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From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD

January 2006

Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et d'Enzymologie

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UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU -------------------

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Unit de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre (U.F.R.S.V.T.)-----------------

Centre de Recherche en Sciences Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN)-----------------

Anne 2006-2007

Laboratoire de Biochimie Emails: [email protected] [email protected] Tel. +227 70272643

TRAVAUX PRATIQUES BIOCHIMIE STRUCTURALE & ENZYMOLOGIE Licence de Biochimie DUT- Contrle Qualit- IAA-2me Anne

Enseignant Pr. Mamoudou H. DICKO, MSc, DSc, PhD Matre de Confrences en Biochimie et Biotechnologie

Moniteurs - Obam Luis Clment (Thse Biochimie) - Karim Koudougou (Thse Biochimie) - Bayili Romaric (DEA Biochimie) - Abdoul-Latif Fatimatou (DEA Biochimie) - Diabat Wilfrid (DESS-IAA) Techniciens Paul KAGANBEGA Kabor Dieudonn Traor EugneTP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

2 AVANT PROPOS

Inutile de rappeler ici les exigences en matire de comportement au laboratoire, la conduite tenir, les rgles dutilisation des appareils etc., car elles sont senses tre connues par un tudiant de niveau Licence ou 2me Anne DUT-Contle de Qualit en Agroalimentaire.

Les objectifs globaux de ce TP sont de : connatre les proprits chimiques et physiques des constituants de la matire vivante et les mthodes de dosage; tre capable d'utiliser les outils de base de la biochimie, de les manipuler correctement avec exactitude et prcision et de prsenter des donnes sous forme de tableaux, de figures ou de graphiques. Le but de ce cours sera avant tout pratique. Il faut donner au futur biochimiste les moyens thoriques de comprendre les techniques biochimiques utilises en laboratoire et dans l'industrie. Le plus souvent, plusieurs techniques s'offrent au Biochimiste qui est amen faire un choix selon les avantages et les inconvnients de chaque mthode et les proprits du matriel tudier. Le gradu devra tre capable de justifier et de proposer ce choix en situant le problme dans un contexte plus gnral. Il devra galement tre capable de comprendre et de proposer l'intgration de plusieurs techniques en une stratgie. Enfin, la Biochimie et l'instrumentation tant en perptuelle volution, le futur gradu devra tre form pour apprendre apprendre. Le plus souvent, le Biochimiste est amen faire un choix selon les avantages et les inconvnients de plusieurs techniques et les proprits du matriel tudier. Enfin, l'tudiant devra tre capable de faire un rapport concis sur le travail demand et les rsultats obtenus. Il devra tre capable de discuter ses rsultats.

copyright , Droit dauteurs : aucune photocopie du document nest autorise sans laccord crit des auteurs.

Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

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SOMMAIRETP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LAMIDON TOTAL,

LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE ................................................................. 4 TP. 2. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SUCRES TOTAUX ET DES SUCRES REDUCTEURS......................................................................................... 7 TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE ................................................................................................................ 9 TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE .............................................................................................................. 10 TP. 4. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE ENZYMATIQUE DE LAMIDON..... 13 TP. 5. COMPARAISON DU DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES PROTEINES PAR LA METHODE DE BRADFORD/SEDMAK ET PAR LA METHODE DE KJELDAHL................................................................................. 17 TP. 6. EXTRACTION ET CARACTERISATION DES LIPIDES ...................................... 21 TP. 7. ETUDE CINETIQUE DE LHYDROLYSE DES TRIGLYCERIDES PAR LA LIPASE DE Pseudomonas Cepacia ........................................................................ 27 TP. 8. FRACTIONNEMENT DUN HOMOGENAT DE PANCREAS ET

CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES ..................................... 33 TP. 9. ETUDE CINETIQUE DE LA LIBERATION DES ACIDES GRAS PAR LA LIPASE PANCREATIQUE A PARTIR DHUILE DARACHIDE .................... 31 TP 10. ELECTROPHORESE DES PROTEINES................................................................. 37


4 TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE LAMIDON TOTAL, LAMYLOSE ET LAMYLOPECTINE Principe Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type (14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires mais branche, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de glucose. Lamylopectine contient plus de 106 rsidus de D-glucose , la rendant ainsi la macromolcule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de lamylopectine est semblable celle du glycogne (polysaccharide de rserve chez les animaux) mais le nombre de rsidus de D-glucose dans les ramifications est de lordre de 8 12 dans le glycogne. En dautres termes le glycogne est plus ramifi que lamylopectine. Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont diffrents. De ce fait ces complexes ont des longueurs dondes maximales pour lamylose (max = 630 nm) et lamylopectine (max = 548 nm) qui sont diffrentes. En plus lamylose absorbe dans le proche visible tan disque lamylopectine ny absorbe pas (Figure 2). On peut donc utiliser cette diffrence spectrale pour doser simultanment lamidon total, lamylose et lamylopectine dans un matriel biologique. Dans cette manipulation on considrera que labsorbance 580 nm est lie la fois lamylose et lamylopectine, par contre labsorbance 720 nm est lie essentiellement lamylose. Matriels et ractifs Bain marie Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v) dans 0.1 N HCl. Amidon de pomme de terre 1 N KOH 1 N HCl

Mode opratoire a. Courbe dtalonnage de lamidon standard

Disperser 0.5 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un volume de100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 5 mg/ml. La courbe dtalonnage est tablie selon le tableau ci-dessous :


5 Tableau 1. Etablissement de la courbe dtalonnage. N.B. Les mesures sont faites en triplet Ractif /tube T=0 (Blanc) (5 0 T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 0.07 4.83 0.1 T=8 0.08 4.82 0.1 T=9 0.09 4.81 0.1 T=10 0.10 4.8 0.1

Amidon 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 mg/ml) en ml H2O (ml) 4.9 4.89 4.88 4.87 4.86 4.85 4.84 Ractif I2/KI 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 (ml) Calculer la conc damidon (mg/ml) Dure 10 min avant les lectures des DOs dincubation DO1 (580 nm)

DO2 (720 nm) Moy DO1 Moy DO2 - Tracer la courbe f([amidon]) = DO1, amidon total Tracer la courbe f([amidon]) = DO, amylose sachant que la proportion damylose et damylopectine dans lamidon de pomme de terre est respectivement de 20% et 80%. b. Prparation de lchantillon analyser

Prendre 0.1 g de farine de matriel biologique bien broy ( = 0.5 mm) et y ajouter 5 ml de 1 N KOH. Bien homogniser la solution la temprature ambiante et la neutraliser ensuite avec 5 ml de 1 N HCl. Bien sassurer que la solution est neutre laide dun papier pH. Mettre ensuite le mlange en bullition au bain-marie pendant 15 min. Rajuster le volume du mlange 10 ml. Centrifuger le mlange et prendre le surnageant. Filtrer au besoin le surnageant et lutiliser pour le dosage de lamidon. C. Dosage de lamidon dans le matriel biologique. N.B. Les mesures sont faites en triplet Blanc Echantillon 1 0 0.05 ml 4.90 ml 4.85 ml 0.1 ml 0.1 ml 10 min avant les lectures des DOs Echantillon 2 0.05 ml 4.85 ml 0.1 ml

Ractif /Echantillon Echantillon H2O Ractif I2/KI Dure dincubation Moy DO (580 nm) Moy DO (720 nm)

A laide de ces mesures, calculer les proportions damidon total, damylose et damylopectine dans les chantillons. Donner une conclusion.


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A M Y LO S E

A M Y L O PE C T INFigure 1. A) structure linaire de lamylose ; B) Structure ramifie de lamylopectine

Figure 2

Rfrence. Jarvis, C. E. and Walker, J. R. L. (1993) Simultaneous, rapid, spectrophotometric determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 , 53-57


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TP2. Dosage spectrophotomtrique des sucres totaux et des sucres rducteursPrincipe En milieu acide et chaux, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolyses. Les oses simples ainsi librs subissent une dshydrations intramolculaires pour des drivs furfuraux (furfural ou hydroxymethyl furfural). La fonction aldhyde des furfuraux se condense ainsi en milieux acides avec lhydroxyl dun compos phnolique (Figure 1) pour donner des actals ou hmi-actals de couleur rougetre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Cette mthode permet ainsi de doser tous les glucides totaux dun matriel biologique. Les sucres rducteurs sont doss par une mthode colorimtrique avec le ractif lAcide 3,5Dinitrosalycilique (DNS). Cest une raction doxydo-rduction non stchiomtrique permettant de quantifier les sucres rducteurs. Dans cette raction, la fonction aldhyde du sucre libre (rducteur) est transforme en fonction carboxylique par le DNS (oxydant). Labsorbance du DNS oxyd est lue 546 nm. Matriels et ractifs Bain marie Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Solution de phnol : 5% (p/v) dans leau Acide sulfurique 75% Ractif au DNS Solution A= 2g de DNS dispers dans 40 ml deau distille Solution B. 3.2 g de NaOH dissout dans 30 ml deau Les deux solutions A et B sont mlanges et on y ajoute 60 g de tartrate double de sodium et de potassium. Dissolution du mlange peut ncessiter un lger chauffage su une plaque chauffante. Aprs dissolution, le volume est ajust 100 ml avec leau. Solution standard de maltose 0.05 mg /ml pour les sucres totaux Solution de maltose 0.5 mg/ml pour les sucres rducteurs

-

Mode opratoire a. Etablissement des courbes dtalonnage

Tableau 1. Courbe dtalonnage pour les sucres totaux : Ractif /tube T=0 T=1 T=2 T=3 (Blanc) Maltose (0.05 0 0.1 0.2 0.3 mg/ml) H2O (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 Phnol (5%) (ml) 0.5 0.50 00.5 0.5 H2SO4 2ml 2ml 2ml 2ml Incubation bain 15 min marie bouillant Incubation lobscurit 15 min

T=4 0.4 0.1 0.5 2ml

T=5 0.5 0 0.5 2ml


8 Ractif /tube T=0 (Blanc) T=1 T=2 T=3 T=4 T=5

Calcul maltose Moy A492 -

conc.

Tracer la courbe A492 = f([maltose]); et donner lquation de la droite.

Tableau 2. Courbe dtalonnage pour les sucres rducteurs Ractif /tube T=0 (Blanc) (0.5 0 T=1 0.1 0.4 1 T=2 0.2 0.3 1 T=3 0.3 0.2 1 T=4 0.4 0.1 1 T=5 0.5 0 1

Maltose mg/ml) H2O (ml) 0.5 Ractif DNS 1 (ml) Incubation bain 8 min marie bouillant Calcul conc. maltose Moy A546O -

Tracer la courbe f([maltose]) = A546 ; et donner lquation de la droite. b. Prparation et dosage des chantillons analyser

1 g de farine dchantillon est dispers dans 10 ml de DMSO 25% (v/v) dans leau. Le mlange est incub au bain marie bouillant pendant 15 min. 0.1 ml de ce mlange est dilu dans 9.9 ml deau. - Dosages des sucres totaux. A 0.5 ml de ce dernier, on ajoute 0.5 ml de phnol (5%). Aprs homognisation, on ajoute 2 ml de H2SO4 (75%). Ce mlange est ensuite trait comme prcdemment dcrit pour le standard. Faire lessai en triplicate. - Dosage des sucres rducteurs. 0.1 ml de lchantillon pralablement dispers dans le DMSO sont mlangs avec 0.4 ml deau distille. La solution est ensuite mlange avec 1 ml du ractif au DNS puis incub au bain comme prcdemment dcrit pour le standard. Faire lessai en triplicate. Calculer la proportion des sucres totaux et des sucres rducteurs dans lchantillon Discuter les rsultats.


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H2SO4

a)

+ 3 H2O

Furfural D-Ribose

H2SO4

b)

+ 3 H2O +

D-Glucose

5-Hydroxymethyl Furfural

Figure 1. a) Exemple de raction de dshydratation dun pentose tel que le D-ribose pour donner le furfural b) exemple de raction de dshydratation dun hexose tel que le D-Glucose pour donner le 5-Hydroxymethyl furfural c) Raction de condensation entre le furfural et une compos phnolique tel que le phnol, lorcinol, le resorcinol.

c)

Actals colors

Rfrences. Sucres totaux : Fox, J. D. and Robyt, J. F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader. Analytical Biochemistry., 195, 93-96. Sucres rducteurs: Miller, G. L. (1958) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31, 426-428.


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TP. 3 Comparaison des pouvoirs rotatoires des mono et polysaccharides : Etude de la mutarotation du glucosePrincipe Les carbohydrates sont des composs optiquement actifs, c'est--dire quils dvient la lumire polarise. Cette dviation est due lexistence de plusieurs carbones asymtriques dans les sucres. En solution, les sucres subissent la mutarotation lie la variation lente de la configuration strochimique de leurs carbones asymtriques. Cette mutarotation peut induire une augmentation ou diminution de langle de dviation selon les pouvoirs rotatoires spcifiques des diffrents anomres. Le pouvoir rotatoire spcifique dune substance optiquement active se calcule selon la formule :

[ ] =

LxC

[] = pouvoir rotatoire spcifique du compos = angle de rotation observ au polarimtre L = longueur du tube de polarimtre (dm) C = concentration du compos en g/ml

Ractifs et appareils Polarimtre Solutions de sucres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, amidon, quilibres dans leau. Poudre de glucose

Mode opratoire Le polarimtre utilis dans ce TP est le Ceti polaris (Figure 1).

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Oculaire Bouton de magnification Analyseur ou bouton de contrle et de focalisation Bouton de focalisation de loculaire Fentre de lecture des valeurs des angles Compartiment contenant le tube du polarimtre de longueur variable Filtre de verre Lampe de sodium (=589 nm) Bouton de mise en marche

Figure 1. Description du polarimtre


11 Utilisation du polarimtre Aprs avoir allum la lampe de sodium, attendre 10 min de chauffage. Introduire le tube contenant leau distille et lire le blanc. Ajuster le bouton de focalisation dobservation pour obtenir une image claire.

Mettre dans le tube du polarimtre une substance optiquement active (par exemple une solution de sucre). Noter la longueur du tube. Tourner le bouton de contrle jusqu ce que la plaque indique presque zro de tous les deux cts (gauche et droite). On observe un cercle jaune/orange divis par une bande noire comme suit : Valeur de mesure <

Tourner lanalyseur la main jusqu ce que les trois parties du cercle aient la mme couleur jauntre :

Valeur de mesure =

Lorsquon dpasse la valeur exacte de langle , on observe limage ci-dessous :

Valeur de mesure >

La valeur positive de langle est lue droite et la valeur ngative gauche. La valeur de langle de rotation est lue comme suit : - Lire la valeur obtenue partir des grandes graduations. - Pour obtenir une meilleure prcision on divise un degr de rotation part 20 parties (petites graduations). Maintenant on lit la valeur dcimale au point o le trait intrieur concide avec un trait du cercle extrieur comme indiqu dans limage ci-dessous : Comparer les angles de dviation des solutions de diffrents sucres pralablement prpars et laisss en quilibres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, mlezitose, amidon, etc. Calculer les concentrations des sucres en utilisant les valeurs de leurs pouvoirs rotatoires spcifiques donnes dans la littrature.


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Etude de la mutarotation du glucose Dissoudre frachement 25 g de glucose dans 100 ml deau distille et lintroduire immdiatement dans un tube de polarimtre de longueur de 2 dm. Lire la valeur de langle t=0, et ensuite toutes les 5 min jusqu ltat dquilibre (si le temps impartit le permet !). On obtient le tableau suivant : Temps 0 5 (min) observ 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 75 90 120

1. Calculer les pourcentages d et de -glucose prsents aprs 15 et 30 min dincubation. 2. Dterminer les constantes cintiques de la mutarotation k1 et k2 ainsi que la constante de la mutarotation km. Donnes : [] glucose= +112.7, [] glucose = +18.7 3. A partir de cette tude pouvons-nous dterminer lanomre le plus stable ? Valeurs des pouvoirs rotatoires spcifiques de quelque carbohydrates Carbohydrate D-ribose L-arabinose D-xylose D-glucose D-galactose D-fructose D-mannose L-rhamonose L-sorbose Lactose Maltose Sucrose Raffinose Trehalose Anomre -23.1 +54.0 +92 +113.4 +144.0 -21.0* +34.0 -7.7 +90.0 +168.0* Mlange lquilibre -23.7 +104.5 +19 +52.2 +80.5 -92.0 +14.6 +8.9 -4.4 +55.3 +16 +66.5 +105.2 +178.3 Anomre +175.0 -20.* +19 +52.0 -133.5 -17.0 +54.0* +35 +118 -

*Valeurs calcules. Rfrence : Rendina G. (1971) Experimental in modern biochemistry. Ed. Saundres W. B. Company, New York (USA). pp.133-161.


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TP. 4 Etude cintique de lhydrolyse enzymatique de lamidonPrincipe Lamidon (polysaccharides de rserve chez les vgtaux) est une macromolcule constitue de deux polymres de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). Lamylose est constitu essentiellement dunits de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type (14). Lamylopectine consiste essentiellement en units (14)-D-glucosidiques linaires mais branches, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques tous les 24-30 units de glucose. Ces deux polymres peuvent tre hydrolyss par les amylases enzymes spcifiques des liaisons (14)), les glucosidases, lamidon phosphorylases, la pullulanse, lamyloglucidase etc. Les amylases sont des hydrolases ; enzymes de la classe III dans la classification internationale des enzymes (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). Lamylase ou -(14)-D-glucane 4-glucanohydroase (EC. 3.2.1.1) est dorigine animale, vgtale et microbienne. Elle est surtout abondante dans les grains de crales (bl, sorgho, mil, etc.) en germination. La -amylase ou -(14) glucane maltohydroase (EC. 3.2.1.2) est surtout rencontre dans les vgtaux et les microbes. Ces deux enzymes ont pour principal substrat lamidon mais leur action est incomplte car elles ne peuvent pas hydrolyser les liaisons (16) prsentes dans lamylopectine. Cette tude consiste extraire les amylases de la farine de sorgho germ (contenant la fois des amylases et ), et ensuite tudier la cintique de lhydrolyse de cet amidon par ces enzymes. Ltude cintique en fonction de la concentration en substrat nous permettra destimer les paramtres cintiques (Km et Vm) des amylases du sorgho. En rappelle les amylases sont des enzymes obissant la loi cintique de Michalis-Menten donne par lquation :

Vi =

Vm[ Eo] Km + [ S ]

O Vi= vitesse initiale de la raction enzymatique ( t 0) Vm, vitesses maximale de lenzyme Km, constante de Michalis, correspondant la concentration en substrat laquelle la vitesse atteint la moiti de la vitesse maximale Le trac en double inverse de Lineweaver et Burk (trac en double inverse) nous permet dobtenir lquation suivante : 1 Km 1 1 = x + Vi Vm [ S ] Vm Le trac 1/vi = f(1/[s]) donne une droite de pente Km/Vm et dordonne lorigine 1/Vm. Liode (I2) interagit avec lamylose et lamylopectine pour donner une coloration respectivement bleue et brune. Dans cette manipulation on considrera que labsorbance 580 nm est lie la fois lamylose et lamylopectine. Lhydrolyse de lamidon par les amylases donne du glucose, du maltose et des dextrines limites (rsidus doligosacchrides posssdant des ramifications de type (16). Cela rsulte de ce fait de la dcoloration du milieu ractionnel, e.g. une baisse de labsorbance 580 nm. En suivant (monitoring) la variation de labsorbance 580 nm, on peut effectivement dterminer les constantes cintiques apparentes globales des amylases du sorgho.Matriels et ractifs

-

Bain marie Spectrophotomtre UV-visibleTP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

14 Tubes essais Centrifugeuse Plaques chauffantes Ractif de liode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI 2 % (w /v). Amidon de pomme de terre Solution tampon McIlvaine (50 mM phosphate/citrate pH 2 9). Prparer une solution dacide citrique, 50 mM, pour un volume de 1 litre Prparer une solution de Na2HPO4, 50 mM, pour un volume de 1 litre

Mode opratoire

-

a. Extraction des amylases du sorgho

Peser 1 g de farine de sorgho germe et les disperser dans 20 ml de tampon McIlvaine pH 6 contenant du CaCl2 2 mM.. Laisser sous agitation pendant 5 min. Centrifuger la solution et prendre le surnageant comme extrait enzymatique. Cet extrait doit tre conserv au frais (4C). b. Etude de la variation de vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.

Disperser 0.1 g damidon dans 20 ml deau distille. Y ajouter 80 ml deau distille bouillante. Agiter lgrement le mlange et continuer lbullition pendant 5 min sur une plaque chauffante pour obtenir une solution damidon limpide. Refroidir le mlange et le complter un volume de 100 ml avec leau distille. Ceci constitue une solution stocke damidon 1 mg/ml. Tableau 1. Prparation Ractif /tube T=0 (Blanc) (1 0 2.5 0.05 200 l T=1 0.02 2.5 0.05 200 l T=2 0.04 2.5 0.05 200 l T=3 0.08 2.5 0.05 200 l T=4 0.12 2.5 0.05 200 l T=5 0.16 2.5 0.05 200 l T=6 0.20 2.5 0.05 200 l

Amidon mg/ml) en ml Tampon Citrate pH6 (ml) Ractif I2/KI (ml) Extrait enzymatique Prendre les DO580 nm toutes les 10 s

t=0 idem idem idem idem idem idem t=10 t=20 t=30 t=-----t= 3 min N.B. La solution enzymatique est additionne juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque concentration en amidon, dterminer les vitesses initiales pour chaque concentration en amidon. Tracer la courbe Vi = f([amidon)]. Dduire si cette cintique est Michalienne ou non Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramtres cintiques Km et Vm. Garder le mme blanc pour toutes mesures


15 c. Etude de lactivit enzymatique en fonction du pH

Ltude de lactivit enzymatique en fonction du pH se fera dans des tampons standard de type McIlvaine (Journal of Biological Chemistry). Cette prparation se fera sur la base de lquation dAnderson Hasselbalch :pH = pK + log [ Base] [ Acide]

La prparation des solutions tampons se fera selon le tableau suivant : Tableau 2. Prparation des tampons McIlvaine Ractif T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 50 mM 100 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml x x x acide ml citrique 50 mM 0 x x x x x 100 ml 100 ml 100 ml Na2HPO4 Volume x 2.3 3 4 5 5.5 6.5 7 8 9 pour obtenir un dsir pH Cette gamme de prparation nous permet dobtenir des solutions tampons de pH variant de 2.5 9. Conserver les solutions tampons au frais avant leur utilisation.Tableau 3. Etude de lactivit en fonction du pH Ractif /tube T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 pH pH3 pH4 pH5 pH5.5 pH6 pH6.5 Tampon 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 McIlvaine (ml) Amidon (1 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 mg/ml) en ml

T=7 pH7.0 2.45

T=8 pH8 2.45

T=8 pH9 2.45

0.2

0.2

0.2

Ractif I2/KI 0.04 (ml) Dure dincubation 5DO580 nm Extrait enzymatique

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

0.04

Incubation 5 min

200 l 200 l

200 l

200 l 200 l

200 l

200 l

200 l

200 l

Prendre les t=0 idem idem idem idem idem idem idem idem DO580 nm t=10 toutes les 10 s t=20 3 min Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque pH, et dterminer les vitesses initiales pour chaque pH. Tracer la courbe Vi = f(pH). Quel est le pH optimum des amylases du sorgho ? Tracer la courbe dactivit relative (%) = f(pH), en considrant 100 % dactivit au pH optimum.


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Reducing end

Figure 1. Mode daction des principales enzymes impliques dans lhydrolyse de lamidon.

Rfrences : Dicko , M. H. et al. (1999) Purification and characterization of -amylase from C. pilosa. Applied Microbiology and Biotechnology (Germany-USA). . 52, 802-805. Dicko, M. H. et al. (2000) Extraction, partial purification and characterisation of -amylase from G. klattianus. Bioresource Technology (England). 73, 183-185. Dicko, M. H. et al. (2001) Polysacharide hydrolases from leaves of B. senegalensis. Applied Biochemistry and Biotechnology (USA). 94, 225-241.


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TP. 5. Comparaison du dosage spectrophotomtrique des protines par la mthode de Bradford/Sedmak et par la mthode de Kjeldahl.Principe Le dosage des protines en solution par la mthode de Bradford est bas sur linteraction en milieu acide, entre les protines et le Coomassie Brillant Bleu G250 (CBBG-250) dont la structure est la suivante :

Tan disque le CBBG-250 seul a une longueur donde maximale 450 nm ; on obtient en prsence des protines un dplacement du spectre vers le rouge (effet bathochrome) avec une longueur donde maximale 620 nm. Dune manire gnrale le CBBG-250 ragit plus spcifiquement avec les acides amins basiques (K, R, H) mais il interagit avec les autres acides amins. De ce fait plus la concentration en protine est leve, plus labsorbance 450 nm baisse, et labsorbance 620 nm augmente. Ainsi, le ratio de labsorbance 620 sur labsorbance 450 est fonction de la concentration protique.A620 = f ([ protine )] A450

Le trac de cette courbe nous donne une droite de la forme y = ax (si on soustrait le blanc) ou une droite de la forme y = ax + b (sans soustraction du blanc). Le dosage des protines par la mthode de Kjeldahl est bas sur la minralisation totale de la matire biologique en milieu acide, suivie de la distillation de lazote sous forme dammoniac. En effet, le matriel biologique est minralis dans lacide sulfurique concentr (H2SO4) chaud (500-600C) pendant 5-10 heures en prsence du catalyseur de la digestion (mlange de K2SO4, CuSO4 et slnium ; ce dernier est de moins en moins utilis cause de sa toxicit). Le dosage de lazote seffectue selon les tapes suivantes :Hydrolyse : H2SO4

Matriel biologiqueNeutralisation : NaOH+

NH4++ autres minraux NH3B(OH)3

Distillation : B(OH)3

NH4

NH3

A la fin de la minralisation lazote se trouve sous la forme minrale [(NH4+)2, SO42-]. Afin de pouvoir distiller lazote par entranement la vapeur deau, il faut dabord neutraliser lacide sulfurique et transformer lazote sous dammoniac gazeux (NH3). Au cours de la distillationTP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2me Anne, Pr. M. H. DICKO

18 lazote de lammoniac (Base de Lwis possdant un doublet lectronique) est entraner la vapeur deau et pig dans lacide borique : B(OH)3 qui est un acide de Lwis (possdant une orbitale vacante). Lammoniac est pig dans lacide borique travers une liaison dative : NH3 B(OH)3, est ensuite titr avec une solution faible (0.1N) dacide sulfurique. La quantification de lazote total permet dextrapoler pour estimer la quantit de protines. On admet dune manire gnrale que : la masse des protines vgtales = masse dazote x 6.25 la masse des protines animales = masse dazote x 5.75Matriels et ractifs

-

Spectrophotomtre UV-visible Tubes essais , Centrifugeuse Bleu de Coomassie G250 Acide sulfurique concentr NaOH 10 N Phnophtaline (1% dans lthanol) Tablet de catalyse de minralisation : K2SO4+CuSO4 Acide perchlorique (HClO4) Srum Albumine bovin Acide borique (1.6 g /litre deau distile)

Modes Opratoires a. Prparation du bleu de Coomassie.

La solution de CBBG-250 (Sigma nr. B-1131) est prpare une concentration de 0.06% (p/v) dans une solution dacide perchlorique 3 % (p/v). La solution est laisse sous agitation pendant 24 h, puis filtre. La solution est ajuste pour donner une DO de 1.3-1.5 450 nm, laide dune solution dacide perchlorique 3 % (p/v). Le ractif, stock labri de la lumire, pourrait tre conserv pendant plus de 10 ans.b. Prparation de la courbe dtalonnage pour le dosage des protines

La protine standard utilise pour le dosage des protines est le bovin serum albumin (BSA) une concentration de 50 g/ml dans leau distille). Tableau 1. Prparation de ltalon Tube blanc 1 2 3 4 BSA (50 g/ml) en 0 0.1 0.2 0.4 0.6 ml Eau distille 1 0.9 0.8 0.6 0.4 Ractif au Bleu de 1 1 1 1 1 Coomassie A620 A450 Aprs avoir ajout le ractif, les DOs sont lues dans les 2-5 min qui suivent. Tracer la courbe : A620 = f ([ protine )] A450

5 0.8 0.2 1

6 1 0 1


19c. Extraction des protines de lchantillon et dosage

- Solution dextraction : 7.5 g de Sodium Dodcyl Sulfate (SDS) sont mlangs 225 l de -mercapto-thanol, le tout complter 500 ml avec leau. La solution dchantillon est obtenue par dissolution de 5 g du matriel biologique dans 12.5 ml de la solution dextraction. Cette solution est ensuite centrifuge 5 000 rpm pendant 5 min. Aprs centrifugation, le surnageant recueilli. Filtrer le surnageant avec un papier filtre ou dfaut un papier lotus, juste pou retenir les particules solides et diluer le surnageant 10 fois. Le dosage seffectue comme suit : Tableau : dosage de lchantillon : Tube blanc 1 2 Echantillon (ml) 0 0.1 0.1 Solution dextraction contenant 0.01 0 0 le DNS Eau 0.990 0.9 0.9 Ractif au Bleu de Coomassie 1 1 1 A620 A450 - Calculer la concentration protique de lchantillon en vous basant sur dtalonnage dj tablie. - Pourquoi mettons dans le blanc le SDS dans les mmes proportions chantillon ?d. Dosage des protines par la mthode de Kjeldahl

3 0.1 0 0.9 1

la courbe que votre

Dans un matras de Kjeldahl, sont introduits 0.2 g de farine, un tablet de catalyseur (1 g) et 10 ml dacide sulfurique concentr. Le tout est minralis pendant 5-10 heures jusquobtention dune solution limpide (verdtre). Le minralist est dilu avec 50 ml deau distille. A ce mlange, on ajoute quelques gouttes de phnophtaline et de la soude 10 N, jusqu lobtention dune coloration rose. Aprs cela, le matras est plac dans lappareil Kjeldahl pour la distillation. Le distillat est recueilli dans 50 ml dacide borique contenant quelques gouttes dhlianthine et de vert de bromocrsol. On effectue la distillation jusqu lobtention dun volume de distillat de 250-300 ml. Le distillat contenant lammoniac est titr en prsence de phnophtaline par lacide sulfurique 0.1 N. La teneur en protine pour un matriel biologique vgtal est donne par lquation :(V 1 Vo) xNx14(0.001) x6.25 x100 PE Vo = Volume de H2SO4, ayant servi pour titrer le blanc V1 : volume de H2SO4 utilis pour le titrage de lchantillon N= normalit de lacide sulfurique PE= masse de prise dessai de lchantillon 6.25= coefficient de conversion 14 = poids molculaire de lazote Calculer la proportion de protine dans votre chantillon et comparer les rsultats avec la mthode dextraction en phase liquide suivie du dosage spectrophotomtrique. Commenter les rsultats. Selon vous quelle est la meilleure mthode ? % protines =

Rfrences.


20 Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry (USA). 72, 248-254. Sedmak, J. J. and Grossbeg, S. E (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using coomassie brilant blue G250. Analytical Biochemistry (USA). 79, 553-560. Zor, T., and Selinger, Z. (1996) Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236, 302-308. Dicko et al. (2002) Zymography of monophenolase and diphenoloase activities of polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.


21

TP. 6. Extraction et caractrisation des lipidesI. Gnralits

Les lipides sont des substances naturelles, constituants des structures cellulaires tels que les phospholipides, les glycolipides membranaires, lments de revtement (cires, cutines, etc. ), les substances de rserve , sources d'nergie cellulaire. On les appelle couramment huiles, graisses, beurres. La distinction entre graisses et huiles est purement arbitraire car base sur l'tat physique temprature ambiante : - huiles pour les liquides - graisses pour les solides et les ptes.Les huiles sont souvent liquides 15C, les beurres fondent 25C, les graisses fondent aux tempratures comprises entre 35C et 40C et les suifs ou graisses animales fondent des tempratures suprieures 40C. On distingue habituellement : -les lipides simples (acides gras, glycrides, crides) - les lipides complexes (phospholipides, glycolipides). La graisse: Substance lipidique onctueuse, fondant entre 25C et 50C,dorigine animale ou vgtale. On parle de : - suif (graisse des ruminants) - Lard (graisse des porcines: porc, sanglier, rhinocros) -saindoux (graisse fondue des porcins) Elle est faite du tissu adipeux trs dvelopp chez certains animaux (porcins, ovins et autres ruminants), oiseaux (dindes, oies, canards, autruches, etc.), carnassiers (lions, tigre, panthre, lopards, etc,), homme (paume des mains, plante des pieds ), mammifres aquatiques (baleines, phoques), poissons (morues., hlicoptres), reptiles (boas, pythons, etc.) C'est la rserve lipidique mobilisable par l'intermdiaire du sang. C'est la source d'nergie efficace, servant d'isolant dans les tissus sous-cutans et autour de certains organes. La graisse est constitue d'esters d'acides gras et de glycrol. Les acides gras sont souvent saturs (tri-starines surtout). Le beurre de lait de mammifres reprsente 3 10% des matires grasses du lait. Sa composition varie selon son origine (ruminant, rongeur, flin, quids, zbus, ovins caprins, bovins etc.), Il est fait de 82 84% de triacyl-glycrols dont 1/3 d'oline, 4% de butyrine qui se transforme en acide butyrique d' odeur dsagrable. Les teneurs en huile des laits de vache et de la femme sont respectivement 3.7-5% et 3.7-10%. Les laits de brebis et chvres renferment respectivement 6.7% et 4.1%.

La margarine reprsentant 83% de lipides est faite de mlange de triacyl glycrols.LES GRAISSES DE LA VIANDE

Le taux des lipides est variable selon les espces. -x < 5%. : poulet, cheval 5< x

Date post:	15-Jul-2015
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