 

followed  by  freeze‐drying  which  led  to  the  formation  of  microscale  pores  from  silk  fibroin 

network. The paraffin was then leached out to produce macroscale pores [53]. Duan et al. soaked 

  Page 112 

  Page 112 

a solution of mesoporous bioactive glass (MBG) and polyacrylic acid (PAA) microscale spheres 

into polyurethane (PU) sponges [54]. The specimens were dried and heated at 600oC for 6 hours 

to burn out PU sponges, which created macroscale pores, and PAA microspheres, which formed 

microscale pores. Reed et al. used acrylonitrile butadiene styrene (ABS) plastic to make negative 

molds and Poly(L‐lactic acid) (PLLA) to make positive molds with pre‐defined macroscale porous 

structures.  Then,  chitosan‐alginate  solutions  were  either  poured  into  the  negative molds  or 

infused into the positive molds by centrifugation. The constructs were crosslinked with CaCl2 and 

lyophilized to create microscale porous networks [55]. Overall, these techniques were limited in 

achieving deterministically complex macroscale pores and controlled microscale pore sizes. 

Additive  biomanufacturing  (ABM)  has  emerged  as  a  unique  technology  to  create 

scaffolds with deterministically designed, interconnected macroscale porous networks. A small 

number of studies have reported on ABM methods to produce dual macro‐/microscale porous 

scaffolds for tissue engineering[38‐41]. Maleksaeedi et al. utilized inkjet 3D printing to fabricate 

titanium – polyvinyl alcohol (PVA) scaffolds, in which the macroscale pores were generated by 

design and in the intra‐strut pores were generated by sintering process [38]. Zhang et al. also 

used inkjet 3D printing and sintering process to fabricate CaP bimodal porous scaffolds [40]. Kim 

et al. utilized non‐solvent induced phase separation (NIPS)‐based plotting method to fabricate 3D 

polycaprolactone  (PCL)/hydroxyapatite  scaffolds  with  macroscale  pores  generated  from  the 

printing design and microscale pores generated from solvent exchange [37]. However, in these 

methods, the pore size was not easily controlled and in the lastest method, it relies on the usage 

of toxic solvent. One might conclude the fundamental effects of microscale porosity on tissue 

formation have not been well characterized.  

Our group has extensive experience in fabricating a wide range of scaffolds using ABM 

[187, 199‐201]. By combining ABM with porogen leaching, we were able to produce macroscale 

porous  scaffolds having  intra‐strut microscale pores with controllable pore sizes  [41, 202].  In 

current study, we hypothesized that the intra‐strut microscale porosity with increased surface 

  Page 113 

  Page 113 

areas  would  enhance  protein  adsorption  and  stimulate  cellular  attachment,  hematoma 

formation and ultimately bone  regeneration. Hematoma  formation  is  the  first  step  following 

implantation and has been recognized as an  important process which guides the subsequent 

tissue regeneration [25‐27]. Hematomas contain a fibrin network, inflammatory cells and growth 

factors (such as platelet‐derived growth factor AB (PDGF‐AB) and transforming growth factor‐β 

(TGF‐β))  with  angiogenic  and  osteogenic  potentials  that  ultimately  accelerate  bone  healing 

process [25, 203, 204]. The importance of the of macro‐ and micro‐scale porosity in hematoma 

formation  and  stabilization  has  been  only  recently  discussed,  but  the  feature  of  having  the 

combined interplay of macro and micro porosity has not been addressed [26, 205]. In this study, 

we manufactured bimodal porous scaffolds  from medical grade polycaprolactone  (mPCL) – a 

material that has been successfully used to develop a number of FDA‐approved medical devices 

[206]  and  investigated  their  physicochemical  properties,  the  effects  on  in  vitro  protein 

adsorption, cellular functions, hematoma formation and eventually in vivo bone regeneration.  

5.3 MATERIALS AND METHODS 

5.3.1 Preparation and characterization of the porogen, mPCL films and mPCL‐porogen films 

Microscale porogen was ground from Dulbecco A’s phosphate buffered saline tablets 

(PBS, OXOID, UK) and sieved to obtain particles smaller than 38 µm. The porogen was mixed with 

medical  grade  polycaprolactone  pellets  (mPCL,  PURASORB®  PC12,  Purac  Biomaterials, 

Netherlands) in chloroform (mPCL 20%w/v) according to the weight ratios shown in table 3. The 

mPCL  concentration  was  chosen  based  on  our  pilot  study  to  achieve  the  viscosity  that  can 

maintain the porogen in the suspension. The mixtures were stirred for 1 hour on a hot plate with 

the  temperature  set  at  100oC,  cast  onto  glass  surfaces  and  left  in  a  fume  hood  for  solvent 

evaporation  overnight  at  room  temperature  (RT).  The  solvent‐cast  films  (approximately  50  ‐

150µm thick) were collected stored in a low humidity cabinet at RT for further use. 

Table 3. Porogen concentration in mixture with mPCL to make scaffolds. 

  Page 114 

  Page 114 

Group  Description  porogen  concentration 

(%w/w) in the mixture 

nmPCL  nonporous mPCL scaffold   0 

pmPCL17  Bimodal  porous  mPCL  scaffolds  prepared  from 

mixture having 17% porogen  

17 

pmPCL44  Bimodal  porous  mPCL  scaffolds  prepared  from 

mixture having 44% porogen  

44 

 

Volume‐average size class of porogen was measured using a Malvern Mastersizer 3000  

laser light scattering unit (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK) by dispersing the porogen in 

100% ethanol and sonicating for 5 minutes prior to measurement at 25°C.  

The influence of porogen on the viscoelasticity and printability of mPCL‐porogen film was 

investigated by amplitude sweep and temperature sweep rheological measurements using an 

Anton Parr M302 Rheometer  (Anton  Paar USA  Inc.,  Virginia, US)  equipped with  a  cylindrical 

parallel  plate  geometry having 25‐mm diameter plate and 1 mm gap.  The  linear  viscoelastic 

regions in amplitude sweep tests were measured by melting samples at 110°C for 5 minutes and 

increasing the shear strain from 0.01% to 150% with a constant angular speed of 10 rad/second. 

The  viscoelastic  behaviors  of  materials  in  temperature  sweep  tests  were  determined  by 

maintaining an angular speed of 10 rad/second and a shear strain of 1%, melting samples at 

125°C,  then  gradually  decreasing  at  5°C  steps  and  equilibrating  for  5 minutes  prior  to  each 

measurement until reaching the final temperature of 40°C.  Graphs of storage (G') and loss (G'') 

moduli and loss tangent (tan δ) were plotted for interpretation and analysis.  

5.3.2 Fabrication and characterization of mPCL scaffolds 

mPCL scaffolds were fabricated using an in‐house built 3D printer as described elsewhere 

[187]. Briefly, mPCL pellets or mPCL‐porogen films were melted at 100‐110°C for 30 minutes and 

then extruded through a metal nozzle (gauge 22) with 0/90° laydown pattern, size of 40x40x1.5 

  Page 115 

  Page 115 

mm3 and strut‐to‐strut distance of 1 mm. The porogen (in pmPCL17 and pmPCL44) was leached 

out over 14 days in NaOH 0.01M at 37°C under shaking condition. Nonporous scaffolds (nmPCL) 

were also treated under the same condition. The theoretical macroscale porosity generated from 

the printing setting was calculated by the following equation:   

𝑃𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑡𝑦 % 𝑉 𝑉𝑠𝑡𝑟𝑢𝑡

𝑉∗ 100 

Where  V  is  the  overall  volume  of  scaffolds  and  Vstrut  is  the  total  volume  of  struts 

measured from diameter, length and number of struts. 

For protein adsorption, blood clot experiment, cell culture and in vivo study, a positive 

control group (a well studied calcium‐phosphate coated scaffolds (nmPCL/CaP) [207‐210]), was 

used for benchmarking against the experimental group. CaP coating was performed as described 

by Vaquette et al. [156]. Briefly, the scaffolds were immersed in 70% ethanol under vacuum for 

10 minutes and then treated with 2M NaOH at 37oC for 5 minutes under vacuum. After that, the 

scaffolds were rinsed with ultrapure water and immersed in highly saturated simulated body fluid 

(SBF 10x) pH 6, vacuum treated for 5 minutes and placed in water bath at 37oC for 30 minutes. 

Finally, the scaffolds were rinsed with ultrapure water, treated with 0.5M NaOH at 37oC for 30 

minutes and washed with ultrapure water. 

Surface  and  cross‐section  morphology  of  mPCL  struts  were  analyzed  by  fracturing 

scaffolds in liquid nitrogen, gold coating using a Leica EM SCD005 gold coater (Leica Microsystems 

GmbH, Wetzlar, Germany) and imaging using a scanning electron microscope (SEM, Zeiss FESEM, 

Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) combined with energy‐dispersive X‐ray spectroscopy (EDX). 

Porogen residues were detected by EDX analysis at an accelerating voltage of 10 kV. Additionally, 

to  quantify  unleached  porogen  residues,  the mPCL  component  of  the  leached  scaffolds was 

dissolved in chloroform (1%w/v) and the porogen/chloroform suspensions were quantified via 

turbidity  measurement  at  600  nm  using  a  Beckman  Coulter  DU  800  spectrophotometer 

(Beckman Coulter Inc., California, US).  

  Page 116 

  Page 116 

5.3.3 Physicochemical characterization 

The  porosity  of  scaffolds  was  characterized  using  SEM  (see  section  2.2)  and micro‐

computed tomography (‐CT). X‐rays were generated by a GE‐Phoenix xs 180 nf micro‐focus X‐

ray source (General Electric, Massachusetts, US) and radiographs were captured on a 3000x3000 

silicon flat panel detector. X‐ray tube settings were 80 kV, 110 μA and 2.2 μm in voxel size. The 

reconstruction was undertaken using a helical cone‐bean filtered back projection method. The 

intra‐strut  microscale  porosity  of  microscale  porous  scaffolds  was measured  based  on  their 

masses and dimensions. mPCL struts were cut  into small  specimens  in order  to measure  the 

length, radius and mass. The porosity of samples was calculated using the following equation:  

𝑝𝑜𝑟𝑜𝑠𝑖𝑡𝑦 % 𝜋𝑟 𝑙

𝑚𝑑

𝜋𝑟 𝑙 100 

where r, l and m are the radius, length and mass of strut, respectively, and d is the density 

of PCL (1.145g/cm3). 

The surface areas of nonporous (nmPCL) and microscale porous scaffolds (pmPCL17 and 

pmPCL44)  were  measured  using  a  Micromeritics  ASAP  2020  accelerated  surface  area  and 

porosimetry system (Micromeritics, Georgia, US) and the data was analyzed following Brunanuer, 

Emmett and Teller (BET) adsorption isotherm equation as described elsewhere [211, 212]. 

To  analyze  the  surface  roughness,  strut  surfaces  were  scanned  by  an  atomic  force 

microscope NT‐MDT Solver SPM apparatus (NT‐MDT Spectrum Instruments, Moscow, Russia) 

equipped with uncoated Ted Pella Tap300‐G cantilevers (Ted Pella Inc., US) [138].  

The  crystallinity  was  measured  using  differential  scanning  calorimetry  (DSC).  The 

temperature was changed from ‐60 to 100oC at a rate of 10oC/minute to determine the melting 

enthalpy.  The  crystallinity  was  calculated  by  comparison  with  the  heat  of  fusion  of    100% 

crystalline PCL of 139.5 J/g [213]. 

Wettability of both groups was evaluated using contact angle measurement. For this 

experiment,  samples were prepared  as  films  to  eliminate  the  effects  of  architecture.  Briefly, 

solvent cast nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 films were cut into specimens of 1x1 cm2, placed on 

  Page 117 

  Page 117 

glass slides and melted at 110oC for 3‐5 minutes,  immersed  in NaOH 0.01 M for 14 days for 

leaching, washed with ultrapure water and dried prior to measurement. Images of contact angle 

measurement were recorded and analyzed using First Ten Angstroms FTA 200 analyzer (First Ten 

Angstroms Inc., Virginia, US). A volume of 20 µL ultrapure water was dropped on the surface of 

samples and the contact angle was measured after 5 seconds. 

To determine the density of negatively charged groups, Toluidine Blue O (TBO) assay 

(Sigma‐Aldrich, US) was performed [214‐217]. Specimens of 5x5 mm2 were prepared and placed 

separately into Eppendorf tubes containing 2 mL of TBO solution (2 mM in NaCl 0.015 M, pH 11). 

After  a  5‐minute  sonication  treatment,  samples were  kept  at  RT  for  2  hours  under  shaking 

conditions to facilitate the solution penetration into the pores. TBO solutions were removed and 

samples were washed by immersing in NaCl 0.015 M, pH 11 and agitating for 4 hours. Then, the 

samples  were  transferred  into  Eppendorf  tubes  containing  70%  acetic  acid,  sonicated  for  5 

minutes and agitated  for  1  hour  at  RT.  The  solutions were  then  collected  for measuring  the 

absorbance  at  wavelength  556  nm  using  a  Bio‐Rad  xMark™  microplate  absorbance 

spectrophotometer  (Bio‐Rad, California, US).  TBO standard  curve was used  to determine  the 

amount of TBO attached on scaffolds, which correspond to the amount of surface negatively 

charged groups. 

5.3.4 Tensile strength characterization 

To determine the effect of the microscale porous structure on the mechanical behavior, 

the  tensile  properties  of  single  struts  were  studied[218].  Since  the  mechanical  behavior  of 

materials  is  different  under  dry  and  wet  conditions,  PBS  solution  was  used  to  create  an 

environment  similar  to body  fluid. The specimens were mounted vertically onto MicroTester 

5848 instrument (Instron Ltd., High Wycombe, UK) equipped with 500 N load cell to have a 12.5‐

mm gap between the top and bottom grips, saturated with 37oC PBS solution for 1 minute and 

elongated at a rate of 1 mm/s for 30 mm for analysis. 

  Page 118 

  Page 118 

5.3.5 Accelerated degradation 

Accelerated degradation studies were performed as previously reported for macroscale 

mPCL scaffolds [219‐221]. Samples were placed in NaOH 2M solution and incubated at 37oC in 

shaking  incubator at 200 rpm. At each time point, the samples were taken out, washed with 

ultrapure water and dried in vacuum at 37oC overnight before weighing and imaging by SEM (as 

described in section 2.2). 

The crystallinity of samples after degradation was evaluated by DSC (as defined in section 

2.3) and Fourier‐transform infrared spectroscopy (FT‐IR). FT‐IR spectra of mPCL scaffolds were 

collected by measuring at the setting of scan number of 64 and step of 1cm‐1 over a wave number 

range from 400 to 4000 cm‐1 by Nicolet FTIR spectrophotometer (Nicolet Analytical Instruments, 

Madison, WI, US). Ratios of the area under the peaks at wavenumber 1720cm‐1/1734cm‐1 were 

recorded as the crystalline/amorphous ratios. 

Gel  permeation  chromatography  (GPC)  was  used  to  measure  the  Number‐average 

molecular  weight  (Mn),  Weight‐average  molecular  weight  (Mw)  and  Polydispersity  of  the 

degraded  samples  [219].  The  analyses  were  performed  on  Waters  gel  permeation 

chromatography system equipped with Waters 1515 Isocratic HPLC Pump, Waters 2707 auto‐

sampler with a 100 µL  injection  loop, a  column heater and a Waters 2487 Dual Absorbance 

Detector  (λ=254  nm)  in  series  with  a  Waters  2414  refractive  index  detector  (Waters, 

Massachusetts, US). Three Phenomenex phenogel columns installed in series (in order 104 Å, 103 

Å and 50 Å pore size) and preceded by a Waters guard column, operating at 30°C and using 

tetrahydrofuran as  eluent  at  a  flow  rate of  1 mL/min.  Sample  injections  comprised of 10 µL 

solution (2.5mg/mL in THF and filtered through 0.22 µm PTFE filters) and molecular weights were 

calculated relative to polystyrene standards. 

5.3.6 In vitro hematoma model 

Heparinized human whole blood sample was kindly provided by Red Cross Blood Bank 

(Brisbane, Australia). The tests were performed following the approval from the Human Ethics 

  Page 119 

  Page 119 

Committee  of  the  Queensland  University  of  Technology  (Human  Ethics  Approval  number 

1400000023). Scaffolds were cut in 6 mm in diameter, pre‐weighed and sterilized by immersing 

in 70% ethanol for 1 hour and dried under sterile condition. The blood sample was pre‐mixed 

with CaCl2  (1080 mg/L, Unilab, Ajax Finechem, Australia) and  thrombin  (200 g/mL, Banksia 

Scientific Company, Australia). Then, a volume of 100 L of pre‐mixed blood was added to each 

2 mL Eppendorf tube containing the sample and incubated at 37oC for 2 hours to achieve fully 

clotted blood [222]. Finally, samples were fixed in 4% glutaraldehyde overnight. The fixed samples 

were  dehydrated  using  a  series  of  ethanol  (50%,  70%,  90%,  100%  for  1  hour  each),  and 

hexamethyldisilazane (HMDS) for 1 hour, weighed and gold coated for SEM imaging.  

Growth factor release from hematoma lysis: The influences of different scaffolds on the 

secretion of platelet‐derived  growth  factor‐AB  (PDGF‐AB)  and  transforming  growth  factor‐β1 

(TGF‐β1) from the hematoma were evaluated by ELISA. The samples containing hematoma were 

immersed  in  ACK  Lysis  Buffer  for  24  hours  at  37oC.  Then  the  solutions  were  collected  and 

centrifuged at 1000g  for 15 minutes. Afterward, quantitative measurements of PDGF‐AB and 

TGF‐β1 in supernatants were performed according to the manufacturer’s instructions using ELISA 

kits for PDGF‐AB (ab100623, Abcam®, Australia) and TGF‐β1 (ab100647, Abcam®, Australia).  

5.3.7 Cell culture study   

To explore the influence of the released growth factors from the clots on osteoblast’s 

growth, a metabolic activity assay was performed. Newborn mouse calvaria‐derived MC3T3‐E1 

subclone 14 pre‐osteoblasts were sourced from the Shanghai Cell Bank of the Chinese Academy 

of Sciences. Cells were expanded in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM; Gibco®, Life 

Technologies  Pty  Ltd.,  Australia)  supplemented  with  10%  fetal  bovine  serum  (FBS; In 

Vitro Technologies,  Australia)  and  1%  penicillin/streptomycin  (50  U/ml  and  50 μg/ml;  P/S; 

Gibco®). The cells were seeded  in 24–well plate with a density of 2 × 104 cells/cm2. After 24 

hours, the medium was replaced with the medium containing the blot clot exudate at a 9:1 ratio 

(900  μL  fresh  medium  and  100 μL  exudate).  Afterward,  the  metabolic  activity  of  cells  was 

  Page 120 

  Page 120 

evaluated at day 1 and 3 by MTT [3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyl tetrazolium bromide] 

assay (R&D Systems). In brief, the medium was removed, the cells were washed with PBS, then 

500 μL of  0.5 mg/mL of MTT/DMEM solution was added  into each well. After  4 hours, MTT‐

DMEM solution was carefully removed and 300 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO, Univar USA) was 

added  to  dissolve  formazan  crystals.  The  absorbance was  then  read  at  570 nm  in  100 μL  in 

triplicate using a microplate spectrophotometer [223]. 

5.3.8 Protein adsorption 

The  protein  adsorption  onto  of  mPCL  scaffolds  was  evaluated  using  bovine  serum 

albumin (BSA) as a model protein according to published protocols [224]. Samples were cut into 

specimens of 6 mm in diameter weighted and pre‐wetted by immersion in 100% ethanol for 1 

hour; subsequently, the samples were immersed twice in a 1x PBS solution for 30 minutes under 

vacuum condition and finally incubated in PBS at 37oC overnight. Each scaffold was placed in a 2‐

mL Eppendorf tube containing 200 µL of BSA solution (100 µg/mL in PBS) and incubated for 4 

hours under shaking conditions at 37oC for protein adsorption. Scaffolds were then washed with 

PBS to remove any non‐adsorbed proteins and placed in the tubes containing 400 µL of sodium 

dodecyl sulfate 5% w/v for 2 hours under shaking conditions at 37oC to recover the adsorbed 

proteins. The amounts of proteins were measured using Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo 

Fisher, US) according to the manufacturer's protocol. 

5.3.9 Cell proliferation  

Mouse pre‐osteoblast cells were expanded as mentioned in section 2.7. Their suspension 

was prepared at a density of 1x106 cell/mL and seeded on scaffolds with a density of 50000 

cell/scaffold. The cell seeded scaffolds were then incubated for 2 hours and then 1 mL of culture 

medium  was  added  into  each  well.  The  cell‐seeded  scaffolds  were  cultured  overnight  and 

transferred into new plates to be ready for cell proliferation characterization by Alamar Blue assay 

at days 1, 3 and 5. At each time point, the culture medium was removed, cells were washed with 

PBS and incubated with Alamar Blue 10% v/v in full culture medium (500 µL/well) for 4 hours. 

  Page 121 

  Page 121 

Their  fluorescence  intensity  was  measured  at  an  excitation  wavelength  of  544  nm  and  an 

emission  wavelength  of  590  nm  using  a  POLARstar  Optima  plate‐reader  (BMG  Labtech, 

Germany). The cells were rinsed with PBS and further cultured until the subsequent time point. 

The measurements were reported as cell percentage normalized to the control (nmPCL) on day 

1. 

5.3.10 In vivo study 

In vivo experiments were approved by the University Animal Ethics Committee (UAEC) 

of  Queensland  University  of  Technology  (Animal  Ethics  Approval  number:  1600000821). 

nmPCL/CaP and pmPCL44 scaffolds were sterilized by immersing in 70% ethanol for 30 minutes, 

dried out under sterile condition and UV‐irradiated for 20 minutes. Twelve Sprague Dawley male 

rats were sourced from the Animal Resources Centre, Canning Vale, WA, Australia. The calvarial 

defects were created as described elsewhere [156, 225]. The animals were anesthetized with 

isoflurane. The dorsal part of the cranium was shaved and disinfected with 50 mg/mL povidone‐

iodine (Betadine, Mundipharma BV, The Netherlands).  A sagittal incision was performed through 

the skin to expose the periosteum of the calvaria and the cranial vertex. After raising the full 

thickness periosteal flap, the circular osseous defects were created on the calvaria by means of a 

trephine bur (internal diameter of 5.0 mm) with copious isotonic solution (0.9% saline) irrigation. 

An 8 mm mPCL membrane was placed on top of the exposed dura mater in order to prevent soft 

tissue infiltration in the defect. A 5‐mm scaffold (nmPCL/CaP or pmPCL44) was placed into each 

defect. A thin electrospun mPCL membrane was used to cover the defect, stabilize the scaffolds 

and provide soft tissue occlusion. The wounds were closed in  layers using resorbable sutures 

(Vicryl  5.0  and 4.0,  Ethicon, Germany). After  8 weeks,  the  animals were  euthanized  and  the 

implants were retrieved, fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours at 4°C and placed in PBS at 

pH 7.4.  

‐CT scanning was used to evaluate new bone formation within the defect site. Samples 

were scanned at 55 kWp, 145 A, 8W and a voxel size of 30 µm using an ‐CT40 (Scanco Medical 

  Page 122 

  Page 122 

AG, Switzerland). The 3D reconstructed images of defects were generated by using ‐CT system 

software with a grayscale thread hold of 220.  

After ‐CT scanning, samples were decalcified in 5% formic acid at RT for 1 month prior 

to paraffin embedding. Samples were sectioned at a 5 m thickness, deparaffinized, and stained 

with hematoxylin‐eosin (H&E). To quantify the levels of new bone formation and stromal tissue 

areas, histomorphometric analyses were performed according to standard protocols using the 

Osteomeasure Analysis System (Osteometrics, Atlanta, GA, USA) on three representative tissue 

sections per animal, each was at least 10 sections apart from each other. 

For Immunohistological analysis, anti‐Collagen I antibody (Col I, ab34710, Abcam, UK), 

anti‐CD31  antibody  (CD31,  ab182981,  Abcam,  UK),  anti‐Alkaline  Phosphatase  antibody  (ALP, 

ab108337, Abcam, UK), anti‐Human von Willebrand Factor (vWF, IR52761‐2, Agilent, US) anti‐

CD163 antibody (CD163, ab182422, Abcam, UK), anti‐CD68 antibody (CD68, ab125212, Abcam, 

UK)  and  anti‐iNOS  antibody  (iNOS,  ab15323,  Abcam,  UK)  were  used.  The  sections  were 

deparaffinized in xylene, rehydrated through a series of ethanol (100%, 90% and 70%). The slides 

were then placed in antigen retrieval buffers (Tris‐sodium citrate pH 6 for Col I, ALP, CD163, CD68 

and iNOS; Tris‐EDTA pH 9 for CD31 and vWF) and heat treated in decloaking chamber at 95oC for 

5 minutes. Then,  the slides were  incubated with H2O2 for 5 minutes at RT, blocked with 2% 

bovine  serum albumin  (Sigma‐Aldrich, US)  at  RT  for  30 minutes  and  incubated with primary 

antibodies for 2 hours at RT (ALP – 1:500 dilution, Col I – 1:100 dilution, vWF and CD163 – 1:100 

dilution) or overnight at 4oC (CD31 – 1:500 dilution, CD68 – 1:100 dilution and  iNOS – 1:100 

dilution). Then,  the slides were  incubated with DAKO Envision+ Dual Link System HRP  for 45 

minutes. Lastly, the slides were incubated with DAKO liquid DAB+ substrate Chromogen for color 

development.  

5.3.11 Statistical analysis 

Data are expressed as mean ± standard error of mean (s.e.m). All in vitro experiments 

were performed with at least three replicates and repeated at least three times. The significant 

  Page 123 

  Page 123 

differences between groups were analyzed by one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test using 

SigmaPlot 13.0 software. The significant difference was recorded when p<0.05. 

5.4 RESULTS 

5.4.1 Scaffold manufacturing 

The  viscoelasticity  properties  of  the  mPCL‐porogen  composites  were  evaluated  to 

determine the impact of porogen concentrations on the ability of polymer melts to be extruded. 

Amplitude sweep results (Supplement data, Figure S10D, F and H) showed that both mPCL and 

composite materials maintained  the  linear  viscoelasticity  up  to  0.1%  shear  strain. mPCL  and 

pmPCL17 had higher viscosity (with tan (δ) values around 7.5 to 8.5) compared with pmPCL44 

(with tan (δ) values around 3). From 0 to 50% shear strain, while nmPCL maintained the linear 

viscoelasticity property, the viscoelasticity properties of composite materials gradually increased 

and  finally  reached  to  the same viscoelasticity  state observed for nmPCL. Overall,  the  results 

indicated  that  under  high  strain  (more  than  20%),  the  viscous  properties  of  the  composite 

materials can match those of mPCL. 

The effects of temperature on the rheological properties of the composite melts were 

also studied (Supplement data, Figure S10E, G and I). The increase in porogen contents, a low 

specific  heat  capacity  material[226,  227],  may  have  protected  the  mPCL  from  temperature 

changes, provided some  levels of thermal  insulation and decreased the thermal sensitivity of 

mPCL. All samples maintained their linear viscoelasticity from 25°C to 45oC. From 45°C to 130oC, 

the  rise  in  temperature  increased  the viscous modulus,  and  the viscoelasticity of  all  samples 

increased differently (Supplement data, Figure S10E and G). While in both nmPCL and pmPCL17, 

the  δ‐value  reached  c.a.  8,  pmPCL44  had  δ‐value  of  c.a.  4  (Supplement  data,  Figure  S10I). 

Composite materials with a δ ‐value above 1 indicating a fluid‐like behavior and were printable. 

  Page 124 

  Page 124 

5.4.2 Porogen leaching 

The completion of porogen leaching was confirmed by SEM imaging, EDX analysis and 

spectrophotometry. There was no visible porogen on the surfaces and in the cross sections of the 

scaffolds  as  confirmed  by  SEM  (Supplement  data,  Figure  S11A).  Only  pmPCL17  group  had 

porogen residuals (less than 2%w/w) (Supplement data, Figure S11 B, C and D). Collectively, the 

results showed that the leaching process was sufficient to remove the porogen from the scaffolds 

with 44% w/w porogen (pmPCL44). For scaffolds with lower porogen concentration (i.e., 17%), 

the amount of porogen was not high enough to allow for complete leaching. 

5.4.3 Physicochemical properties 

The  scaffolds were  designed  to  have macroscale  porosity  of  50%  ‐  60%, which was 

confirmed  based  on  the  dimensions  of  the  scaffolds  after  manufacturing.  Regarding  the 

microscale porosity, SEM micrographs showed remarkable differences in pore size and geometry 

on strut’s surface. (Figure 26A). Pores on the surface of nmPCL were identified as gaps between 

PCL spherulites; whereas, pores on the surface of pmPCL scaffolds also included the smaller pores 

from leaching of porogen near the surface. There were no significant differences in surface pore 

areas among all groups. In the bimodal porous groups, pmPCL44 scaffolds were showed to have 

bigger intra‐strut microscale pores and higher porosity when compared with pmPCL17 (Figure 

26B). There were no differences in surface roughness among all groups (Figure 26C). 

  Page 125 

  Page 125 

 

Figure 26.  The  increased porogen  concentration  resulted  in  the higher  intra‐strut microscale 

porosity,  surface  area  and  negatively  charged  group  density.  A  and  B:    Representative  SEM 

micrographs  of  strut’s  surface  and  cross‐section,  respectively.  C:  3D  reconstructed  AFM 

micrographs  of  strut’s  surface  with  their  root‐mean‐square  surface  roughness  (RMS).  D: 

Representative  µ‐CT  micrographs  of  scaffolds  with  their  pore  area.  E:  Intra‐strut  porosity 

(determined from µ‐CT scans), surface area (measured by gas adsorption), water contact angles 

  Page 126 

  Page 126 

and surface charged group density (measured through TBO assay). RMS was measured from AFM 

scans of 20x20‐µm2 areas on struts’ surface. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. **  is 

p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are 

nonporous mPCL scaffolds, bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 17% 

and 44% porogen, respectively. The scaffolds were extruded with the optimum flow rate and 

temperature to achieve the “superflow” extrusion state, create smooth and defect‐free struts 

[228]. As a result of the “superflow” state, only a small number of porogen was located at the 

surface  of  the  struts;  therefore,  the  surface  porosity  was  significantly  lower  than  intra‐strut 

porosity. 

 

The  intra‐strut  microscale  porosity  (measured  by  the  pore  area)  increased  from 

21.2±0.5% for pmPCL17 to 40.6±0.5% for pmPCL44 (mean ± s.e.m; n=6). The microscale pores 

had a relatively uniform distribution (Figure 26D). The presence of circular pores in nmPCL as well 

as in pmPCL17 and pmPCL44 was attributed to air entrapment during the extrusion of molten 

polymer.  The  amount  of  porogen  in  the  pmPCL17  was  not  sufficient  to  allow  the  porogen 

particles to be completely leached out (appearing as bright dots in the µ‐CT images; Figure 26D). 

The porosity of the experimental group was also calculated based on their mass, volume 

and density. The intra‐strut porosity increased from 10.7±0.7% for pmPCL17 to 35.2±1.4% for 

pmPCL44 (Figure 26E). Microscale pores also increased surface area approximately 3 folds from 

718±47 cm2/g (nmPCL) to 2457±36 cm2/g (pmPCL44) (mean ± s.e.m; n=6, Figure 26E).  

DSC analysis showed no significant differences in the crystallinity among all the groups 

(61.9±1.5%, 59.5±1.2% and 60.8±1.0% (mean ± s.e.m; n=6) for nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44, 

respectively). Static contact angle measurement showed that all groups had hydrophilic surface 

with contact angle of about 50o (Figure 26E). The  increase  in microscale porosity also  led  to 

significant  increase  in  the density of negatively  charged groups, 3.6±0.2, 5.0±0.3 and 7.9±0.2 

nmol/mg (mean ± s.e.m; n=6) for nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44, respectively (Figure 26E).  

  Page 127 

  Page 127 

5.4.4 Tensile strength  

Young’s modulus and ultimate tensile strength (UTS) were influenced by the intra‐strut 

microscale pores. Young modulus decreased from 357.5±31.6 to 276.2±30.1 and 261.6±23.8 MPa 

for nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44, respectively. The UTS decreased from 19.4±0.8 MPa (nmPCL) 

to 14.2±1.1 MPa (pmPCL17) and 7.4±0.4 MPa (pmPCL44) (mean ± s.e.m; n= 6, p<0.01, Table 2). 

Introduction of microscale porosity resulted in more flexible scaffolds, yet toughness decreased 

compared with the nonporous scaffolds (Table 4). 

Table 4. Ultimate tensile strength, Young's modulus, and elongation at break of single 

struts with different porosity. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ** is p<0.01 from one‐

way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are nonporous mPCL 

scaffolds, bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 17% and 44% porogen, 

respectively. 

  nmPCL  pmPCL17  pmPCL44 

Ultimate tensile strength (MPa)  19.4±0.8**  14.2±1.1**  7.4±0.4** 

Young’s modulus (MPa)  357.5±31.6  276.2±30.1  261.6±23.8 

Elongation at break (%)  >240**  24.4±0.2  36.0±8.9 

 

5.4.5 Microscale porosity accelerated degradation of mPCL scaffolds 

PCL is an aliphatic polyester, which has a fairly slow hydrolysis rate  [221]. Therefore, it 

was  expected  that microscale  porosity would  enhance  the  scaffold’s  degradation  process  of 

microscale porous scaffolds thanks to the increased surface area.  

SEM micrographs (Figure 27A‐B) showed stark differences in the degradation among all 

the groups. After 24 hours of degradation in the accelerated condition, in pmPCL44 group, both 

strut’s  surface and cross  sections showed evidence of degradation  (the  surface was  rougher, 

surface pores were widened and more  interconnected  intra‐strut pores formed); whereas,  in 

nmPCL and pmPCL17 groups, only the surface showed clear evidence of degradation (rougher 

  Page 128 

  Page 128 

surface). After 48 hours, pmPCL44 struts were thoroughly degraded and deformed; whereas, in 

nmPCL group, only the surface were significantly degradaded (Figure 27A‐B).  

 

Figure  27.  Microscale  porosity  accelerated  degradation  of  mPCL  scaffolds.  A  and  B: 

Representative SEM micrographs from cross‐section (A) and surface (B) of nmPCL, pmPCL17 and 

pmPCL44 at 0, 24 and 48 hours in the accelerated conditions. C, D and E: Mass loss percentage 

(C), crystallinity measured from DSC (D) and molecular weight measured from GPC (E) of scaffolds 

after 48 hours of degradation. nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, 

bimodal  porous  mPCL  scaffolds  prepared  from  mixture  having  17%  and  44%  porogen, 

respectively. All microscale porous scaffolds showed evidence of degradation after 24 hours both 

  Page 129 

  Page 129 

on  strut’s  surface  (rougher  and  enlarged  pores)  and  throughout  cross  section  (more  small 

interconnected  pores).  After  48  hours,  nmPCL  showed  only  surface  degradation;  whereas, 

pmPCL44 degraded throughout the strut’s cross section. Data are expressed as mean ± s.e.m; 

n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. 

 

The mass loss percentage showed that the microscale porous scaffolds degraded faster 

than the nonporous scaffolds (Figure 27C). After 48 hours, the mass loss percentage of 1.8±0.1%, 

19.8±1.1% and 66.8±3.7% (mean ± s.e.m; n=6) were found in nmPCL, pmPCL17 and pmPCL44, 

respectively. 

The mass loss was proportional with the increased crystallinity (Figure 27C and D). The 

mass loss of pmPCL44 increased sharply during 48 hours of degradation, and its crystallinity also 

significantly increased. The continuous bulk erosion of pmPCL44 led to the continuous increase 

in  the crystallinity of  the  remaining of pmPCL44 samples.  In  the nmPCL group,  there was no 

significant  change  in  the  scaffold mass  after  48  hours  of  degradation.  The  initial  increase  in 

crystallinity of nmPCL could be because of the degradation and removal of the less crystalline 

fraction on the surface. A small decrease in the crystallinity from 36 hours to 48 hours from 65% 

to 62% could be caused by bulk erosion on surface and at the deepened pores, which degraded 

and removed crystalline regions. The crystalline/amorphous ratios were calculated from FT‐IR 

data and confirmed  the  changes  in  crystallinity of pmPCL44 scaffolds during  the degradation 

process (Supplementary data, Figure S12A). 

To better understand the degradation process of the scaffolds, the molecular weights of 

nmPCL and pmPCL44 were determined by GPC. The number average molecular weight (Mn) of 

nmPCL scaffolds remained almost the same after 24h degradation (Figure 27E), which can be 

explained  as  the  degradation  of  nmPCL  scaffolds  occurred  on  the  surface  only  and  the 

degradation products were removed by rinsing of the scaffolds. However, there were significant 

decreases in Mn of all microscale porous groups (Figure 27E). The microscale porous groups had 

  Page 130 

  Page 130 

a higher surface area compared with nmPCL scaffolds and had both bulk and surface erosion; as 

a result, regions of both low and high Mn could be removed and long polymer chains could be 

readily hydrolyzed into shorter chains, leaving the remaining scaffolds with decreased Mn. 

In the remaining of the study, we used pmPCL44 scaffold and compared it with nmPCL 

scaffold. Since we aimed to evaluate the scaffolds for bone regeneration, we also included a new 

group which was nmPCL that had biomimetic calcium phosphate coating (CaP) as a reference 

(nmPCL/CaP). The CaP coating on polycaprolactone scaffolds and on other materials have been 

shown in the literature to significantly improve bone formation [210, 229, 230]. The surface areas 

of scaffolds are shown in Table 5. 

Table 5. Surface area of scaffolds measured by gas adsorption analysis. (data = mean ± 

s.e.m; n=3). *** is p < 0.001. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 are nonporous mPCL scaffolds, 

calcium phosphate coated nmPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from 

mixture having 44% porogen, respectively. 

Scaffold  nmPCL   nmPCL/CaP  pmPCL44 

Surface area (cm2/g)  718±47***  3642±82***  2457±36*** 

  

5.4.6 In vitro hematoma model  

SEM  analysis  showed  blood  cells  penetrated  into  the  intra‐strut microscale  pores  in 

pmPCL44 scaffolds; whereas, on nmPCL and nmPCL/CaP, the blood cells were remained only on 

the  surface  (Figure  28A  and  B).  Moreover,  fibrin  network  were  appeared  to  be  denser  on 

pmPCL44 and nmPCL/CaP than on nmPCL. There was no significant difference in the weight of 

hematomas which formed in all the groups (Figure 28C).  

  Page 131 

  Page 131 

 

Figure 28. In vitro blood clotting experiments. A and B: SEM micrographs of cross‐section (A) and 

surface (B) of hematoma encapsulated scaffolds. C: Wet weight of hematoma. D and E: TGF‐ß1 

(D) and PDGF AB (E) release from hematoma after 24 hours incubation in the culture medium. F: 

Cell proliferation results (MTT assay) of MC3T3‐E1 cultured with hematoma supernatant after 1 

and 3 days. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant, * is p<0.05 and ** is 

p<0.01, from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 

are nonporous mPCL scaffolds, calcium phosphate coated nmPCL scaffolds and bimodal porous 

mPCL scaffolds prepared from mixture having 44% porogen, respectively. 

The  microscale  porosity  significantly  influenced  the  growth  factor  releases  in  the 

hematoma experiments. Both nmPCL/CaP and pmPCL44 increased the release of TGF–ß1 and 

  Page 132 

  Page 132 

PDGF AB (Figure 28D and E). pmPCL44 significantly increased the release of TGF–ß1 compared 

with nmPCL. There was also a statistically non‐significant increase in the release of PDGF AB in 

pmPCL44 compared with nmPCL and nmPCL/CaP scaffolds (Figure 28E).  

The conditioned media containing the released growth factors from hematoma were 

used for cell culture experiments to  investigate their bioactivity on osteoblast precursor cells, 

MC3T3‐E1. Proliferation assay showed that supernatant from pmPCL44 significantly enhanced 

osteoblast cell growth after 1 day (Figure 3F). Cell growth in pmPCL44 at day 3 was also higher 

but not statistically significant than that in nmPCL/CaP (Figure 3F).  

5.4.7 Multiphasic scaffolds enhanced protein adsorption in vitro    

The interactions between scaffolds and proteins play important roles in cell behavior and 

tissue regeneration [231]. In this study, albumin was used as a model protein to study protein 

adsorption. pmPCL44 showed the highest amount of protein adsorption, followed by nmPCL/CaP 

and  then  nmPCL  (Figure  29A).  The  amount  of  protein  adsorbed  on  pmPCL44  was  1.8±0.1 

µg/scaffold; whereas,  those of nmPCL/CaP and nmPCL were 1.3±0.1 µg/scaffold and 0.5±0.3 

µg/scaffold, respectively. 

 

Figure 29. Increased protein adsorption on pmPCL44 was observed compared with nmPCL and 

nmPCL/CaP.  Metabolic  activities  of  MC3T3‐E1  cells  on  nmPCL,  nmPCL/CaP  and  pmPCL44 

scaffolds after 1, 3 and 5 days. Results were normalized to control scaffold (nmPCL) at day 1. Data 

are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant, * is p<0.05 and ** is p<0.01 from one‐

  Page 133 

  Page 133 

way ANOVA test and Tukey post hoc test. nmPCL, nmPCL/CaP and pmPCL44 are nonporous mPCL 

scaffolds,  calcium  phosphate  coated  nmPCL  scaffolds  and  bimodal  porous  mPCL  scaffolds 

prepared from mixture having 44% porogen, respectively. 

 

5.4.8 Multiphasic scaffolds had better support for cell proliferation in vitro 

The ability of  scaffolds  to  support  cell  attachment and proliferation was assessed by 

seeding mouse pre‐osteoblast cells on scaffolds and performing Alamar Blue metabolic activity 

assay at days 1, 3 and 5 to characterize the cell viability. pmPCL44 scaffolds significantly increased 

the cell attachment compared with nmPCL and nmPCL/CaP, this was indicated by the increased 

metabolic activity at day 1 (Figure 29B). After 3 and 5 days, the cells cultured on pmPCL44 still 

had the highest metabolic activity compared with the cells on nmPCL and nmPCL/CaP. 

5.4.9 In vivo study 

From the results of the in vitro experiments, pmPCL44 and nmPCL/CaP were selected to 

evaluate their regenerative potential in a rat critical size calvarial defect model. Both nmPCL/CaP 

and pmPCL44 supported new bone formation into the scaffolds at similar levels (8.7±1.8 mm3 

for nmPCL/CaP and 10.7±2.4 mm3 for pmPCL44, n=6; p=0.520).  Figure 30B, left column showed 

the position of scaffolds (labeled s) in the calvarial defects (black box sandwiched between the 

skin‐side and dura‐side membranes (labeled sm and dm, respectively), and the formation of new 

bone  tissue  (labeled  nb)  next  to  old  bone  (labeled  ob)  inside  the  nmPCL/CaP  and  pmPCL44 

scaffolds. At high magnification (Figure 30B, middle column), significant new bone formation in 

the periphery and center of the defect in both nmPCL/CaP and pmPCL44 was observed. Due to 

the presence of intra‐strut microscale pores, pmPCL44 demonstrated additional support for new 

bone formation, as infiltration of extracellular substances into the middle and at the boundary of 

the struts were observed only in pmPCL44 group (Figure 30B, right column, black arrows). 

  Page 134 

  Page 134 

 

Figure  30.  Bimodal  porous  scaffolds  had  a  similar  osteoconductivity  compared with  calcium 

phosphate coated scaffolds. A: µ‐CT‐based 3D reconstructed images of new bone formation at 

calvarial defects and their bone volume. nmPCL/CaP and pmPCL44 are calcium phosphate coated 

nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture having 

44%  porogen,  respectively.  B:  H&E  staining  at  calvarial  defects  (boxed)  of  nmPCL/CaP  and 

pmPCL44 with arrows showed microtissue  inside the pmPCL44 struts. ob: old bone; nb: new 

bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; and dm: dura‐side membrane; black arrow: infiltrated 

extracellular materials. C: Histomorphometrical analysis of bone area percentage and stroma 

  Page 135 

  Page 135 

tissue  area  percentage measured  from  scanned H&E  stained  slides  using  the Osteomeasure 

Analysis System. Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. ns is not significant from one‐way 

ANOVA test and Tukey post hoc test. 

The histomorphometrical  analysis was performed  to quantify  the  levels of bone and 

stroma tissue areas in the implantation site. The percentage of bone area in the defect showed a 

slight  increase  in  pmPCL44  group;  whereas,  the  percentage  of  stroma  tissue  area  in  the 

nmPCL/CaP was higher with no statistically significant difference (Figure 30C; n=6).    

IHC staining was used to validate the presence of new bone formation in the defect area. 

In both nmPCL/CaP and pmPCL44 groups, the IHC analyses confirmed bone‐like tissue formation 

next to the struts (Figure 31). The new bone formation was confirmed by positive staining for  ALP 

and Col‐I markers (Figure 31). Both nmPCL/CaP and pmPCL44 groups demonstrated similar levels 

of ALP and Col‐I expression. These data suggest that the stromal tissue was being remodelled in 

the process of bone regeneration.  

  Page 136 

  Page 136 

 

Figure 31. Validation of new bone formation via immunohistological staining with osteoblast key 

markers, ALP (A) and Col I (B) at week 8 after scaffold implantation. Nonporous medical grade 

polycaprolactone ( nmPCL/CaP) and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL 

scaffolds  and  bimodal  porous  mPCL  scaffolds  prepared  from  mixture  having  44%  porogen, 

respectively. Both nmPCL/CaP and pmPCL44 groups demonstrated similar levels of ALP and Col I 

expression. ob: old bone; nb: new bone; s: scaffold; sm: skin‐side membrane; and dm: dura‐side 

membrane. 

 

  Page 137 

  Page 137 

Furthermore, IHC was also used to confirm vascularization throughout the scaffolds at 

the defects (Figure 32). The vascularization was observed at the interphase of scaffolds and the 

membranes  as well  as  in  the  stroma and new bone areas, which was  confirmed by positive 

staining for CD31 and vWF markers (key endothelial cell markers).  

 

 

Figure 32. Confirmation of blood vessel formation via immunohistological staining for CD31 (A) 

and vWF  (B)  at 8 weeks after  scaffold  implantation  in  rat  critical  size  calvarial defect model. 

  Page 138 

  Page 138 

nmPCL/CaP and pmPCL44 are calcium phosphate coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal 

porous mPCL  scaffolds  prepared  from mixture  having  44%  porogen,  respectively.  The  blood 

vessel formation was confirmed by positive staining for CD31 and vWF as indicated with brown 

color.  ob:  old  bone;  nb:  new  bone;  s:  scaffold;  sm:  skin‐side  membrane;  dm:  dura‐side 

membrane; and black arrows: blood vessel. 

The effect of intra‐strut microscale porosity on inflammatory responses was evaluated 

by immunostaining for macrophages (Figure 33). In both nmPCL/CaP and pmPCL44 groups, the 

macrophages infiltrated into the macroscale pores of scaffolds, as indicated by the presence of 

CD68+ cells. There was a similar level of macrophage infiltration into the defect areas in both 

nmPCL/CaP and pmPCL44 scaffolds (Figure 33A and B). The macrophages mainly distributed in 

the stroma and in the space between the membranes and the defects. The number of CD68+ 

cells  (macrophages)  in  the bone area was  limited.  Further  staining  for M1  (iNOS+  cells;  pro‐

inflammatory)  and  M2  (CD163+  cells;  pro‐remodeling)  macrophages  showed  there  was 

significantly higher M2 macrophages at the defect sites, indicating the bone regeneration process 

were occurring [232, 233]. The presence of M1 macrophage in a small quantity compared with 

M2 macrophage demonstrated low level of inflammation in the defect sites. 

  Page 139 

  Page 139 

 

Figure 33.  Immunohistological staining showed the presence of M1 macrophages (CD68+ and 

iNOS+) much less than M2 macrophages (CD68+ and CD163+) within the defect areas in both 

nmPCL/CaP  (A)  and  pmPCL44  (B)  groups.  nmPCL/CaP  and  pmPCL44  are  calcium  phosphate 

coated nonporous mPCL scaffolds and bimodal porous mPCL scaffolds prepared from mixture 

having  44%  porogen,  respectively.    ob:  old  bone;  nb:  new  bone;  s:  scaffold;  sm:  skin‐side 

membrane;  and  dm:  dura‐side  membrane.  Black  arrows  demonstrate  positive  cells  (brown 

color). 

5.5 DISCUSSION 

Macroscale  porosity  is  as  a  critical  factor  in  the  scaffold  guided  tissue  formation  to 

achieve sufficient vascularization and tissue remodeling [24, 234, 235]. Moreover, the essential 

role  of  microscale  porosity  in  enhancing  protein  adsorption,  hematoma  formation,  cellular 

attachment  and  cell  infiltration  has  been  recently  recognized  [236‐238].  The  microporous 

environment supports the infusion of nutrients and oxygen and diffusion of waste products, cell 

  Page 140 

  Page 140 

migration. It also increases surface area, which increases cell – material interaction [239]. The 

increase in surface area from microporous structure also leads to more protein adsorption, which 

increases bone‐related cell proliferation and calcium deposition [236, 240]; the capillary force 

generated from that structure enhanced the migration of bone related cells [236]. However, the 

contribution of macroscale and microscale porosity in a single scaffold on cellular behaviour and 

tissue regeneration has not been well characterized. In this study, we used a combination of ABM 

and porogen leaching techniques to obtain bimodal macro‐, micro‐ porous scaffolds.  

Specifically, we extruded a mixture of mPCL and porogen (phosphate salt microparticles), 

which were then leached out to create intra‐strut microscale pores. During the extrusion process, 

the polymer melt flow instability occurred because of the difference in local stress concentration 

between the material at the core and the material near the nozzle and the stick‐slip condition 

when the extrudate existed from the nozzle, which resulted  in surface distortions  i.e. surface 

roughness (non‐periodic distortion) and “sharkskin” effect – periodic small‐amplitude distortion 

[228]. To eliminate the distortion, we increased the flow rate of the extrudate to achieve the 

“superflow” state and matching the flow rate with the speed of the collecting board to achieve 

defect‐free struts. When extruded, the scaffolds were immersed to leach out the porogen and 

create microscale pores. 

The  increase  in  the  surface  area,  contributed  by  the  intra‐strut  microscale  porous 

network,  significantly  accelerated  the  degradation  of  microscale  porous  scaffolds.  While 

conventional macro‐scale porous scaffolds (nmPCL) slowly degraded from the surface toward the 

inner  structure, microscale  porous  scaffolds were  degraded  throughout  the  thickness  of  the 

struts.  Because  PCL  has  a  relatively  slow degradation  (approximately  2‐4  years  for  complete 

degradation  in  vivo  depending  on  the  molecular  weight  and  implant  volume  [189]),  the 

introduction of intra‐strut microscale pores can be utilized to achieve a faster degradation [241‐

243].   

  Page 141 

  Page 141 

It  is well established  that blood clotting  (hematomas)  is an  important step  triggering 

tissue regeneration [203, 244, 245]. In the case of bone, the hematomas induce the infiltration of 

inflammatory cells and release of key cytokines such as TGF–ß1 and PDGF–AB [244]. The release 

of cytokines from the initial hematoma induces cell migration and regulates the tissue hemostasis 

[246].  Subsequently,  the  released  cytokines  stimulate  the proliferation  and differentiation of 

osteoblasts,  induce matrix  proteins  synthesis  and  inhibit  bone  resorption by  suppressing  the 

osteoclast  precursor  activities  resorption  [247].  In  our  study,  scaffolds  with  dual  porosity 

(pmPCL44) showed a higher growth factor release from the hematoma, which was found to be 

correlated with the increase in the proliferation of osteoblast progenitor cells. Our results are in 

agreement with previous reports showing microscale porosity could enhance the entrapment 

and release of growth factors, such as TGF–ß1 and rhBMP‐2 [248, 249]. The increase in growth 

factor release in pmPCL44 despite the similarity in blood clot weights can be attributed to the 

entrapment of blood cells within the microscale pores. In this study, only PDGF AB and TGF‐ ß1 

were measured; however, the contribution of other growth factors on the results needs to be 

investigated [250, 251]. 

The  increase  in  surface  roughness  generated  from  different  fabrication  processes 

increases surface area for protein – material and cell – material interactions. The difference in 

surface roughness (pattern, level of roughness) can lead to the enhancement of different types 

of cells [240, 252]. In this study, regarding protein – polymer interaction, albumin was used as a 

protein  model.  The  adsorption  mechanism  between  protein  and  polymer  was  thanks  the 

wettability  of  the  polymer  and  non‐specific  to  any  particular  protein;  therefore,  the  level  of 

albumin adsorption could represent the level of proteins, which have similar hydrophilicity to 

albumin, adsorb to the scaffolds. It was proven that level of albumin adsorbed on the scaffolds 

was  directly  proportional  to  the  level  of  mouse‐calvaria‐derived  pre‐osteoblastic  cells 

proliferation and calcium deposition [240]. The fact that protein adsorbed more on pmPCL44 

than calcium phosphate coated scaffolds (nmPCL/CaP) despite the latter had higher surface area 

  Page 142 

  Page 142 

can be attributed to the intra‐strut microscale pore architecture in pmPCL44 group which could 

entrap  more  protein  solution  through  capillary  actions.  In  fact,  microscale  pores  and  their 

associated capillary forces have been found to result in higher cell adhesion, attachment strength, 

proteins adsorption and cell penetration [231, 236, 253].  

We  further  implanted  pmPCL44  scaffolds  in  a  rat  critical  size  calvarial  defect  to 

investigate the bone regeneration potential in vivo. As a reference group, we used biomimetic 

CaP‐ coated mPCL scaffold. Previous work from our group and others demonstrated that the CaP 

coatings significantly increased the tissue mineralization and new bone formation [210, 225].  

The rat critical size calvarial defect model has been successfully used by our group and 

others to specifically investigate the new bone formation from native bone toward the scaffolds 

[254‐258].  In our study, we  further utilized the occlusive electro‐spun membranes  (minimum 

pore size of less than 1 µm) [259] [260]  at the top and bottom of the defects (containing the 

scaffolds) to minimize penetration of cells from the dura and skin and maintain space for bone 

formation.  

After 8 weeks of implantation, the μ‐CT results showed ossification occurred from the 

defect’s edge toward the center of the defect suggesting the new bone tissues were originated 

from the host bone and not from mesenchymal precursor cells present in the dura. This result 

illustrate the use of occlusive membranes to highly control and evaluate osteoconductivity of the 

scaffolds  in skull defect model. Both nmPCL/CaP and pmPCL44 had similar osteoconductivity, 

which was demonstrated by a similar level of bone formation. IHC staining showed a low level of 

macrophages in both groups. M1 macrophages, which are associated with inflammation, were 

found to be in much lower numbers than M2 macrophages in the defect area. M2 macrophages 

are an indicator that regeneration was occurring in the defect region [232, 233]. Additionally, H&E 

staining  revealed  extracellular  matrix  (ECM)  materials  infiltrated  into  the  microscale  pores 

supposedly  through  the  capillary  forces  from  the  pores.  We  suggest  that  this  ECM  could 

  Page 143 

  Page 143 

contribute to tissue formation by the entrapment and subsequent release of signaling molecules 

[261].  

The manufacturing parameters in this study, such as the porogen size, concentration and 

strut diameter, were chosen based on our pilot trials to achieve maximum porosity while the 

polymer‐porogen mixture can still be extruded. In this study, we used solvent to dissolve mPCL 

and mixed in porogen particles. We are moving toward using melt‐mixing methods to completely 

avoid toxic solvents  in the preparation of the composite material  for being used on the ABM 

platform.  It  is  envisioned  that  scaffold  macroscale  pore  designs  (e.g.,  pore  size  and  pore 

architecture) and microscale pore sizes could be further optimized to enhance in vivo hematoma 

formation and stabilization, blood vessel penetration, and ultimately in vivo tissue formation and 

remodelling.  

5.6 CONCLUSION 

This  study  aimed  to  investigate  the  application  of  3D  printed  scaffolds  with  dual 

macro/microscale porosity for bone tissue regeneration. The combination of screw‐driven melt 

extrusion with porogen leaching technique was employed to manufacture mPCL scaffolds with 

dual macro‐, microscale porosity. These new scaffolds showed higher surface area and surface 

negatively  charged  groups  compared  with  scaffolds  having  only  macroscale  porosity.  The 

scaffolds also enhanced blood clot formation and cell attachment in vitro. In vivo experiments 

showed  pmPCL44  scaffolds  had  a  similar  level  of  osteoconductivity  and  bone  formation 

compared with the scaffolds having biomimetic calcium phosphate coating.  

 

   

  Page 144 

  Page 144 

6Chapter 6: Conclusion and future directions 

6.1 CONCLUSION 

This  thesis presents  the  fabrication and characterisation of a new type of 3D‐printed 

scaffold with bimodal porosity to be used as a dual‐function device for tissue reconstruction and 

local drug delivery. The main conclusions are summarized below. 

At  the outset,  the method of  fabricating bimodal porous  scaffolds was  introduced  in 

Chapter 2. The scaffolds were prepared by using an SME system to build the scaffolds with a 

designed  lay‐down  pattern.  Porogen  was  leached  from  the  extruded  scaffolds  to  create 

microscale pores. The microscale pores increased the drug loading capacity by providing more 

surface  area  for  drug  attachment.  The  scaffolds  demonstrated  a  reduced  burst  release  and 

prolonged  release  profile  of  cefazolin  when  combined  with  GelMA  coating  compared  with 

GelMA‐coated solid‐strut scaffolds. Last, the antimicrobial property of cefazolin‐loaded scaffolds 

was also demonstrated in vitro. 

In Chapter 3, the application of bimodal porous scaffolds for drug delivery was further 

characterized. The ionic bonding interaction of DOX was previously shown by Jassal et al. [217] 

and Niza et al. [262]. The slow diffusion rate of PTX due to its hydrophobic property was shown 

by Innocente et al. [263] and Zhu et al. [264]. The fast diffusion rate of highly hydrophilic CEF 

resulting fast release was shown by Mutsuzaki et al. [91] and Rath et al. [265]. Positively charged 

hydrophilic drug (DOX) had more interaction with pmPCL scaffolds, resulting in a reduced burst 

release  and  sustained  release  profile.  Non‐charged  hydrophobic  drug  (PTX)  also  showed  a 

sustained  release  profile  because  of  the  hydrophobic  property  of  PTX.  For  non‐charged 

hydrophilic drug (CEF), the burst release was reduced compared with the solid‐strut scaffolds; 

however,  it  was  still  high  because  there was  no  electrostatic  interaction  between  drug  and 

  Page 145 

  Page 145 

pmPCL, and the drug was easy to dissolve  in water.  In addition, drug‐loaded bimodal porous 

scaffolds demonstrated  in vitro that the drug retained its bioactivities (antimicrobial and anti‐

cancer properties). 

In Chapter 4,  the bimodal porous  scaffolds were  fabricated  and  loaded with DOX  to 

demonstrate, as a proof‐of‐concept, their potential application in breast cancer treatment. The 

DOX‐loaded  scaffolds  demonstrated  their  dose‐dependent  chemotherapeutic  effects  in  vitro 

against  MDA‐MB‐231  cells  with  the  dose  range  of  0.4–10 μg  DOX/mg  pmPCL  scaffold.  The 

implanted DOX‐loaded scaffolds, which used 5% and 20% of the I.V. injection dose, demonstrated 

reduced  cytotoxicity  and  enhanced  chemotherapeutic  effects  on  local  recurrent  tumour 

compared  with  I.V.  injected  DOX.  However,  further  dose  optimisation  needs  to  be  done  to 

balance the chemotherapeutic effect and cytotoxicity. 

Last, in Chapter 5, the application of the bimodal porous scaffolds for tissue regeneration 

was  demonstrated.  The  scaffolds  demonstrated  their  biocompatibility  by  enhanced  protein 

adsorption, cell attachment and proliferation compared with solid‐strut scaffolds and CaP‐coated 

scaffolds. Finally, their osteoconductivity was demonstrated  in vivo with a similar level of new 

bone formation to CaP‐coated scaffolds. 

All in all, this thesis introduced and proposed a new type of scaffold with distinct porous 

architecture  as  a  dual‐function  scaffold  for  tissue  reconstruction  and  local  drug  delivery  to 

enhance the treatment efficiency and reduce the complications and side effects of conventional 

treatment. The findings in this thesis can serve as a proof‐of‐concept and a foundation for future 

research regarding dual‐function devices for tissue engineering and drug delivery applications. 

6.2 LIMITATIONS AND FUTURE DIRECTIONS  

This thesis serves as a proof‐of‐concept for bimodal porous scaffolds to be used as dual‐function 

scaffolds. The scaffolds were developed as a viable product and to validate its feasibility in a broad 

application.  As  such,  further  optimization  and  deeply  characterization  need  to  be  done  for 

  Page 146 

  Page 146 

speficic purpose. Therefore,  further  investigation needs to be done before achieving the final 

goal. 

This thesis demonstrated a possibility of improving the commonly used 3D PCL scaffolds 

in  tissue engineering  field  to become dual‐functional  scaffolds  that  can be used  for different 

applications.  Due  to  the  limited  timeframe  of  a  PhD,  certain  in‐dept  characterization  and 

optimization experiments have been excluded  to prioritize  for  the demonstration of a broad 

application  of  this  scaffold.  Herein,  we  would  like  to  discuss  about  limitations  and  provide 

recommendations for further study following this project.  

 

6.2.1 Chapter 2  

Firstly, in this study, the porogen used was sieved from PBS tablets to a specific size range. 

This can be improved by using commercialized water‐soluble porogen with specific size classes 

and shapes to evaluate how the pore size and shape affect the release profile. Furthermore, after 

preparing the porogen‐polymer composite for printing, the rheological measurement was only 

used to validate the printability of limited conditions. It is suggested that the temperature, air 

pressure and other contribution factors should be considered and well characterized for different 

porogen‐polymer ratio and printing condition (different nozzle size and printing pattern). The 

porogen‐polymer ratio can affect the viscosity of the composite while the nozzle size and printing 

pattern may determine the cooling time of the printed strut and determine if there was enough 

cooling time between different layers. In the next step of drug loading method, the drop loading 

combined with gelMA coating showed very low loading efficiently, which mainly due to the drug 

lost during the coating process. This can be improved by using other method to create the coating 

barrier for the scaffolds after drug loading, such as using electrospinning to fabricate thin layer of 

polymers, covering the scaffolds and hence reduce the release of the drug. Lastly, for the drug 

release study, the drug release should be modelized to understand the release kinetic of  the 

applied drugs 

  Page 147 

  Page 147 

 

6.2.2 Chapter 3 

Secondly, in this study, the physicochemical and mechanical properties characterization and the 

degradation  test  were  performed;  however,  the  long‐term  stability  e.g.  properties  of  the 

scaffolds after degraded or after long period of time were not characterized. Beside long‐term 

stability,  the  influence  of  porogen,  fabrication  process,  leaching  and  drug  loading  on 

crystallization,  crystallinity  and  mechanical  properties  should  be  tested.  In  this  experiment 

design, the polymer used was pmPCL, which has a charged surface and interacts with charged 

molecules, thereby altering the release profile. Other polymers can be used to characterize and 

achieve a specific need of interacting with the used drug and achieve the desired release profile. 

Furthermore, the strength of interaction between drug and polymers should be quantified for 

comparison.  

6.2.3 Chapter 4 

Thirdly,  in  application  of  local  delivery  of  chemotherapeutic  drug  to  prevent  breast 

cancer recurrence and metastasis, the chemotherapeutic effect of HD group was more effective 

than LD group in in vitro setting but slightly lower in in vivo setting. We suggested to repeat the 

experiment with better selection of animal used right before stating the treatment as well as 

optimize  the  doses  to  balance  between  the  chemotherapeutic  effect  and  the  systemic 

cytotoxicity. In this study, we used immunocompromised animals. It would be beneficial in our 

future study to use immunocompetent animals. The characterization of tissue regeneration after 

transplantation and the used of combined agents loaded scaffolds are of interest for our future 

study.  

6.2.4 Chapter 5 

Lastly, in application of bone reconstruction, the study showed that the bimodal porous 

scaffolds could regenerate bone in the calvaria defect model as good as CaP coating scaffolds. 

Those the effect of osteoinduction was claimed for the intrastrut microscale porous structure, 

  Page 148 

  Page 148 

the mechanism of why such structure can enhance new bone formation should be the focus of 

the next study.  

  Page 149 

  Page 149 

Appendices 

 

Figure S1.  Rheology testing of mPCL and mPCL‐porogen for printing process showing amplitude 

sweep tests (a1‐a3) and temperature sweep (b1‐b3). For amplitude tests, temperature was kept 

constant at 110°C and angular frequency at 10 rad/sec. Each data point is the average of three 

experimental  repeat  (N=3);  the  error  bars  correspond  to  SD.  For  temperature  sweep  the 

temperature  was  varied  from  125°C  to  35°C.  Strain  was  kept  constant  at  1%  and  angular 

frequency at 10 rad/sec. Each point is the average of three experimental repeat (N=3); the error 

bars correspond to SD.  

  Page 150 

  Page 150 

 

Figure S2. Microporous mPCL scaffolds – after compression – relaxation cycles  in mechanical 

testing 

 

Figure S3. mPCL scaffolds – after compression – relaxation cycles in mechanical testing 

  Page 151 

  Page 151 

 

Figure S4. Morphology of nMPCL and pMPCL. (A): Representative bright field microscopic images 

of nMPCL and pMPCL. (B): AFM micrographs of surface of struts on nMPCL and pMPCL scaffolds 

and their root‐mean‐square surface roughness (RMS, data are expressed as mean ± s.e.m, n=6). 

(C) and (D): SEM and microCT images showing surface pores (short arrows) and connection to the 

inside  pores  through  interconnectivity  (long  arrows).  (E):  Intra‐strut  micropore  size  class 

distribution on surface and cross‐section of nMPCL and pMPCL. Data are expressed as mean ± 

s.e.m, n=6. 

 

 

  Page 152 

  Page 152 

 

Figure S5. Schematic of interaction between DOX and MPCL molecules. 

 

  Page 153 

  Page 153 

 

Figure S6. Drug loading efficiency of DOX, PTX and CEF on nPCL and pPCL. Data are expressed as 

mean ± s.e.m, n=6. ** is p<0.01 from one‐way ANOVA test and Tukey post hoc test. 

 

Figure S7. Pore size distribution of bimodal porous medical grade polycaprolactone scaffolds. 

data were expressed as mean ± SEM, n = 4. 

  Page 154 

  Page 154 

 

 

Figure S8. In vivo IVIS images of the control (A, bimodal porous medical grade polycaprolactone 

(pmPCL) scaffolds without drug), I.V. (B, I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), low dose 

and high dose (C and D, DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups.  

  Page 155 

  Page 155 

 

Figure S9. Doxorubicin (DOX) –loaded bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) 

scaffolds  effectively  reduced  the  breast  tumor  metastasis  in  liver  and  spleen.  A  and  B: 

Morphology, organ weight normalized to body weight and total flux from ex vivo BLI imaging of 

liver (A) and spleen (B) of the Control (bimodal porous medical grade polycaprolactone (pmPCL) 

scaffolds without drug), I.V. (I.V. injection of doxorubicin (DOX) at 2 mg/kg), Low Dose and High 

Dose (DOX–loaded pmPCL with 2 and 8 µg DOX/scaffold, respectively) groups. The organs were 

weighed after  fixation and normalized  to  the body weight of  the animal at day 28. Data are 

expressed as mean ± SEM (n=6 mice  in each experimental group). ns: data  is not statistically 

significant; * is p<0.05; ** is p<0.01 from one‐way ANOVA and Tukey post hoc test. 

 

 

  Page 156 

  Page 156 

Table S1. List of primary antibodies used for immunohistochemically staining and their antigen 

retrieval conditions. 

  Catalogue 

number 

Company  Antigen  retrieval 

solution 

Antigen  retrieval 

condition 

Dilution

 

Anti‐NuMA 

antibody 

ab97585  Abcam, 

UK 

Tris‐sodium citrate 

pH 6 

95oC for 5 minutes 1:200

Anti‐Ki67 

antibody 

ab15580  Abcam, 

UK 

 

Tris‐sodium citrate 

pH 6 

90oC for 20 minutes  1:200 

 

 

  Page 157 

  Page 157 

 

Figure S10. Porogen size class and viscoelasticity of MPCL and MPCL‐porogen films. A and B: 

Representative size class distribution by volume acquired by light scattering. C: SEM micrograph 

showing the morphology of PBS porogen. D, F and H: Storage modulus (G'), loss modulus (G'') 

and loss tangent result from amplitude sweep rheological measurement of PCL and porogen‐PCL 

composites at a temperature of 110°C and an angular frequency of 10 rad/sec. E, G and I: Storage 

modulus  (G'),  loss  modulus  (G'')  and  loss  tangent  (tan  δ)  results  from  temperature  sweep 

rheological measurements at a strain of 1% and an angular frequency of 10 rad/sec. 

 

  Page 158 

  Page 158 

 

Figure S11. Validation of complete leaching of porogen. A: SEM micrographs of pMPCL44 before 

(left) and after (right) leaching. B: EDX analysis results of pPCL44 scaffolds after 0, 7 and 14 days 

leached in NaOH 0.01M in shaking  incubator. C: EDX analysis results of all PCL scaffolds after 

leaching. D: UV‐Vis absorbance results of remained porogen percentage after leaching. Data are 

expressed as mean ± s.e.m; n=6. *: p<0.05 and **: p<0.01 from One‐way ANOVA test and Tukey 

post‐hoc test. 

 

Figure S12. Degradation of pMPCL compared with nMPCL. The crystalline/amorphous ratios of 

nPCL and pPCL44 scaffolds after 12, 24, 36 and 48 hours of degradation (A). GPC determination 

of molecular weight and polydispersity of nPCL and pPCL44 scaffolds after 48 hours of accelerated 

degradation  (B and C). Data are expressed as mean ± s.e.m; n=6. **  is p<0.01  from one‐way 

ANOVA test and Tukey post hoc test. 

 

  Page 159 

  Page 159 

 

Figure  S13.  Representative  SEM micrographs  at  low  (A)  and  high  (B) magnification  showing 

surface morphology of nPCL/CaP scaffold. 

  Page 160 

  Page 160 

Bibliography 

 

1.  Ratheesh, G., et al., 3D Fabrication of Polymeric Scaffolds for Regenerative Therapy. ACS Biomaterials Science & Engineering, 2017. 3(7): p. 1175‐1194. 

2.  Hutmacher, D.W., Scaffolds  in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials, 2000. 21: p. 2529‐43. 

3.  Chhaya, M.P., et al., Sustained regeneration of high‐volume adipose tissue for breast reconstruction  using  computer  aided  design  and  biomanufacturing.  Biomaterials, 2015. 52: p. 551‐60. 

4.  Chhaya,  M.P.,  et  al.,  Transformation  of  Breast  Reconstruction  via  Additive Biomanufacturing. Sci Rep, 2016. 6: p. 28030. 

5.  Song, Z., et al., Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthopedic reviews, 2013. 5: p. 65‐71. 

6.  Lamagni,  T.,  Epidemiology  and  burden  of  prosthetic  joint  infections.  Journal  of Antimicrobial Chemotherapy, 2014. 69: p. 5‐10. 

7.  Phillips,  B.T.,  et  al.,  A  systematic  review  of  antibiotic  use  and  infection  in  breast reconstruction: what is the evidence? Plastic and reconstructive surgery, 2013. 131: p. 1‐13. 

8.  Feldman,  E.M.,  et  al.,  Breast  implant  infections:  is  cefazolin  enough?  Plastic  and reconstructive surgery, 2010. 126: p. 779‐785. 

9.  Huiras, P., et al., Local antimicrobial administration for prophylaxis of surgical site infections. Pharmacotherapy:The Journal of Human Pharmacology & Drug Therapy, 2012. 32: p. 1006‐1019. 

10.  Marshall,  B.M.,  D.J.  Ochieng,  and  S.B.  Levy,  Commensals:  Underappreciated Reservoir of Antibiotic Resistance. Microbe, 2009. 4: p. 231‐238. 

11.  Colleoni, M., et al., Annual Hazard Rates of Recurrence for Breast Cancer During 24 Years of Follow‐Up: Results From the International Breast Cancer Study Group Trials I to V. J Clin Oncol, 2016. 34(9): p. 927‐35. 

12.  Cipriano,  C.,  et  al.,  Developing  an  Evidence‐based  Followup  Schedule  for  Bone Sarcomas Based on Local Recurrence and Metastatic Progression. Clin Orthop Relat Res, 2017. 475(3): p. 830‐838. 

13.  Harasym,  T.O.,  P.R.  Cullis,  and  M.B.  Bally,  Intratumor  distribution  of  doxorubicin following  i.v.  administration  of  drug  encapsulated  in  egg phosphatidylcholine/cholesterol  liposomes.  Cancer  Chemother  Pharmacol,  1997. 40(4): p. 309‐17. 

14.  Shim,  J.‐H.,  et  al.,  Three‐dimensional  printing  of  antibiotics‐loaded  poly‐ε‐caprolactone/poly(lactic‐co‐glycolic  acid)  scaffolds  for  treatment  of  chronic osteomyelitis. Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2015. 12(5): p. 283‐293. 

15.  Repka, M.A., et al., Applications of hot‐melt extrusion for drug delivery. Expert Opin Drug Deliv, 2008. 5(12): p. 1357‐76. 

16.  Traub, W.H. and B. Leonhard, Heat stability of the antimicrobial activity of sixty‐two antibacterial agents. J Antimicrob Chemother, 1995. 35(1): p. 149‐54. 

17.  Anselmo, A.C. and S. Mitragotri, An overview of clinical and commercial  impact of drug delivery systems. J Control Release, 2014. 190: p. 15‐28. 

  Page 161 

  Page 161 

18.  Moul,  J.W.  and  K.  Civitelli,  Managing  advanced  prostate  cancer  with  Viadur (leuprolide acetate implant). Urologic nursing, 2001. 21(6): p. 385. 

19.  Jonat, W., et al., Goserelin versus cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy in premenopausal patients with node‐positive breast cancer: The Zoladex Early Breast Cancer Research Association Study. J Clin Oncol, 2002. 20(24): p. 4628‐35. 

20.  Rock,  J.A.,  et  al.,  Zoladex  (Goserelin  Acetate  Implant)  in  the  Treatment  of Endometriosis: A Randomized Comparison With Danazol. Obstetrics & Gynecology, 1993. 82(2): p. 198‐205. 

21.  Samavedi, S., A.R. Whittington, and A.S. Goldstein, Calcium phosphate ceramics  in bone tissue engineering: a review of properties and their influence on cell behavior. Acta Biomater, 2013. 9(9): p. 8037‐45. 

22.  Wei,  J.,  et  al.,  Hierarchically  microporous/macroporous  scaffold  of  magnesium‐calcium phosphate for bone tissue regeneration. Biomaterials, 2010. 31(6): p. 1260‐9. 

23.  Zhang,  J.,  et  al.,  3D‐printed  magnetic  Fe3O4/MBG/PCL  composite  scaffolds  with multifunctionality  of  bone  regeneration,  local  anticancer  drug  delivery  and hyperthermia. J. Mater. Chem. B, 2014. 2(43): p. 7583‐7595. 

24.  Liu,  X.  and  P.X.  Ma,  Polymeric  scaffolds  for  bone  tissue  engineering.  Annals  of biomedical engineering, 2004. 32(3): p. 477‐486. 

25.  Schell, H., et al., The haematoma and its role  in bone healing. J Exp Orthop, 2017. 4(1): p. 5. 

26.  Shiu, H.T., P.C. Leung, and C.H. Ko, The roles of cellular and molecular components of a hematoma at early stage of bone healing. J Tissue Eng Regen Med, 2018. 12(4): p. e1911‐e1925. 

27.  Pajarinen, J., et al., Mesenchymal stem cell‐macrophage crosstalk and bone healing. Biomaterials, 2019. 196: p. 80‐89. 

28.  Freeman, F.E., et al., Biofabrication of multiscale bone extracellular matrix scaffolds for bone tissue engineering. Eur Cell Mater, 2019. 38: p. 168‐187. 

29.  Gupta, D., et al., Multiscale Porosity in Compressible Cryogenically 3D Printed Gels for Bone Tissue Engineering. ACS Appl Mater Interfaces, 2019. 11(22): p. 20437‐20452. 

30.  Rustom, L.E., et al., Multiscale Porosity Directs Bone Regeneration in Biphasic Calcium Phosphate Scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering, 2016. 3(11): p. 2768‐2778. 

31.  Zhang, J., et al., RhBMP‐2‐loaded calcium silicate/calcium phosphate cement scaffold with  hierarchically  porous  structure  for  enhanced  bone  tissue  regeneration. Biomaterials, 2013. 34(37): p. 9381‐9392. 

32.  Salerno, A., et al., Engineered mu‐bimodal poly(epsilon‐caprolactone) porous scaffold for  enhanced  hMSC  colonization  and  proliferation.  Acta  Biomater,  2009.  5(4):  p. 1082‐93. 

33.  Akkouch,  A.,  Z.  Zhang,  and  M.  Rouabhia,  A  novel collagen/hydroxyapatite/poly(lactide‐co‐ε‐caprolactone)  biodegradable  and bioactive 3D porous scaffold for bone regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2011. 96A(4): p. 693‐704. 

34.  Yan, L.‐P., et al., De novo bone formation on macro/microporous silk and silk/nano‐sized  calcium phosphate  scaffolds.  Journal  of Bioactive  and Compatible Polymers, 2013. 28(5): p. 439‐452. 

35.  Reignier, J. and M.A. Huneault, Preparation of interconnected poly(ε‐caprolactone) porous scaffolds by a combination of polymer and salt particulate leaching. Polymer, 2006. 47(13): p. 4703‐4717. 

  Page 162 

  Page 162 

36.  Ahn,  M.‐K.,  et  al.,  Design  and  Production  of  Continuously  Gradient Macro/Microporous Calcium Phosphate  (CaP) Scaffolds Using Ceramic/Camphene‐Based 3D Extrusion. Materials, 2017. 10(7): p. 719. 

37.  Kim, J.W., et al., Production of Poly(epsilon‐Caprolactone)/Hydroxyapatite Composite Scaffolds with a Tailored Macro/Micro‐Porous Structure, High Mechanical Properties, and Excellent Bioactivity. Materials (Basel), 2017. 10(10). 

38.  Maleksaeedi, S., et al., Toward 3D Printed Bioactive Titanium Scaffolds with Bimodal Pore Size Distribution for Bone Ingrowth. Procedia CIRP, 2013. 5: p. 158‐163. 

39.  Martins,  A.,  R.L.  Reis,  and  N.M.  Neves, Micro/Nano  Scaffolds  for  Osteochondral Tissue Engineering. Adv Exp Med Biol, 2018. 1058: p. 125‐139. 

40.  Zhang, B., et al., Porous bioceramics produced by inkjet 3D printing: Effect of printing ink  formulation  on  the  ceramic  macro  and  micro  porous  architectures  control. Composites Part B: Engineering, 2018. 155: p. 112‐121. 

41.  Dang,  H.P.,  et  al.,  3D  printed  dual  macro‐,micro‐porous  network  as  a  tissue engineering scaffold with drug delivery function. Biofabrication, 2019. 

42.  Liaw, C.Y. and M. Guvendiren, Current and emerging applications of 3D printing in medicine. Biofabrication, 2017. 9(2): p. 024102. 

43.  Habraken, W.J.,  J.G. Wolke,  and  J.A.  Jansen, Ceramic  composites  as matrices  and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev, 2007. 59(4‐5): p. 234‐48. 

44.  Palama, I.E., et al., Therapeutic PCL scaffold for reparation of resected osteosarcoma defect. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12672. 

45.  Feng, B., et al., The effect of pore size on tissue ingrowth and neovascularization in porous bioceramics of controlled architecture in vivo. Biomed Mater, 2011. 6(1): p. 015007. 

46.  Liu, X. and P.X. Ma, Polymeric scaffolds for bone tissue engineering. Ann Biomed Eng, 2004. 32(3): p. 477‐86. 

47.  Cipitria, A., et al., Porous scaffold architecture guides tissue formation. J Bone Miner Res, 2012. 27(6): p. 1275‐88. 

48.  Hutmacher, D.W., et al., State of the art and future directions of scaffold‐based bone engineering from a biomaterials perspective. J Tissue Eng Regen Med, 2007. 1(4): p. 245‐60. 

49.  Chan, B.P. and K.W. Leong, Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue‐specific considerations. Eur Spine J, 2008. 17 Suppl 4: p. 467‐79. 

50.  Chiu, Y.C., et al., The role of pore size on vascularization and tissue remodeling in PEG hydrogels. Biomaterials, 2011. 32(26): p. 6045‐51. 

51.  Jones,  J.R.,  Scaffolds  for  tissue  engineering,  in  Biomaterials,  artificial  organs  and tissue engineering. 2005, Woodhead Publishing. p. 201‐214. 

52.  Sosnowski, S., P. Wozniak, and M. Lewandowska‐Szumiel, Polyester  scaffolds with bimodal pore size distribution for tissue engineering. Macromol Biosci, 2006. 6(6): p. 425‐34. 

53.  Du,  L.,  et  al.,  Hierarchical  macro/micro‐porous  silk  fibroin  scaffolds  for  tissue engineering. Materials Letters, 2019. 236: p. 1‐4. 

54.  Duan,  B.,  et  al., Microporous  density‐mediated  response  of MSCs  on  3D  trimodal macro/micro/nano‐porous  scaffolds  via  fibronectin/integrin  and  FAK/MAPK signaling pathways. Journal of Materials Chemistry B, 2017. 5(19): p. 3586‐3599. 

55.  Reed, S., et al., Macro‐ and micro‐designed chitosan‐alginate scaffold architecture by three‐dimensional  printing  and  directional  freezing.  Biofabrication,  2016.  8(1):  p. 015003. 

56.  Zhu, M., et al., 3D‐printed hierarchical scaffold for localized isoniazid/rifampin drug delivery and osteoarticular tuberculosis therapy. Acta Biomater, 2015. 16: p. 145‐55. 

  Page 163 

  Page 163 

57.  Vorndran,  E.,  et  al., Simultaneous  Immobilization  of  Bioactives During  3D  Powder Printing of Bioceramic Drug‐Release Matrices. Advanced Functional Materials, 2010. 20(10): p. 1585‐1591. 

58.  Martinez‐Vazquez, F.J., et al., Fabrication of novel Si‐doped hydroxyapatite/gelatine scaffolds  by  rapid  prototyping  for  drug  delivery  and  bone  regeneration.  Acta Biomater, 2015. 15: p. 200‐9. 

59.  Water, J.J., et al., Three‐Dimensional Printing of Drug‐Eluting Implants: Preparation of  an  Antimicrobial  Polylactide  Feedstock  Material.  Journal  of  pharmaceutical sciences, 2015. 104(3): p. 1099‐1107. 

60.  Boetker,  J.,  et  al., Modifying  release  characteristics  from  3D  printed  drug‐eluting products. Eur J Pharm Sci, 2016. 90: p. 47‐52. 

61.  Zimmerli,  W.,  Prosthetic  joint  associated  infections.  Best  Practice  and  Research: Clinical Rheumatology, 2006. 20: p. 1045‐1063. 

62.  Tran,  N.,  et  al.,  Silver  doped  titanium  oxide–PDMS  hybrid  coating  inhibits Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis growth on PEEK. Materials Science and Engineering: C, 2015. 49: p. 201‐209. 

63.  Tran, P.A., D.M. Hocking, and A.J. O'Connor, In situ formation of antimicrobial silver nanoparticles  and  the  impregnation  of  hydrophobic  polycaprolactone  matrix  for antimicrobial  medical  device  applications.  Materials  Science  and  Engineering:  C, 2015. 47: p. 63‐69. 

64.  Tran,  P.A.  and  T.J.  Webster,  Antimicrobial  selenium  nanoparticle  coatings  on polymeric medical devices. Nanotechnology, 2013. 24(15): p. 155101. 

65.  van  Heerden,  J.,  et  al., Antimicrobial  coating  agents:  can  biofilm  formation  on  a breast implant be prevented? Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery, 2009. 62(5): p. 610‐617. 

66.  Tran, N. and P.A. Tran, Nanomaterial‐based treatments for medical device‐associated infections. ChemPhysChem, 2012. 13(10): p. 2481‐2494. 

67.  Holländer, J., et al., Three‐dimensional printed PCL‐based implantable prototypes of medical  devices  for  controlled  drug  delivery.  Journal  of  pharmaceutical  sciences, 2016. 105(9): p. 2665‐2676. 

68.  Malinauskas, M., et al., 3D microporous scaffolds manufactured via combination of fused  filament  fabrication and direct  laser writing ablation. Micromachines, 2014. 5(4): p. 839‐858. 

69.  Lam,  C.X.F.,  et  al.,  Scaffold  development  using  3D  printing  with  a  starch‐based polymer. Materials Science and Engineering: C, 2002. 20(1): p. 49‐56. 

70.  Zhang, J., et al., Coupling 3D printing with hot‐melt extrusion to produce controlled‐release tablets. Int J Pharm, 2017. 519(1‐2): p. 186‐197. 

71.  Traub, W.H. and B. Leonhard, Heat stability of the antimicrobial activity of sixty‐two antibacterial  agents.  Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1995. 35(1): p.  149‐154. 

72.  Hutmacher,  D.W.,  et  al.,  Mechanical  properties  and  cell  cultural  response  of polycaprolactone scaffolds designed and fabricated via fused deposition modeling. J Biomed Mater Res, 2001. 55(2): p. 203‐16. 

73.  Loessner,  D.,  et  al.,  Functionalization,  preparation  and  use  of  cell‐laden  gelatin methacryloyl‐based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature protocols, 2016. 11: p. 727‐46. 

74.  Varslot, T., et al., High‐resolution helical cone‐beam micro‐CT with theoretically‐exact reconstruction from experimental data. Med Phys, 2011. 38(10): p. 5459. 

75.  Yazdi, I.K., et al., Cefazolin‐loaded mesoporous silicon microparticles show sustained bactericidal  effect  against  Staphylococcus  aureus.  J  Tissue  Eng,  2014.  5:  p. 2041731414536573. 

  Page 164 

  Page 164 

76.  Meijer, G.J., et al., Cell‐based bone tissue engineering. PLoS medicine, 2007. 4(2): p. e9. 

77.  Fisher, J.P., et al., Soft and hard tissue response to photocrosslinked poly (propylene fumarate) scaffolds in a rabbit model. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2002. 59(3): p. 547‐556. 

78.  Mouriño,  V.  and A.R.  Boccaccini, Bone  tissue  engineering  therapeutics:  controlled drug delivery in three‐dimensional scaffolds. Journal of the Royal Society Interface, 2009: p. rsif20090379. 

79.  Kim, K., et al., Incorporation and controlled release of a hydrophilic antibiotic using poly  (lactide‐co‐glycolide)‐based  electrospun  nanofibrous  scaffolds.  Journal  of Controlled Release, 2004. 98(1): p. 47‐56. 

80.  Loh,  Q.L.  and  C.  Choong,  Three‐dimensional  scaffolds  for  tissue  engineering applications: role of porosity and pore size. Tissue Eng Part B Rev, 2013. 19(6): p. 485‐502. 

81.  Hutmacher, D.W. and S. Cool, Concepts of  scaffold‐based tissue engineering  ‐ The rationale  to  use  solid  free‐form  fabrication  techniques.  Journal  of  Cellular  and Molecular Medicine, 2007. 11: p. 654‐669. 

82.  Prabu, P., et al., Preparation and drug release activity of scaffolds containing collagen and  poly  (caprolactone).  Journal  of  Biomedical  Materials  Research  Part  A,  2006. 79(1): p. 153‐158. 

83.  Miyai,  T.,  et  al.,  Antibiotic‐loaded  poly‐ε‐caprolactone  and  porous  β‐tricalcium phosphate composite  for  treating osteomyelitis. Biomaterials, 2008. 29(3): p. 350‐358. 

84.  Raval, A., J. Parikh, and C. Engineer, Mechanism of Controlled Release Kinetics From Medical Devices. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2010. 27: p. 211‐225. 

85.  Elsner,  J.J.,  et  al., Highly  porous  drug‐eluting  structures:  from wound  dressings  to stents and scaffolds for tissue regeneration. Biomatter, 2012. 2: p. 239‐270. 

86.  Mouriño,  V.  and A.R.  Boccaccini, Bone  tissue  engineering  therapeutics:  controlled drug delivery in three‐dimensional scaffolds. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society, 2010. 7: p. 209‐27. 

87.  Abizaid, A. and J.R. Costa, New drug‐eluting stents an overview on biodegradable and polymer‐free  next‐generation  stent  systems.  Circulation:  Cardiovascular Interventions, 2010. 3: p. 384‐393. 

88.  Yue,  K.,  et  al.,  Synthesis,  properties,  and  biomedical  applications  of  gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials, 2015. 73: p. 254‐271. 

89.  Zeller,  V.,  et  al., Ctontinuous  cefazolin  infusion  to  treat  bone  and  joint  infections: Clinical efficacy, feasibility, safety, and serum and bone concentrations. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009. 53: p. 883‐887. 

90.  Douglas,  A.,  et  al.,  Plasma  and  tissue  pharmacokinetics  of  cefazolin  in  patients undergoing  elective  and  semielective  abdominal  aortic  aneurysm  open  repair surgery. Antimicrob Agents Chemother, 2011. 55(11): p. 5238‐42. 

91.  Mutsuzaki, H., et al., Cefazolin‐containing poly(ε‐caprolactone) sponge pad to reduce pin  tract  infection  rate  in  rabbits.  Asia‐Pacific  Journal  of  Sports  Medicine, Arthroscopy, Rehabilitation and Technology, 2014. 1(2): p. 54‐61. 

92.  Teo, E.Y., et al., Polycaprolactone‐based fused deposition modeled mesh for delivery of antibacterial agents to infected wounds. Biomaterials, 2011. 32(1): p. 279‐87. 

93.  Reichert, J.C., et al., A Tissue Engineering Solution for Segmental Defect Regeneration in Load‐Bearing Long Bones. Science Translational Medicine, 2012. 4: p. 1‐9. 

94.  Wang, M., et al., Cold atmospheric plasma (CAP) surface nanomodified 3D printed polylactic acid (PLA) scaffolds for bone regeneration. Acta Biomater, 2016. 46: p. 256‐265. 

  Page 165 

  Page 165 

95.  Bauermeister, A.J., A. Zuriarrain, and M.I. Newman, Three‐Dimensional Printing  in Plastic and Reconstructive Surgery: A Systematic Review. Ann Plast Surg, 2015. 

96.  Melchels,  F.,  et al., CAD/CAM‐assisted breast  reconstruction. Biofabrication, 2011. 3(3): p. 034114. 

97.  Winter,  J.,  S.  Shiga,  and  A.  Islur,  The  Complications  of  Polyacrylamide  Hydrogel Augmentation  Mammoplasty.  Plastic  Surgery  Case  Studies,  2017.  3:  p. 2513826X1769382. 

98.  Nava, M.B., et al., How to prevent complications in breast augmentation. Gland Surg, 2017. 6(2): p. 210‐217. 

99.  Wei,  W.,  Treatment  of  complications  from  polyacrylamide  hydrogel  breast augmentation. Exp Ther Med, 2016. 12(1): p. 173‐176. 

100.  Ogita, M., et al., Risk factors for complications among breast cancer patients treated with  post‐mastectomy  radiotherapy  and  immediate  tissue‐expander/permanent implant reconstruction: a retrospective cohort study. Breast Cancer, 2017. 19: p. 1‐9. 

101.  Visscher, L.E., et al., Breast Augmentation and Reconstruction from a Regenerative Medicine Point of View: State of the Art and Future Perspectives. Tissue Eng Part B Rev, 2017. 23(3): p. 281‐293. 

102.  Gehl,  J.,  et  al.,  Combined  doxorubicin  and  paclitaxel  in  advanced  breast  cancer: Effective and cardiotoxic. Annals of Oncology, 1996. 7: p. 687‐693. 

103.  Swain, S.M., F.S. Whaley, and M.S. Ewer, Congestive heart failure in patients treated with  doxorubicin:  a  retrospective  analysis  of  three  trials.  Cancer,  2003. 97(11):  p. 2869‐79. 

104.  Wang, F., et al., Preclinical development of drug delivery systems for paclitaxel‐based cancer chemotherapy. J Control Release, 2017. 

105.  Feng, L. and R.J. Mumper, A critical  review of  lipid‐based nanoparticles for taxane delivery. Cancer Lett, 2013. 334(2): p. 157‐75. 

106.  Gelderblom,  H.,  et  al.,  Cremophor  EL:  the  drawbacks  and  advantages  of  vehicle selection for drug formulation. Eur J Cancer, 2001. 37(13): p. 1590‐8. 

107.  Sparreboom, A., et al., Nonlinear pharmacokinetics of paclitaxel in mice results from the pharmaceutical vehicle Cremophor EL. Cancer Res, 1996. 56(9): p. 2112‐5. 

108.  Fonseca,  C.,  S.  Simoes,  and  R.  Gaspar,  Paclitaxel‐loaded  PLGA  nanoparticles: preparation,  physicochemical  chracterization  and  in  vitro  anti‐tumoral  activity. Journal of Controlled Release, 2002. 83: p. 273‐286. 

109.  Crosasso,  P.,  et  al.,  Preparation,  characterization  and  properties  of  sterically stabilized paclitaxel‐containing liposomes. J Control Release, 2000. 63(1‐2): p. 19‐30. 

110.  Khandare,  J.J.,  et  al.,  Dendrimer  versus  linear  conjugate:  Influence  of  polymeric architecture  on  the  delivery  and  anticancer  effect  of  paclitaxel.  Bioconjug  Chem, 2006. 17(6): p. 1464‐72. 

111.  Sun, T., et al., Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew Chem Int Ed Engl, 2014. 53(46): p. 12320‐64. 

112.  Gibson,  J.D.,  B.P.  Khanal,  and  E.R.  Zubarev,  Paclitaxel‐functionalized  gold nanoparticles. J Am Chem Soc, 2007. 129(37): p. 11653‐61. 

113.  Tran, N., et al., Non‐lamellar  lyotropic  liquid crystalline nanoparticles enhance  the antibacterial effects of rifampicin against Staphylococcus aureus. J Colloid Interface Sci, 2018. 519: p. 107‐118. 

114.  Zhai, J., et al., Epidermal growth factor receptor‐targeted lipid nanoparticles retain self‐assembled nanostructures and provide high specificity. Nanoscale, 2015. 7(7): p. 2905‐13. 

115.  Wu,  J.,  Q.  Liu,  and  R.J.  Lee, A  folate  receptor‐targeted  liposomal  formulation  for paclitaxel. Int J Pharm, 2006. 316(1‐2): p. 148‐53. 

116.  Zhong, Y., et al., Ligand‐directed active tumor‐targeting polymeric nanoparticles for cancer chemotherapy. Biomacromolecules, 2014. 15(6): p. 1955‐69. 

  Page 166 

  Page 166 

117.  Choi,  C.H.,  et  al., Mechanism  of  active  targeting  in  solid  tumors with  transferrin‐containing gold nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(3): p. 1235‐40. 

118.  Zhang,  L.,  et  al.,  Tailored  Synthesis  of  Octopus‐type  Janus  Nanoparticles  for Synergistic Actively‐Targeted and Chemo‐Photothermal Therapy. Angew Chem Int Ed Engl, 2016. 55(6): p. 2118‐21. 

119.  Gao,  W.,  J.M.  Chan,  and  O.C.  Farokhzad,  pH‐Responsive  nanoparticles  for  drug delivery. Mol Pharm, 2010. 7(6): p. 1913‐20. 

120.  Mura,  S.,  J.  Nicolas,  and  P.  Couvreur,  Stimuli‐responsive  nanocarriers  for  drug delivery. Nat Mater, 2013. 12(11): p. 991‐1003. 

121.  Park, J.W., Liposome‐based drug delivery in breast cancer treatment. Breast Cancer Res, 2002. 4(3): p. 95‐9. 

122.  O'Brien, M.E.R., Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated  liposomal  doxorubicin  HCl  (CAELYXTM/Doxil")  versus  conventional doxorubicin for first‐line treatment of metastatic breast cancer. Annals of Oncology, 2004. 15(3): p. 440‐449. 

123.  Miele, E., et al., Albumin‐bound formulation of paclitaxel (Abraxane® ABI‐007) in the treatment of breast cancer. International Journal of Nanomedicine, 2009. 4: p. 99‐105. 

124.  Green, M.R., et al., Abraxane, a novel Cremophor‐free, albumin‐bound particle form of paclitaxel  for the treatment of advanced non‐small‐cell  lung cancer. Ann Oncol, 2006. 17(8): p. 1263‐8. 

125.  Micha,  J.P.,  et  al.,  Abraxane  in  the  treatment  of  ovarian  cancer:  the  absence  of hypersensitivity reactions. Gynecol Oncol, 2006. 100(2): p. 437‐8. 

126.  Zhai, J., et al., Paclitaxel‐Loaded Self‐Assembled Lipid Nanoparticles as Targeted Drug Delivery Systems for the Treatment of Aggressive Ovarian Cancer. ACS Appl Mater Interfaces, 2018. 10(30): p. 25174‐25185. 

127.  Danhier, F., To exploit the tumor microenvironment: Since the EPR effect fails in the clinic, what is the future of nanomedicine? J Control Release, 2016. 244(Pt A): p. 108‐121. 

128.  Wilhelm,  S.,  et  al., Analysis  of  nanoparticle  delivery  to  tumours.  Nature  Reviews Materials, 2016. 1(5). 

129.  Wolinsky,  J.B.,  Y.L.  Colson,  and M.W.  Grinstaff,  Local  drug  delivery  strategies  for cancer  treatment: gels, nanoparticles, polymeric  films,  rods, and wafers.  J Control Release, 2012. 159(1): p. 14‐26. 

130.  De  Souza,  R.,  et  al.,  Polymeric  drug  delivery  systems  for  localized  cancer chemotherapy. Drug Deliv, 2010. 17(6): p. 365‐75. 

131.  Bastiancich, C., et al., Anticancer drug‐loaded hydrogels as drug delivery systems for the local treatment of glioblastoma. J Control Release, 2016. 243: p. 29‐42. 

132.  Weinberg, B.D.,  et  al., Antitumor efficacy and  local distribution of doxorubicin  via intratumoral delivery from polymer millirods. J Biomed Mater Res A, 2007. 81(1): p. 161‐70. 

133.  Boateng, J.S., et al., Characterisation of freeze‐dried wafers and solvent evaporated films as potential drug delivery systems to mucosal surfaces. Int J Pharm, 2010. 389(1‐2): p. 24‐31. 

134.  Sionkowska, A., Current research on the blends of natural and synthetic polymers as new biomaterials: Review. Progress in Polymer Science, 2011. 36(9): p. 1254‐1276. 

135.  Uhrich, K.E., et al., Polymeric Systems for Controlled Drug Release. Chemical Reviews, 1999. 99(11): p. 3181‐3198. 

136.  Pillai, O. and R. Panchagnula, Polymers in drug delivery. Curr Opin Chem Biol, 2001. 5(4): p. 447‐51. 

137.  Inzana, J.A., et al., 3D printed bioceramics for dual antibiotic delivery to treat implant‐associated bone infection. Eur Cell Mater, 2015. 30: p. 232‐47. 

  Page 167 

  Page 167 

138.  Jeon,  H.,  H.  Lee,  and  G.  Kim,  A  surface‐modified  poly(varepsilon‐caprolactone) scaffold comprising variable nanosized surface‐roughness using a plasma treatment. Tissue Eng Part C Methods, 2014. 20(12): p. 951‐63. 

139.  Sigma‐Aldrich.  440752  Aldrich  Polycaprolactone.  Available  from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440752?lang=en&region=AU. 

140.  Wunderlich,  B.,  Heat  capacity  of  polymers.  Handbook  of  thermal  Analysis  and Calorimetry, 2002. 3(1): p. 47. 

141.  Thorn, C.F., et al., Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Genomics, 2011. 21(7): p. 440‐6. 

142.  Von Hoff, D.D., et al., Risk factors for doxorubicin‐induced congestive heart failure. Ann Intern Med, 1979. 91(5): p. 710‐7. 

143.  Leenheer,  J.A.,  R.L.  Wershaw,  and  M.M.  Reddy,  Strong‐Acid,  Carboxyl‐Group Structures  in  Fulvic‐Acid  from  the  Suwannee  River,  Georgia  .2.  Major  Structures. Environmental Science & Technology, 1995. 29(2): p. 399‐405. 

144.  Rowinsky, E.K. and R.C. Donehower, Paclitaxel (taxol). N Engl J Med, 1995. 332(15): p. 1004‐14. 

145.  Perez, E.A., Paclitaxel in Breast Cancer. The Oncologist, 1998. 3(6): p. 373‐389. 146.  Ma, P. and R.J. Mumper, Paclitaxel Nano‐Delivery Systems: A Comprehensive Review. 

J Nanomed Nanotechnol, 2013. 4(2): p. 1000164. 147.  Chao, T.C., et al., Paclitaxel in a novel formulation containing less Cremophor EL as 

first‐line  therapy  for advanced breast  cancer: A phase  II  trial.  Investigational New Drugs, 2005. 23(2): p. 171‐177. 

148.  Periti, P., G. Stringa, and E. Mini, Comparative multicenter trial of teicoplanin versus cefazolin  for  antimicrobial  prophylaxis  in  prosthetic  joint  implant  surgery.  Italian Study Group for Antimicrobial Prophylaxis in Orthopedic Surgery. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1999. 18(2): p. 113‐9. 

149.  Allababidi, S. and J.C. Shah, Efficacy and pharmacokinetics of site‐specific cefazolin delivery  using  biodegradable  implants  in  the  prevention  of  post‐operative  wound infections. Pharmaceutical Research, 1998. 15(2): p. 325‐333. 

150.  Adams, W.P., Jr., et al., Optimizing breast‐pocket  irrigation: the post‐betadine era. Plast Reconstr Surg, 2001. 107(6): p. 1596‐1601. 

151.  Tacconelli, E., et al., Vancomycin versus cefazolin prophylaxis for cerebrospinal shunt placement in a hospital with a high prevalence of meticillin‐resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect, 2008. 69(4): p. 337‐44. 

152.  Jiang, B. and B. Li, Polypeptide nanocoatings for preventing dental and orthopaedic device‐associated  infection:  pH‐induced  antibiotic  capture,  release,  and  antibiotic efficacy. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2009. 88(2): p. 332‐8. 

153.  Loessner,  D.,  et  al.,  Functionalization,  preparation  and  use  of  cell‐laden  gelatin methacryloyl‐based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nat Protoc, 2016. 11(4): p. 727‐46. 

154.  Burgess, D.J. and J.E. Carless, Microelectrophoretic Studies of Gelatin and Acacia for the  Prediction  of  Complex  Coacervation.  Journal  of  Colloid  and  Interface  Science, 1984. 98(1): p. 1‐8. 

155.  Lee,  J.  and  D.‐W.  Cho,  3D  Printing  Technology  Over  a  Drug  Delivery  for  Tissue Engineering. Current Pharmaceutical Design, 2015. 21(12): p. 1606‐1617. 

156.  Mathew,  A.,  et  al.,  Antimicrobial  and  Immunomodulatory  Surface‐Functionalized Electrospun Membranes for Bone Regeneration. Adv Healthc Mater, 2017. 6(10). 

157.  Beeley,  N.R.,  et  al.,  Fabrication,  implantation,  elution,  and  retrieval  of  a  steroid‐loaded polycaprolactone subretinal implant. J Biomed Mater Res A, 2005. 73(4): p. 437‐44. 

  Page 168 

  Page 168 

158.  Gorrasi,  G.,  et  al.,  Vapor  barrier  properties  of  polycaprolactone  montmorillonite nanocomposites: effect of clay dispersion. Polymer, 2003. 44(8): p. 2271‐2279. 

159.  Gao, B., et al., 4D Bioprinting for Biomedical Applications. Trends Biotechnol, 2016. 34(9): p. 746‐756. 

160.  Wu, J.‐J., et al., 4D Printing: History and Recent Progress. Chinese Journal of Polymer Science, 2017. 36(5): p. 563‐575. 

161.  Gladman, A.S., et al., Biomimetic 4D printing. Nat Mater, 2016. 15(4): p. 413‐8. 162.  He, H., J. Guan, and J.L. Lee, An oral delivery device based on self‐folding hydrogels. J 

Control Release, 2006. 110(2): p. 339‐346. 163.  Siegel, R.L., K.D. Miller, and A. Jemal, Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin, 2015. 

65(1): p. 5‐29. 164.  National Cancer Institute, SEER Cancer Statistics Review: 1975‐2012. 2015. 165.  Australian Institute of Health and Welfare, Australian Cancer Incidence and Mortality 

(ACIM) books: breast cancer. 2016. 166.  Paredes, et al., The impact of breast reconstruction on the quality of life of patients 

after  mastectomy  at  the  Plastic  Surgery  Service  of  Walter  Cantídio  University Hospital. Revista Brasileira de Cirurgia Plástica, 2013. 28(1): p. 100‐4. 

167.  Nissen, M.J., K.K. Swenson, and E.A. Kind, Quality of life after postmastectomy breast reconstruction. Oncol Nurs Forum, 2002. 29(3): p. 547‐53. 

168.  Stavrou,  et  al.,  Quality  of  life  after  breast  cancer  surgery  with  or  without reconstruction. ePlasty: Open Access Journal of Plastic Surgery, 2009. 9. 

169.  Dean, C., U. Chetty, and A.P. Forrest, Effects of immediate breast reconstruction on psychosocial morbidity after mastectomy. Lancet, 1983. 1(8322): p. 459‐62. 

170.  Anampa, J., D. Makower, and J.A. Sparano, Progress in adjuvant chemotherapy for breast cancer: an overview. BMC Med, 2015. 13: p. 195. 

171.  Effects of  radiotherapy and of differences  in  the extent of  surgery  for early breast cancer on local recurrence and 15‐year survival: an overview of the randomised trials. The Lancet, 2005. 366(9503): p. 2087‐2106. 

172.  Polgar, C., et al., Sole brachytherapy of the tumor bed after conservative surgery for T1  breast  cancer:  five‐year  results  of  a  phase  I‐II  study  and  initial  findings  of  a randomized phase III trial. J Surg Oncol, 2002. 80(3): p. 121‐8; discussion 129. 

173.  de la Puente, P. and A.K. Azab, Delivery systems for brachytherapy. J Control Release, 2014. 192: p. 19‐28. 

174.  Onitilo,  A.A.,  et  al., Breast  cancer  subtypes  based  on  ER/PR  and Her2  expression: comparison of clinicopathologic features and survival. Clin Med Res, 2009. 7(1‐2): p. 4‐13. 

175.  Schlegel, P.N., Efficacy and Safety of Histrelin Subdermal  Implant  in Patients With Advanced Prostate Cancer. The Journal of Urology, 2006. 175(4): p. 1353‐1358. 

176.  Westphal, M., et al., Gliadel wafer in initial surgery for malignant glioma: long‐term follow‐up of a multicenter controlled trial. Acta Neurochir (Wien), 2006. 148(3): p. 269‐75; discussion 275. 

177.  Wu, Y.,  et  al., An  Injectable  Supramolecular Polymer Nanocomposite Hydrogel  for Prevention  of  Breast  Cancer  Recurrence  with  Theranostic  and  Mammoplastic Functions. Advanced Functional Materials, 2018. 28(21): p. 1801000. 

178.  Qi, Y., et al., Injectable Hexapeptide Hydrogel for Localized Chemotherapy Prevents Breast Cancer Recurrence. ACS Appl Mater Interfaces, 2018. 10(8): p. 6972‐6981. 

179.  Seib, F.P. and D.L. Kaplan, Doxorubicin‐loaded silk films: drug‐silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials, 2012. 33(33): p. 8442‐50. 

180.  Li,  Q.,  et  al.,  Graphene‐Nanoparticle‐Based  Self‐Healing  Hydrogel  in  Preventing Postoperative Recurrence of Breast Cancer. ACS Biomaterials Science & Engineering, 2019. 5(2): p. 768‐779. 

  Page 169 

  Page 169 

181.  Yuan,  Z.,  et  al.,  Doxorubicin‐loaded  mesoporous  silica  nanoparticle  composite nanofibers  for  long‐term  adjustments  of  tumor  apoptosis.  Nanotechnology,  2016. 27(24): p. 245101. 

182.  Yuan, Z., et al., In situ adjuvant therapy using a responsive doxorubicin‐loaded fibrous scaffold after tumor resection. Colloids Surf B Biointerfaces, 2017. 158: p. 363‐369. 

183.  Ding, Q., et al., Preparation and therapeutic application of docetaxel‐loaded poly(d,l‐lactide) nanofibers in preventing breast cancer recurrence. Drug Deliv, 2016. 23(8): p. 2677‐2685. 

184.  Hollander, J., et al., Three‐Dimensional Printed PCL‐Based Implantable Prototypes of Medical Devices  for  Controlled Drug Delivery.  J  Pharm Sci,  2016. 105(9):  p.  2665‐2676. 

185.  Ahangar, P., et al., Nanoporous 3D‐Printed Scaffolds for Local Doxorubicin Delivery in Bone Metastases Secondary to Prostate Cancer. Materials (Basel), 2018. 11(9). 

186.  Dang, H.P., et al., 3D printed biodegradable scaffolds with dual macro‐,micro‐scale porous networks for bone tissue regeneration. Biomaterials, 2019. Submitted. 

187.  Dang, H.P.,  et  al., 3D printed dual macro‐, microscale  porous  network  as  a  tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication, 2019. 

188.  Untch, M. and G. von Minckwitz, Recent advances in systemic therapy: advances in neoadjuvant  (primary)  systemic  therapy with  cytotoxic agents. Breast Cancer Res, 2009. 11(2): p. 203. 

189.  Sun,  H.,  et  al.,  The  in  vivo  degradation,  absorption  and  excretion  of  PCL‐based implant. Biomaterials, 2006. 27(9): p. 1735‐40. 

190.  Dang, H.P.,  et  al., 3D printed dual macro‐, microscale  porous  network  as  a  tissue engineering  scaffold  with  drug  delivering  function.  Biofabrication,  2019. 11(3):  p. 035014. 

191.  Defail,  A.J.,  et  al.,  Controlled  release  of  bioactive  doxorubicin  from microspheres embedded within gelatin scaffolds. J Biomed Mater Res A, 2006. 79(4): p. 954‐62. 

192.  Bala Balakrishnan, P., et al., Star poly(epsilon‐caprolactone)‐based electrospun fibers as  biocompatible  scaffold  for  doxorubicin  with  prolonged  drug  release  activity. Colloids Surf B Biointerfaces, 2018. 161: p. 488‐496. 

193.  Sedlacek, O., et al., Poly(2‐ethyl‐2‐oxazoline) conjugates with doxorubicin for cancer therapy:  In  vitro  and  in  vivo  evaluation  and  direct  comparison  to  poly[N‐(2‐hydroxypropyl)methacrylamide] analogues. Biomaterials, 2017. 146: p. 1‐12. 

194.  Henninger,  C.,  et  al.,  Chronic  heart  damage  following  doxorubicin  treatment  is alleviated by lovastatin. Pharmacol Res, 2015. 91: p. 47‐56. 

195.  Huang, W., et al., Surfactin‐based nanoparticles loaded with doxorubicin to overcome multidrug resistance in cancers. Int J Nanomedicine, 2018. 13: p. 1723‐1736. 

196.  Alkreathy, H.M., et al., Enhanced antitumour activity of doxorubicin and simvastatin combination loaded nanoemulsion treatment against a Swiss albino mouse model of Ehrlich ascites carcinoma. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2019. 46(5): p. 496‐505. 

197.  Pawar,  S.,  G.  Shevalkar,  and  P.  Vavia,  Glucosamine‐anchored  doxorubicin‐loaded targeted  nano‐niosomes:  pharmacokinetic,  toxicity  and  pharmacodynamic evaluation. J Drug Target, 2016. 24(8): p. 730‐43. 

198.  V, S.S. and V.M. P, Degradation of Poly(epsilon‐caprolactone) and bio‐interactions with mouse  bone marrow mesenchymal  stem  cells.  Colloids  Surf  B  Biointerfaces, 2018. 163: p. 107‐118. 

199.  Carter, S.D., et al., Additive Biomanufacturing: An Advanced Approach for Periodontal Tissue Regeneration. Ann Biomed Eng, 2017. 45(1): p. 12‐22. 

200.  Hutmacher, D.W., M. Sittinger, and M.V. Risbud, Scaffold‐based tissue engineering: rationale for computer‐aided design and solid free‐form fabrication systems. Trends Biotechnol, 2004. 22(7): p. 354‐62. 

  Page 170 

  Page 170 

201.  Cipitria,  A.,  et  al.,  BMP  delivery  complements  the  guiding  effect  of  scaffold architecture without altering bone microstructure in critical‐sized long bone defects: A multiscale analysis. Acta Biomater, 2015. 23: p. 282‐294. 

202.  Visscher,  L.E.,  et  al.,  3D  printed  Polycaprolactone  scaffolds  with  dual  macro‐microporosity for applications in local delivery of antibiotics. Materials Science and Engineering: C, 2018. 87: p. 78‐89. 

203.  Kolar, P., et al., Human early fracture hematoma is characterized by inflammation and hypoxia. Clin Orthop Relat Res, 2011. 469(11): p. 3118‐26. 

204.  Claes,  L.,  S.  Recknagel,  and  A.  Ignatius,  Fracture  healing  under  healthy  and inflammatory conditions. Nature Reviews Rheumatology, 2012. 8: p. 133. 

205.  Claes,  L.,  S.  Recknagel,  and  A.  Ignatius,  Fracture  healing  under  healthy  and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol, 2012. 8(3): p. 133‐43. 

206.  Manavitehrani,  I.,  et  al.,  Biomedical  Applications  of  Biodegradable  Polyesters. Polymers, 2016. 8(1): p. 20. 

207.  A  review  paper  on  biomimetic  calcium  phosphate  coating.  The  Open  Biomedical Engineering Journal, 2015. 9: p. 56‐64. 

208.  Dadsetan,  M.,  et  al.,  Effect  of  calcium  phosphate  coating  and  rhBMP‐2  on  bone regeneration  in  rabbit  calvaria  using  poly(propylene  fumarate)  scaffolds.  Acta Biomater, 2015. 18: p. 9‐20. 

209.  Surmenev,  R.A.,  M.A.  Surmeneva,  and  A.A.  Ivanova,  Significance  of  calcium phosphate coatings for the enhancement of new bone osteogenesis‐‐a review. Acta Biomater, 2014. 10(2): p. 557‐79. 

210.  Vaquette, C., et al., Effect of culture conditions and calcium phosphate coating on ectopic bone formation. Biomaterials, 2013. 34(22): p. 5538‐51. 

211.  Cacicedo, M.L., et al., Modified bacterial cellulose scaffolds for localized doxorubicin release in human colorectal HT‐29 cells. Colloids Surf B Biointerfaces, 2016. 140: p. 421‐9. 

212.  Kosik‐Kozio, A., et al., Surface modification of 3D printed polycaprolactone constructs via  a  solvent  treatment:  impact  on  physical  and  osteogenic  properties.  ACS Biomaterials Science & Engineering, 2018. 

213.  Crescenzi, V., et al., Thermodynamics of fusion of poly‐β‐propiolactone and poly‐ϵ‐caprolactone.  Comparative  analysis  of  the  melting  of  aliphatic  polylactone  and polyester chains. European Polymer journal, 1972. 8: p. 15. 

214.  Tiraferri, A. and M. Elimelech, Direct quantification of negatively charged functional groups on membrane surfaces. Journal of Membrane Science, 2012. 389: p. 499‐508. 

215.  Ma, Z., Z. Mao, and C. Gao, Surface modification and property analysis of biomedical polymers used for tissue engineering. Colloids Surf B Biointerfaces, 2007. 60(2): p. 137‐57. 

216.  Foo,  H.L.,  et  al.,  Catalytic  surface modification  of  roll‐milled  poly(ε‐caprolactone) biaxially  stretched  to  ultra‐thin  dimension.  Materials  Science  and  Engineering:  C, 2007. 27(2): p. 299‐303. 

217.  Jassal,  M.,  S.  Sengupta,  and  S.  Bhowmick,  Functionalization  of  electrospun poly(caprolactone)  fibers  for pH‐controlled delivery of doxorubicin hydrochloride.  J Biomater Sci Polym Ed, 2015. 26(18): p. 1425‐38. 

218.  Standard Test Method for Tensile Properties of Plastics. 2014, ASTM International. 219.  Lam, C.X., et al., Evaluation of polycaprolactone scaffold degradation for 6 months in 

vitro and in vivo. J Biomed Mater Res A, 2009. 90(3): p. 906‐19. 220.  Lam,  C.X.F.,  S.H.  Teoh,  and  D.W.  Hutmacher,  Comparison  of  the  degradation  of 

polycaprolactone  and  polycaprolactone–(β‐tricalcium  phosphate)  scaffolds  in alkaline medium. Polymer International, 2007. 56(6): p. 718‐728. 

  Page 171 

  Page 171 

221.  Lam, C.X., et al., Dynamics of in vitro polymer degradation of polycaprolactone‐based scaffolds:  accelerated  versus  simulated  physiological  conditions.  Biomed  Mater, 2008. 3(3): p. 034108. 

222.  Shiu, H.T., et al., Controlling whole blood activation and resultant clot properties by carboxyl  and  alkyl  functional  groups  on material  surfaces:  a  possible  therapeutic approach for enhancing bone healing. J. Mater. Chem. B, 2014. 2(20): p. 3009‐3021. 

223.  Sadowska,  J.M.,  et  al.,  Effect  of  nano‐structural  properties  of  biomimetic hydroxyapatite on osteoimmunomodulation. Biomaterials, 2018. 181: p. 318‐332. 

224.  Woo, K.M., V.J. Chen, and P.X. Ma, Nano‐fibrous scaffolding architecture selectively enhances protein adsorption contributing to cell attachment. J Biomed Mater Res A, 2003. 67(2): p. 531‐7. 

225.  Dinarvand,  P.,  et  al.,  New  approach  to  bone  tissue  engineering:  simultaneous application  of  hydroxyapatite  and  bioactive  glass  coated  on  a  poly(L‐lactic  acid) scaffold. ACS Appl Mater Interfaces, 2011. 3(11): p. 4518‐24. 

226.  Wen, J., Heat capacities of polymers, in Physical Properties of Polymers Handbook. 2007. p. 145‐154. 

227.  Archer, D.G., Thermodynamic Properties of the NaCl + H2O System. I. Thermodynamic Properties of NaCl(cr). journal of physical and chemical reference data, 1991. 21(1): p. 1‐21. 

228.  Kishore, V., et al. Predicting sharkskin instability in extrusion additive manufacturing of  reinforced  thermoplastics.  in  The  28th  Annual  International  Solid  Freeform Fabrication Symposium ‐ An Additive Manufacturing Conference. 2017. 

229.  Choong,  C.,  J.T.  Triffitt,  and  Z.F.  Cui,  Polycaprolactone  Scaffolds  for  Bone  Tissue Engineering. Food and Bioproducts Processing, 2004. 82(2): p. 117‐125. 

230.  Poh, P.S.P., et al.,  In vitro and  in vivo bone  formation potential of surface calcium phosphate‐coated polycaprolactone and polycaprolactone/bioactive glass composite scaffolds. Acta Biomater, 2016. 30: p. 319‐333. 

231.  Amani, H., et al., Controlling Cell Behavior through the Design of Biomaterial Surfaces: A Focus on Surface Modification Techniques. Advanced Materials Interfaces, 2019: p. 1900572. 

232.  Palmer,  J.A.,  et  al.,  Macrophage  phenotype  in  response  to  implanted  synthetic scaffolds:  an  immunohistochemical  study  in  the  rat.  Cells  Tissues  Organs,  2014. 199(2‐3): p. 169‐83. 

233.  Mantovani, A., et al., Macrophage polarization: tumor‐associated macrophages as a paradigm for polarized M 2 mononuclear phagocytes. TRENDS in Immunology, 2002. 23(11): p. 549‐55. 

234.  Feng, B., et al., The effect of pore size on tissue ingrowth and neovascularization in porous  bioceramics of  controlled  architecture  in  vivo.  Biomedical Materials,  2011. 6(1): p. 015007. 

235.  Shafiee,  A.,  et  al.,  Fetal  Bone  Marrow‐Derived  Mesenchymal  Stem/Stromal  Cells Enhance Humanization and Bone Formation of BMP7 Loaded Scaffolds. Biotechnol J, 2017. 12(12). 

236.  Zhang,  K.,  et  al., Effect  of microporosity  on  scaffolds  for  bone  tissue  engineering. Regen Biomater, 2018. 5(2): p. 115‐124. 

237.  Rustom,  L.E.,  M.J.  Poellmann,  and  A.J.  Wagoner  Johnson,  Mineralization  in micropores of calcium phosphate scaffolds. Acta Biomater, 2019. 83: p. 435‐455. 

238.  Perez, R.A.  and G. Mestres, Role of pore  size and morphology  in musculo‐skeletal tissue regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2016. 61: p. 922‐39. 

239.  Turnbull,  G.,  et  al., 3D  bioactive  composite  scaffolds  for  bone  tissue  engineering. Bioact Mater, 2018. 3(3): p. 278‐314. 

  Page 172 

  Page 172 

240.  Khampieng, T., et al., Protein adsorption and cell behaviors on polycaprolactone film: The effect of surface topography. Advances in Polymer Technology, 2018. 37(6): p. 2030‐2042. 

241.  De  Witte,  T.M.,  et  al.,  Bone  tissue  engineering  via  growth  factor  delivery:  from scaffolds to complex matrices. Regen Biomater, 2018. 5(4): p. 197‐211. 

242.  Stevens,  M.M.,  Biomaterials  for  bone  tissue  engineering.  Materials  Today,  2008. 11(5): p. 18‐25. 

243.  Zhang, N., et al., Assessment of the degradation rates and effectiveness of different coated Mg‐Zn‐Ca alloy scaffolds for in vivo repair of critical‐size bone defects. J Mater Sci Mater Med, 2018. 29(9): p. 138. 

244.  Shiu, H.T.,  et  al., Formation of blood  clot on biomaterial  implants  influences bone healing. Tissue Eng Part B Rev, 2014. 20(6): p. 697‐712. 

245.  Hoff, P., et  al., Human  immune cells'  behavior and  survival under bioenergetically restricted  conditions  in  an  in  vitro  fracture  hematoma model.  Cell Mol  Immunol, 2013. 10(2): p. 151‐8. 

246.  Shah,  P.,  L.  Keppler,  and  J.  Rutkowski, A  review of  platelet  derived  growth  factor playing pivotal role in bone regeneration. J Oral Implantol, 2014. 40(3): p. 330‐40. 

247.  Bonewald, L.F. and G.R. Mundy, Role of Transforming Growth Factor Beta  in Bone Remodeling: A Review. Connective Tissue Research, 2009. 23(2‐3): p. 201‐208. 

248.  Tang, W.,  et  al., Bioinspired  trimodal macro/micro/nano‐porous  scaffolds  loading rhBMP‐2 for complete regeneration of critical size bone defect. Acta Biomater, 2016. 32: p. 309‐323. 

249.  Sohier,  J.,  et  al., Tailored  release of TGF‐beta1  from porous  scaffolds  for  cartilage tissue engineering. Int J Pharm, 2007. 332(1‐2): p. 80‐9. 

250.  Durante,  C.,  et  al.,  Growth  factor  release  from  platelet  concentrates:  analytic quantification and characterization for clinical applications. Vox Sang, 2013. 105(2): p. 129‐36. 

251.  Schar, M.O., et al., Platelet‐rich concentrates differentially release growth factors and induce cell migration in vitro. Clin Orthop Relat Res, 2015. 473(5): p. 1635‐43. 

252.  Petrochenko, P. and R.J. Narayan, Novel approaches to bone grafting: porosity, bone morphogenetic  proteins,  stem  cells,  and  the  periosteum.  J  Long  Term  Eff  Med Implants, 2010. 20(4): p. 303‐15. 

253.  Microporosity  enhances  bioactivity  of  synthetic  bone  draft  substitutes.  Journal  of Materials Science: Materials in Medicine, 2005. 16: p. 467‐475. 

254.  Woodruff, M.A., et al., Sustained release and osteogenic potential of heparan sulfate‐doped fibrin glue scaffolds within a rat cranial model.  J Mol Histol, 2007. 38(5): p. 425‐33. 

255.  Schantz,  J.T.,  et  al., Repair  of  calvarial  defects  with  customised  tissue‐engineered bone grafts II. Evaluation of cellular efficiency and efficacy in vivo. Tissue Eng, 2003. 9 Suppl 1: p. S127‐39. 

256.  Schantz,  J.T.,  et  al., Repair  of  calvarial  defects  with  customised  tissue‐engineered bone  grafts  ‐  II.  Evaluation  of  cellular  efficiency  and  efficacy  in  vivo.  Tissue Engineering, 2003. 9: p. S127‐S139. 

257.  Berner, A., et al., Effects of scaffold architecture on cranial bone healing. Int J Oral Maxillofac Surg, 2014. 43(4): p. 506‐13. 

258.  Sawyer, A.A., et al., The stimulation of healing within a rat calvarial defect by mPCL‐TCP/collagen scaffolds loaded with rhBMP‐2. Biomaterials, 2009. 30(13): p. 2479‐88. 

259.  Vaquette, C., et al., A biphasic scaffold design combined with cell sheet technology for  simultaneous  regeneration  of  alveolar  bone/periodontal  ligament  complex. Biomaterials, 2012. 33(22): p. 5560‐5573. 

  Page 173 

  Page 173 

260.  Mathew,  A.,  et  al.,  Antimicrobial  and  Immunomodulatory  Surface‐Functionalized Electrospun  Membranes  for  Bone  Regeneration.  Advanced  healthcare  materials, 2017. 6(10): p. 1601345. 

261.  Somo,  S.I.,  et  al.,  Pore  Interconnectivity  Influences  Growth  Factor‐Mediated Vascularization  in Sphere‐Templated Hydrogels.  Tissue Eng Part C Methods, 2015. 21(8): p. 773‐85. 

262.  Niza,  E.,  et  al., Assessment of  doxorubicin delivery devices based on  tailored bare polycaprolactone against glioblastoma. Int J Pharm, 2019. 558: p. 110‐119. 

263.  Innocente, F., et al., Paclitaxel‐eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation? Circulation, 2009. 120(11 Suppl): p. S37‐45. 

264.  Zhu,  Y.,  et  al.,  A  highly  flexible  paclitaxel‐loaded  poly(epsilon‐caprolactone) electrospun  fibrous‐membrane‐covered  stent  for  benign  cardia  stricture.  Acta Biomater, 2013. 9(9): p. 8328‐36. 

265.  Rath,  G.,  et  al.,  Fabrication  and  characterization  of  cefazolin‐loaded  nanofibrous mats for the recovery of post‐surgical wound. Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2016. 44(8): p. 1783‐1792.