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Fases alternativas al
C18 y sus aplicaciones
Julián de la Mata
Especialista de Columnas
26-27 Septiembre 2012
Agenda
Fases alternativas al C18 y sus aplicaciones
Zorbax CN, Stable Bond Aq, Bonus RP
Polaris Amide y Ether
Zorbax Fenil y Pursuit Difenil y PFP
Columnas HILIC
WIN 2010 organization
Agilent Restricted
July 7th to 9th , 2010 Page 2
Confidentiality Label
September 27, 2012 3
C18 es la fase reversa ligada más popular porque...
Las columnas C18 proporcionan buena retencion y resolución
con muchas muestras diferentes
Las columnas C18 tiene una larga duración en muchas fases
móviles diferentes (pH 2-8 o e incluso pH 2-9 y hasta 11.5)
Las columnas C18 son muy flexibles para el desarrollo de
métodos y la optimización, debido a su amplio rango de
condiciones de uso.
Hay una gran variedad de C18’s para optimizar la selectividad y
resolución con diferentes tipos de muestras– i.e. diferentes tipos
de ligado C18 (monomerico vs. polimerico, monofuncional vs.
trifuncional, diferente densidad de ligado, diferentes reactivos de
ligado etc.) y diferentes desactivaciones ( endcapping).
Confidentiality Label
September 27, 2012 4
Química de la fase reversa ligada en HPLC
- 95% de la gente usa HPLC de fase reversa
La mayoría de las fases C18 son monocapa ligada y desactivadas
endcapping ligado Superficie de
silanoles
libre, 50% sin
desactivar
Endcapping
group
Superficie de
silanoles libres antes
del ligado
Confidentiality Label
September 27, 2012 5
Ligado Monomérico vs. Polimérico
Ligado monomerico
Ligado típico Zorbax
•Eclipse Plus
•Eclipse XDB
•StableBond
•Bonus-RP
•Agilent HC(2)/TC(2)
Ligado Polimérico
Eclipse PAH
Silano Trifuncional
Altamente reproducible
¿Porqué necesitamos alternativas al C18?
Page 6
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
min 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
mAU
0
10
20
Fenol
Metilparaben Etilparaben
N,N-Dietil-m-
toluamida
Propilparaben Butilparaben
Tolueno
Heptilparaben
Eclipse Plus C18
Eclipse Plus
PhenylHexyl
Bonus RP
Flujo: 0.5ml/min; Gradiente::25 a 80%ACN en 3min, a 4min 90%ACN,a 4.5min 25%ACN, por 6min25%ACN
Tiempo de análisis: 6min; Vol inyección.: 3µl con needle wash (Agua/Methanol=50/50)por 6 s; T: 30°C (storage/run)
DAD: 254nm bw 10, ref. 360/100nm, 4nm slit, peak width 0.01min
Impacto en el desarrollo de métodos:Resolución—Efecto
de la Selectividad, Eficiencia, y Retención
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Reso
luti
on
Increase N
Increase Alpha
Increase k'
Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad
• Cambio Fase Estacionaria
• Cambio Fase Móvil
• Temperatura
• Los Platos es lo más fácil de aumentar
Rs = N½/4 (-1)/ k’/(k’+1)
Plates: 5000 10000 15000 20000 25000
Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1
k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0
Parámetros Típicos Desarrollo Métodos
Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad
¿Qué clases de Fármacos son críticos? Ácidos, bases, moleculas polares y compuestos aromáticos/conjugados,
Page 8
4-Acetamidofenol
pKa 9.71
C l
N +
C l -
Clormequat
Adenosintrifosfato (ATP)
Acido acetilsalicílico
pKa = 3.5
cis-Permetrina
Page 9
Influencia del valor de pH en diferentes clases
de sustancias
apolar polar ionizable
Naftaleno Alcohol Bencílico Acido Benzoico
Acenafteno Nitrobenceno Benzanilida
pH 3
pH 7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (min) Time (min) Time (min)
Page 10
Efecto del pH en la Forma de Pico
a o cerca del pKa de la Muestra
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (min) Time (min)
Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Fase Móvil: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN
Flujo: 1.0 mL/min. Temperatura: RT
pH 4.4
Cerca
del pka
pH 3.0
Al menos una
unidad de pH
alejada del pka
Ibuprofeno
pKa = 4.4
CH3CHCOOH
CH2CH(CH3)2
• Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y
esto debe evitarse.
Tf = 3.9 Tf = 1.8
Page 11
Fases ZORBAX CN y StableBond Aq,
ZORBAX Bonus RP, Polaris Amide y Polaris Ether
para compuestos polares
O
CH3
O
CH3
StableBond CN
Eclipse XDB CN
O
Aq StableBond Aq
(Bonus RP y Polaris tambien para bases fuertes)
Page 12
Separación de Acidos/Bases. Fases Stablebond
Columna: 4.6 x 75 mm, 3.5 m Fase Móvil : 80% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 : 20% MeOH Flujo : 1.0 mL/min Temperatura: 35°C Detección: UV 254 nm
StableBond
SB-C18
Time (min)
0 5 10
1 3
2
StableBond
SB-Phenyl
1
3
StableBond
SB-C8
Time (min)
0 5 10 15
1
2, 3
Time (min)
0 5 10 15 20
Time (min)
0 5 10
2
3
1
2
StableBond
SB-CN
Muestra: 1. Barbital 2. Sulfametoxazol 3. Cafeina
Page 13
Selectividad óptima para separaciones ultrarrápidas
min
RRHT SB-Phenyl: Selectividad más rápida!
Columna: RRHT 4.6 x 50mm, 1.8um Fase Movil: Acetonitrilo (40%):Tampon 60% pH=2.4 25mM NaH2PO4
Flujo: 1.85 mL/min Detección: DAD, 254 nm LC: Agilent 1200 RR LC Vol inyección: 1 uL
Orden de elución: Picos 3,4 & 5
Muestras:
1. Tolmetina
2. Naproxeno
3. Diflusinal
4. Ibuprofeno
5. Diclofenaco
para SB-Phenyl
SB-Phenyl 1.8um
SB-C8 1.8um
SB-C18 1.8um
SB-CN 1.8um
0 1 2 3 4 5
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Optima!
Doble de tiempo
Tailing
Interacciones secundarias
Co-Elución
Page 14
ZORBAX: Bonus RP
1
1
1
1
1
1
PG R
PG R
PG R
Rango de pH: 2 - 9
Límite de temperatura: 60ºC Tamaños de Partícuila: 1.8, 3.5, 5, 7 3m
•Gel de sílice ultra pura Zorbax RxSil
•Silanos monofuncionales
•Grupo amida polar embebido
•Cadenas laterales voluminosas para
estabilidad a bajo pH
•Triple desactivación para estabilidad
a pH medio y buenas formas de pico
Ventajas:
Analisis de compuestos altamente
polares en condiciones 100% acuosas.
Selectividad ortogonal
Page 15
Columnas:4.6 x 150 mm, Fase Móvil: 25 mM Citrato
Sódico, pH 6/ MeOH, 75/25, Flujo: 1 mL / min.,
Detección: 254 nm
Volumen de inyección: 3 µLMuestra: Cefalosporinas
(1 Cefalexin, , 2 Cefaclor, 3 Cefuroxim, 4 Cefoxitin)
Columnas: 4.6 x 150 mm, Fase Móvil: MeOH:0.1% TFA
(70:30) Flujo: 1 mL/min., Temperatura: RT, Inj.: 2 µL,
Detección: 254 nm, Muestra: Triazinas (1. Prometrina 2.
Tebuthion, 3. Atrazina, 4. Propazina, 5. Diuron, 6.
Propanill, 7. Dacthal
Selectividad Ortogonal de la Bonus RP
mAu
0
40
80
120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ063.D)
min2 4 6 8
mAu
0
40
80
120 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ062.D)
0
1
2
3
4
2
3
1
4
Bonus-RP
Alkyl-C8
mAU
0
400
800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE046.D)
min0 2 4 6 8
mAU
0
400
800 DAD1 B, Sig=254,16 Ref=360,60 (F:\2\DATA\TRIAZINE\AZINE047.D)
Bonus-RP
Alkyl-C8
1
2 3 4
7
5 6
Cefalosporinas Pesticidas
1
2
3 5
4
7 6
La mejor resolución con Poroshell 120 Bonus-RP –
Compuestos básicos- β-Bloqueantes
2
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
1
1
2
3
3 4
4
5
5 6 7
6 7
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300 2
1 3 4 5
7 6
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
min 0 2 4 6 8 10 12
mAU
-100
0
100
200
300
2
1 3 4
5 7
6 Poroshell 120 Bonus RP
10 mM pH 3.8 NH4HCO2, Metanol; 90 % B a 30 % B durante 12 min, 0.35 ml/min, todas las columnas 2.1 x 100 mm
1. Atenolol, 2. Pindolol, 3. Naldolol, 4. Metoprolol, 5. Acebutolol, 6. Propranolol, 7. Alprenolol
Page 17
.
Polaris Amide y Polaris Ether
Las fases Polaris C18/C8-A y Ether
deslocalizan la densidad de electrones, lo
que minimiza las interacciones
secundarias con los silanoles libres
residuales
Optimización de la simetría de pico
Tamaños de partícula: 5 und 33m
Las Fases Polaris optimizan la forma de pico y la
retención
Polaris C18 Ether 30 X 2.0
Polaris C18A 50 X 2.0
Pursuit C18 50 X 2.0
Optimización de la forma de pico
Mejora la retención
Polaris C18 Ether 30 X 2.0
Polaris C18A 50 X 2.0
Pursuit C18 50 X 2.0
Page 19
ZORBAX Bonus RP
Polaris Amide y Ether
• Fases alquílicas con amida
polar embebida e intensa
desactivación (endcapping)
=>Para el análisis de
compuestos polares
=> Para trabajar con fases 100%
acuosas
Para rango de pH medio
StableBond-Aq
• Fase Reversa Polar con cadenas laterales voluminosas
=> Para el análisis de compuestos polares
=> Para trabajar con fases 100% acuosas
Para rango de pH bajo y alta temperatura
Desarrollo de métodos con fases polares de
diferente selectividad
Page 20
Columna: 4.6*150 mm (5µm)
Fase Móvil: 99% 20 mM NaHPO4, pH2, 1% ACN
Muestra: Ácidos orgánicos
1. Acido láctico
2. Ácido acético
3. Ácido Cítrico
4. Fumárico
5. Ácido succínico
Columna: 4.6 x 150, 5 um
Fase Móvil: (25 mM Kphos , pH7.2)/(MeOH: ACN,
50:50), 45:55
Muestra:Supresores del apetito. Aminas
1. Fentermina pKa10.1
2. Fenfluramina pKa 9.1
StableBond-Aq
Desarrollo de métodos con fases polares de
diferente selectividad
Bonus RP
Page 21
Separación de Uracilo y Urea via HILIC con
ZORBAX RxSIL
HPLC System: HP1090
Columna:ZORBAX Rx-SIL, 4.6 x 150 mm
Part. No.: 883975-901
Fase Móvil: isocrático - 90/10
ACN: K2HPO4, 20 mM pH 7.2
Detección: UV 210 nm
Flujo: 1 mL/ min.
Temperatura: RT
min1 2 3 4 5
mAu
0
20
40
60
80
100
120
140
160
DAD1 A, Sig=210,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ112.D)
0
ZORBAX Rx-SIL
1
2
1. Uracilo
2. Urea
Precaución: Las columnas Rx-SIL se envían en disolvente de fase normal (hexano). Deben acondicionarse
previamente para trabajar en HILIC. El procedimiento de lavado está disponible
Page 22
HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography
Tipos de compuestos:
Moléculas altamente polares que no se retienen en fase reversa
Fases estacionarias:
Silica gel Rx Sil, Amino, Diol, Cyano y las especiales (zwitterionicas)
Fase móvil:
>50-60 Acetonitrilo mezclado con fase acuosa/polar , ácido fórmico, formiato, acetato (no tampón fosfato)
Gradiente:
100% ACN a 50%ACN
El agua es el disolvente más fuerte
Detección:
UV y MS-ESI
El alto contenido orgánico ofrece una buena sensibilidad en MS
Confidentiality Label
September 27, 2012 23
Analitos típicos en HILIC
1. Amino acidos (cuando solo unos pocos
son de interés)
2. Bases nucleicas (purinas y pirimidinas,
uracilo, adenina, guanina, timina,
cistosina)
3. Nucleosidos (Adenosina, citosina.)
4. Alcaloides
5. Carbohidratos
6. Acrilamida
Melamina
Citosina
Amfetamina
CH 2 CHCH 3
NH 3 +
24
Mecanismos de interacción HILIC en columnas
basadas en sílica
O O O O
H2O H2O
H2O H2O H2O
H2O
H2O H2O
- - - -
H2O
3
CH 2 CHCH 3
NH +
ACN
ACN ACN
ACN ACN
ACN ACN
ACN ACN ACN
3
CH 2 CHCH 3
NH +
1. Partición con la capa de agua adsorbida a la sílice
2. Intercambio iónico con los silanoles
1.
2.
Silica
Page 25
Elución de los componentes de una muestra
Alcanos
Olefinas
Aromaticos
Etéres
Esteres, Aldehidos,
cetonas
Alcoholes, Aminas
Amidas
Ácidos carboxílicos
NP
RP
Se
cu
en
cia
de
Elu
ció
n
< k’-Valor
No polar
polar
HILIC
Secu
en
cia
de E
lució
n
< k’-Valor
polar
Alcoholes, Aminas
Amidas
Ácidos carboxílicos
< k’-Valor
Page 26
Condiciones RP
ZORBAX Eclipse XDB C18,
2.1*150 mm
100ppb
5%ACN – 90%ACN en 10 min
Ranitidina
m/z 315 - 176
Condiciones HILIC
ZORBAX Eclipse
RxSil,
2.1*150 mm
100ppb
95%ACN – 50%ACN
en 10 min Ranitidina
m/z 315 - 176
Paroxetina
m/z 330 - 192 Paroxetina
m/z 330 - 192
Separación HILIC de
productos
farmacéuticos básicos
en suero mediante
ZORBAX RxSil
Nota de aplicación 5989-3761EN
Page 27
Ventajas con HILIC
Buena retención de compuestos altamente polares que no se
conseguiría en el modo de RP.
Selectividad diferente a la LC RP y NP. Selectividad ortogonal. Orden
de elución inversa a RP
• Pueden usarse flujos más altos y/o columnas más largas debido a la baja
viscosidad de las fases con alto contenido en organico: mayor eficiencia
Mejor sensibilidad en en LC/MS
• Un alto contenido en orgánico lleva a una mejor s/n en ESI-MS
La preparación de la muestra es más fácil gracias a la alta
concentración de fase orgánica
• SPE, o extracción líquido/líquido que dejan las muestras en un alto
contenido orgánico.
• Desolvatación y spray más eficaz en electrospray MS
• Puede facilitar la solubilidad de la muestra
Page 28
Consideraciones a tener en cuenta en HILIC
El gel de silice necesita una equilibración más lenta
• Una equilibración intensa es esencial para la obtención de resultados reproducibles
• Es aconsejable el uso de formiato / acetato + sal (amonio, etc) para aumentar la fuerza iónica, y obtener un mejor control de la forma de pico y de las interacciones.
• A menudo se logran mejores resultados en modo isocrático.
• Gradientes restringidos de 100%-50% de ACN
Las separaciones son muy sensibles al pH, éste debe ajustarse con mucha precisión.
• El pH elegido debe permitir la máxima interacción con la gel de slice
• Picos dobles (peak splitting)
• Causa: los mecanismos de par iónico se ajustan a través de la fuerza iónica por la concentración de la sal o tampón
Page 29
Separación de analitos del ―Grupo 4‖ de la EPA
1694: HILIC con ZORBAX HILIC Plus en aguas
residuales Ap.Note 5989-3761EN
Condiciones HILIC
ZORBAX Eclipse HILIC Plus,
2.1*150 mm, 3.5 um
100ppb
98%ACN – 70%ACN in 12 min
Temperatura: 25C
Flujo:0.25 ml/min
Pos ESI Ionisierung
Sensibilidad: por debajo de
ppb (0.1 ppb)
Poroshell 120 HILIC -análisis de Catecolaminas
min 1 2 3 4 5
mAU
0
50
100
150
200
250
0.2
22
0.6
71
1.2
65
1.8
85
2.1
61
3.0
72
A: 90 (Tampón100 mM pH 3) 10 MeCN
B: 90 MeCN 10 (Tampón100 mM pH 3)
% A % B
Inicial 0 100
5 Min 7.5 92.5
6 min 0 100
12 min 0 100
0. 55 mL/min
Poroshell 120 HILIC 2.1x 100mm
1. Dopamina, 2. Epinefrina, 3. Norepinefrina
3
1
2
• Las Catecolaminas pueden ser
dificiles de separar por fase reversa
• Este cromatograma muestra un
rápido análisis de 3 catecolaminas
con la columna Poroshell 120 HILIC
Group/Presentation Title
Agilent Restricted
Month ##, 200X
Tipo de fase
Fenil ligada
Desacti
vada
Tipo de
Silica Columna Agilent Qué las diferencia?
Dimetil
Fenilhexil Si B Eclipse Plus Phenyl-
Hexyl
El grupo hexilo más
voluminoso añade
hidrofobicidad a la fase.
Dimetil Feniletil
Si B Eclipse XDB-Phenyl Primera Fenil Silica Tipo B
Diisopropil
Feniletil No B SB-Phenyl
La no desactivación
aumenta las interacciónes
hidrofílicas y con los
silanoles
Dimetil Feniletil
Si A ZORBAX Phenyl
Fenil original
Silica tipo A con diferente
selectividad
Diphenyl
Si B Pursuit Diphenyl Única con funcionalidad
Difenilo
Fases ZORBAX Fenil y Pursuit DiPhenyl.
Un amplio rango de selectividades alternativas.
Pursuit Diphenyl- Selectividad Unica
WIN 2010 organization
Agilent Restricted
July 7th to 9th , 2010 Page 32
Par Crítico
Antifungicos en Pursuit XRs DP y C18
Columnas: Mencionadas en los cromatogramas
Dimensiones: 150 x 4.6 mm, 5m
Fase movil : A: H2O + 0.1% HCOOH, B: CH3CN +
0.1% HCOOH
A:B - 80:20
Flujo: 1.0 ml/min
Temperatura: Ambiente
Detección: 254 nm
Muestra: 1. 4-Acido Aminobenzoico
2. Acido Sorbico
3. Acido benzoico
4. Acido salicílico
Ácido Benzoico Ácido Sorbico
Pursuit PFP (Pentaflurofenil): Analitos polares,
Nucleotidos y Nucleosidos
Buena alternativa a C18 para compuestos polares en fases 100% acuosas o con
alto contenido acuoso, como compuesos aromáticos y nitroaromáticos y sistemas
conjugados (esteroides),isomeros posicionales y compuestos halogenados
Selectividad basada en interacciones p-p, transferencia de cargas, dipolos,
enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas.
Compatible con fase reversa, fase normal e HILIC. A bajo contenido de organico
la retencion se basa en fuertes interacciones dipolo-dipolo, y a alto contenido de
orgánico en interacciones hidrofóbicas y p-p
Page 33
DISCOVERY TOUR
26-27 Septiembre 2012
Page 34
Formulas moleculares de hormonas esteroideas
Pequeños sistemas conjugados
Page 35
Esteroides – Fase Fenilo y ACN
El ACN facilita la separación según la hidrofobicidad
Page 36
Esteroides – Fase Fenilo y MeOH
El MeOH facilita la separación según la aromaticidad/electrones pi
Page 37
App. Note 5989-9130EN
Formulas moleculares de hormonas esteroideas
: Estrógenos Sistemas aromáticos altamente conjugados
Page 38
Estrógenos: Diferencias de selectividad ZORBAX Eclipse
Plus C18/FenilHexil
Condicions Isocráticas:
Fase Móvil : 60% MeOH/40% Agua, Flujo: 1ml/min, Vol. inyección: 3ul, Temperatura: 25C, Detección: 220nm
App. Note 5989-9130EN
Alrededor de un 30% más de eficiencia
La mejor resolución con Poroshell 120 Phenyl-Hexyl
– Para compuestos esteroideos
0 2 4 6 8 10 12
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
100
150
mAU
0
50
100
150
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
Poroshell 120 Bonus RP
Separación de 8 Esteroides : 40 -80 % MeOH/14 min, 0.4 ml/min 25 C 2.1 x 100 mm , 0.1 % acido fórmico tanto en agua como en MeOH
1.Hydrocortisone, 2.b-Estradiol, 3. Andostadiene 3,17 dione, 4. Testosterone, 5.
Ethyestradione, 6. Estrone, 7. Norethindone acetate, 8. Progesterone
1 3
2,5 6
4 7 8
1
3
2,5,6
4 7 8
1
1
3,2
3
7,8
7 8
4
2 5 6
6,4
5
Page 40
Structures of Azo Dyes
Aniline o-toluidine Methoxyanaline Benzidine
ChloroanilineDimethylbenzidine Napthalamine
Dichlorbenzidine
3,3′-Dimethoxybenzidine
Estructuras de los colorantes azoicos
R-N=N-R‘ Compuestos azo
HN=NH Diazeno
N=N Grupo Azo
Page 41
Condiciones:
Fase Móvil A:10mM Acetato amónico, B: MeOH, Gradiente: 25%B->90%B en 9 min, Flujo: 1ml/min, Vol. Inyección: 2ul,
Temperatura: 25C, Detección: 220nm
Colorantes Azo y sus productos de degradación
en diferentes fases Zorbax Fenil.
Separación de derivados de la degradación de
colorantes Azo -N=N-
15 to 100 % MeOH over 10 min @ 0.4 ml/min, Solvent A is 10 mM Ammonium Acetate pH 4.8
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000002.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000004.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000006.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=260,80 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY30000008.D)
Poroshell 120 EC-C18
Poroshell 120 SB-C18
Poroshell 120 Phenyl Hexyl
Poroshell 120 Bonus RP
9 picos
Different Bonded Phases – Different Selectivity
NSAIDS
Mobile Phase 40 % ACN 60 % 25 mM Sodium Phosphate Buffer pH= 2.4 Flow Rate= 1.5 ml/min 4.6 x 50mm UV
210 nm 2µl Elution order for Eclipse Plus Phenyl Hexyl: (1) Piroxicam, (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen,
(5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex (equal portions of approximately 1 mg/ml solutions
Eclipse Plus Phenyl-Hexyl
Eclipse Plus C8
Eclipse Plus C18
min0 2 4 6 8 10
mAU
0
50
100
150
200
min0 2 4 6 8 10
mAU
0
100
200
300
400
min0 2 4 6 8 10
mAU
0
100
200
300
1 2
3
4
56
7
3
4
56
7
1,2
3
4
56
7
1,2
α2,1=1.11
α6,5=1.24
α2,1= 1
α5,6=1.11
Rs5,6=2.26
α2,1= 1
α5,6=1.08
Rs5,6=1.84
Eclipse Plus – Selectividad en función del grupo
funcional fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)
Page 44
RRHT Eclipse Plus Phenyl - Hexyl
4.6 x 50 mm, 1.8um
4.6 x 100 mm, 3.5um
4.6 x 150 mm, 5um
Fase Móvil 40 % ACN 60 % 25 mM Na Tampon Fosfato pH= 2.4 Flujo= 1.5 ml/min Detección: UV 210 nm 2
Muestra: (1) Piroxicam , (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen, (5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex 1 mg/ml)
2 µ l inj
4 µ l inj
6 µ l inj
min 2.5 5 7.5
10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
50
100
150
200
min 2.5 5 7.5 10 12.5 15
17.5 20
mAU
0
50
100
150
200
min 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20
mAU
0
50
100
150
200
Eclipse Plus Phenylhexyl – La selectividad es
independiente del tamaño de partícula fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)
Confidentiality Label
September 27, 2012 45
Columnas Agilent ZORBAX y especiales de HPLC Columnas para Pequeñas Moléculas
Fase Reversa • Poroshell 120 EC-C18, EC-C8
• Eclipse Plus C18, C8, Phenyl-Hexyl, Poroshell Phenyl-Hexyl
• Eclipse XDB-C18, C8, Phenyl, CN, Poroshell EC-CN
• StableBond-C18, C8, Phenyl, C3, CN and SB-AQ, Poroshell 120 SB-C18 , SB-C8 y SB-Aq
• Bonus-RP, Polaris C18-A , C18-eter. C8-A y C8-eter, Poroshell 120 Bonus-RP
• Extend-C18
• Pursuit XRs Diphenyl y PFP
• Rx-C18, Rx-C8
• Traditional/Original ZORBAX – ODS (C18), C8, Phenyl, CN, TMS
Fase Normal • Rx-Sil
• Original ZORBAX – CN, NH2, Sil, Eclipse XDB-CN
HILIC
• ZORBAX HILIC Plus
• Poroshell 120 HILIC
Columnas para BioMoleculas –
Proteinas y Peptidos
Fase Reversa
• 300StableBond
• 300Extend-C18
Intercambio iónico – Bio SCX Series II – para
aplicaciones de proteómica 2D y Bio-IEX
Poroshell (Fase Reversa)
• 300SB-C18, C8, C3, 300Extend-C18
Exclusión Molecular
• GF-250 and GF-450
• Bio-SEC
Bio Monoliths
• Protein A
• Ion-Exchange (DEAE, QA, SCX)
Columnas Poliméricas
• Hi-Plex poliméricas para Carbohidratos y acidos
organicos
• PLRP-S y PL-IEX y PLGel para GPC
¿Entonces, que fase ligada debo
elegir?* C18 ofrece la mayor retención, quizás demasida para algunas
muestras y a veces muy poca para otras.
C8 retiene menos que C18, pero con similar selectividad en la
mayoría de los casos
Fenil significantemente menos retentiva para compuestos no
polares, pero retiene bien compuestos polares, por lo que
reduce los tiempos de análisis para las mezclas polar/no polar
CN la menos retentiva, cambios en selectividad, buena para
reducir tiempos de analisis para compuestos que eluyen muy
tarde y evita las separaciones en gradientes.
HILIC ofrece buena retención de compuestos muy polares con fases
móviles de alto contenido de orgánico
* Mas del 20% de Organico
¿Entonces, que fase ligada debo
elegir?* Fases Móviles al t ament e
Acuosas*
C18 raramente ofrece ventajas en la retención, y la selectividad
puede no ser óptima y con poca retención
C8 a menudo proporciona un poco más de retención que C18
con una selectividad similar
Fenil más retentivo con cambios de selectividad
C3 similar a Fenil en retención pero muestra cambios en selectividad
comparada con C18, C8 y Fenil
CN la menos retentiva, grandes cambios en selectividad,
buena resolución.
Bonus RP, las mejores columnas en cuanto a retención y selectividad para
SB-Aq, fases 100% acousas
Polaris,PFP
* Por debajo del 20% de Orgánico
Nuestra recomendación es usar
Poroshell 120, disponible en
9/27/2012
Agilent Confidential 48
EC-C18
EC-C8
SB-C18
SB-C8
EC-CN
Fenil-Hexil
Bonus RP
SB-Aq
HILIC
1.7um
0.5um
0.5um
Y las precolumnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
Nuestra recomendación es usar
Poroshell 120, disponible en
9/27/2012
Agilent Confidential 49
EC-C18
EC-C8
SB-C18
SB-C8
EC-CN
Fenil-Hexil
Bonus RP
SB-Aq
HILIC
1.7um
0.5um
0.5um
Y las precolumnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
Pida el nuevo catálogo
5990-5951EN
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Gracias por su atención