I M R A H M E N D E S S E M I N A R S
M O D E R N E A N W E N D U N G D E R M A G N E T I S C H E N R E S O N A N Z
V O R G E T R A G E N
V O N
S T E P H A N I E K L E I N
„Functional and shunt states of
bacteriorhodopsin resolved by 250 GHz dynamic nuclear polarization-enhanced solid-
state NMR“
Stephanie Klein
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14.10.2013
Gliederung
Einleitung
Bakteriorhodopsin
Methoden
Vorgehensweise
Ergebnisse
Zusammenfassung
Quellen
Stephanie Klein
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Einleitung
• Strukturuntersuchungen von Membranproteinen stellen eine besondere Herausforderung dar.
• Strukturuntersuchung der Bakteriorhodopsin Intermediate im Photozyklus.
• Verbesserung der Auflösung und Empfindlichkeit durch 2D-MAS (Magic-Angel-Spinning) und DNP (dynamic nuclear polarisation).
• Zuordnung einzelner chemischer Verschiebungen.
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Bakteriorhodopsin
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Bakteriorhodopsin (bR) ist ein Membranprotein in der Zellmembran des Organismuses Halobacterium salinarum.
Das Protein ist ein Lichtenergie-Konverter.
Die Lichtenergie dient zum Aufbau eines Protonen-Konzentrationsunterschiedes zwischen Cytoplasma und extrazellulärem Medium.
Dieser Konzentrationsunterschied ist eine Energiequelle für die ATP-Synthase.
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Aufbau des bR
bR besteht aus 248 Aminosäuren, welche in sieben parallelen alpha-Helices angeordnet, eine Pore bilden.
In der Pore befindet sich ein, an das Protein gebundenes, Retinal-Molekül.
Das Retinal ist das Chromophor des Moleküls.
Retinal ist über eine Imidbindung (Schiff'sche Base) an die Amidfunktion von Lys 216 gebunden.
Die Isomerisierung erfolgt durch Lichteinwirkung.
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Photozyklus des bR
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Nach Heßling et al. 1993
Isomere des Retinals
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Methoden
MAS (Magic-Angle-Spinning) wird allgemein als Methode zur Strukturuntersuchung von Membranproteinen eingesetzt.
Technik zur Verbesserung der Signalqualität in der Festkörper-NMR.
Das Prinzip beruht auf der schnellen Rotation der Probe während der Messung.
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MAS
Probenanodnung: Rotor ist in einem
Winkel von Ɵ = 54,7 °( „magischer Winkel“) zu
B0 orientiert.
Bei hinreichend schneller Probenrotation
werden sämtliche Kernspinverbindungsvektoren
im zeitlichen Mittel entlang des magischen Winkels
orientiert.
Anisotropie wird dadurch eliminiert.
Verbesserung der Auflösung um Faktor 90.
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DNP
DNP (dynamic nuclear polarisation) stellt eine Methode zur
Verbesserung der Signalintensität dar.
Prinzip: Erhöhung der Polarisation durch Kopplung mit dem Elektronenspin.
Zugabe von Radikalen: TEMPO, BDPA, TOTAPOL.
Strahlenquelle: Gyrotron mit Kryomagnet.
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TEMPO BDPA
TOTAPOL
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Vorgehensweise
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U-13C und 15N markierte bR-
Proben
• 9T (250 GHz e-, 380 MHz 1H Frequenzen)
• Messung bei verschiedenen Temp.
K: grünes Licht bei 90 K L´s: rotes Licht bei 150 K
Mo: grünes Licht bei 210K
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Anregung von bR568 via
Laserbestrahlung (in situ) MAS
15N-13C Korrelations-
spektren
DNP
Vorgehensweise
Kontinuierliche Bestrahlung
des Elektron-Resonanz
Spektrums mit 250 GHz
Mikrowellen.
Frequenzselektiver heteronuklearer Magnetisierungstransfer von SB 15N zum C15 des Retinals.
Homonuklearer Polarisationstransfer
a) entlang des Retinals
b) entlang der K216-Seitenkette
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15N-13C Korrelationsspektrum I.
A = dunkel-adaptiert bR568
und bR555
B = licht-adaptiert bR568
C = bR568, vier L-Zustände.
D = Mo
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15N-13C Korrelationsspektrum II.
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A = dunkel-adaptierter Zustand
B = licht-adaptierter Zustand
C = K-Zustand
D = L-Zustand
E = M-Zustand
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Ergebnisse
Spektren weisen jeweils ein 15N-13C Kreuzpeak für jedes C-Atom im licht-adaptierten, K-und M0- Zustand auf.
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Ergebnisse
Im Gegensatz dazu weisen die Spektren der dunkel-adaptierten und der L-Zustände Heterogenität auf.
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Ergebnisse
Erkennbares stärkeres Signal deutet auf mehrfache 15N -13C Kreuzpeaks für jeden einzelnen Zustand in der 13C -Dimension hin.
Aufspaltungen sowohl in bR555 als auch
bR568-Komponenten (dunkel-adaptiert)
weisen darauf hin, dass jedes mindestens zwei
unterschiedliche Konformationen in der
Nachbarschaft der SB-Kopplung bildet.
.
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Ergebnisse
Eindeutig vier Intermediate im L-Zustand.
Erkennbar aufgrund der unterschiedlichen chemischen Verschiebung des C15-Atoms und des bR568
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Entwicklung der Retinal-Drehung
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Zusammenfassung I.
MAS kombiniert mit DNP ist eine empfindlich und spezifische Methode, um ein Gemisch aus verschiedenen Intermediaten zu untersuchen und dabei Momentaufnahmen aus dem Photozyklus zu erhalten.
Die erhöhte Empfindlichkeit ermöglicht eine Zuordnung chemischer Verschiebungen im Retinal Chromophor und macht somit eine Strukturanalyse von zuvor noch nicht beobachteten Zuständen möglich.
Korrelationsspektren weisen unerwartete Heterogenität im dunkel-adaptierten bR und Verzerrungen im K-Zustand auf.
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Zusammenfassung II.
Aus den Spektren geht hervor, dass die chemische 15N SB-Verschiebung außerordentlich empfindlich gegenüber ihrer Umgebung ist.
Die Spektren weisen eindeutig mehrere L-Zustände auf und ermöglichen differenzierte Unterscheidungen zwischen einem funktionalen Zustand und drei untergeordneten Zuständen.
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Quellenverzeichnis
Vikram S. Bajaj, Melody L. Mak-Jurkauskas, Marina Belenky, Hudith Herzfeld, Robert G. Griffin, PNAS, 2009, 106 (23), 9244-9249.
Vikram S. Bajaj, Melody L. Mak-Jurkauskas, Marina Belenky, Hudith Herzfeld, Robert G. Griffin, PNAS, 2009, 10.1073/pnas.0900908106, 1-3.
David D. Laws, Hans-Marcus L. Bitter, Alexej Jerschow, Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 3096-3129.
Fichero M. F., Diss., Universität Würzburg, 2007, 1-150.
Linden A. H., Diss., Universität Berlin, 2012, 1-94.
Stephanie Klein
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
Stephanie Klein
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