g
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA
ESCOLA SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ESA
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E RECURSOS NATURAIS DA
AMAZÔNIA– MBT
FUNGOS AMAZÔNICOS COM POTENCIAL PARA DEGRADAÇÃO
DE POLIETILENO TEREFTALATO-PET
ELAINE PIRES SOARES
MANAUS
2012
ii
ELAINE PIRES SOARES
FUNGOS AMAZÔNICOS COM POTENCIAL PARA
DEGRADAÇÃO DE POLIETILENO TEREFTALATO-PET
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação da Universidade do Estado
do Amazonas, para obtenção do grau de
Mestre em Biotecnologia e Recursos
Naturais da Amazônia.
Orientador: Prof. Dr. ADEMIR CASTRO E SILVA
MANAUS
2012
iii
PARECER
Os membros da Banca Examinadora, designada pela Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia da Universidade do
Estado do Amazonas, reuniram-se para realizar a argüição da dissertação de
MESTRADO apresentada pela candidata Elaine Pires Soares sob o título “Fungos
Amazônicos com potencial para degradação de Polietileno da Amazônia.
Após análise do referido trabalho e argüição da candidata, os membros dão o parecer
pela APROVAÇÃO da dissertação.
Manaus, 26 de Abril de 2012.
Dra. Arelis Abalos Rodriguez
Universidade Estadual do Amazonas (UEA) – Membro Titular
Dra. Milade dos Santos Carneiro Cordeiro
Universidade Estadual do Amazonas (UEA) – Membro Titular
Dr. Ademir Castro e Silva
Universidade Estadual do Amazonas (UEA) – Presidente da Banca e Orientador
iv
“Evoluir é reconhecer nossos erros.
Não para consertá-los,
Mas para não repeti-los”.
(Amanda Chakur)
“Não importa onde você parou...
Em que momento da vida você cansou.
O que importa é que sempre é possível recomeçar.
Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo...
É renovar as esperanças na vida e o mais importante...
Acreditar em você de novo”.
(Carlos Drummond de Andrade)
v
DEDICAÇÃO
Ao meu esposo Deodato e meus filhos com muito amor:
Júnior, Ândria e Henrique, pela compreensão e apoio
quando ausente estive, em busca de um sonho realizar.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que na sua infinita bondade iluminou sempre meus caminhos e deu-
me forças para seguir em frente nesta caminhada apesar das dificuldades encontradas
nesta jornada.
Ao professor orientador Ademir Castro e Silva por todos os ensinamentos passados,
incentivo e conselhos profissionais dados, pelos laços de amizade formado, atenção e
confiança dedicados ao longo do trabalho.
Agradeço aos meus pais, Vanildo e Raimunda que torcem sempre por mim e que me
dão sempre amor e carinho.
Agradecimento especial ao meu esposo Deodato que sempre me apoiou,
compreendendo-me, amando-me, sendo meu alicerce nas horas difíceis, base primordial
para o meu sucesso pessoal e profissional.
Agradeço a minha família que sempre me deu apoio, amor, carinho e felicidade, nada
na minha vida teria graça. Eu amo muito vocês.
Agradeço aos professores Dr. Aldo Procópio, Dra. Helena Camarão, Dra. Helen,
Dr. Everson Miranda, Dr. Wilson Castro Silva, Dra. Arelis Ábalos Rodrigues, Dr.
Enrique Ramon Molina Perez, que ministraram as disciplinas do curso e pelos tantos
ensinamentos repassados.
Aos amigos do Laboratório de Biologia, Química e Coordenação do Mestrado, Joyce,
Claudomiro e Priscila pela troca de experiência e conhecimento, pelos momentos de
descontração vividos nas longas horas de trabalho e pelo apoio dado nos momentos
mais difíceis.
Aos novos amigos conquistados no mestrado Adriana Nunes, Aaron Machado,
Adrya Figueiredo, Izabel Cristina, Vanessa Galúcio e Paula Mara que com muito
esforço conseguimos alcançar nossos objetivos.
vii
Aos alunos de iniciação científica Patrícia, Esmeralda Andrade, Bruno Pantoja,
Rilk Azedo, Ricardo Katak, em especial Aldenize Viana, João Bosco e Rafael, pelo
suporte e incentivo.
As amigas Cláudia Ramos, Liviane Martins, Daízes Pimentel, pela compreensão,
apoio, carinho e torcida.
À minha prima e amiga Solange Pires de Araújo, pelo incentivo e carinho nos
momentos difíceis.
À minha querida amiga Naimy Farias Castro que sempre ouve meus desabafos,
anseios com toda “paciência” do mundo.
Ao CNPq pelo incentivo educacional e bolsa de estudos concedida.
À Universidade do Estado do Amazonas, Coordenação do Mestrado e Centro de
Estudo Superiores de Parintins por fornecer todo o suporte docente e administrativo
para a minha formação.
A Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP/FEA – Faculdade de Engenharia
Química na pessoa do Prof. Dr. Everson Miranda e Kelly Palma que possibilitaram
que fossem feitas as análises de Microscopia Eletrônica de Varredura das amostras de
PET.
Aos amigos Marcelino Norberto e Silvia Ferreira do Laboratório Mateus Pena
Ribeiro que abriram as portas desta instituição e possibilitaram a realização das análises
em espectrofotômetro.
A Secretaria Municipal de Saúde de Parintins, em nome do Secretário de Saúde
Josimar Martins Marinho pela liberação para os estudos, compreensão e apoio nesta
jornada acadêmica.
A todos que contribuíram direta e indiretamente em minha jornada
viii
SUMÁRIO Página
1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 1
3 OBJETIVOS ....................................................................................... 3
3.1 Objetivo Geral ................................................................................ 3
3.2 Objetivos Específicos ..................................................................... 3
3 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................ 4
3.1 Polímeros Sintéticos......... ............................................................. 4
3.2 Polietileno Tereftalato..................................................................... 7
3.2.1 Produção da Resina............................................................. 8
3.2.2 Aditivação do PET.............................................................. 9
3.3 Resíduos Agroindustriais............................................................... 9
3.3.1 Astrocaryum aculeatum Meyer-Tucumã da Amazônia...... 11
3.4 Utilização de microorganismos na degradação de plásticos 13
3.4.1 Consórcio de microorganismos fúngicos....................... 14
3.5 Fungos Amazônicos com potencial para biodegradação de
compostos xenobióticos..............................................................
14
3.6 O complexo oxidativo lignolítico de fungos Basidiomycetos........ 16
3.7 Degradação de Polímeros............................................................... 17
3.7.1 Técnicas para avaliação de alterações estruturais de
polímeros..............................................................................................
19
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................. 21
4.1 Coleta de fungos............................................................................. 21
4.2 Isolamento fúngico e preparo do inóculo....................................... 22
4.3 Capacidade enzimática oxidativa................................................... 22
4.4 Preparo dos polímeros.............................................................. ..... 23
4.4.1Desinfeção das amostras...................................................... 23
4.5 Substrato utilizado para o meio de cultivo...................................... 24
4.6 Controle abiótico e biótico.............................................................. 25
ix
4.7 Fermentação submersa.................................................................... 25
4.8 Tratamento com consórcio de fungos............................................. 26
4.9 Polietileno Tereftalato sob pré-tratamento com temperatura 35º C e
50ºC.......................................................................................................
26
4.10 Determinação da perda de massa do polímero.............................. 27
4.11 Microscopia Eletrônica de Varredura............................................ 28
4.11.1 Preparo das amostras.......................................................... 28
4.11.2 Análise morfológica do PET-MEV.................................... 29
4.12 Determinação Enzimática.............................................................. 29
4.12.1 Atividade de Lacase (Lac)................................................. 30
4.12.2 Atividade de Manganês – Peroxidase (MnP) .................... 30
4.12.3 Atividade de Lignina – Peroxidase (LiP)........................... 30
4.13 Análise Estatítisca........................................................................... 31
5 RESULTADOS .................................................................................... 32
5.1 Seleção de fungos............................................................................. 32
5.2 Degradação de PET por Fungos Amazônicos................................. 33
5.3 Degradação de PET por Consórcio de Fungos................................ 38
5.4 Microscopia Eletrônica de Varredura............................................. 42
5.5 Atividade enzimática........................................................................ 52
5.5.1 Atividade de Lacase (Lac).................................................... 52
5.5.2 Atividade de Lignina - Peroxidase (LiP)............................... 55
5.5.3Atividade Manganês-Peroxidase............................................ 59
6 DISCUSSÃO ......................................................................................... 62
7 CONCLUSÃO....................................................................................... 66
x
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................... 68
ANEXOS................................................................................................. 81
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Composição química do Tucumã da Amazônia (Astrocaryum
aculeatum Meyer) oriundos de Manaus e Rio Preto da Eva, AM................
13
Tabela 02: Fungos produtores de fenoloxidases em períodos de 24, 48 e 72
horas.....................................................................................................................
32
Tabela 03: Percentagens médias de perda de massa das amostras de PET em
diferentes meio de cultivo, PET sem tratamento físico, por um período de 90
dias..................................................................................................................................
34
Tabela 04: Percentagens médias de perda de massa das amostras de PET em
diferentes meio de cultivo, PET submetido ao pré-tratamento com temperatura
35ºC e 50ºC, por um período de 90 dias..............................................................
35
Tabela 05: Percentagens médias de perda de massa das amostras de PET em
diferentes meio de cultivo e temperaturas, por um período de 90 dias...............
39
Tabela 06: Valor médio da atividade enzimática de lacase, em diferentes
meio de cultura e amostras de PET com e sem tratamento físico de
temperatura, em 90 dias de incubação.................................................................
52
Tabela 07: Valor médio da atividade enzimática de lignina peroxidase, em
diferentes meio de cultura e amostras de PET com e sem tratamento físico de
temperatura, em 90 dias de incubação...........................................................
56
Tabela 08: Valor médio da atividade enzimática de manganês peroxidase, em
diferentes meio de cultura e amostras de PET com e sem tratamento físico de
temperatura, em 90 dias de incubação.................................................................
59
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química do Polietileno Tereftalato – PET............................ 9
Figura 2: Mapa de Parintins- Local de coleta dos carpóforos fúngicos ............. 21
Figura 3: Teste de Bavendamm. A. Ácido tânico; B. Meio de cultura BDA
homogeneizado com ácido tânico; C. Meio vertido em placas de
Petri; D. Fragmento fúngico inoculado no meio teste. .........................
.
23
Figura 4: A.Fungo P. sanguineus; B. Fungo FBL; C. Fungo FV12.................... 33
Figura 5: A. Fungo P. sanguineus; B. Fungo FBL e C. Fungo FV12 em 24 de
incubação em presença do ácido tânico..............................................
33
Figura 6: Perda de massa do PET sem tratamento físico, com as linhagens
fúngicas P. sanguineus, FBL, FV12, em fermentação submersa
estacionária no período de 15, 30 60 e 90 dias de incubação. A.
Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha
de tucumã - MFT..................................................................................
35
Figura 7: Perda de massa do PET submetido à temperatura 35ºC, com as
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL, FV12, em fermentação
submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90 dias de
incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado
com farinha de tucumã - MFT ............................................................
36
Figura 8: Perda de massa do PET submetido à temperatura 50ºC, com as
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL, FV12, em fermentação
submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90 dias de
incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado
com farinha de tucumã - MFT............................................................
37
Figura 9: Perda de massa do PET sem tratamento físico, com os consórcios
fúngicos C1, C2 e C3, em fermentação submersa estacionária no
período de 15, 30, 60 e 90 dias de incubação. A. Meio sem
suplementação -M1; B. Meio suplementado com farinha de tucumã -
MFT......................................................................................................
39
Figura 10:
Perda de massa do PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC, com os consórcios fúngicos C1, C2 e C3, em
fermentação submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90 dias
de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã – MFT......................................
40
xiii
Figura 11: Perda de massa do PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC, com os consórcios fúngicos C1, C2 e C3, em
fermentação submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90 dias
de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã – MFT..............................
41
Figura 12: Fotomicrografias de amostras do PET sem tratamento físico e
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12 por MEV em 90 dias
de incubação. A. controle abiótico; B. PYC em meio M1; C. PYC
em meio MFT; D. controle abiótico; E. FBL em meio M1; F. FBL
em meio MFT; G. controle abiótico; H. FV12 em meio M1; I. FV12
em meio MFT – 3000X........................................................................
44
Figura 13: Fotomicrografias de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento
com temperatura 35º C e linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12 por MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico; B.
PYC em meio M1; C. PYC em meio MFT; D. controle abiótico; E.
FBL em meio M1; F. FBL em meio MFT; G. controle abiótico; H.
FV12 em meio M1; I. FV12 em meio MFT – 3000X........................
45
Figura 14: Fotomicrografias de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento
com temperatura 50º C e linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12 por MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico; B.
PYC em meio M1; C. PYC em meio MFT; D. controle abiótico; E.
FBL em meio M1; F. FBL em meio MFT; G. controle abiótico; H.
FV12 em meio M1; I. FV12 em meio MFT – 3000X.........................
46
Figura 15: Fotomicrografias ampliadas de amostras do PET submetidas ao pré-
tratamento com temperatura 50º C e linhagens fúngicas A. FBL e B.
FV12 por MEV em 30 dias de incubação em MFT. Modificações
na superfície do PET após retirada da massa celular dos fungos.
3000X...................................................................................................
47
Figura 16: Fotomicrografias de amostras de PET sem tratamento físico e
consórcio de fungos, MEV em 90 dias de incubação. A. controle
abiótico; B. Consórcio C1 em meio M1; C. Consórcio C1 em meio
MFT; D. controle abiótico; E. Consórcio C2 em meio M1; F.
Consórcio C2 em meio MFT; G. controle abiótico; H. Consórcio C3
em meio M1; I. Consórcio C3 em meio MFT – 3000X.......................
48
xiv
Figura 17: Fotomicrografias de amostras de PET submetidas ao pré-tratamento
com temperatura 35ºC e consórcio de fungos, MEV em 90 dias de
incubação. A. controle abiótico; B. Consórcio C1 em meio M1; C.
Consórcio C1 em meio MFT; D. controle abiótico; E. Consórcio C2
em meio M1; F. Consórcio C2 em meio MFT; G. controle abiótico;
H. Consórcio C3 em meio M1; I. Consórcio C3 em meio MFT –
3000X...................................................................................................
49
Figura 18: Fotomicrografias de amostras de PET submetidas ao pré-tratamento
com temperatura 35ºC e consórcio de fungos, MEV em 90 dias de
incubação. A. controle abiótico; B. Consórcio C1 em meio M1; C.
Consórcio C1 em meio MFT; D. controle abiótico; E. Consórcio C2
em meio M1; F. Consórcio C2 em meio MFT; G. controle abiótico;
H. Consórcio C3 em meio M1; I. Consórcio C3 em meio MFT –
3000X...................................................................................................
50
Figura 19: Fotomicrografias ampliadas de amostras do PET submetidas ao pré-
tratamento com temperatura 50º C e consórcios de fungos A. C1 e
B. C3 por MEV em 90 dias de incubação em MFT. Modificações
na superfície do PET após retirada da massa celular dos fungos.
3000X..................................................................................................
51
Figura 20: Atividade enzimática de Lac, PET sem tratamento físico com as
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação
submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A.
Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha
de tucumã - MFT.................................................................................
53
Figura 21: Atividade enzimática de Lac, PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e
90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
54
Figura 22: Atividade enzimática de Lac, PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 50ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e
90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
55
xv
Figura 23: Atividade enzimática de LiP, PET sem tratamento físico com as
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação
submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A.
Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha
de tucumã - MFT........................................................................
57
Figura 24: Atividade enzimática de LiP, PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e
90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
58
Figura 25: Atividade enzimática de LiP, PET submetido ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e
FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e
90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
58
Figura 26: Atividade enzimática de MnP, PET sem tratamento físico com as
linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação
submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A.
Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha
de tucumã - MFT..................................................................................
60
Figura 27: Atividade enzimática de MnP, PET submetido ao pré-tratamento
com temperatura 35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus,
FBL e FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30,
60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
61
Figura 28: Atividade enzimática de MnP, PET submetido ao pré-tratamento
com temperatura 50ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus,
FBL e FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30,
60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT......................................
61
xvi
ABREVIATURAS E SIGLAS
AAO - Álcool aril oxidase
ABIQUIM – Associação Brasileira da Indústria Química
ABTS - 2,2 – azino – bis – (3 – ethilbenzothialine – 6 – sulphonic acid)
AM – Amazonas
ASTM G22-76 - American Society for Testing Materials. Standart Practice for
Determinig Resistence of Plastics to bacteria.
ASTM G21-90 – American Society for Testing Materials. Standart Practice for
Determinig Resistence of Plastics to fungi.
ASTM D5210-92 – American Society for Testing Materials. Standart Test
Method for Determining the Anaerobic Biodegradation of Rastic Materials in
the presence of Municipal Sewage Sludge.
ASTM D5247- 92 – American Society for Testing Materials Standart method
for aerobic biodegradability of degradable plastics by specific microorganisms.
BAL-TEC - Preparation Technology for Electron Microscopy
BTU – Unidade Térmica Britânica
C1-Consórcio fúngico constituído por P. sanguineus, FBL e FV12.
C2- Consórcio fúngico constituído por P. sanguineus e FBL.
C3- Consórcio fúngico constituído por P. sanguineus e FV12.
CESP – Centro de Estudos Superiores de Parintins
DMT – Dimetiltereftalato cristalizado
DHET - Dihidroxietileno Tereftalato
ER - Resina epoxídica
FAO - Food and Agriculture Organization
FT - Farinha da casca de tucumã
HDPE - Polietileno de alta densidade
INSTITUTO GEA – Instituto Ética e Meio Ambiente
INPA – Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
Lac – Lacase
LabEF - Laboratório de Estudos Fúngicos
LiP – Lignina Peroxidase
xvii
LDPE - Polietileno de baixa densidade
M1- Meio sem suplementação de farinha da casca do tucumã
MFT- Meio suplementado com a farinha da casca do tucumã
MEG – Monoetilenoglicol
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MnP – Manganês Peroxidase
OSE-COC - Organização Sorocabana de Ensino
PET – Polietileno tereftalato
PVC - Policloreto vinila
PU – Poliuretano
POM – Polioximetileno
pop. - População
PP – Polipropileno
PC - Policarbonato
PMMA – Polimetacrilato de metila
PR – Resina fenólica
PS – Poliestireno
PEAD’s –Polietileno de alta densidade
PEBD – Polietileno de baixa densidade
UEA - Universidade do Estado do Amazonas
UV – Ultravioleta
UI/L – Unidades Internacionais por Litro
xviii
LISTA DE SÍMBOLOS
CH4 – Metano
cm - Centímetro
H2O – Água
Kg – Kilograma
Mn+2
– Cátion manganês
m – Metro
mm – Milímetro
mg – Miligrama
ml – Mililitros
µmol – Micromol
M – Molar
MnSO4 – Sulfato de manganês
NaOH 5 mol.L-1
– Solução
aquosa de Hidróxido de sódio
(Na (CH3)2 AsO2) 0,1 M –
Tampão cacodilato de sódio
nd – não detectado
nm- Nanometro
° C – Grau Celsius
OsO4 – Tetróxido de Ósmio
xix
RESUMO
FUNGOS AMAZONICOS COM POTENCIAL PARA DEGRADAÇÃO DO
POLIETILENO TEREFTALATO-PET
SOARES, Elaine Pires1 ([email protected]); CASTRO E SILVA, Ademir
1
1 Universidade Estadual do Amazonas, Centro de Estudos Superiores de Parintins – CESP/AM
Este trabalho tem como objetivo o estudo da ação degradativa do polímero sintético
Polietileno Tereftalato - PET por fungos basidiomicetos amazônicos. Foram testados
três linhagens fúngicas (P. sanguineus, FBL, FV12) e o consórcio entre os mesmos em
meio de cultivo líquido estacionário, com e sem suplementação com farinha da casca do
tucumã nos períodos de 15, 30, 60 e 90 dias de crescimento a 27ºC+1. Amostras de PET
foram submetidas ao pré-tratamento com temperatura 35ºC e 50ºC. Após incubação
foram avaliados a perda de massa polimérica, a determinação de enzimas lignolíticas e
analises das amostras de PET através de Microscopia Eletrônica de Varredura para
verificar a ocorrência de modificações morfológicas e/ou estruturais da superfície
polimérica. Todas as linhagens promoveram perda de massa do PET, destacaram-se os
fungos FBL e FV12 e o consórcio C1-PYC+FBL+FV12 em 90 dias de cultivo, com
PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC, com a maior perda de massa
do plástico. Todos os fungos testados apresentaram atividade enzimática lignolítica. A
manganês peroxidase (MnP) foi a enzima que apresentou os maiores valores de
atividade dentre as três enzimas estudadas. A linhagem FV12 com PET submetido à
temperatura 50ºC, em 90 dias de incubação foi a que apresentou maior valor médio
desta enzima. Ressalta-se que os melhores resultados foram obtidos com meio de
cultura suplementado com a farinha da casca do tucumã. MEV evidencia que o PET
submetido à temperatura 50ºC, sofreu severo desgaste da superfície polimérica, com
descamações, rupturas e aspecto quebradiço em toda superfície, assim como
clareamento da amostra. Conclui-se que os fungos amazônicos estudados possuem
potencial para degradar o Polietileno Tereftalato.
Palavras-chave: Fungos amazônicos, Polietileno tereftalato, enzimas oxidativas,
biodegradação.
xx
ABSTRACT
FUNGI AMAZON WITH POTENTIAL FOR DEGRADATION OF
POLYETHYLENE TEREPHTHALATE-PET
SOARES, Elaine Pires1 ([email protected]); CASTRO E SILVA, Ademir
1
1 University of Amazonas, Centre for Advanced Studies in Parintins - CESP / AM.
This work aims to study the degradative action of the synthetic polymer polyethylene
terephthalate - PET by basidiomycetous fungi Amazon. Three different fungal strains
(P. sanguineus, FBL, FV12) and the consortium between them in stationary liquid
culture medium, with or without supplementation with flour bark tucumã at 15, 30, 60
and 90 days of growth at 27 ° C +1. Samples of PET were subjected to pre-treatment
temperature 35 ° C and 50 ° C. After incubation were evaluated polymer mass loss, the
determination of ligninolytic enzymes and analysis of samples using PET scanning
electron microscopy to verify the occurrence of morphological and / or structural
polymeric surface. All the strains resulted in loss of mass of PET, the highlights were
the fungi FBL and FV12 and the consortium C1-PYC + FBL + FV12 within 90 days of
cultivation, with PET subjected to the pretreatment temperature 50 ° C, with greater
weight loss plastic. All fungi tested showed enzyme activity lignolítica. The manganese
peroxidase (MnP) was the enzyme that showed the highest activity among the three
enzymes studied. The strain FV12 PET subjected to temperature 50 ° C in 90 days of
incubation showed the highest mean value of this enzyme. It should be noted that the
best results were obtained with a culture medium supplemented with tucumã shell
flour. shows that PET subjected to temperature 50 ° C, suffered severe wear of the
polymeric surface with flaking, ruptures and cracked appearance across the surface, as
well as bleaching of the sample. It follows that the Amazon fungi studied have potential
to degrade the Polyethylene Terephthalate.
Keywords: Fungi Amazon, Polyethylene Terephthalate, oxidative enzymes,
biodegradation.
1 INTRODUÇÃO
O uso intenso de material descartado tem ocasionado um aumento na quantidade
de resíduos gerados e não utilizados pelo homem, muitos deles provocando a
contaminação do meio ambiente e trazendo riscos à saúde humana, basicamente nas
áreas urbanas (JARA, 2007).
Neste contexto, evidencia-se o plástico que é um material proveniente de resinas
geralmente sintéticas e derivadas do petróleo. O uso do plástico é considerado
problemático para o meio ambiente pela sua alta durabilidade e grande volume na
composição total do lixo (OSE-COC, 2010). Com uma produção imensa, a indústria de
embalagens é a grande responsável pelo aumento da poluição por plásticos. Este é o
caso, por exemplo, do polietileno tereftalado (PET) que vem sendo extremamente
utilizado como embalagens carbonatadas e que podem resistir por décadas na natureza
(MÜLLER et. al., 2001). O PET é um polímero considerado não degradável, resistente
a hidrólise, inócuo para humanos, e visto como material acumulativo em grandes
volumes, com alta resistência na atmosfera aos agentes biológicos (JARA, 2007).
Existem várias opções de tecnologias descarte/tratamento dos resíduos plásticos:
através de deposição em aterros sanitários, reciclagem, compostagem (em biorreatores),
incineração e biodegradação (COSTA, 2001; JARA, 2007). Assim, a biodegradação
tem sido descrita como um processo fundamental para reduzir o acúmulo dos polímeros
contaminantes ambientais.
A existência de microorganismos capazes de metabolizar compostos
xenobióticos é de grande interesse para processos de biorremediação (CHANDRA e
RUSTGI, 1998), e os fungos de decomposição branca, ou seja, os degradadores de
lignina têm apresentando êxito em pesquisas relacionadas à biodegradação de poluentes
(O’ SULLIVAN, 1994). Estes microorganismos são capazes de transformar e
mineralizar contaminantes ambientais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos,
2
corantes azo, herbicidas e outros compostos tóxicos através da ação de suas enzimas
extracelulares.
Desta forma, surge o potencial fúngico ainda inexplorado da região do Baixo
Amazonas no Estado do Amazonas, como alternativa para a degradação do PET. Essa
região, sem ação antrópica mais contundente guarda ainda espécies fúngicas com
potencial enzimático capaz de participar em vários processos industriais. Urge, portanto,
a necessidade de prospecção dessa biodiversidade na busca de microorganismos capazes
de produzir enzimas específicas com potencial para uso em aplicações biotecnológicas,
como por exemplo, em biotransformações e tecnológicas como biorremediação, na
indústria papeleira, têxtil e farmacêutica (CASTRO E SILVA et. al., 2002). Lacase é
uma das enzimas pertencentes ao sistema enzimático oxidativo dos fungos
Basidiomicetos. Esta enzima em conjunto com a lignina peroxidase (LiP) e manganês
peroxidase (MnP), são responsáveis pela degradação da lignina, polímero aromático
encontrado na parede celular dos vegetais, através de um processo definido como
combustão enzimática (KIRK; FARREL, 1987).
Diante do exposto, a relevância desta pesquisa para o desenvolvimento do
Estado do Amazonas contempla-se no beneficio refletido primeiramente sobre a
população do município de Parintins, AM, no sentido de ser produzida uma ferramenta
ambiental, que poderá no futuro contribuir para a produção de um produto inovador e
biodegradável composto por um conjunto de enzimas com potencial para degradar
compostos recalcitrantes oriundo de fungos do Baixo Amazonas.
Portanto, o presente projeto objetiva a avaliação de linhagens fúngicas da região
do Baixo Amazonas capazes de promover o processo de biodegradação do PET,
seguido de detecção de enzimas envolvidas com a degradação desse polímero.
3
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL:
Investigar o potencial de fungos da classe dos Basidiomycetes coletados na
região do Baixo Amazonas-AM para biodegradação de Polietileno Tereftalato (PET).
2.2 ESPECÍFICOS:
Selecionar cepas fúngicas com potencial para degradar o Polietileno
Tereftalato- PET;
Avaliar o potencial da fermentação submersa na deterioração do Polietileno
Tereftalato utilizando meio nutricional suplementado com matéria prima regional;
Mensurar a perda da massa do polímero, com ou sem tratamento físico, em
diferentes períodos de incubação.
Investigar através de Microscopia Eletrônica de Varredura as alterações
morfológicas e/ou estruturais dos polímeros após biodegradação.
Determinar a atividade enzimática oxidativa (Lac, LiP e MnP) durante o
período de degradação do PET.
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 POLÍMERO SINTÉTICO
Os primeiros materiais plásticos empregados na indústria foram obtidos de
produtos naturais, por modificação química, como nitrato de celulose, proveniente da
celulose do algodão, a galalite originária da caseína do leite e a ebonite, da borracha
natural. Staudinger (1920) Apud Mano e Mendes (1999) considerou que a borracha
natural e outros produtos de síntese, de estrutura química até então desconhecida, eram
na verdade materiais constituídos de moléculas de cadeias longas, e não agregados
coloidais de pequenas moléculas. Porém, somente em 1928 foi definitivamente
reconhecido pelos cientistas que os polímeros eram substância de elevado peso
molecular.
A palavra “polímero” foi criada por Berzelius em 1832, para designar compostos
de peso moleculares múltiplos (MANO e MENDES, 1999). Tem origem no vocábulo
grego polumeres, composto por polu (πολσ) que pode ser traduzido como muitas e
meres (μέρος) que significa partes. Polímeros são, portanto, substâncias químicas
formadas por muitas partes. A estrutura molecular de um polímero consiste na repetição
de pequenas unidades, ligadas por covalência, originando uma molécula bastante longa,
de alta massa molar, ou seja, uma macromolécula. Estas pequenas unidades são
chamadas de monômeros (do grego, uma parte). A reação que promove a união dos
monômeros para formar um polímero é chamada de polimerização (LOPES, 2007).
A baquelita, uma resina fenólica (PR) foi um dos primeiros plásticos sintéticos
comercializados sob a forma de artefatos, e mais tarde o policloreto vinila (PVC), o
polimetacrilato de metila (PMMA) e o poliestireno (PS). Surgiram o polietileno de
baixa densidade (LDPE), o poliuretano (PU) e a resina epoxídica (ER) na década de 40.
E, na década de 50 foram introduzidos o polioximetileno (POM), o polietileno de alta
5
densidade (HDPE), o polipropileno (PP) e o policarbonato (PC) (MANO e MENDES,
1999).
Com o passar dos anos, o uso dos polímeros tem se tornado cada vez mais
freqüente na sociedade e grande quantidade de artefatos estão sendo produzidos pelo
homem onde os polímeros são usados como matéria-prima para suas diferentes
elaborações (ROSA; CHUI, 2002). Milhões de toneladas de polímeros sintéticos são
produzidos no mundo, no entanto, praticamente metade de toda esta produção é
descartada rapidamente, permanecendo em depósitos de lixo e aterros sanitários por
décadas (AHN et. al., 2001; REDIFF, 2010), e com a popularização dos polímeros
sintéticos o mercado de plásticos em geral tende a crescer.
Nos últimos anos, diversos materiais tradicionais, como vidro, metais e fibras
naturais, vêm sendo crescentemente substituídos por produtos de origem plástica, com
menores custos de obtenção e produção, maior flexibilidade, diversidade e assepsia, e
possibilidade de reciclagem. O consumo mundial de matérias plásticas foi de
aproximadamente 114 milhões de toneladas em 1999 com o Brasil ocupando a sexta
posição, com 3,2% do mercado consumidor mundial (PLÁSTICOS, 2010).
A expansão de uso e o grande consumo de polímeros sintéticos têm contribuído
para a poluição ambiental, uma vez que podem demorar séculos para se degradar e
conseqüentemente, interferir de forma negativa nos processos de compostagem e
estabilização biológica. Além disso, os resíduos poliméricos quando descartados em
lugares inadequados, como lixões, rios, encostas, etc., causam um impacto ainda maior
ao meio ambiente (SPINACÉ; DE PAOLI, 2005).
Na realidade, sob o ponto de vista ambiental, o uso do plástico é considerado
problemático pela sua alta durabilidade e grande volume na composição do lixo (OSE-
COC, 2010). Estima-se que seriam necessários de 100 a 150 anos para que os polímeros
sejam degradados na natureza (JARA, 2007).
Quando depositados no ambiente, os plásticos chegam aos sistemas de coleta de
esgoto resultando no seu entupimento e, conseqüentemente, em inundações locais. Por
outro lado, quando depositados em lixões, os plásticos apresentam risco pela queima
indevida e sem controle, que pode resultar em descargas de gases tóxicos na atmosfera
6
(REDIFF, 2010), além do fato de dificultar a decomposição dos elementos
biologicamente degradáveis (INSTITUTO GEA, 2010), prejudicando os processos
fermentativos e impedindo a circulação de líquidos e gases, necessários à biodegradação
dos materiais (FORLIN & FARIA, 2002).
Ressalta-se que o PET é altamente combustível, com valor aproximado de
20.000 BTU/kg e libera gases residuais quando incinerado como monóxido e dióxido de
carbono, acetaldeído, benzoato de vinila e ácido benzóico (VILLAIN et. al., 1994).
O acúmulo indevido de polímeros sintéticos também atinge ambientes marinhos,
causando inúmeros problemas, como a ingestão de sacos plásticos por tartarugas
marinhas e baleias, ingestão de bolas de polietileno por aves marinhas, mortes de focas
por ingestão de plásticos provenientes de embalagens, dentre outros (CONTATO et. al.,
2003).
A despeito de tudo isso, os polímeros sintéticos têm sido largamente utilizados
nos diversos campos industriais e domésticos com inúmeras aplicações, principalmente
como materiais de embalagem, poliuretanos, poliestirenos (MUSTAFA, 1993). Suas
propriedades dependem de diversos fatores, como natureza química, estrutura, massa
molar, polidispersão, etc. Durante sua produção o processo de polimerização conduz à
formação de cadeias poliméricas de diferentes tamanhos, e conseqüentemente de massa
molares diferentes. Assim, os polímeros possuem propriedades físicas e químicas muito
distintas das que têm os corpos formados por moléculas simples (GOMES, 2006). Em
função disso, são muito resistentes à ruptura e ao desgaste, muito elásticos e resistentes
à ação dos agentes atmosféricos. Estas propriedades, juntamente com a sua fácil
obtenção a baixas temperaturas, têm possibilitado a sua fabricação em grande escala
(JARA, 2007).
Conforme o tipo de polímero e aditivos usados na sua formulação pode-se obter
material com flexibilidade bastante variável. Alta resistência ao impacto e a
transparência permite substituição do vidro em várias aplicações, como por exemplo,
lentes de óculos (em acrílico ou policarbonato), faróis de automóveis (policarbonato),
janelas de trens (policarbonato) etc. (ANON, 1997).
7
Há diversas maneiras de se classificar os polímeros. De uma maneira geral os
polímeros podem ser divididos em termoplásticos, termorrígidos (termofixos) e
elastômeros (borrachas) (MANO, 1985; CANEVAROLO, 2002).
Os polímeros são formados pela união de monômeros durante o processo de
polimerização (ABIQUIM, 2010). São materiais compostos por macromoléculas que
são cadeias compostas pela repetição de uma unidade básica, chamada mero. Desta
forma, origina-se o nome: poli (muitos) + mero. Os meros estão dispostos um após o
outro, analogicamente as pérolas num colar, ou seja, uma macromolécula que assume
formato muito semelhante ao de um cordão (MICHAELI, 1995).
A matéria-prima que dá origem ao polímero chama-s monômero. No caso do
polietileno (PE) é o etileno, que é obtido a partir do petróleo ou gás natural, pois é a rota
mais barata. O polietileno é o plástico mais conhecido e utilizado no Brasil que está
presente nas sacolas de embalagens utilizadas no comércio. Contudo, alterando as
condições em que ocorre a polimerização, as indústrias conseguem variar bastante a
aparência e as propriedades físicas de um plástico, podendo gerar os PET, os PEAD’s e
os PEBD’s que se diferenciam entre si pelo tamanho das cadeias e arranjos moleculares
(LIMA, 2001).
3.2 POLIETILENO TEREFTALATO– PET
O polietileno tereftalato (PET) é um termoplástico da família do poliéster
formado pela reação entre o acido tereftalico e o etileno glicol que teve suas origens nas
primeiras décadas do século passado na Universidade de Harvard (KAPLAN, 1998).
Estes componentes reúnem as características ideais para uma reação gradual de poli-
condensação produzindo o mero denominado ácido tereftalato de etileno
(CANEVAROLO, 2002).
Por possuir propriedades termoplásticas, isto é, pode ser reprocessado diversas
vezes pelo mesmo ou por outro processo de transformação. Quando aquecidos a
temperaturas adequadas, esses plásticos amolecem, fundem e podem ser novamente
moldados. Em 1962, surgiu o primeiro poliéster pneumático. As garrafas produzidas
com este polímero só começaram a ser fabricadas na década de 70, após cuidadosa
8
revisão dos aspectos de segurança e meio ambiente. Aparte de então, o PET começou a
ser utilizado pela industria de embalagens (GOMES, 2006).
As macromoléculas de PET puro constituem-se de repetições da molécula mais
simples (mero) de tereftalato de etileno. Nos polímeros comerciais, 130 a 155 repetições
desse mero constituem a macromolécula típica de PET (CANEVAROLO, 2002). Por
outro lado, o PET homopolímero, constituído pela repetição de um só mero (molécula
simples), cristaliza-se com facilidade, prejudicando a transparência do polímero. Para se
evitar esse problema as condições de processamento têm de ser muito precisas, o que
atrapalha a vida do transformador. Por isso, o PET homopolímero não é muito usado.
Prefere-se usar copolímeros de PET, os quais se cristalizam mais lentamente, facilitando
as condições de transformação para se obter um produto com boa transparência
(ANON, 1997).
Os passos da polimerização dos poliésteres são independentes e não necessitam
de radicais ou íons transmissores de cadeia; na verdade resultam de uma reação gradual,
com a intervenção de dois monômeros contendo cada um deles mais de um grupo
funcional idêntico. Ao reagirem, possibilitam longas cadeias macromoleculares, de
elevada massa molar. Em cada ligação que é estabelecida, liberta-se uma molécula
simples do tipo H2O ou CH4 o que leva a designar o processo como condensação,
diferenciando-o da polimerização por adição. Quando os monômeros são ácidos
carboxílicos e álcool, ambos com mais de um grupo funcional, a molécula resultante da
reação apresenta, além da ligação éster, um grupo terminal carboxílico e um grupo
terminal hidroxila, que permite a repetição das ligações, gerando uma macromolécula
com muitas ligações éster (SPINACÉ, 2000).
3.2.1 Produção da resina
O Polietileno Tereftalato (PET) forma-se a partir dos monômeros
dimetiltereftalato cristalizado (DMT) e monoetilenoglicol (MEG), através de
transesterificação, para formar o Dihidroxietileno Tereftalato (DHET) que é um
monômero do PET. A reação ocorre na presença de um catalisador com liberação de
metanol. No monômero puro (DHET) tem-se n igual a 1, o qual é aumentado em
aproximadamente 80 vezes para se obter a cadeia final do PET. O fator n é referido
como grau de polimerização. A reação continua até que a massa molecular ideal seja
9
alcançada e o polímero PET seja totalmente formado (SILVA, 2009). Após sua
fabricação, o polímero segue para a extrusão. Depois é resfriado e enviado para
produção de grãos (pellets), forma mais comum de comercialização do PET pronto. Os
pellets são então levados a um processo de secagem para reduzir o teor de umidade e
por fim ensacados (PEREIRA et al.,2002). A Figura 1. ilustra uma representação da
molécula de PET.
Fonte: GOMES (2006)
Figura 1. Estrutura química do monômero ácido tereftalato de etileno.
3.2.2 Aditivação do PET
O PET normalmente não necessita de adições de plastificante ou outros aditivos
para seu processamento. Mesmo no caso em que precise o uso de aditivos, a formulação
é feita pelo próprio produtor da resina e não pelo transformador, que já compra o
produto pronto. Normalmente nas resinas de PET são usados como agentes de reforço,
fibras de aramida, esferas de vidro, carbonato de cálcio (por exemplo, em fitas
magnéticas, pois melhora o coeficiente de fricção da fita), asbestos e wollastonita
(CANEVAROLO, 2002).
O PET também pode ser usado na forma expandida, requerendo neste caso a
adição de agentes de expansão. Corantes são utilizados para colorir as resinas. No caso
de filmes, podem ser usados aditivos para controlar a rugosidade superficial e,
conseqüentemente, o coeficiente de atrito da superfície do filme. Outros aditivos podem
ser usados para controlar o grau de transparência e de reflexão superficial (JARA,
2007).
10
3.3 UTILIZAÇÃO DE MICROORGANISMOS NA DEGRADAÇÃO DE
PLÁSTICOS
A busca de microorganismos capazes de degradar compostos xenobióticos é de
grande interesse para os processos de biorremediação, principalmente na remoção de
plásticos (CHANDRA; RUSTGI, 1998). Pesquisas intensas com este objetivo vêm
sendo realizadas com a finalidade de degradar os plásticos sintéticos (ALBERTSSON;
HUANG, 1995).
Um número significativo de espécies fúngicas produz substâncias de grande
interesse industrial, entre as quais podemos destacar antibióticos como a penicilina ou a
cefalosporina, vitaminas como a riboflavina, esteróides, ácido cítrico, etanol, enzimas
tipo celulases, proteases, amilases e muitas outras de valor industrial. Os fungos têm
grande importância agrícola e ecológica, decompondo restos vegetais, degradando
substâncias tóxicas e na simbiose com as plantas. Devido a sua versatilidade, os fungos
vêm sendo estudados, principalmente quanto à sua aplicabilidade biotecnológica
(AZEVEDO, 2003: ESPOSITO & AZEVEDO, 2004).
Bactérias e fungos são capazes de degradar a madeira, em ecossistemas
terrestres naturais, sendo que fungos superiores, especialmente os da classe
Basidiomycetes, são os mais eficientes degradadores (BLANCHETE, 1991;
ERIKSSON et. al., 1990).
3.3.1 Consórcios de microorganismos fúngicos
Os consórcios microbianos podem ser utilizados como inóculos em tratamentos
biológicos, visando a redução do tempo de degradação dos resíduos. São constituídos
por uma complexa população de espécies que, em sinergismo, são potencialmente
aplicados na biodegradação de poluentes derivados do petróleo (COSTA et. al., 2007).
Os consórcios de microorganismos apresentam atividades enzimáticas
relacionadas à degradação de substâncias xenobióticas, usualmente presentes em águas
industriais oleosas. Nos processos aeróbicos, o oxigênio é requerido para o processo de
biodegradação, envolvendo catabolismo dos hidrocarbonetos por ação de oxidases
11
(GHAZALI et. al., 2004). As bactérias, fungos filamentosos e leveduras são agentes
transformadores eficazes, face à sua habilidade em degradar ampla gama de substância
orgânicas, utilizando-as como fonte de carbono e energia durante seu crescimento.
Devido à complexidade dos processos metabólicos necessários à degradação do
petróleo, apenas consórcios de microorganismos com diferentes gêneros e espécies
conseguem degradar as frações e derivados deste óleo (TIBURTIUS et. al., 2004).
Gallego e seus colaboradores (2007) confirmaram experimentalmente que a
biodegradação pelo consórcio de microorganismos, em especial o consórcio fúngico,
apresenta-se como uma poderosa alternativa biotecnológica, técnica e economicamente
viável nos processos de biodegradação de derivados do petróleo.
3.4 FUNGOS AMAZONICOS COM POTENCIAL PARA BIODEGRADAÇÃO
DE XENOBIÓTICOS
A grandeza da biodiversidade Amazônica é bem conhecida, e dentre os
microorganismos que contribuem para a nossa megadiversidade estão os fungos. Com o
avanço dos estudos na área biotecnológica os organismos fúngicos tornaram-se de
grande interesse e vêm contribuindo com produtos e processos de importância industrial
(FERREIRA, 2005).
Apesar do seu papel nos ecossistemas e suas aplicações na biotecnologia, o
conhecimento sobre os fungos ainda permanece num nível incipiente, onde estima-se
que somente cerca de 5% das espécies é conhecida, e que muito pouco é conhecido
sobre a sua biologia (CASTRO E SILVA et.al.; 2002).
Para a Amazônia, as estimativas estão longe de significar o seu real potencial
micológico tendo em vista as grandes áreas e diferentes ecossistemas que ainda não
foram devidamente estudados, e que com toda certeza contém uma flora micológica que
poderá nos revelar grande incidência de microrganismos ainda desconhecidos da ciência
ou mesmo de ocorrência não citada para determinada área na Amazônia (CASTRO E
SILVA, et. al.; 2002). Souza (2002), por exemplo, realizando estudos taxonômicos de
representantes da Ordem Agaricales Clements (Hymenomycetes, Basidiomycotina) na
Reserva Biológica Walter Egler – INPA (Manaus/AM) cita a ocorrência de 38 espécies,
distribuídas em 13 gêneros e 6 famílias citadas pela primeira vez para a Reserva. Essa
12
Ordem tem grande importância ecológica e várias espécies tem valor econômico como
comestíveis (MAU et al., 1991; SONG et. al., 1991) e no uso em processos
biotecnológicos devido ao "pool" enzimático, que é importante na bioconversão de
resíduos lignocelulósicos, e que pode ser usado na biorremediação de solos
contaminados e no tratamento de efluentes da indústria papeleira e têxtil ( MATHEUS
& OKINO, 1998).
Castro e Silva et. al., (1993) trabalhando com cepas de fungo de podridão branca
proveniente da Amazônia concluíram que o “pool” enzimático do P. sanguineaus o
indica como potencial na descoloração de efluente Kraft de indústria papeleira, uma vez
que a presença de lignase ou lacase, juntamente com manganês peroxidase (MnP) na
presença de -glucosidase, são importantes para a degradação de compostos
cloroligninos (ESPOSITO et. al., 1991; DURÁN, 1992).
Pesquisas científicas estão sendo realizadas, visando descobrir novas
alternativas de uso das enzimas de estirpes fúngicas amazônicas através da
biotecnologia para gerar uma ferramenta ambiental na forma de um produto oriundo de
fungos amazônicos voltada para beneficiar a sociedade os ecossistemas terrestres e
aquáticos da Amazônia. Vislumbra-se produzir uma tecnologia que não produzirá novas
formas de poluição, as enzimas, ou seja, proteínas biodegradáveis na forma de um
produto, que será formado por um conjunto de enzimas que tem potencial para degradar
compostos que são recalcitrantes (ERIKSSON et. al., 1990). Portanto, o que se busca é
obtenção de um produto inovador e biodegradável onde através de seu uso se estará
colaborando para minimizar os impactos ambientais negativos decorrentes do resíduo
sólido PET e de sua liberação no ambiente. Um produto que atue para minimizar a
bioacumulação de substâncias tóxicas nos seres vivos expostos a agentes tóxicos, bem
como também para minimizar a biomagnificação que atinge a cadeia alimentar aquática
e terrestre, podendo chegar ao topo da cadeia alimentar.
Neste contexto, a região do Baixo Amazonas apresenta-se como um grande
laboratório, com uma biodiversidade fúngica em sua magnitude ainda inexplorada que
apresenta possibilidades de aplicações nos mais diversos setores industriais.
13
3.5 O COMPLEXO OXIDATIVO LIGNOLÍTICO DE FUNGOS
BASIDIOMICETOS.
Alguns fungos são capazes de degradar lignina, o polímero existente na parede
celular das plantas, a partir de um sistema enzimático produzido durante o metabolismo
secundário (REYES, 2003). A mineralização completa da lignina pelos
microorganismos requer dois processos importantes: a hidrólise do polímero e clivagem
do anel do núcleo aromático (SCHOEMAKER, 1990).
Devido à natureza e tamanho da molécula de lignina, as enzimas responsáveis
pelo ataque inicial precisam ser extracelulares e não específicas. As enzimas
extracelulares melhores estudadas, produzidas por estes fungos, são: Lignina Peroxidase
(LiP), Manganês Peroxidase (MnP) e Lacase. Diferentes fungos de decomposição
branca produzem diferentes combinações de enzimas: existem o produtores de LiP e
MnP, outros que produzem MnP e Lacase, fungos que produzem LiP e Lacase, e ainda
os que não produzem LiP nem MnP, mas sim Lacase e Álcool aril oxidase(AAO), ou
ainda outras enzimas (TUOMELA, et. al., 2000).
Lacase é uma das enzimas pertencentes ao esse sistema enzimático dos fungos
lignolíticos que em conjunto com a lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase
(MnP), são responsáveis pela degradação da lignina, através de um processo definido
como combustão enzimática (KIRK; FARREL, 1987).
Lacases são geralmente as primeiras enzimas lignolíticas a serem secretadas para
o meio pelos fungos. Normalmente, oxidam somente aqueles compostos de lignina com
um grupo fenólico livre, formando radicais fenoxis (GIANFREDA et. al.,1999). Muitas
aplicações da lacase requerem o uso de mediadores redox, ou seja, grupo de compostos
orgânicos de baixo peso molecular que podem ser oxidados pela lacase (GOCHEV;
KRASTANOV, 2007). ABTS [2,2 – azino – bis – (3 – ethilbenzothialine – 6 –
sulphonic acid)] foi um dos primeiros mediadores para lacase (CALL; MUCCKE,
1997). Essas enzimas são amplamente estudadas pelo grande potencial biotecnológico
como produção de celulose e papel, na indústria têxtil, biorremediação e na síntese de
produtos químicos/medicinais (DURAN; ESPOSITO, 2002).
14
A Lignina Peroxidase (LiP), uma glicoproteína contendo um grupo heme é
responsável pela degradação da lignina na presença de peróxido de hidrogênio e tem
capacidade para oxidar um grande número de substâncias aromáticas, incluindo
compostos altamente poluentes e pesticidas. Estas propriedades fazem a LiP
potencialmente útil em produções que utilizam matéria-prima lignocelulósica tais como
a industria de papel e de polpas, e na conversão da lignina em sub-produtos tais como
combustível e ração animal (MACEDO et . al., 1999).
A Manganês Peroxidase (MnP) que também contém grupo heme, oxida o Mn+2
a
Mn+3
que então oxida os anéis fenólicos a radicais fenoxi na presença de peróxido de
hidrogênio levando à decomposição dos compostos. O papel crucial da MnP na
biodegradação da lignina está relacionado a despolimerização e desametilação da
lignina e clorolignina, no branqueamento de polpas e na mediação das etapas iniciais de
degradação da lignina de alto peso molecular (HATAKA, 1994).
3.6 DEGRADAÇÃO DE POLÍMEROS
A maioria dos polímeros sintéticos são considerados resistentes ao ataque
microbiano. Esse fenômeno começou a gerar um grave problema econômico e
ambiental quando os aterros sanitários começaram a ficar saturados, constituindo o
plástico, uma parcela importante nesta problemática, visto que permanece inalterado no
ambiente por um longo período de tempo (MUSTAFA, 1993).
A biodegradabilidade dos polímeros depende de várias propriedades físicas e
químicas (SILVA, 2009), cujos procedimentos para a determinação da resistência de
polímeros sintéticos a degradação fúngica consistem na seleção de espécimes plásticos
adequados para determinação de propriedades convenientes de resistência ao ataque
microbiano, inoculação dos espécimes plásticos com microorganismos selecionados,
exposição dos espécimes plásticos inoculados a condições favoráveis ao crescimento
microbiano e avaliação do crescimento visual (ASTM G21-90, 1990).
O polietileno maciço de baixo peso molar facilita o crescimento fúngico a um
determinado grau (AGARWAL et. al., 1971). Embora diversos microorganismos
facilitem a biodegradação dos hidrocarbonetos, a biodegradação do polietileno é um
processo muito lento (ALBERTSSON; RANBY, 1976).
15
Silva (2009) refere que a deterioração do PET pode ocorrer por duas rotas: pela
fotoclivagem direta do polímero e por subseqüente fotoxidação dos grupos glicol.
Quando expostos à luz solar a foto oxidação não é uniforme sendo degradado,
preferencialmente, na superfície orientada pela luz. Em relação à degradação hidrolítica
todos os poliésteres aromáticos podem ser degradados a temperaturas máximas de
utilização em torno de 105º C (MARK et al., 1986). Embora sua estabilidade térmica
seja relativamente alta, substâncias voláteis tóxicas são emitidas à temperaturas de 200-
300º , durante a produção, processamento e reciclagem do material, produzindo
principalmente acetaldeído, formaldeído, monóxido de carbono e benzeno. As reações
de degradação termo-oxidativas são mais complicadas com a participação do O2
formando hidroperóxido seguido pela ruptura da cadeia (DZIECIOL &
TRZESZCZYNSKI, 1998).
A decomposição de compostos orgânicos por microorganismos é um fenômeno
comum e muito desses materiais orgânicos, como alimentos, produtos de madeira ou
demais matérias orgânicas, são decompostos e retornam ao ambiente na forma de
compostos simples, como dióxido de carbono, água ou amônia. Muitos desses materiais
contém, polímeros naturais, como celulose, amido, lignina e proteínas e assim, a
biodegradação de alguns compostos orgânicos se torna um processo conhecido na
natureza (MUSTAFA, 1993).
A biodegradação é um processo natural, onde compostos químicos presentes no
ambiente são convertidos a componentes mais simples, mineralizados e redistribuídos
através do ciclo do carbono, nitrogênio e enxofre (CHANDRA e RUSTGI, 1998). A
biodegradação foi definida por GÖPFERICH (1996) como um processo de quebra da
cadeia durante a qual a cadeia polimérica é clivada para formar oligômeros e finalmente
monômeros.
O estudo de microorganismos, como os fungos de decomposição branca,
capazes de degradar polímeros sintéticos faz-se necessário, uma vez que a incineração
não adequada de compostos plásticos emite gases tóxicos ao homem e a reciclagem de
materiais plásticos não é amplamente utilizada (REYES, 2003). O manejo adequado de
polímeros sintéticos requer combinações complementares de incineração, reciclagem e
16
biodegradação, sendo esta última a solução mais eficaz a longo prazo, requerendo,
portanto intensa pesquisa e desenvolvimento.
3.6.1 Técnicas para avaliação de alterações estruturais de polímeros
Um dos métodos analíticos mais simples utilizados para avaliação de alterações
decorrentes de biodegradação polimérica é a pesagem dos espécimes plásticos antes e
após os ensaios de incubação com os microorganismos, para controle de perda de massa
dos polímeros com a biodegradação (ASTM D5210-92, 1992).
As análises de superfícies mais empregadas no campo da ciência de polímeros
para investigações morfológicas são as de Microscopia Eletrônica. O Microscópio
Eletrônico de Varredura (MEV) é uma das ferramentas mais indispensáveis utilizadas
por várias empresas para analisar os constituintes e estruturas de novos materiais
desenvolvidos, até mesmo como técnica de rotina (SCOTT e GILEAD, 1995).
Observar a degradação de um polímero é de extrema dificuldade, pois este
fenômeno pode ocorrer sem que haja necessariamente a perda de massa do polímero,
mas alterações na molécula do polímero podem ser observadas (SCHNABEL, 1981;
SCOTT & GILEAD, 1995).
Desta forma, a Microscopia Eletrônica de Varredura demonstra ser uma
ferramenta eficaz no estudo de superfícies e morfologia dos polímeros e de grande
importância como instrumento complementar para avaliação da degradação (BASSET,
1981; ALLEN & BEVINGTON, 1989; SCOTT & GILEAD, 1995).
3.7 RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS
O termo resíduo é utilizado em sentido amplo englobando não somente sólidos
como também os efluentes líquidos e os materiais presentes nas emissões atmosféricas.
Assim como os plásticos, o acúmulo de resíduos agroindustriais causa um grande
impacto ambiental já que a maioria desses materiais é parcialmente ou completamente
desperdiçados (TIMOFIECSYK & PAWLOWSKY, 2000).
17
A busca da utilização dos resíduos agroindustriais, devido à incessante demanda
das atividades agrícolas, vem também em função do acúmulo destes resíduos que gera a
deterioração do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição significante para o
problema da reciclagem e conservação da biomassa. Diversos processos são
desenvolvidos para utilização desses materiais, transformando-os em compostos
químicos e produtos com alto valor agregado como álcool, enzimas, ácidos orgânicos,
aminoácidos, etc. O resíduo da agroindústria brasileira pode ser potencial para
diferentes alternativas de substratos para a fermentação, e pode contribuir para
minimizar o problema da poluição ambiental (PANDEY et al., 2000).
Ampla variedade e quantidade de resíduos orgânicos são gerados anualmente
pela atividade agroindustrial (CHANG, 1997). Os resíduos agrícolas, florestais e
agroindustriais, sendo, na sua maioria, biomassa lignocelulósica, representam uma fonte
abundante e renovável de substratos que podem ser biologicamente convertidos em
biomassa microbiana de elevado valor nutricional (SILVA, 2009). Estes resíduos
agroindustriais são, em sua maioria, de natureza lignocelulósica (KEREM et al.,1992), e
a utilização de material lignocelulósico são uma grande alternativa para a geração de
energia, devido a sua grande disponibilidade na natureza. Atualmente, os maiores usos
da lignocelulose concentram-se na indústria de celulose e papel, proteína para ração
alimentar, além de poderem gerar energia através da produção de etanol
(BALLESTEROS, 2001).
De uma forma geral os resíduos agrícolas contêm de 20 a 60% de celulose, 20 a
30% de hemicelulose e 15 a 30% de lignina (COWLING e KIRK, 1976).
De acordo com Sermanni; Porri (1989), a utilização desse material
lignocelulósico para a obtenção de compostos de alto valor econômico, por
biotransformação, é um dos mais interessantes campos da pesquisa biotecnológica.
Segundo Doelle (1996), uma tecnologia de fermentação desenvolvida a partir de
materiais lignocelulósicos resultando em múltiplos produtos, sem efluentes poluentes no
solo, na água e no ar, é caracterizada como uma “tecnologia integrada”.
18
3.7.1 Astrocaryum aculeatum Meyer – Tucumã da Amazônia
A Amazônia apresenta inúmeras espécies nativas de plantas frutíferas que
apresentam potencial econômico, tecnológico e nutricional, que vem despertando o
interesse de estudos científicos em diversificadas áreas, tais como: alimentícia,
farmacêutica, cosmética, aromatizante e essências (CLEMENT et.al., 2005; YUYAMA
et.al., 1998). Dentre eles verifica-se o tucumã (Astrocaryum aculeatum Meyer), fruto da
árvore tucumãzeiro, encontrada em ecossistema de terra firme da Amazônia central e
ocidental, em ambientes degradados e de vegetação secundária (FAO, 1987).
O tucumã é considerado nativo do norte da América do Sul, onde tem seu centro
de dispersão até a Guiana Francesa e Suriname. O gênero Astrocaryum apresenta
diversas variações de espécimes, tais como: Astrocaryum vulgare Mart., A. aculentum
Meyer., A. segregatum Dr., A. princeps Bard., A. giganteum Bar., A. tucumã Mart., A.
acaule Mart., A cantensis, A. chonta Mart., A. leisphota Bard., A. undata Mart. No
entanto, nos estados do Pará e Amapá, a espécie comumente encontrada é o A. vulgare
Mart (VILLACHICA, 1996).
O fruto é uma drupa globosa ou ovóide, cujo mesocarpo é fibroso e de coloração
amarelo-alaranjada, contendo alto teor de pró-vitamina A (AGUIAR et al., 1980;
MARINHO; CASTRO, 2002), lipídios e energia (AGUIAR, 1996; YUYAMA et al.,
2005). A polpa é apreciada e consumida pela população na forma in natura ou como
recheio de sanduíches, tapioquinha, cremes e sorvetes. O sub aproveitamento do fruto e
sua importância econômica estão atrelados à exploração tecnológica da polpa,
possibilitando assim, aumento da vida-de-prateleira e sua disponibilidade no período da
entressafra (YUYAMA et al., 2008).
Os frutos e sementes são utilizados na alimentação humana e de animais, as
folhas e estipes construção de casas pelas populações do interior da Amazônia
(MIRANDA, 2001). Está espécie comumente encontrada na região amazônica pode
alcançar de 10 a 15 m de altura, 15 a 20 cm de diâmetro (CLEMENTE et. al., 2005;
CAVALCANTE, 1991). Cresce próximo de rios, em áreas não cobertas com água, em
terra firme, cobertura vegetal baixa e em campo limpo. Tem característica de florescer e
frutificar durante quase todo o ano. Os frutos normalmente elipsóides, alaranjados,
quando maduros apresentam de 3 a 5 cm de comprimento e possuem um odor
19
característico. A polpa alaranjada de 2 a 4 mm de espessura, de consistência pastoso-
oleosa apresenta uma característica fibrosa (FERREIRA, et. al., 2008).
O mesocarpo (polpa) é considerado uma fonte alimentícia altamente calórica,
(MORAIS; DIAS, 2001) devido ao elevado conteúdo de lipídios, apresenta elevado
potencial de pró-vitamina A (caroteno), (MARINHO; CASTRO, 2002; YUYAMA
et.al., 1998) teores satisfatórios de fibra (RIBEIRO; SOARES, 1995) e vitamina E
(LUBRANO et. al., 1994; BROCHIER, 2000). O óleo de cor amarela extraído do
mesocarpo possui características organolépticas e nutritivas de alto valor para a
indústria de alimentos e cosmética. Poucos estudos têm sido realizados a fim de
contribuir para a sua domesticação e aproveitamento sendo sua comercialização ainda
caracterizada por um mercado meramente local (FERREIRA et. al., 2008).
Considerando a escassez de informações em relação aos constituintes
nutricionais da polpa do tucumã e o percentual expressivo de desperdício do mesocarpo
aderido ao epicarpo do fruto, quantificou-se os teores de elementos minerais e a
composição centesimal do fruto e casca do tucumã (YUYAMA et. al.,2005) (Tabela 1).
Trabalhos anteriores já demonstraram que na sua composição química do fruto
do tucumã encontra-se, em média, 46% umidade, 5% de proteínas, 30% de lipídios, 9%
de fibras e 3% de minerais (GUEDES, et. al., 2005; MORAIS; DIAS, 2001; YUYAMA
et. al., 1998; RIBEIRO; SOARES, 1995).
Estudos realizados com frutos do tucumã oriundos do Puraquequara (Manaus,
AM), doravante denominado de (pop.1) e Rio Preto da Eva (AM), (pop. 2)
demonstraram que o percentual da parte comestível do tucumã na ordem de 22% é
pouco representativo quando comparado ao caroço em torno de 61% do fruto e a casca
17% (Tabela 1).
Os resultados demonstram o potencial do tucumã (polpa e casca) como fonte de
potássio, cálcio, e selênio e a polpa com teores expressivos de lipídios e
conseqüentemente energia, assim como fibra alimentar, predominantemente na casca,
demonstrando a viabilidade de utilização da mesma (YUYAMA, et. al., 2005).
20
Tabela 1. Composição química do Tucumã da Amazônia (Astrocaryum aculeatum
Meyer) oriundos de Manaus e Rio Preto da Eva, AM.
Fonte: YUYAMA, et. al., (2005)
nd- não detectado
Composição
química do
Tucumã
Puraquequara/Manaus-AM
(Pop.1)
Rio Preto da Eva/Am
(Pop.2)
Polpa Casca Polpa Casca
Teor de lipídeos 37.50% nd 33.90% nd
Fibra alimentar 6% 17.90% 7.10% 17.70%
Cálcio 87.4±⌠2.2 mg% 61.4±6.2 mg% 57.9±4.8 mg% 58.2±13.5 mg%
Sódio 1.4±0.2mg% 2.6±0.3 mg% 1.0±0.2 mg% 3.6±0.2 mg%
Potássio 431.5±31.7 mg% 795.3±20.2 mg% 517.6±21.2 mg% 1113.6±51.8 mg%
Ferro 0.6±0.1 mg% 1.4±0.2 mg% 2.0±0.2 mg% 2.4±0.2mg%
Zinco 0.5±0.01 mg% 0.5±0.05 mg% 0.5±0.01mg% 0.6±0.01 mg%
Selênio nd 4.+00.9 ⌠g% 7.6±1.0 ⌠g% 13.9±2.4 ⌠g%
Bromo 453.32±7 ⌠% 642.1±1.8 ⌠% 90.6±0.4 ⌠g% 236.2±5.7 ⌠g%
21
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 COLETA DE FUNGOS
Carpóforos de 12 fungos pertencentes à classe dos Basidiomicetos degradadores
de madeira foram coletados na zona rural região da comunidade do Limão,
especificamente na propriedade particular Fazendinha, interior do município de
Parintins-AM, região do Baixo Amazonas (Figura 2). As amostras foram
acondicionadas em sacos de papel poroso e transportados para o Laboratório de Estudos
Fúngicos – LabEF, do Centro de Estudos Superiores de Parintins-CESP, onde foi
realizado o isolamento para obtenção das culturas axênicas e posterior uso nos testes
experimentais.
.
Fonte: Projeto de Assentamento da Gleba Vila Amazônia, 2009.
Figura 2. Mapa de Parintins- Local de coleta dos carpóforos fúngicos.
22
Dentre as linhagens fúngicas coletadas, somente o fungo P. sanguineus foi
identificado, os demais foram devidamente codificados para posterior identificação
taxonômica.
4.2 ISOLAMENTO FÚNGICO E PREPARO DO INÓCULO
As amostras dos fungos foram submetidas à assepsia, retirando fragmentos do
basidiocarpo e mergulhando-os em soluções de álcool a 70% com a finalidade de
quebrar a tensão superficial, o hipoclorito de sódio a 20 % para eliminar
microorganismos agregados e água destilada para retirar o excesso das soluções e evitar
oxidação, por um período de 1-2 minutos em cada solução.
O preparo do inoculo foi feito em placas de Petri contendo o meio de cultura
semi- sólido BDA (Batata, Dextrose Agar), nas proporções 39g de Agar BDA e 1000
ml de água destilada. As linhagens foram incubadas em temperatura ambiente (27 +
1ºC) por um período de 5 dias. O processo de repicagem ocorreu no meio BDA,
procedimento este executado em ambiente estéril (interior da Câmara de Fluxo
Laminar), para a obtenção de culturas puras. As placas de Petri foram identificadas,
lacradas com fita plástica (Parafilm “M”). As culturas foram armazenadas em
temperatura de 4ºC, para posterior utilização.
Após o crescimento homogêneo nas placas, os microorganismos em estudo
foram transferidos para o meio de crescimento líquido.
4.3 CAPACIDADE ENZIMÁTICA OXIDATIVA
A capacidade de distinguir isolados capazes de produzir fenoloxidase foi
determinada pelo teste de Bavendamm (DAVIDSON, et.al.,1938). Para isso discos de
micélio com 5mm de diâmetro foram retirados das bordas de colônias com 5 dias de
crescimento e transferidos para placas de Petri contendo meio BDA e ácido tânico
(5gL¹). Para o preparo do meio utilizou-se 500 ml do meio de cultura BDA com 50 ml
a menos de água destilada, que foi esterilizada separadamente em autoclave. Após
esterilização e resfriada a água acrescentou-se em condições assépticas 2,5g de ácido
tânico e agitou-se até a formação da mistura homogênea. Após esse procedimento
23
adicionou-se esta solução ao meio de cultura BDA levemente morno. Os fragmentos
fúngicos previamente miceliados foram inoculados no centro da placa e incubados em
estufa BOD a 30ºC para observação dos aspectos de indicação de fenoloxidases. Após
24 horas de incubação, realizou-se a avaliação visual quanto à formação de um halo
marrom considerado como reação positiva para produção de fenoloxidases. Os fungos
que apresentaram reação positiva em menor tempo foram utilizados para teste
biológicos com PET.
Figura 3: Teste de Bavendamm. A- Ácido tânico; B- Meio de cultura BDA homogeneizado
com ácido tânico; C- Meio vertido em placas de Petri; D- Fragmento fúngico inoculado no meio
teste.
4.4 PREPARO DOS POLÍMEROS SINTÉTICOS
As amostras utilizadas nos ensaios foram confeccionados a partir de garrafas
Polietileno Tereftalato - PET pós uso. As amostras foram constituídas na forma de
quadrados (1x1 cm e com espessura de 0,35 mm). Nesta etapa realizou-se também a
pesagem das amostras.
4.4.1 Desinfecção das amostras de PET
Após pesagem, as amostras dos plásticos foram desinfetadas para eliminação de
contaminantes microbianos. Este procedimento foi realizado de acordo com o protocolo
desenvolvido e validado pela American Society for Testing Materials (ASTM G22-76,
1990) e constituídos dos seguintes passos:
A B C
D
24
1) Para o preparo da solução desinfetante universal (LEE et. al., 1991), foi
utilizado um litro de água estéril e foram adicionados 14 ml do detergente Tween 80,
que foi esterilizada por filtração com membrana de éster de celulose de porosidade 0,22
µm (Millipore GSW04700) com bomba de vácuo. Após filtração foi adicionada 20 ml
de hipoclorito de sódio.
2) Os espécimes plásticos previamente pesados foram colocados em
“saquinhos” confeccionados com gaze e identificados com o peso inicial e em seguida
adicionados à solução desinfetante universal por 60 minutos e deixados em temperatura
ambiente, agitando-se ocasionalmente com um bastão de vidro estéril (REYES, 2003).
Com o auxílio de uma pinça estéril, cada plástico imerso na solução desinfetante
universal foi removido e transferido para outro frasco contendo apenas água estéril à
temperatura ambiente, também misturando-se ocasionalmente para ocorrer uma
lavagem efetiva, por no mínimo 1 hora.
3) Os plásticos foram novamente removidos e mergulhados em um béquer
contendo uma solução de etanol a 70%, sempre mantendo o frasco coberto e à
temperatura ambiente por 30 minutos. Por fim, as amostras plásticas desinfetadas foram
acondicionadas em frascos estéreis fechados em local arejado e à temperatura ambiente
para propiciar a evaporação de resíduos de etanol das amostras por um período de12
dias.
4.5 SUBSTRATO UTILIZADO PARA O MEIO DE CULTIVO
O meio de cultivo utilizado como substrato para o crescimento fúngico foi
composto de matéria prima regional a partir da casca do tucumã (Astrocaryum
aculeatum Meyer). Frutos do tucumã foram coletados na Feira Municipal, descascados
e desidratados, em seguida trituradas em moinho de facas, formando-se desta forma a
farinha da casca de tucumã (MFT). Foram utilizados 20g da farinha de tucumã e 500 ml
de água destilada. Foram realizados também tratamentos com o meio sem
suplementação deste resíduo (M1), ambos devidamente autoclavados a 121º C por 20
minutos.
25
4.6 CONTROLE ABIÓTICO E BIÓTICO
4.6.1 Controle Abiótico
Foram utilizados erlenmeyers contendo apenas os substratos submetidos à
fermentação submersa inoculados com os polímeros, ou seja, não foram inoculados com
os microrganismos. Desta forma, eliminou-se a interferência das características dos
microrganismos. Este controle foi realizado em triplicata, sendo três frascos para cada
período de incubação.
4.6.2 Controle Biótico
Foram utilizados erlenmeyers contendo apenas os substratos submetidos à
fermentação submersa inoculados com os microrganismos, ou seja, não foram
inoculados com os polímeros. Desta forma, eliminou-se a interferência das
características dos polímeros. Este controle foi realizado em triplicata, sendo três
frascos para cada período de incubação.
4.7 FERMENTAÇÃO SUBMERSA – FS
Para os testes de perda de massa do PET em fermentação submersa, foi utilizado
o meio de cultivo contendo resíduo agroindustrial à base de farinha da casaca de tucumã
- MFT e meio sem suplemento deste resíduo - M1, foram realizados 288 ensaios sendo
tratamentos individuais, com consórcio de fungos (com amostras de PET submetidas ao
pré-tratamento com temperatura 35º e 50ºC e o controle). Erlenmeyers de 125 ml foram
utilizados nos quais foram adicionados 50 ml do meio de cultivo, devidamente
autoclavados a 121ºC por 20 minutos. Em câmara de fluxo laminar adicionou-se 05
amostras do polímero previamente desinfetado.
Os fungos previamente crescidos em placa de Petri contendo BDA foram
inoculados em fermentação submersa em câmara de fluxo laminar na proporção de
1cm2 para cada 50 ml de meio de cultura líquido (CLEMENTE, 2002; PAVARINA,
2002).
26
A incubação foi feita em estufas à 30º C em condição estacionária durante 15,
30, 60 e 90 dias. Após os períodos determinados de fermentação, as amostras foram
filtradas e uma alíquota do caldo obtido foi transferida para tubos de ensaios de 10 ml
que foram armazenados em freezer à -10ºC e os polímeros utilizados também foram
reservados, para posteriores análises (REYES, 2003).
4.8 TRATAMENTO COM CONSÓRCIO DE FUNGOS
Esta etapa consistiu em realizar crescimento dos fungos concomitantemente
obedecendo aos tratamentos seguintes:
1) A partir do 5º dia de crescimento, foram retiradas amostras do fungo P.
sanguineaus de cerca de 1cm2 e inoculados para cada 50 ml de meio de cultura líquido.
Após 48 horas foram inoculados amostras do fungo FBL e 72 horas depois foi realizado
a inoculação do fungo FV12, obtendo-se desta forma o consórcio C1-PYC+FBL+FV12;
2) Este tratamento é constituído pela inoculação inicial de P. sanguineaus e
após 48 horas ocorreu a inoculação do segundo fungo FBL, formando-se o consórcio
C2- PYC+FBL;
3) Para o terceiro tratamento inoculou-se primeiramente P. sanguineaus e após
48 horas foi inoculado o fungo FV12, constituindo-se o consorcio C3-PYC+FV12.
A incubação foi feita em estufas à 30º C em condição estacionária durante 15,
30, 60 e 90 dias. Após os períodos determinados de fermentação, as amostras foram
filtradas e uma alíquota do caldo obtido foi transferida para tubos de ensaios de 10 mL
que foram armazenados à -10ºC e os polímeros utilizados também foram reservados,
para posteriores análises (REYES, 2003).
4.9 POLIETILENO TEREFTALATO SOB PRÉ-TRATAMENTO COM
TEMPERATURA 35ºC E 50ºC
Os polímeros plásticos cortados em partículas, correspondentes ao tamanho de
1x1 cm, com espessura de 0,35 mm, previamente pesados e desinfetados, foram
27
submetidos ao pré-tratamento com temperatura 35ºC e 50ºC durante 72 horas em estufa.
(JARA, 2007).
Os ensaios foram realizados em fermentação submersa utilizando Erlenmeyers
de 125 ml contendo 50 ml do meio, uma amostra dos microrganismos em estudos e 05
amostras do PET, que foram incubados durante 15, 30, 60 e 90 dias em estufas em
condição estacionária à 30º C. Após os períodos determinados de fermentação, as
amostras foram filtradas e uma alíquota do caldo obtido foi transferida para tubos de
ensaios de 10 ml que foram armazenados à - 10ºC e os polímeros utilizados também
foram reservados, para posteriores análises (REYES, 2003).
4.10 DETERMINAÇÃO DA PERDA DE MASSA DOS POLÍMEROS
As amostras dos plásticos cortados na forma de quadrados (1x1 cm) foram
previamente pesados em balança analítica. Após os períodos de incubação, os polímeros
foram colocados em pesa-filtros e deixados em estufas de secagem a 50º C por 12 horas.
A determinação da perda de massa dos polímeros foi baseada na metodologia ASTM
D5247-92 (1992) que consiste em colocar as amostras em solução de NaOH 5 mol.L-1
por aproximadamente 8 horas para retirada da massa microbiana e em seguida lava-se
em água corrente e mantém em repouso durante 8 horas em água destilada.
Após este período, as amostras condicionadas em pesa-filtros, foram novamente
colocadas em estufas de secagem a 50º C por 12 horas para determinação da perda de
massa dos polímeros. O percentual de perda de massa dos polímeros foi calculado
através da seguinte equação:
P = peso do PET, em porcentagem.
Pf = peso final
Pi = peso inicial
P M (%) = Pi - Pf x 100
Pf
28
4.11 MICROSCOPIA ELETRONICA DE VARREDURA
4.11.1 Preparação das Amostras
O protocolo utilizado foi uma adaptação a partir de dados de literatura para
processamento de amostras biológicas (BAL-TEC, 1999). A metodologia de
processamento das amostras de polímeros contendo células microbianas foi composta
das seguintes etapas:
1) Com o auxílio de um bisturi e pinça, os plásticos foram cortados em
dimensões bem reduzidas e pouca espessura, em seguida foi realizada a primeira
fixação, onde os plásticos foram mergulhados em solução de glutaraldeído 2%
preparado em tampão cacodilato de sódio (Na (CH3)2 AsO2) 0,1 M, e 0,2% de ácido
tânico, por 3 horas. Para a segunda fixação os plásticos foram novamente mergulhados
em solução glutaraldeído 2% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, porém com 2% de
ácido tânico, por 3 horas.
2) Em seguida as amostras foram lavadas três vezes em tampão cacodilato de
sódio 0,1 M, por 10 minutos com 3 repetições. Ocorreu uma etapa de pós-fixação, na
qual os plásticos foram imersos em solução de tetróxido de ósmio (OsO4) a 1% diluído
em tampão cacodilato de sódio 0,1 M por 1 hora. Logo após, foi realizada a segunda
lavagem onde as amostras foram mergulhadas em água destilada por 10 minutos com 3
repetições.
3) A desidratação ocorreu em soluções com concentrações crescentes de etanol
absoluto, nas concentrações de 30%, 50%, 70%, 90% e 100%, durante 10 minutos em
cada solução. As amostras serão passadas na solução a 100% por 3 vezes.
Posteriormente, a secagem foi realizada no equipamento denominado ponto crítico,
colocadas em suportes específicos (stubs), e presas com uma cola de prata, em seguida
metalizadas com ouro e mantidas em dessecadores para a visualização no MEV.
29
4.11.2 Análise Morfológica do PET- MEV
As amostras de PET foram preparadas para visualização morfológica por
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de sua superfície, ausente de
microrganismos, segundo adaptações do protocolo da BAL-TEC (1999).
Os polímeros foram fixados em suportes específicos (stubs) onde permaneceram
em repouso durante aproximadamente 4 horas para fixação e posteriormente foram
metalizadas com ouro (Sputter) e mantidas em dessecadores para visualização no MEV.
Após todas as etapas de preparo relacionadas anteriormente, os espécimes foram
adaptados em um porta-amostras e elétron-micrografadas em Microscópio Eletrônico de
Varredura (Jeol – JSM 5800 LV). As imagens obtidas foram capturadas pelo
computador, acoplado ao MEV, e armazenadas para posterior análise.
4.12 DETERMINAÇÃO ENZIMÁTICA
Todas as determinações das atividades enzimáticas foram realizadas em
triplicata. As leituras da absorvância foram realizadas em espectrofotômetro UV – 1201
– Shimadzu e as atividades enzimáticas foram expressas em UI/L, onde UI é a
quantidade de enzima necessária para causar perda de 1 mol de substrato por minuto
sob condições especificas. Os valores foram obtidos através de cálculos utilizando-se a
fórmula abaixo.
Equação para determinação enzimática (U/Litro), (LEONIWICZ e
GRZYWNOWICZ, 1981).
U/L= Δ Abs. x 106
ε x R x t
Δ Abs.= absorvância (final-inicial)
ε = absorvância molar
R = qtde. de caldo enzimático utilizado
t = tempo de reação utilizado
30
4.12.1 Atividade de Lacase-Lac
O substrato seringaldazina (SYR) foi utilizado para determinação da enzima
lacase, utilizando-se o método proposto por SCKLARZ et. al. (1989), que baseia-se na
oxidação do substrato enzimático de seringaldazina para sua forma de quinona. A
mistura reacional será composta de 50 µL da amostra filtrada; 0,95 ml tampão tartarato
de sódio pH 4,5; 1ml seringaldazina (produção estoque de 5mg/ 1ml de etanol) e 1ml de
água destilada, sendo monitorado o aumento da absorbância em 525 nm durante 60
segundos, utilizando-se o coeficiente de extinção ɛ = 6,5x104 cm¹.M¹.
Uma unidade de atividade enzimática corresponde à quantidade de produto
(µmol) liberada em um minuto por mL de amostra (U= µmol. mim¹).
4.12.2 Atividade de Lignina Peroxidase -Li–P
A atividade de Li–P na solução enzimática bruta foi determinada a 30 ºC numa
mistura de reação composta de 0,8 ml de tampão tartarato dissódico a 0,05 M (pH 3,0),
ou tampão fitalato ácido de potássico – HCl a 0,05 M (pH 3,0), 0,1 ml de solução álcool
veratrílico a 40Mm e 0,1 ml de solução de enzima bruta. A reação foi iniciada com a
adição de peróxido de hidrogênio (0,2 mM) e o aumento da absorbância, devido à
oxidação do álcool veratrílico, medido à 310 nm. Uma unidade de atividade de enzima é
definida como a quantidade de enzima necessária para formar 1 µmol de veratraldeído
por minuto, utilizando o coeficiente de extinção molar de 9,3 x 103/ mol/ cm. (TIEN &
KIRK, 1988).
4.12.3 Atividade de Manganês Peroxidase-Mn-P
A atividade de MnP na solução enzimática bruta foi determinada a 30 ºC numa
mistura reacional composta de 0,8 ml de tampão lactato de sódio a 0,05 M (pH 4,5),
0,1ml de MnSO4 a 0,4M e 0,1ml da solução de enzima bruta. A reação foi iniciada com
a adição de peróxido de hidrogênio (40 µM) e a absorbância medida a 270 nm. Uma
unidade de atividade de enzima será definida como a quantidade de enzima necessária
para formar 1 µmol de Mn+3
por minuto, utilizando o coeficiente de extinção molar de
8,1 x 103/mol/cm (GLENN et. al. , 1986; AITKEN & IRVINE, 1990).
31
4.13 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística dos dados coletados foi usado o software Bioestat 5.0
para obter os parâmetros descritivos (média, desvio padrão, variância) e correlação entre
as variáveis. Para a inferência sobre a relação entre as variáveis a serem mensuradas foi
utilizado o teste ANOVA e para contraste das médias o Teste de Tukey.
32
5 RESULTADOS
5.1 SELEÇÃO DE FUNGOS
Dos doze fungos testados, oito apresentaram-se positivos para enzimas
oxidativas, através do aparecimento do halo marrom ao redor da colônia na presença do
ácido tânico (DAVIDSON, et.al., 1938) (Tabela 2). Os fungos Pycnoporus sanguineus,
FBL e FV12 foram selecionados para os testes.
Tabela 2: Fungos produtores de fenoloxidases em períodos de 24, 48 e 72 horas.
Os fungos P.sanguineus, FBL e FV-12 destacaram-se pelas características de
crescimento rápido e detecção de fenoloxidades em menor tempo de cultivo na presença
do ácido tânico.
nº Fungos 24h 48h 72h
1 FBL +
2 FI-02
+
3 FV-12 +
4 FI-11
+
5 P.sanguineus +
6 FV-06 - - -
7 FI-09 - - -
8 FI-03
+
9 CV-50 - - -
10 CV-24 - - -
11 CV-25
+
12 CV-29 +
33
Figura 4: A. Fungo P. sanguineus, B. Fungo FBL e C. Fungo FV12.
Figura 5: A. Fungo P. sanguineus; B. Fungo FBL e C. Fungo FV12 em 24 de incubação em
presença do ácido tânico com a formação de um halo marrom considerado como reação positiva
para produção de fenoloxidases.
5.2 DEGRADAÇÃO DE PET POR FUNGOS AMAZÔNICOS
As amostras de PET que não sofreram tratamento de temperatura e foram
incubadas em diferentes meio de cultura, apresentaram diferenças na perda de massa
(Tabela 3). A perda de massa no meio MFT mostrou-se maior quando comparado com o
meio M1 para todos os fungos testados.
No meio MFT a maior perda de massa ocorreu para o fungo FBL. Ressalta-se,
entretanto, que não há diferença estatística ao nível de 95% de significância de perda de
massa do PET entre o fungo FBL e FV12. Por outro lado, a perda de massa do PET para
P. sanguineus foi 79,7% menor em relação aos outros fungos testados (Tabela 3).
A B C
A C B
Fonte: SOARES, E.P.,2011 Fonte: NUNES, A.S., 2011
NUNUNES,NUNEA.S.P.,2
011
Fonte: NUNES, A.S., 2011
NUNUNES,NUNEA.S.P.,2
011
34
TABELA 3: Média de perda de massa das amostras de PET em diferentes meio de
cultivo, PET sem pré-tratamento com temperatura, por um período de 90 dias.
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05).
No meio M1, o fungo FV12 apresentou o maior valor absoluto de perda de
massa do polímero. Porém, análise estatística evidenciou que não há diferença ao nível
de 95% de significância entre os valores de perda de massa realizados pelos fungos
incubados neste meio (Tabela 3).
Todas as amostras de PET sem tratamento físico de temperatura apresentaram
decréscimo em sua massa após incubação com as linhagens fúngicas nos diferentes
períodos testados em fermentação submersa estacionária.
De forma geral, as maiores perdas de massa ocorreram em 90 dias de incubação,
com PET sem tratamento físico, em meio MFT, para a linhagem FBL (Figura 6B). A
menor perda de massa alcançada neste meio de cultivo foi de 5,90% para o fungo P.
sanguineus em 30 dias de incubação.
Todas as amostras de PET que foram submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC e 50ºC apresentaram perda de massa inicial do polímero após
incubação com os fungos amazônicos em fermentação submersa.
MEIO DE CULTIVO
LINHAGENS FUNGICAS
P. sanguineus FBL FV12
M1 7.1(a)
5.2(a)
9.8(a)
MFT 13.3(a)
23.9(b)
21.3(b)
35
A B
Figura 6: Perda de massa do PET sem tratamento físico, com as linhagens fúngicas P.
sanguineus, FBL, FV12, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90
dias de incubação. A. Meio sem suplementação (M1); B. Meio suplementado com farinha de
tucumã (MFT).
O percentual da perda de massa das amostras de PET para ambas as
temperaturas testadas foi maior para o meio MFT para todas as linhagens (Tabela 3). O
percentual de perda de massa do PET submetido ao pré-tratamento com temperatura de
50ºC foi maior em relação àquelas que receberam pré-tratamento com temperatura 35ºC
nesse meio para todas as linhagens testadas. Para o fungo FV12, por exemplo, a perda
de massa do PET foi 100% maior nos ensaios com pré-tratamento com temperatura
50ºC, enquanto que, para o P. sanguineus e FBL essa diferença foi de 64% e 65,7%,
respectivamente.
TABELA 4: Percentagens médias de perda de massa das amostras de PET em
diferentes meio de cultivo, PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 35ºC e
50ºC, por um período de 90 dias.
MEIO DE
CULTIVO
TEMPERATURA 35ºC TEMPERATURA 50ºC
P. sanguineus FBL FV12 P. sanguineus FBL FV12
M1 2.8(a)
1.8(a)
5.3(a)
1.8(a)
1.6(a)
7.3(b)
MFT 13.5(a)
18.1(a)
15(a)
22.2(a)
30(a)
30(a)
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05).
36
Com as amostras de PET submetidas ao pré-tratamento com temperatura 35ºC, o
maior percentual de perda de massa foi obtido pelo fungo FBL, alcançando a média de
31,3% de decréscimo na massa do PET durante 90 dias de incubação em meio MFT.
Neste meio de cultivo a menor média do percentual de perda de massa foi para FV12
(5,80%) em 15 dias (Figura 7B).
A B
Figura 7: Perda de massa do PET submetido à temperatura 35ºC, com as linhagens fúngicas P.
sanguineus, FBL, FV12, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90
dias de incubação. A. Meio sem suplementação (M1); B. Meio suplementado com farinha de
tucumã (MFT).
De modo geral, o padrão da perda de massa, mostrou-se crescente até os trinta
dias de incubação para todos os fungos no meio M1(Figura 7A). No meio MFT, o fungo
FBL mostrou um padrão crescente no percentual da perda de massa até o período total
do experimento. Para este fungo a perda de massa entre os quinze primeiros dias até o
final do experimento foi de 300%. Padrão decrescente no percentual da perda de massa
do PET até os sessenta dias de incubação foi apresentado pelos fungos P. sanguineus e
FV12. Ressalta-se que para todos os fungos o maior percentual de perda de massa
ocorreu aos noventa dias de incubação no meio MFT (Figura 7B).
37
A B
Figura 8: Perda de massa do PET submetido à temperatura 50ºC, com as linhagens fúngicas P.
sanguineus, FBL, FV12, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30 60 e 90
dias de incubação. A. Meio sem suplementação (M1); B. Meio suplementado com farinha de
tucumã (MFT).
O padrão de perda de massa do PET pré-tratado à 50ºC em diferentes períodos
de incubação mostrou-se similar para os fungos FBL e FV12 no meio M1, onde a
tendência de aumento de perda de massa do PET nos trinta primeiros dias de incubação,
enquanto que para o P. sanguineus no mesmo período observa-se um padrão contrário
no percentual de perda de massa (Figura 8A).
Por outro lado, no meio acrescido do meio MFT foi onde ocorreu o maior
percentual de massa do PET para todos os fungos. P. sanguineus apresentou um padrão
decrescente no percentual de perda de massa no período de 90 dias de incubação.
Padrão contrário foi observado para FV12 onde ocorreu um percentual crescente de
perda de massa do PET até 30 dias de incubação (Figura 8B).
Teste de ANOVA realizado para verificar diferenças estatísticas entre as perdas
de massa das amostras de PET submetidas aos pré-tratamentos com diferentes
temperaturas dentre os tratamentos evidenciaram que não há diferenças ao nível de 95%
de probabilidade no pré- tratamento à 50ºC entre os fungos incubados em meio MFT.
Por outro lado, no meio M1 nesse mesmo pré-tratamento de temperatura ficou
evidenciado a maior perda de massa, ao nível de 95% de probabilidade (p<0,05) ocorreu
38
para o fungo FV12, enquanto que para o P. sanguineus e FBL a perda de massa foi
igual estatisticamente. Resultado similar foi observado no pré-tratamento com
temperatura 35ºC e meio M1. A diferença entre tratamentos nos diferentes meios de
cultura com pré-tratamentos em diferentes temperaturas evidenciou diferença estatística
(p<0,05) entre eles, confirmando que perda de massa de todos os fungos incubados no
meio MFT é maior (Tabela 4).
5.3 DEGRADAÇÃO DO PET POR CONSÓRCIO DE FUNGOS
Através das análises realizadas para determinar a perda de massa do PET
verificou-se que as amostras de PET apresentaram diminuição em sua massa após
incubação com os consórcios de fungos nos períodos de 15, 30,60 e 90 dias em
fermentação submersa estacionária.
O maior valor médio da perda de massa nas amostras de PET foi obtido nos
ensaios com consórcio C3, submetidas à temperatura 50ºC e meio MFT, enquanto que o
menor percentual de perda de massa ocorreu nas amostras submetidas ao tratamento
com o consórcio C1 na mesma temperatura, porém, em meio M1. Ressalta-se por outro
lado, que o percentual de perda de massa foi sempre maior nas amostras incubadas em
meio MFT, para todas as amostras pré-tratadas com diferentes temperaturas e tipos de
consórcios fúngicos testados (Tabela 5).
Em valores absolutos, os maiores percentuais médios de perda de massa
ocorreram nas amostras pré-tratadas com temperatura 50ºC e em meio MFT, para todos
os consórcios fúngicos.
O padrão da perda de massa em diferentes períodos de crescimento mostrou-se
similar para alguns dos tratamentos com consórcios. Para os consórcios C1, C2 e C3 e
amostras de PET sem tratamento físico e em meio M1, o padrão de perda de massa
apresenta-se crescente durante os períodos de tratamentos (Figura 9A). Exceção ocorreu
para o consórcio C2 em 60 dias de crescimento que apresentou um decréscimo no
percentual de perda de massa.
39
TABELA 5. Percentagens médias de perda de massa das amostras de PET em
diferentes meio de cultivo e temperaturas, por um período de 90 dias.
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05).
Para os consórcios fúngicos no meio MFT e amostras de PET sem tratamento
físico, o padrão de perda de massa apresentou-se também crescente durante o período de
teste. O consórcio C1 apresentou maior perda de massa em 30 dias de incubação,
enquanto que para os demais consórcios a maior perda ocorreu no fim do experimento,
aos 90 dias de incubação (Figura 9B).
A B
Figura 9: Perda de massa do PET sem tratamento físico, com os consórcios fúngicos C1, C2 e
C3, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30, 60 e 90 dias de incubação. A.
Meio sem suplementação -M1; B. Meio suplementado com farinha de tucumã - MFT.
MEIO DE
CULTIVO
PET SEM
TRATAMENTO FÍSICO PET-TEMP. 35ºC PET-TEMP. 50ºC
C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3
M1 5.9(a)
8.4(a)
9.2(a)
2.6(a)
3.4(a)
6.7(a)
1.6(a)
6.9(a)
6.8(a)
MFT 19.62(a)
19.31.3(a)
23.5(a)
13.7(a)
15.6(a)
23.6(b)
36.4(b)
17.2(a)
27.3(a)
40
Para as amostras de PET pré-tratadas com temperatura 35ºC e incubadas no
meio M1, o padrão da perda de massa para os consórcios C1 e C2 apresentou
comportamento similar com maior perda em 60 dias de incubação (Figura 10A).
Exceção para o consórcio C3 que, mostrou maior percentual de perda de massa após 90
dias de incubação.
Amostras de PET com mesmo pré-tratamento de temperatura, mas em meio
MFT, verifica-se que todos os consórcios testados mostraram maior percentual de perda
de massa após 90 dias de incubação (Figura 10B). Neste caso, foi onde se observou o
maior valor de perda de massa (~37%) entre os consórcios testados.
A B
Figura 10: Perda de massa do PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 35ºC, com os
consórcios fúngicos C1, C2 e C3, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30
60 e 90 dias de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha
de tucumã - MFT.
O percentual de perda de massa para as amostras de PET pré-tratadas com
temperatura 50ºC e meio M1 mostrou padrão crescente ao longo do período de 90 dias
de incubação (Figura 11A).
Comportamento contrário apresentou o padrão da perda de massa das amostras
de PET para o meio MFT dos consórcios C2 e C3. O consórcio C2 apresentou padrão
de perda de massa crescente em 60 dias, enquanto que C3 nas mesmas condições
mostrou decrescente no mesmo período. Exceção ocorreu para o consórcio C1, que
apresentou comportamento crescente a partir dos primeiros 15 dias de incubação, onde
41
observou-se o maior valor da porcentagem da perda de massa das amostras no período
final do experimento (Figura 11B).
A B
Figura 11: Perda de massa do PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC, com os
consórcios fúngicos C1, C2 e C3, em fermentação submersa estacionária no período de 15, 30
60 e 90 dias de incubação. A. Meio sem suplementação -M1; B. Meio suplementado com
farinha de tucumã -MFT.
Teste de ANOVA realizado para verificar diferenças estatísticas entre as perdas
de massa das amostras de PET que não foram submetidas ao tratamento com
temperatura demonstraram que não existe diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade dentre os tratamentos (Tabela 5).
As amostras de PET submetidas aos pré-tratamentos com diferentes
temperaturas dentre os tratamentos evidenciaram que não há diferenças ao nível de 95%
de probabilidade no pré- tratamento à 35ºC entre os fungos incubados em meio M1. Por
outro lado, no meio MFT nesse mesmo pré-tratamento de temperatura ficou evidenciado
a maior perda de massa, ao nível de 95% de probabilidade (p<0,05) ocorreu para o
consórcio fúngico C3, enquanto que para o consórcio C1 e C2 a perda de massa foi
igual estatisticamente (Tabela 5).
42
Amostras de PET submetidas ao pré-tratamento com temperatura 50ºC em meio
M1 não apresentaram diferença estatística ao nível de 95% de probabilidade dentre os
tratamentos. Porém, no meio MFT nesse mesmo pré-tratamento de temperatura ficou
evidenciado que a perda de massa dos consórcios C2 e C3 foram iguais
estatisticamente. Exceção para o consórcio C1, que apresentou diferença estatística ao
nível de 95% de probabilidade (p<0,01) (Tabela 5).
A diferença entre tratamentos nos diferentes meios de cultura com amostras de
PET sem tratamento físico e submetidas aos pré-tratamentos em diferentes temperaturas
evidenciou diferença estatística (p<0,05) entre eles, confirmando que perda de massa de
todos os fungos incubados no meio MFT é maior (Tabela 5).
5.4 MICROSCOPIA ELETRONICA DE VARREDURA
Observações no MEV mostram alterações na superfície das amostras analisadas.
As amostras de PET submetidas à incubação durante 90 dias com as linhagens fúngicas
em meio M1 e MFT apresentaram morfologias distintas (Figuras 12, 13 e 14).
Verifica-se na Figura 14F e 14I, modificações na superfície do PET após retirada
da massa celular do fungos FBL e FV12 respectivamente, em 30 dias de incubação, sob
temperatura 50ºC, em meio tucumã. Na Figura 15B ampliada observa-se que o PET
sofreu severo desgaste da superfície polimérica, com descamações, rupturas e aspecto
quebradiço em toda superfície, assim como clareamento da amostra.
Nas Figuras 12F e 12I observa-se modificações na superfície do PET em relação
ao controle, no meio tucumã incubados durante 90 dias. Após a retirada da massa
celular do fungo FBL o PET apresentou aspecto da superfície polimérica com rupturas e
descamações.
As amostras de PET submetidas ao tratamento com temperatura 35ºC, incubados
com o fungo FBL em meio tucumã, durante 90 dias revela rupturas na superfície do
PET (Figura 13F). Contundo, quando se observa a Figura 12I, verifica-se que a
superfície do PET apresenta rupturas, descamação e fendas.
43
Para efeito comparativo das características da ação dos consórcios fúngicos nas
amostras, utilizou-se àquelas oriundas do último período do experimento, ou seja, após
90 dias de incubação, para ilustrar a superfície das amostras de PET vista ao MEV.
Comparando-se as fotomicrografias das amostras do controle com aquelas que
sofreram a ação dos fungos, verifica-se que estas apresentam rupturas, escavações,
descamações e aspecto quebradiço (Figura 16, 17 e 18).
As amostras oriundas do meio MFT e com pré-tratamento com temperatura 50ºC
para o consórcio C1 foram as que apresentaram as maiores modificações na superfície,
concordando com os valores obtidos para a perda de massa, onde neste tratamento foi
maior (Figura 18C). Após a retirada da massa celular observa-se rupturas de uma
primeira camada do polímero e o aparecimento de um “buraco” possivelmente
proporcionado por ataque enzimático ou mecânico na superfície do polímero sob o
tratamento com temperatura de 35ºC (Figura 17C), características peculiares das
Figuras 18C e 18I.
De modo geral, essa parece ser a característica comum a toda superfície
independente do tratamento utilizado. O ataque inicia-se pela formação de um orifício
deixando exposta uma segunda camada do polímero, que posteriormente sofre a ação
similar com formação de um novo orifício nessa camada exposta.
Independente dos pré-tratamentos com diferentes temperaturas esse padrão de
ataque diferencia-se apenas na intensidade, reflexo do meio de cultura que é utilizado.
Nas amostras desse mesmo C1, oriundas do meio sem acréscimo de FT e nas
mesmas condições de incubação e pré-tratamentos com diferentes temperaturas,
observa-se a formação inicial de orifício com mais claras (Figura 18B).
44
A B C
D E F
G H I
Figura 12: Fotomicrografias de amostras do PET sem tratamento físico e linhagens fúngicas P.
sanguineus, FBL e FV12 por MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico; B. PYC em
meio M1; C. PYC em meio MFT; D. controle abiótico; E. FBL em meio M1; F. FBL em meio
MFT; G. controle abiótico; H. FV12 em meio M1; I. FV12 em meio MFT – 3000X.
45
A B C
D E F
G H I
Figura 13: Fotomicrografias de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 35º C e linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12 por MEV em 90 dias de
incubação. A. controle abiótico; B. PYC em meio M1; C. PYC em meio MFT; D. controle
abiótico; E. FBL em meio M1; F. FBL em meio MFT; G. controle abiótico; H. FV12 em meio
M1; I. FV12 em meio MFT – 3000X.
46
A B C
D E F
G H I
Figura 14: Fotomicrografias de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 50º C e linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12 por MEV em 30 dias de
incubação. A. controle abiótico; B. PYC em meio M1; C. PYC em meio MFT; D. controle
abiótico; E. FBL em meio M1; F. FBL em meio MFT; G. controle abiótico; H. FV12 em meio
M1; I. FV12 em meio MFT – 3000X.
47
A
B
Figura 15: Fotomicrografias ampliada de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 50º C e linhagens fúngicas A. FBL e B. FV12 por MEV em 30 dias de incubação
em MFT. Modificações na superfície do PET após retirada da massa celular dos fungos.
3000X.
48
A B C
D E F
G H I
Figura 16: Fotomicrografias de amostras de PET sem tratamento físico e consórcio de fungos,
MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico; B. Consórcio C1 em meio M1; C.
Consórcio C1 em meio MFT; D. controle abiótico; E. Consórcio C2 em meio M1; F. Consórcio
C2 em meio MFT; G. controle abiótico; H. Consórcio C3 em meio M1; I. Consórcio C3 em
meio MFT – 3000X.
49
A B C
D E F
G H I
Figura 17: Fotomicrografias de amostras de PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 35ºC e consórcio de fungos, MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico;
B. Consórcio C1 em meio M1; C. Consórcio C1 em meio MFT; D. controle abiótico; E.
Consórcio C2 em meio M1; F. Consórcio C2 em meio MFT; G. controle abiótico; H. Consórcio
C3 em meio M1; I. Consórcio C3 em meio MFT – 3000X.
50
A B C
D E F
G H I
Figura 18: Fotomicrografias de amostras de PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 50ºC e consórcio de fungos, MEV em 90 dias de incubação. A. controle abiótico;
B. Consórcio C1 em meio M1; C. Consórcio C1 em meio MFT; D. controle abiótico; E.
Consórcio C2 em meio M1; F. Consórcio C2 em meio MFT; G. controle abiótico; H. Consórcio
C3 em meio M1; I. Consórcio C3 em meio MFT – 3000X.
51
A
B
Figura 19: Fotomicrografias ampliada de amostras do PET submetidas ao pré-tratamento com
temperatura 50º C e consórcios de fungos A. C1 e B. C3 por MEV em 90 dias de incubação em
MFT. Modificações na superfície do PET após retirada da massa celular dos fungos. 3000X.
.
52
5.5 ATIVIDADE ENZIMÁTICA
5.5.1 Atividade de Lacase-Lac
A Tabela 6 mostra a atividade enzimática média dos fungos com amostras
de PET sem tratamento físico com temperatura em diferentes meios de cultivo.
A atividade de lacase (Lac) no meio MFT para todos os fungos testados foi
~2,2 vezes maior do que no meio M1. No meio MFT os valores médios da atividade de
Lac foram similares entre as linhagens fúngicas, enquanto que, no meio M1 os valores
médios de atividade enzimática mostram-se diferenciado entre os fungos.
Tabela 6. Valor médio da atividade enzimática de lacase, em diferentes meio de cultura
e amostras de PET com e sem tratamento físico de temperatura, em 90 dias de
incubação.
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05). (1)
Diferença estatística ao nível de 99% de significância.
*PYC-P. sanguineus
Nesse contexto, o fungo FV12 foi o que apresentou maior atividade enzimática e
diferença estatística ao nível de 95% de significância (p<0.05) no meio M1 (Tabela 5).
Observa-se diferença também na atividade enzimática de FBL entre os meios de
incubação.
O padrão da atividade enzimática no meio M1 mostrou-se crescente com
atividade máxima para P. sanguineus e FBL em 90 dias de incubação (Figura 20A). No
meio MFT a atividade enzimática máxima para P. sanguineus e FV12 ocorreu nos 60
MEIO DE
CULTIVO
PET SEM
TRATAMENTO
FÍSICO
PET - TEMP. 35ºC PET-TEMP. 50ºC
PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12
M1 6.78(a)
5.97(a)
9.27(b)
7.81(a)
7.92(a)
8.05(a)
5.30(a)
6.01(a)
7.66(a)
MFT 15.83(a)
15.00(a)
16.09(a)
10.72(a)
9,96(a)
9.48(a)
14.43(a,b)(1)
14.79(a,b)(1)
15.05(a,b)(1)
53
dias de incubação, enquanto que, para FBL a máxima atividade de Lac ocorreu nos 90
dias (Figura 20B).
A B
Figura 20: Atividade enzimática de Lac, PET sem tratamento físico com as linhagens fúngicas
P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de
incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha de tucumã -
MFT.
De modo geral, o meio acrescido de FT e com PET sem tratamento com
temperatura foi onde ocorreu a maior atividade média de Lac para todos os fungos
testados. Para os meios onde as amostras de PET sofreram pré-tratamento com
temperatura 35ºC o valor médio da atividade de Lac para todos os fungos, ficou
próximo para ambos os meios (Tabela 6).
Assim como ocorreu na atividade de Lac onde o PET não sofreu nenhum
pré-tratamento de temperatura, a atividade enzimática foi maior no meio MFT onde
estava presente amostras de PET submetidas ao pré-tratamento com temperatura 35ºC
durante 60 dias. Neste contexto, P. sanguineus, apresentou uma atividade de Lac 37%
maior que no meio M1, enquanto que, para FBL e FV12 esta atividade enzimática foi
25,8% e 22,2% maior, respectivamente no meio FMT (Tabela 6). Ressalta-se,
entretanto, que nessa mesma condição, ao nível de 95% de significância (p<0.05) não
diferença estatística entre e dentre os fungos testados.
54
O padrão da atividade enzimática de Lac ao longo do período de teste para o
meio M1, onde as amostras de PET sofreram pré-tratamento a 35ºC foram similares
para todos os fungos, com maior atividade enzimática aos 60 dias de incubação (Figura
21A).
A B
Figura 21: Atividade enzimática de Lac, PET submetido ao pré-tratamento com temperatura
35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT.
No meio MFT, com amostras de PET pré-tratados a 35ºC, o padrão da atividade
de Lac mostrou pico máximo aos 30 dias de incubação para os fungos FBL e FV12,
decrescendo até o final do experimento. P. sanguineus, mostrou um padrão crescente de
atividade até atingir o pico máximo aos 60 dias de incubação (Figura 21B).
Para os ensaios com PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC,
de modo geral, os fungos apresentaram maior atividade de Lac no meio acrescido com
FT (Tabela 6). Embora no meio MFT a atividade enzimática se apresentar similar para
todos os fungos, no meio M1 foi cerca de 172% menor. Dentre os tratamentos, não
ocorre diferença estatística ao nível de 95% de significância (p<0.005) na atividade de
Lac para o fungo FBL e, entre os tratamentos existe diferença na atividade enzimática
dos fungos ao nível de 99% de significância (p<0.01).
O padrão da atividade enzimática de Lac mostrou-se crescente, com pico
máximo aos 30 dias de incubação no meio MFT (Figura 21B). Ao final do experimento
55
a atividade dessa enzima foi cerca de 6.8% maior em relação ao período de 15 dias,
marco inicial de mensuração.
A B
Figura 22: Atividade enzimática de Lac, PET submetido ao pré-tratamento com, temperatura
50ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação - M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT
Comportamento contrário foi observado para FBL e P. sanguineus no meio M1
onde o padrão se mostrou decrescente até o final do experimento (Figura 22A). Nesta
mesma condição o fungo FV12 apresentou um padrão de decréscimo inicial na
atividade enzimática até o trigésimo dia de crescimento, e a partir desse período
apresentou um padrão crescente de atividade de Lac até o final do experimento.
5.5.2 Atividade de Lignina Peroxidase-LiP
A atividade de lignina peroxidase (LiP) no meio M1, na presença das amostras
de PET sem tratamento físico foi menor para todos fungos (Tabela 6). O maior valor
médio da atividade de LiP nessas condições foi obtido para P. sanguineus. Ressalta-se,
entretanto, que ao nível de 95% de significância (p<0.05) não há diferença estatística na
atividade de LiP entre e dentre os fungos testados em ambos os meios, com amostras de
PET sem tratamento físico.
56
Tabela 7. Valor médio da atividade enzimática de lignina peroxidase, em diferentes
meio de cultura e amostras de PET com e sem tratamento físico de temperatura, em 90
dias de incubação.
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05). (1)
Diferença estatística ao nível de 99% de significância.
*PYC-P. sanguineus
O padrão de atividade de LiP nesta etapa da pesquisa, ocorreu em 15 dias de
incubação para a linhagem P. sanguineus em meio MFT. Após essa atividade máxima
houve um decréscimo abrupto e subseqüentemente redução da atividade até o tempo
final da medição (Figura 23A).
No entanto, no meio M1, apesar da atividade dessa enzima ter começado em 15
dias de incubação, observa-se um decréscimo no trigésimo dia e subseqüentemente um
aumento da atividade seguindo até 90 dias de incubação. (Figura 23B).
Da mesma maneira que ocorreu no meio M1 com PET sem tratamento físico, a
atividade de LiP nesse meio com amostras de PET submetidas a pré-tratamento de
35ºC, foi também menor do aquele do meio MFT nessas mesmas condições de pré-
tratamento (Tabela 7). O fungo FBL foi o que apresentou a maior atividade de LiP no
meio MFT. Ressalta-se, entretanto, que não há diferença estatística ao nível de 95% de
significância (p<0.05) entre a atividade dos fungos. Porém, entre os tratamentos existe
diferença entra a atividade de LiP dos fungos ao nível de 99% de significância (p<00.1)
(Tabela 7).
MEIO DE
CULTIVO
PET SEM
TRATAMENTO FÍSICO PET - TEMP. 35ºC PET-TEMP. 50ºC
PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12
M1 70.73(a) 68.40(a) 70.67(a) 74.68(a) 62.17(a) 68.28(a) 71.22(a) 59.68(a) 78.55(a)
MFT 102.46(a) 79.45(a) 93.54(a) 117.92(a,b)(1) 125(a,b)(1) 95.25(a,b)(1) 107.18(a,b) 97(a,b) 107.23(a,b)
57
A B
Figura 23: Atividade enzimática de LiP, PET sem tratamento físico com as linhagens fúngicas
P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de
incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio suplementado com farinha de tucumã-
MFT.
A atividade de LiP no meio M1 e com partículas de PET submetido à
temperatura 35ºC, atingiu seu nível máximo em 60 dias para o todos os fungos testados
.(Figura 24 A). O padrão de atividade de LiP nas mesmas condições, porém no meio
MFT apresenta o pico máximo aos 30 dias de incubação para o fungo P. sanguineus
(Figura 24B).
A atividade de LiP em meio com presença de partículas de PET pré-tratada à
50ºC foi maior no meio MFT. Nestas condições FV12 apresentou o maior valor
absoluto da atividade enzimática de LiP. Ressalta-se, que dentre os meios não há
diferença estatística da atividade de LiP ao nível de 95% de significância (p<0.005). Por
outro lado, encontramos diferenças na atividade enzimática do P. sanguineus entre os
meios de incubação (Tabela 7).
O padrão de atividade de LiP foi similar para todas as linhagens estudadas
em meio M1 e MFT, tendo seu pico máximo em 60 dias de incubação. (Figura 25A e
25B).
58
A B
Figura 24: Atividade enzimática de LiP, PET submetido ao pré-tratamento com temperatura
35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT.
.
A B
Figura 25: Atividade enzimática de LiP, PET submetido ao tratamento físico, temperatura
50ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT.
59
5.5.3 Atividade de Manganês Peroxidase – MnP
Ensaios onde partículas de PET não sofreram qualquer tratamento físico antes de
serem adicionadas aos diferentes meios de cultura e fungos, a maior atividade média de
MnP ocorreu no meio MFT (Tabela 8). Neste meio, o FV12 apresentou maior atividade
de MnP, 63% maior do que no meio M1. Ressalta-se que não existe diferença estatística
ao nível de 95% de significância entre e dentre os tratamentos realizados.
Tabela 8. Valor médio da atividade enzimática de manganês peroxidase, em diferentes
meio de cultura e amostras de PET com e sem tratamento físico de temperatura, em 90
dias de incubação.
Letras iguais na horizontal não apresentam diferença estatística ao nível de 95% de
probabilidade (p<0,05). (1)
Diferença estatística ao nível de 99% de significância.
*PYC-P. sanguineus
A atividade de MnP foi maior para todos os fungos e meios testados. No
caso especifico onde as amostras de PET não sofreram qualquer tratamento físico antes
de serem adicionadas aos diferentes meio de cultura o padrão de atividade de MnP teve
sua atividade máxima em 60 dias para o fungo P. sanguineus e FBL. Comportamento
contrário para FV12 que demonstrou que a atividade enzimática decresceu nesse mesmo
período (Figura 26A). O padrão de atividade enzimática de MnP ao longo do
experimento para o meio MFT nas condições acima citadas, mostrou-se decrescente
para todos os fungos com atividade máxima aos quinze dias de incubação (Figura 26B).
O padrão de atividade MnP, no meio M1, que continha as amostras de PET
pré-tratadas a 35ºC, mostrou-se crescente com máximo de atividade aos 60 dias de
incubação para todos os fungos (Figura 27A). No meio MFT nas mesmas condições de
pré-tratamento, a atividade de MnP apresentou padrão decrescente para P. sanguineus e
MEIO DE
CULTIVO
PET SEM TRATAMENTO
FÍSICO PET-TEMP. 35ºC PET-TEMP. 50ºC
PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12 PYC* FBL FV12
M1 66.3(a) 69.7(a) 54.5(a) 60.1(a) 58.2(a) 58.7(a) 53.6(a) 49.0(a) 60.4(a)
MFT 80.2(a) 85.3(a) 88.7(a) 102.5(a,b)(1) 103.8(a,b)(1) 82.5(a,b)(1) 107.3(a,b) 147.1(a,b) 156.9(a,b)
60
FBL com atividade máxima nos quinze primeiros dias de incubação, exceção para o
fungo FV12 cujo padrão de atividade enzimática mostrou-se crescente durante o
período do experimento, alcançando atividade máxima aos sessenta dias de incubação
(Figura 27B).
A B
Figura 26: Atividade enzimática de MnP, PET sem tratamento físico com as linhagens fúngicas
P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de
incubação. A. Meio água; B. Meio suplementado com farinha de tucumã.
Para o meio MFT que continha amostras de PET pré-tratadas à 50ºC a atividade
média de MnP foi maior para FV12, seguida de FBL e P. sanguineus (Tabela 8). Nesta
condição de pré-tratamento da amostra e meio MFT foi onde ocorreu a maior atividade
de MnP, em comparação com as amostras sem nenhum pré-tratamento e aquelas pré-
tratadas a 35ºC. No meio M1, a atividade enzimática mostrou-se similar para todos os
tratamentos, exceção para FBL com atividade enzimática máxima em 30 dias de
incubação (Figura 28A).
O padrão de atividade enzimática de MnP ao longo do experimento para o meio
MFT nas condições acima citadas, mostrou-se decrescente para todos os fungos com
atividade máxima aos 15 dias de incubação para FV12 e 30 dias para P. sanguineus e
FBL (Figura 28B).
61
A B
Figura 27: Atividade enzimática de MnP, PET submetido ao tratamento físico, temperatura
35ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT.
A B
Figura 28: Atividade enzimática de MnP, PET submetido ao tratamento físico, temperatura
50ºC, com as linhagens fúngicas P. sanguineus, FBL e FV12, em fermentação submersa
estacionária, durante 15, 30, 60 e 90 de incubação. A. Meio sem suplementação-M1; B. Meio
suplementado com farinha de tucumã - MFT.
62
6 DISCUSSÃO
Através das análises realizadas para determinar a perda de massa dos polímeros
em estudo verificou-se que todas as amostras de PET apresentaram decréscimo em sua
massa inicial após incubação com as linhagens fúngicas nos períodos de incubação
testados.
Silva (2009) refere que a degradação do PET pode ocorrer por duas rotas: pela
fotoclivagem direta do polímero e por subseqüente fotoxidação dos grupos glicol.
Quando expostos à luz solar a foto oxidação não é uniforme sendo degradado,
preferencialmente, na superfície orientada pela luz. Em relação à degradação hidrolítica
todos os poliésteres aromáticos podem ser degradados a temperaturas máximas de
utilização em torno de 105º C (MARK et. al., 1986).
Foram realizados pré-tratamentos com temperatura 35º e 50ºC visando explorar
os processos de transformações químicas e físicas objetivando a perda dessas
propriedades, tornando mais acessíveis à colonização dos fungos e conseqüentemente o
processo de biodegradação. Dzieciol; Trzeszczynski, (1998) afirmam que a estabilidade
térmica do PET é relativamente alta, substâncias voláteis tóxicas são emitidas à
temperaturas de 200-300º , durante a produção, processamento e reciclagem do
material, produzindo principalmente acetaldeído, formaldeído, monóxido de carbono e
benzeno. As reações de degradação termo-oxidativas são mais complicadas com a
participação do O2 formando hidroperóxido seguido pela ruptura da cadeia.
Cepas amazônicas dos fungos FBL e FV12 no período de 90 dias de cultivo em
meio MFT, submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC, promoveram a maior
perda de massa do plástico, atingindo ambos o percentual de 30%. Este resultado
concorda com o de JARA (2007), que realizando experimentos com o fungo
basidiomiceto Phanerochaete chrysosporium, no processo de degradação do PET,
observou que as amostras de PET submetidas à pré-tratamento com temperatura 50ºC e
63
incubadas com o referido fungo, obtiveram também diminuição de sua massa
polimérica em 60 dias de incubação, sendo que nossos fungos apresentaram maior perda
de massa das partículas de PET.
Nos ensaios realizados sem nenhum tratamento físico, os melhores resultados
foram obtidos no período de 90 dias de incubação em meio MFT, fermentação
submersa estacionária para o fungo FBL, alcançando a média 23,9% de perda inicial de
massa do PET. REYES (2003), realizando ensaios com PET sem tratamento físico, em
meio de cultivo líquido contendo água e sais, utilizando o fungo basidiomiceto
Pleurotos 001, alcançou a média em torno de 5,79% em 30 dias de incubação. COSTA
(2001) também estudando a perda de massa do PET em fermentação submersa,
utilizando resíduos agroindustriais, encontrou um período máximo de perda similar ao
encontrado na presente pesquisa (90 dias).
Tratamentos biológicos utilizando consórcios de microorganismos vêm sendo
apresentado como uma poderosa alternativa biotecnológica, apresentado-se viável no
processo de biorremediação/biodegradação (KUNZ et. al.; 2002).
Neste sentido, nossos resultados mostraram-se melhores com consórcios de
fungos do que quando testados individualmente. Gallego e seus colaboradores (2007),
por exemplo, também demonstraram experimentalmente que a biodegradação de
derivados do petróleo, pelo consórcio de fungos filamentosos, foi mais eficiente do que
com os microorganismos isolados. Costa et.al., (2007), referem que os consórcios
microbianos podem utilizados como inóculos em tratamentos biológicos, visando
reduzir o tempo de degradação. E, no processo de biodegradação dos derivados do
petróleo é necessária a cooperação sinérgica entre os microorganismos para
metabolizarem os compostos presentes no petróleo até a completa mineralização destes
em gás carbônico e água ou gás metano e água (URURAHY et.al., 1998).
Nossos resultados mostraram-se diferentes quando realizamos ensaios com
partículas de PET submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC, com melhores
resultados obtidos no período de 90 dias de incubação em meio MFT, para o consórcio
C1. Tais resultados corroboram com outras pesquisas que mostram o potencial de
consórcios fúngicos para a degradação do PET (GALEGO et. al., 2007).
64
Com relação à atividade enzimática, todas as linhagens estudadas apresentaram
atividade para lacase, lignina peroxidase e manganês peroxidase em 90 dias de
incubação em fermentação submersa estacionária.
A lacase tanto pode atuar na destoxificação de compostos do substrato como
oxidar grupos fenólicos (KEREM et.al., 1992). Nossos experimentos realizados com os
fungos testados produziram máxima atividade de peroxidases (LiP e MnP) no mesmo
período de pico de lacase, comportando-se de forma similar, o que permite inferir sobre
possível sinergismo dessas enzimas na degradação dos compostos que constituem o
PET. Estudos realizados evidenciam tal comportamento na descoloração de corantes
industriais (KUMARAN et. al., 1997; RODRIGUEZ et. al., 1999; SWAMY &
RAMSAY, 1999).
A produção de lacase e peroxidases (LiP e MnP) ocorreu durante a fase
exponencial do fungo, possivelmente após a ação das enzimas celulolíticas conforme
sugerido por Akhmedova (1994), mas que não foram o foco do presente trabalho.
Nuske e colaboradores (2002) mostraram que a produção de lacase em cultivo
submerso de Nematoloma frowardi ocorreu conjuntamente com o crescimento fúngico,
cessando com o decréscimo da produção de biomassa. Enzimas de interesse
botecnológico têm sido tradicionalmente produzidas por fermentação submersa, devido
à maior facilidade de controle e operação do processo (ALONSO, 2001).
Os ensaios envolvendo a linhagem fúngica FV12 e o PET submetido à
temperatura 50ºC em meio MFT, foram os que apresentam melhores resultados quanto
à atividade de manganês peroxidase, coincidindo com o maior valor médio de perda de
massa do PET nas mesmas condições de incubação, revelando forte relação da atuação
dessa enzima no processo de degradação do PET.
O meio de cultivo suplementado com MFT foi onde ocorreu o maior
crescimento radial, para todos os fungos testados e a maior produção de atividade
enzimática, coincidindo com a maior perda de massa das partículas de PET, indicativo
de que as enzimas oxidativas determinadas têm um papel importante na degradação de
compostos presentes no polímero. Este meio demonstra apresentar requisitos
nutricionais para os fungos no processo de degradação do PET. FERREIRA et. a.l,
65
(2008) descreve que na composição química do fruto do tucumã encontra-se, em média
46% de umidade, 5% de proteínas, 30% de lipídios, 9% de fibras e 3% de minerais. A
casca do tucumã é composta de potássio, cálcio, e selênio e fibra alimentar, verifica-se,
portanto, a viabilidade de utilização da mesma (YUYAMA, 2005).
As amostras de PET submetidas à fermentação submersa estacionária e pré-
tratamento com temperatura 50ºC e incubadas durante 90 dias com a linhagem FBL,
FV12 e com o consórcio C3 foram os ensaios que apresentaram os melhores resultados
no que tange a diminuição da massa inicial do polímero, realizou-se Microscopia
Eletrônica de Varredura para verificar se suas superfícies sofreram alguma modificação.
Após análise, observa-se que as partículas de PET sofreram severo desgaste da
superfície polimérica, com descamações, rupturas, escavações e aspecto quebradiço em
toda superfície, assim como clareamento da amostra. É importante ressaltar que
verificar a degradação de um polímero é de extrema dificuldade, pois este fenômeno
pode ocorrer sem que haja necessariamente a perda de massa do polímero, mas
alterações na molécula do polímero podem ser observadas (SCHNABEL, 1981; SCOTT
& GILEAD, 1995). REYES (2003), trabalhando com degradação do PET, destacou o
basidiomiceto P. chrysosporium, como a linhagem que promoveu maior diminuição de
massa do PET, 6,7% em 90 dias de incubação e apresentou maior desgaste e alterações
da superfície polimérica ao MEV.
Ressalta-se que a maior perda de massa das partículas de PET, ocorreu nas
amostras pré-tratadas à 50ºC. Esse pré-tratamento das partículas de PET possivelmente
alteraram algumas propriedades físicas e estrutura química do Polietileno tereftalato
(PET), facilitando a colonização dos fungos testados e promovendo o processo de
biodegradação.
Nossos resultados, com fungos amazônicos concordam com àqueles obtidos por
Jara (2007) que mostrou que partículas de Polietileno Tereftalato tratadas com
temperatura de 50ºC e submetidas ao crescimento com P. chrysosporium, apresentaram
o maior valor de perda de massa.
66
7 CONCLUSÕES
De uma maneira geral, as linhagens fúngicas utilizadas neste trabalho foram
capazes de diminuir a massa molar do PET.
As linhagens fúngicas FBL, FV12 e o consórcio C1 promoveram a maior
perda de massa do PET quando submetido ao pré-tratamento com temperatura 50ºC
durante 90 dias. Demonstraram ter um grande potencial na degradação de polietileno
tereftalato apresentando alterações da morfologia e superfície do polímero em MEV
com severo desgaste da superfície polimérica, descamações, escavações, rupturas e
aspecto quebradiço em toda superfície, assim como clareamento da amostra.
A utilização de consórcio de microorganismos fúngicos apresenta-se
como uma poderosa alternativa biotecnológica, demonstra-se técnica e economicamente
viável no processo de biodegradação do polietileno tereftalato - PET.
A enzima manganês peroxidase (MnP) em meio MFT foi a que
apresentou os maiores valores de atividade dentre as três enzimas estudadas.
67
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nossos resultados qualificaram outras indagações sobre variáveis não
estudadas, que poderiam influenciar nos resultados. Nesse sentido é necessário os
seguintes estudos:
Verificar a influência do pH no processo de degradação do PET e o
efeito dos tratamentos físicos (UV e temperatura) na toxicidade do meio de cultivo;
Verificar atividades de enzimas hidrolíticas e a influência de indutores
para aumentar a atividade das enzimas oxidativas;
Estudar faixa maior de temperatura para pré-tratamento das partículas de
PET;
Testar outros meios de cultura alternativos para incubação e consórcios
com outros fungos;
Estudar a incubação sob fermentação em estado de agitação;
68
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aculeatum Meyer) desidratado e pulverizado. Cienc. Tecnol. Aliment. v. 28, n. 2,
Campinas, 2008.
81
ANEXOS
RESUMOS
82
ATIVIDADE OXIREDUTASE DO Pycnoporus sanguineus: SECREÇÃO DE LACASE EM MEIO
SUPLEMENTADO COM DIFERENTES FONTES DE CARBONO
Naimy Farias de Castro 1
Edilson Albuquerque Vieira 1
Elaine Pires Soares 1
Adriana da Silva Nunes 1
Ademir Castro e Silva 1
1. Universidade do Estado do Amazonas
INTRODUÇÃO: Enzimas ligninolíticas têm potencial para aplicações em vários processos industriais e biotecnológicos.
Tais aplicações incluem descontaminação de efluentes industriais, principalmente da industrial têxtil e
petroquímica, processo de alvejamento e deslignificação na indústria de celulose e papel e na remoção de
compostos fenólicos na indústria de bebidas (BALAN & MONTEIRO, 2001) e várias outras aplicações.
Dentre essas enzimas encontra-se a lacase (benzenediol: oxigen oxireductase EC 1.10.3.2), que catalisa a
oxidação de vários substratos com a redução de moléculas de oxigênio em água. Fungos causadores de
podridão branca da madeira (white-rot fungi) são grandes secretores dessa enzima. Dentre estes encontra-
se o Pycnoporus sanguineus que vem sendo estudado nos seus vários aspectos de atividade enzimática. É
necessário, entretanto, pesquisar novas fontes de carbono que possam estimular o aumento da atividade
de lacase. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo testar a atividade de lacase produzida
pelo fungo Pycnoporus sanguineus em meio suplementado com diferentes fontes de carbono, industriais
e naturais na fermentação líquida e no estado estacionário.
METODOLOGIA: Cepa de Pycnoporus sangunieus foi coletada na zona rural do município de Manaus. Pequenos
fragmentos do carpóforo foram inoculados em meio extrato de malte para posterior obtenção da cultura
pura utilizada para determinação enzimática. O meio de crescimento foi composto de 3g de NaNO3, 0,5g
KPO4, 0,5 mg MgSO47H2O, 0,5mg KCl e 0,01% FeSO4 7H2O e 24 mEq./l de NaNO3. O meio foi
acrescido individualmente de α-celulose (Sigma-Adrich USA), xilana (Fluka Biochemika, Switzerland),
dextrose anidra e serragem de madeira de Calophyllum brasiliensis e Aniba sp sem extrativos (extração
com acetato de etila:etanol:água, 1:1:1). A atividade enzimática de lacase foi determinada conforme
metodologia proposta por Szklarz (1989) que consiste na oxidação do substrato enzimático de
seringaldazina até a sua forma quinona com leitura da absorbância em espectrofotômetro a 525 nm (ε=
65.000 M-1. cm-1). Todo o teste foi feito em triplicatas.
RESULTADOS: A maior atividade de lacase ocorreu no meio suplementado com serragem de madeira de Aniba sp, sem
extrativos, com uma atividade 77 % maior do que no meio sem esse substrato (controle = 3,80 U.L-1). Por
outro lado, no meio contendo serragem da madeira de Calophyllum brasiliensis sem extrativos, a
atividade foi menor (1,53 U.L-1) do que a do controle. Considerando que a espécie Aniba sp contém
células oleíferas no seu tecido xilemático é possível inferir que o fungo utilize-as na síntese da lacase.
Estudos específicos, entretanto, são necessários para comprovar tal suposição. O meio suplementado com
-celulose foi o que apresentou a menor secreção de lacase (1,39 U.L-1). O acréscimo de glicose no meio
inibiu parcialmente a atividade enzimática confirmando estudos anteriores de que o excesso desses
açucares no meio pode inibir a secreção de lacase. A suplementação do meio com xilana contribuiu para
uma secreção 3,6 vezes menor de lacase.
CONCLUSÃO: O material lignocelulósico (madeira) com tratamento para retirada dos extrativos, ou ainda sem extração
desses químicos, pode contribuir para o aumento da secreção de lacase. È necessário estudos sobre
diferentes tipos de madeira que possam contribuir para o aumento da atividade de lacase considerando a
quantidade e qualidade dos extrativos que possam estar inibindo ou não a secreção dessa enzima.
Instituição de Fomento: CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior;
FAPEAM - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas
Palavras-chave: Enzima Ligninolitica, Fungo Amazônico, Serragem de Madeira.
83
SECREÇÃO DE LIGNINA-PEROXIDASE (LiP) E MANGANÊS-PEROXIDASE (MnP) DO FUNGO
Pycnoporus sanguineus EM FERMENTAÇÃO ESTACIONÁRIA
Elaine Pires Soares 1
Solange Pires de Araujo 2
Marcia Jaqueline Mendonca Maciel 1
Adriana da Silva Nunes 1
Helena Camarao 1
Ademir Castro e Silva 1
1. Universidade do Estado do Amazonas
2. Universidade Federal do Amazonas
INTRODUÇÃO: Os fungos de podridão branca degradam a lignina mais rápida e extensivamente do que outros grupos de
microrganismos e são os únicos grupos de organismos capazes de degradar completamente a lignina para
dióxido de carbono e água (Eriksson et al., 1990). As enzimas responsáveis pela degradação da lignina são
principalmente lignina-peroxidase (LiP), managês-peroxidase (MnP) e lacase. O potencial dessas enzimas
ligninolíticas na indústria e biotecnologia tem estimulado pesquisas sobre sua atividade em fungos
(Vikineswary et al., 2006; Songulashvili et al., 2007). A LiP e a MnP apresentam potencial uso na indústria
alimentícia, indústria de celulose e papel, na indústria têxtil, na bioremediação e para síntese orgânica.
(Lamascolo et al., 1999; Barbosa et al. 2008; Sigoillot et al., 2005; Maijala et al., 2007; Robles-Hernandez et.
al, 2008; Champagne & Ramsay, 2005; Wen et al., 2009; Iwahara et al. 2000). No setor médico e farmacéutico
a LiP vem sendo pesquisada para uso em cremes para redução de pigmentação da pele (Belinky et al., 2005).
Considerando o potencial dessas peroxidases para aplicação industrial, o presente trabalho objetiva avaliar a
atividade enzimática da LiP e MnP secretadas por Pycnoporus sanguineus em meio suplementados com
diferentes fontes de carbono.
METODOLOGIA:
Cepa de Pycnoporus sanguineus foi coletada na zona rural do município de Manaus. Pequenos fragmentos do
carpóforo foram inoculados em meio extrato de malte para posterior obtenção da cultura pura utilizada para
determinação enzimática. O meio de crescimento foi composto de 3g de NaNO3 , 0,5 g KPO4 , 0,5 mg
MgSO47H2O; 0,5g KCl e 0,01 FeSO4 7H2O, 24 mEq./l de NaNO3. O meio foi acrescido individualmente de α-
celulose Sigma-Adrich (USA), xilana (Fluka Biochemika, Switzerland), dextrose anidra e serragem de madeira
de Calophyllum brasiliensis e Aniba sp com e sem extrativos (extração com acetato de etila:etanol:água, 1:1:1).
A atividade enzimática foi determinada conforme metodologia proposta por Tien & Kirk (1984) com leitura da
absorbância em espectrofotômetro a 460 nm (ε= 29.400 M-1
. cm-1
). Todo o teste foi feito em triplicatas.
RESULTADOS: No meio acrescido de glicose a atividade de LiP (46,08 U.L
-1) foi 2,7 vezes menor do que o controle (125,6
U.L-1
) (sem acréscimo dessa fonte de carbono). O meio com α-celulose aumentou em 65% a atividade de LiP.
Nos meios com lignocelulósico (serragem de madeira) sem tratamento químico para a retirada dos "extrativos",
LiP foi ligeiramente maior em comparação com aquele onde ocorreu a extração desse material. Podemos inferir
que alguns desses compostos podem estar contribuindo para a síntese dessa enzima. De modo geral, todos os
suplementadores contribuíram para o aumento da secreção de MnP. A menor atividade de MnP (0,83 U.L-1
)
ocorreu no meio acrescido de glicose embora tenha sido maior (0,38 U.L-1
) do que no controle (sem essa fonte
de carbono). A maior atividade ocorreu no meio acrescido com serragem de madeira de Aniba sp sem extração
dos extrativos (14,67 U.L-1
), sendo 38 vezes maior em comparação com controle (sem adição dessa fonte de
carbono). Atividade de MnP em meio de cultura contendo serragem de madeira de Calophyllum brasiliensis
com a extração dos extrativos(13,16 U.L-1
) foi 4,6 maior do que sem extrativos (2,86 U.L-1
) . Aparentemente, o
efeito sinergético de alguns extrativos pode contribuir para o aumento da atividade de MnP.
CONCLUSÃO: O acréscimo de α-celulose no meio czapek-Dox contribui com aumento de 65,5% na secreção de lignina-
peroxidase (LiP). A serragem da madeira de Calophyllum brasiliensis, sem extrativos, acrescida ao meio
czapek-Dox aumentou em 360% a secreção de manganês-peroxidase (MnP), ao contrario da serragem de Aniba
sp., com a presença de extrativos, que aumentou a secreção dessa enzima em 3.760%. O meio de crescimento
acrescidos de xilana, serragem de Calophyllum brasilienesis- com extrativo, serragem de Calophyllum
brasiliensis- sem extrativos, serragem de Aniba sp. - com extrativos e Aniba sp. sem extrativo aumentaram a
secreção de lignina-peroxidase (LiP) em 7,5%, 50,5%, 23,7%, 20,4% e 18,4% respectivamente.
Instituição de Fomento: CAPES, FAPEAM, UEA.
Palavras-chave: peroxidases, fungo amazônico, madeira.
84
CRESCIMENTO DE DIFERENTES CEPAS DE Pycnoporus sanguineos EM
“CHORUME” OBTIDO NO LIXÃO MUNICIPAL DE PARINTINS
Autores: NUNES, A.S., TAVARES, B.P., SOUZA, P.L., SOARES, E.P., CASTRO E
SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de Parintins/AM
Introdução: O chorume é um resíduo líquido de elevada carga orgânica e forte coloração,
produzida pela decomposição química e microbiológica dos resíduos sólidos depositados em
um aterro. De maneira geral, o chorume pode ser considerado como uma matriz de extrema
complexidade, composta por quatro frações principais: matéria orgânica dissolvida,
compostos orgânicos xenobióticos, macrocomponentes inorgânicos e metais potencialmente
tóxicos. Por sua vez, pesquisas vêm sendo realizadas para tratamento enzimático desse tipo
de resíduo utilizando-se fungos que produzem enzimas oxidativas capazes de quebrar
compostos recalcitrantes em moléculas menores diminuindo a toxicidade da substância em
teste. Considerando a grande diversidade fungica da região amazônica, e o pouco que se
conhece objetivou-se avaliar a produção de biomassa fúngica por três diferentes cepas de
Pycnoporus sanguineos em chorume do lixão de Parintins. Material e métodos: Carpóforos
do fungo Pycnoporus sanguineos foram coletados em três diferentes áreas no município de
Parintins/AM, codificados em cepa 1, cepa 2 e cepa 3. Foram cultivados em meio BDA. Para
produção de biomassa foi utilizado meio contendo água estéril e chorume em concentração
0,5%. A produção de massa micelial foi avaliada pelo crescimento em meio líquido em
condição estacionária, em intervalos de 13, 14, e 15 dias, utilizando-se o método de filtragem
alíquota em papel filtro para quantificação da biomassa produzida. Resultados e discussão:
As linhagens testadas apresentaram crescimento utilizando o chorume como fonte de
carbono. Em valores absolutos a maior produção de biomassa ocorreu para CEPA 1
(11,45%) no 13º dia de crescimento seguida das cepas 2 e 3. Ressalta-se que essa cepa 1
apresentou uma rápida pigmentação. O crescimento em chorume dessas linhagens mostra que
as mesmas possuem atividade enzimática capaz de quebrar compostos presentes no chorume.
Teste ANOVA ao nível de 95% de probabilidade mostrou que estatisticamente não existe
diferença no crescimento entre as linhagens de P. sanguineus testadas. Conclusão: P.
sanguineus apresenta potencial para degradação dos compostos presentes no chorume. Faz-se
necessário o estudo enzimático para identificar quais possíveis enzimas poderiam estar
atuando nessa atividade.
Palavras-chave: Biomassa, Chorume, Enzimas oxidativas, Região Amazônica, Pycnoporus
sanguineos
85
CRESCIMENTO IN VITRO DE FUNGOS AMAZÔNICOS EM RESÍDUO DE
“CHORUME”
Autores: TAVARES, B. P, SOUZA, P.L., NUNES, A.S., SOARES, E.P., CASTRO E
SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de arintins/AM
Introdução: O predomínio dos lixões a céu aberto é dos grandes problemas ambientais
contemporâneos. Originados a partir da liberação de resíduos sólidos do lixo urbano. Quando
biodeteriorados forma o chorume, um líquido percolado de cor escura, classificado como um
resíduo sólido da classe I, potencialmente tóxico, e possuir uma alta carga de compostos
recalcitrantes. Fungos de podridão branca têm se mostrado eficazes na degradação desses
compostos, pois possuem um potencial enzimático diversificado. A região amazônica possui
um potencial fúngico pouco explorado de suas enzimas para aplicação industrial e ambiental.
Neste sentido, o objetivo desta pesquisa foi avaliar o crescimento de fungos basidiomicetos
como potenciais degradadores do chorume obtido do lixão a céu aberto do município de
Parintins. Material e métodos : O crescimento foi avaliado em teste de placa de Petri. Foram
utilizados quatro linhagens de fungos basidiomicetos FI-03, FV-12, FBL e Pycnoporus
sanguineos. Os fungos foram incubados em meio BDA (M1) acrescido das seguintes
concentrações de chorume coletado no lixão a céu aberto no município de Parintins: 20µ/L,
100 µ/L, 1000 µ/L e 10000 µ/L. O mesmo tratamento foi realizado em meio somente de ágar
(M2) acrescido das diferentes concentrações de chorume. Foram incubados em estufa BDO em
temperatura de 30ºC e seu crescimento mensurado a cada 24 horas durante 7 dias. Resultados
e discussão: O crescimento dos fungos em meio BDA(M1) acrescido de diferentes
concentrações de chorume foi maior do que no meio Agar (M2) tendo chorume como única
fonte de carbono. Neste último meio (M2), entretanto, a linhagem FV-6 mostrou maior
crescimento (0,6cm) na concentração de 104 µg.L
-1 de chorume como única fonte de carbono
seguida da linhagem FBL para todas as concentrações, exceção para concentração de 20 µg.L-1
. O crescimento da linhagem FV-6 em meio BDA suplementado com chorume (M1) foi menor
e lento iniciando após três dias de incubação, enquanto que para FBL após 24 horas. No meio
(M1), o P. sanguineus apresentou o melhor crescimento em todas as concentrações testadas.
Conclusão: Todas as linhagens testadas apresentaram-se promissoras para degradar
compostos do chorume. As linhagens FV-6 e FBL são as mais promissoras para degradar
compostos de chorume in natura.
Palavras-chave: crescimento, fungos basidiomicetos, chorume, degradação.
86
DESCOLORAÇÃO DO CORANTE “METILORANGE” POR FUNGOS
AMAZÔNICOS
Autores: SOUZA, P. L., GONÇALVES, M. S., SOUZA, E.G., SOARES, E. P., NUNES, A.
S., CASTRO E SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de Parintins/AM.
Introdução: Uma grande quantidade de corantes químicos é largamente utilizada em
atividades industriais como indústria têxtil, fotográfica, de bebidas e outras, que geram grandes
quantidades de resíduos tóxicos que afetam significativamente o equilíbrio ambiental. Esses
efluentes contem compostos de alto peso molecular, como metais pesados que apresentam
enorme poder de resistência os tratamentos convencionais. Estudos têm mostrado que fungos
de podridão branca tem se destacado como eficientes degradadores desses compostos, por
possuírem um complexo enzimático capaz de tolerar altas concentrações de poluentes tóxicos.
A Amazônia possui um enorme potencial fúngico, porém em sua maioria ainda permanece
desconhecido. Dessa forma objetivou-se selecionar fungos coletados na Região do Baixo
Amazonas como potenciais descolorizadores do corante metilorange. Material e métodos :
Foram utilizados nove linhagens de fungos provenientes do laboratório de microbiologia do
CESP-UEA: Pycnoporus sanguineos, FV-6, FV-12, FI-2, FI-3, FI-9, FBL, CV-29 e CV-35.
Três fragmentos de cerca de 5mm de diâmetro de cada fungo foram acrescidos em solução do
corante metilorange, na concentração de 0,01% em 100 ml de água estéril, em balão de fundo
chato de 250 mL, incubadas a 30ºC, durante 27 dias. Foram feitas análises qualitativas
(visuais) diárias para verificar a ação dos fungos no processo de descoloração do corante e
avaliado a produção de biomassa através método de filtragem de alíquota em papel filtro.
Resultados e discussão: Todos os fungos mostraram crescimento no meio testado. As
linhagens FI-3 e FV-6 mostraram coloração escurecida do meio 5 horas após incubação,
enquanto que as linhagens FI-9 e CV-29 após 6 dias de crescimento. Ressalta-se, entretanto,
que FI-9 após o sétimo dia apresentou clareamento do meio. As linhagens FI-2, FBL, CV-35,
Pycnoporus sanguineos e FV-12 apresentaram clareamento em um período de 9 dias. A
linhagem FV-12 continuou clareando em relação ao controle. A maior produção de biomassa
ocorreu para a linhagem FV-29 (4,7%) seguida de FV-6 (1,31%), e FI-2 (1,29%). As menores
produção de biomassa (< 1%) foram obtidas pelas outras linhagens testadas sendo que FBL e
FV-12 apresentaram uma baixa produção de biomassa de 0,27% e 0,26% respectivamente.
Conclusão: Os fungos testados apresentaram uma relação positiva em relação à descoloração
do corante “metilorange” indicando estarem utilizando o corante como fonte de alimento com
destaque para a linhagem CV-29. Urge, entretanto, continuar estudos no sentido de verificar
se a biomassa produzida está ou não adsorvendo o corante.
Palavras-chave: Metilorange, Fungos da Amazônia, Degradação, Corantes.
87
INFLUÊNCIA DA AUTOCLAVAGEM DA GLICOSE NO CRESCIMENTO DE
FUNGOS AMAZÔNICOS
Autores: SILVA, A.V., DIAS, R.A., SILVA, M.A., SOARES, E.P., NUNES, A.S.,
CASTRO E SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de arintins/AM.
Introdução : Os requisitos nutricionais para o crescimento de fungos são caracterizados por
fontes de carbono e minerais. Dentre as fontes de carbono a glicose é uma das mais utilizadas.
A autoclavagem do meio suplementado com glicose faz com que a alta temperatura quebre as
cadeias longas desses açúcares formando monossacarídeos de cadeias pequenas e
subprodutos, que podem ser responsáveis pelo escurecimento do meio (Reação de Minard).
Alguns fungos podem utilizar ou não esses produtos como requisito nutricional para seu
crescimento. Não existem informações sobre o uso do produto da glicose da reação em alta
temperatura em fungos amazônicos. Portanto, este trabalho objetiva verificar se o meio com
glicose autoclavada ou não influência no crescimento de cinco fungos amazônicos. Material
e métodos: Para os testes utilizaram-se cinco fungos provenientes do Laboratório de
Microbiologia do CESP – UEA, Pycnoporus sanguineos, FV-6, FV-12, FI0-3 e FBL. Para o
cultivo dos fungos, utilizou-se 500 mL de meio BDA, com 7,5 g de glicose para cada
tratamento. No primeiro a glicose foi autoclavada juntamente com o meio, no segundo a
glicose foi adicionada após a autoclavagem do meio. O crescimento da fronteira micelial foi
mensurado a cada 24hrs durante 10 dias, em temperatura de 30° C. Todos os tratamentos
foram realizados em duplicatas. Resultados e discussão: A glicose em alta temperatura
propicia a formação de monossacarídeos e possivelmente outros produtos oriundos da síntese
de transformação que ocorre em condições de alta temperatura. Estes produtos dão a cor
escura ao meio. Alguns fungos utilizam esses açúcares de cadeias menores para acelerar o seu
crescimento. A cepa FI-3, por exemplo, possivelmente utilizou os monossacarídeos para este
fim. Para o crescimento nos dois tratamentos ( meio com glicose não autoclavada e
autoclavada), não houve diferença dentre as cepas com exceção da cepa FI-3, onde
apresentou maior crescimento no meio onde a glicose foi autoclavada (2,29 cm). Em termos
absolutos a cepa FV-12 foi a que apresentou maior crescimento médio no meio suplementado
com glicose não autoclavada. O menor crescimento, onde a glicose não foi autoclavada
aconteceu para o fungo Pycnoporus sanguineos. Nos tratamentos com meio com glicose
autoclavada, não houve diferença de crescimento entre as cepas ao nível de 99% de
probabilidade. Por outro lado, no meio com glicose não autoclavada a cepa FV-12 foi que
apresentou maior crescimento entre os tratamentos (2,74 cm). Conclusão : De modo geral, no
meio com glicose autoclavada o crescimento em termos absolutos é maior, embora essa
diferença não seja significante ao nível de 95% de probabilidade. Exceção para a cepa FV-12
onde o crescimento com glicose não autoclavada foi maior.
Palavras-chave: Glicose, Crescimento, Fungos, Fonte de carbono.
88
CRESCIMENTO MICELIAL DE FUNGOS AMAZÔNICOS EM DIFERENTES FAIXAS DE
pH EM MEIO SUPLEMENTADO COM FARINHA DA CASCA DE TUCUMÃ (Astrocaryum
aculeatum MEYER)
Mariane dos Santos Gonçalves 1
Adriana da Silva Nunes 1
Naímy Farias de Castro 1
Ademir Castro e Silva 1
Elaine Pires Soares 1
1. Dep.Ciências Biológicas - Universidade do Estado do Amazonas - UEA
2. Mestranda em Biotecnologia e Recursos Naturais - Universidade do Estado do Amazonas - UEA
3. Prof. Msc./Orientadora - Universidade do Estado do Amazonas - UEA
4. Prof. Dr./ Co-orientador - Universidade do Estado do Amazonas - UEA
5. Mestranda em Biotecnologia e Recursos Naturais - Universidade do Estado do Amazonas - UEA
INTRODUÇÃO: Os fungos tem, comparativamente, uma ampla faixa de pH sobre a qual podem crescer e o pH ótimo
para a maioria dos fungos está no lado ácido da escala, abaixo do pH 7. Qualquer curva de pH –
crescimento é o sumário de todos os efeitos do pH sobre inúmeros fatores que controlam o crescimento
e não representa um efeito unitário. Fungos invariavelmente alteram o pH do meio onde crescem. Por
outro lado, os fungos necessitam de alguns elementos nutricionais que são essenciais para seu
crescimento onde encontram-se os macro-elementos (carbono, nitrogênio, hidrogênio, oxigênio,
enxofre, etc.) os quais são requisitados em grande quantidade pelos fungos e podem ser fatores
determinantes no rendimento e na produção de biomassa, onde esta, por sua vez, pode ser empregada na
biosorção de metais pesados. Poucos trabalhos nesse sentido são realizados com fungos da região do
Baixo Amazonas, portanto, o objetivo dessa pesquisa foi avaliar o crescimento micelial de fungos
amazônicos da classe dos basidiomicetos em meio de cultura alternativo a base de farinha da casca de
tucumã na concentração 0,5% em diferentes faixas de pH.
METODOLOGIA: Carpóforos de fungos Basidiomicetos foram coletados no perímetro rural do município de
Parintins/AM, codificados em FV-12, FV-06, FI-09, FI-03 e Pycnoporus sanguineos. Para obtenção de
cultura pura, pequenos fragmentos dos carpóforos foram crescidos em meio de cultura BDA. Para os
testes de crescimento linear utilizou-se a farinha da casca do tucumã (Astrocaryum aculeatum Meyer)
previamente seca e esterilizada na concentração 0,5% e nas faixas de pH 4, 6, 8, 10 e 12. A medição do
crescimento foi realizada a cada 24 horas por um período de cinco dias ou até o preenchimento total da
placa, à temperatura de 30º C. Todos os tratamentos foram realizados em duplicata.
RESULTADOS: Em dados absolutos o maior crescimento micelial na concentração 0,5% na faixa de pH 4 ocorreu para o
fungo Pycnoporus sanguineos com 2,5 cm. Na faixa de pH 6 novamente Pycnoporus sanguineos obteve
o maior crescimento (2,5 cm) seguido dos fungos FV-12 e FI-03 (2,28 cm). Já na faixa de pH 8 o
melhores crescimentos ocorreram para as linhagens FV-12 e FI-03 cm 2,2 cm. Nas faixas 10 e 12 em
meio acrescido com farinha da casca de tucumã Pycnoporus sanguineos apresentou o melhor
crescimento com 2,15 cm e 2,25 cm respectivamente. O crescimento micelial dos fungos testados em
meio suplementado com a farinha da casca de tucumã na concentração 0,5% não mostrou diferença
estatística entre os tratamentos ao nível de 5% de significância (p< 0,05).
CONCLUSÃO: O crescimento micelial dos fungos testados em meio suplementado com farinha da casca de tucumã
(Astrocaryum aculeatum Meyer) na concentração 0,5% nas faixas de pH 4, 6, 8, 10 e 12 apresentou
relação positiva e resultados promissores, uma vez que os fungos basidiomicetos amazônicos testados
apresentaram crescimento nas faixas de pH 4, 10 e 12 contrariando dados da literatura que indica as
faixas entre 5 e 7 como pontos ótimos para crescimento.
Palavras-chave: pH, Meio de cultura alternativo, Fungos amazônicos.
89
SECREÇÃO DE LACASE POR CONSÓRCIO DE FUNGOS AMAZONICOS.
Autores: SOARES, E.P, MUNIZ, V.A, NUNES, A.S, SILVA, A.V, SOUZA, P.L,
GALÚCIO, V.A, KATAKI, R.M, CASTRO E SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: A utilização de organismos fúngicos em bioprocessos envolvendo
descontaminação ambiental vem crescendo nos últimos tempos, no que se refere à
utilização de sistema enzimáticos, devido às vantagens de sua utilização.Devido à sua
baixa especificidade por substratos e seu potencial para utilização em aplicações
biotecnológicas, as lacases fúngicas tem sido objeto de investigação.Lacases são
enzimas envolvidas na degradação de lignina e tem a capacidade de catalisar a
oxidação de fenóis e outros compostos aromáticos. Neste contexto, surge a
biodiversidade fúngica amazônica inexplorada com potencial para a degradação de
plásticos sintéticos. Este trabalho visa avaliar a atividade enzimática de lacase por
consórcio de fungos amazônicos em meio de cultivo contendo farinha da casca de
tucumã (Astrocaryum aculeatum Meyer)no processo de biodegradação do polietileno
tereftalato (PET). Material e métodos: Foram utilizadas consórcio de três estirpes
fúngicas da classe dos Basidiomicetos: Pycnoporus sanguineaus, FV12, FBL. O meio
de cultivo foi composto de 20g farinha da casca de tucumã e 500ml de água destilada.
Amostras do PET foram submetidas à temperatura de 35ºC, em estufa durante 72
horas e como controle foram utilizados partículas de polímeros sem tratamento físico.
Erlenmeyers de 125 ml receberam 50ml do meio, 5 amostras dos polímeros, os fungos
em estudo e incubados à 30º C. A determinação de lacase - Lac foi avaliada através de
filtrados de enzima bruta obtido em fermentação submersa e condição estacionária
durante 30 dias, sendo centrifugado a 1.400 rpm, durante 5 minutos e utilizado o
sobrenadante para a leitura em espectofotômetro. O método baseia-se na oxidação do
substrato enzimático de seringaldazine para sua forma de quinona com absorção à 525
nm (ε=65000Mˉ¹ cmˉ¹). Resultado e discussão: O consórcio dos fungos
Pyc+FBL+FV12 nos testes PET +28ºC foi o que apresentou maior produção de Lac
(10,2 U.L-1
). No entanto, esse consórcio de fungos em teste PET 35ºC apresentou uma
atividade de Lac 10 vezes menor. Pode-se ressaltar que ocorreu uma correlação
positiva para os tratamentos com o consórcio Pyc+FBL+FV12 entre a maior atividade
de Lac (10,2 U.L-1
) e para a perda de massa do PET (14,4%) no ensaio PET+28ºC. No
entanto, a maior perda de massa ocorreu com o consórcio Pyc+FBL (28,7%) e
(19,7%) nos teste PET +28ºC e 35ºC respectivamente, porém no que diz respeito a
atividade de Lac com os referidos consórcio nestes tratamentos, os mesmos não
apresentaram resultados significativos, sendo 0,1 U.L-1
e 3,3 U.L-1
respectivamente.
Conclusão: De modo geral ocorre a atividade de lacase -Lac no meio testado, no
entanto, destaca-se o consórcio dos fungos Pyc+FBL+FV12 que apresentou maior
produção de Lac e perda de massa significativa do polímero no teste PET +28ºC.
90
DETERMINAÇÃO ENZIMÁTICA DE FUNGOS AMAZONICOS MEIO
ACRESCIDO COM FARINHA DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum Meyer)
Autores: SOARES, E.P; SILVA, A.V; NUNES, A.S; ARAUJO, S.P; DIAS, R.A;
TAVARES, B.P; SOUZA, E.A; MELO, J.L; CASTRO E SILVA,
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
INTRODUÇÃO: Com o avanço dos estudos na área biotecnológica os organismos
fúngicos, principalmente a produção de enzimas tornaram-se de grande interesse e
vêm contribuindo com produtos e processos de importância industrial. Apesar do seu
papel nos ecossistemas e suas aplicações na biotecnologia, o conhecimento sobre os
fungos amazônicos ainda permanece num nível incipiente, sendo que poucos dados
na área sobre enzimas com o potencial industrial são disponíveis. O presente trabalho
visa avaliar a atividade de enzimas oxidativas em meios de cultivo utilizando resíduo
agroindustrial de baixo custo, como fonte de carbono no processo de degradação do
politereftalato de etileno. MATERIAL E METODOS: Foram utilizadas três amostras
de fungos Basidiomicetos: Pycnoporus sanguineaus, FV12, FBL e o consórcio entre
os mesmos. O meio de cultivo foi composto de 20g farinha da casca de tucumã e 500
ml de água destilada. Erlenmeyers de 125 ml receberam 50ml do meio, 5 amostras
dos polímeros, os fungos em estudo e incubados à 30º C. Amostras do PET foram
submetidas à temperatura de 35ºC, em estufa, durante 72 horas e como controle
foram utilizados partículas de polímeros sem tratamento físico. A determinação
enzimática foi avaliada através de filtrados de enzima bruta obtido em fermentação
submersa e condição estacionária durante 30 dias. Para atividade de lacase e
peroxidase, utilizou-se a metodologia de SZKLARZ et.al. 1989, para a atividade de
LiP utlizou-se o método proposto por Tien-Kirk (1984) e a atividade de MnP foi
baseada na metodologia de GLEN et.al., (1986); AITKEN & IRVINE, (1990).
RESULTADO E DISCUSSÃO: A atividade de Lac mostrou-se de modo geral, maior
para o ensaio PET +28ºC. O consórcio dos fungos Pyc+FBL+FV12 foi o que
apresentou maior produção de Lac (10,2 U.L-1
). Por outro lado esse consórcio de
fungos em teste PET 35ºC apresentou uma atividade de Lac 10 vezes menor. Nos
ensaios individuais o fungo FBL apresentou maior produção de Lac (6,5 U.L-1
) no
teste PET +28ºC. No entanto, o Pyc. sanguineaus no teste PET 35ºC apresentou
menor atividade de Lac (0,05 U.L-1
). Em média a atividade de LiP foi 56,2 e 55,2
U.L-1
para o teste PET +28ºC e PET 35ºC respectivamente, enquanto que a MnP foi
61,8 e 61,3 U.L-1
nos mesmos testes respectivamente. A atividade de peroxidase foi
maior no teste PET +28ºC para o consórcio Pyc+FBL+FV12 (8,4 U.L-1
), enquanto
que o Pyc+FBL foi onde ocorreu a menor atividade dessa enzima (0,05 U.L-1
).
CONCLUSÃO: De modo geral ocorre a atividade das enzimas oxidativas no meio
testado. Pesquisas continuam a fim de verificar testes com "consórcios" de fungos
que apresentaram os melhores resultados de atividade enzimática, com destaque para
o consórcio Pyc+FBL+FV12.
91
SECREÇÃO DE LIGNINA PEROXIDASE (LiP) E MANGANÊS
PEROXIDASE (MnP) POR FUNGOS AMAZONICOS COM POTENCIAL
PARA DEGRADAR POLIETILENO TEREFTALATO.
Autores: SOARES, E.P; ANDRADE, F.S; NUNES, A.S; SILVA, A.V, SANTOS,
I.C.C; VALENTE, P.M.R; GALÚCIO, V.A; CASTRO E SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Os fungos envolvidos na degradação das ligninas secretam diferentes
enzimas extracelulares que catalisam reações que levam a degradação do polímero. As
mais importantes são as ligninas peroxidases (Lip), manganês peroxidase (Mnp) e a
lacase. Desta forma, surge o potencial fúngico ainda inexplorado da região do Baixo
Amazonas, como alternativa para a degradação do polietileno tereftalato (PET). Essa
região, sem ação antrópica mais contundente guarda ainda espécies fúngicas com
potencial enzimático capaz de participar em vários processos industriais. Urge,
portanto, a necessidade de prospecção dessa biodiversidade na busca de
microorganismos capazes de produzir enzimas específicas com potencial para uso em
aplicações biotecnológicas, em particular na degradação do PET. Material e
métodos: Foram utilizadas três linhagens fúngicas da classe dos Basidiomicetos:
Pycnoporus sanguineaus, FV12, FBL e o consórcio entre os mesmos. Para a
realização dos testes de degradação do polímero foi utilizado meio contendo 20g
farinha da casca de tucumã (Astrocaryum aculeatum Meyer) e 500ml de água
destilada. Amostras de PET foram preparadas previamente (corte 1x1cm, peso e
assepsia) e submetidas à temperatura de 35ºC, em estufa durante 72 horas e como
controle foram utilizados partículas de polímeros sem tratamento físico. Erlenmeyers
de 125 ml receberam 50ml do meio previamente autoclavado, 5 amostras dos
polímeros e os microrganismos em estudo, e incubados à 30º C. A determinação
enzimática foi avaliada através de filtrados de enzima bruta obtido em fermentação
submersa estacionária durante 30 dias. Para a atividade de LiP utlizou-se o método
proposto por Tien-Kirk (1984) e a atividade de MnP foi baseada na metodologia de
GLEN et al. , (1986); AITKEN & IRVINE, (1990). Resultado e discussão: Após 30
dias de fermentação submersa a atividade de LiP e MnP não apresentaram diferença
estatística a nível de 5% de significância no teste de ANOVA entre os ensaios PET
+28ºC e PET 35ºC . Em média a atividade de LiP foi 56,2 U.L-1
para o controle e 55,2
U.L-1
para o tratamento, enquanto que a MnP foi 61,8 U.L-1
para o ensaio PET +28ºC
e 61,3 U.L-1
para os ensaios PET 35º, tanto em testes individuais com em consórcios
de fungos. Quanto aos testes para verificação de perda de massa do polímero o
consórcio Pyc+FBL foi o que apresentou maior perda (28,7%), enquanto que a
atividade de LiP com este consórcio, verificou-se que a maior atividade ocorreu com o
tratamento (57,1 U.L-1
) e para a atividade de MnP o melhor resultado foi para o
tratamento com a linhagem FBL (64,1 U.L-1
). Conclusão: Nos bioensaios realizados
com as linhagens fungicas amazônicas verificou-se que todas apresentaram potencial
para a produção de enzimas lignases, LiP e MnP no meio composto de farinha de
tucumã, independente da perda de massa do polímero.
92
EFEITO DO pH NO CRESCIMENTO IN VITRO DE FUNGOS AMAZONICOS
EM MEIO SUPLEMENTADO COM CHORUME
Autores: NUNES, A. S, SOUZA, E.A, SOUZA, P.L , SOARES, E.P, CORDEIRO,
M.S.C , SILVA, A.V , GALÚCIO, V.A , CASTRO E SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: O pH exerce grande influência sobre o metabolismo de fungos, que pode
num meio afetar o crescimento direta ou indiretamente. Ainda que o pH mais
favorável ao desenvolvimento dos fungos esteja entre 5, 6 e 7, a maioria dos fungos
tolera amplas variações de pH. Uma das características que podem sofrer variação é a
pigmentação que pode diversas vezes estar relacionada com o pH do substrato, pois o
microorganismo se adapta ao ambiente respondendo com mecanismos de natureza
química ou física. Outro efeito é sobre a permeabilidade da célula, a qual é alterada
com diferentes graus de acidez ou alcalinidade. Pouco se conhece sobre o efeito do
pH no crescimento de fungos da região amazônica e sua fisiologia, menos ainda
quando submetidos a alto grau de estresse nutricional, como por exemplo com a
presença de chorume, líquido resultante da decomposição de resíduos sólidos. Nesse
contexto, o objetivo dessa pesquisa foi avaliar os efeitos do pH no crescimento in
vitro de fungos amazônicos em meio de cultivo acrescido com chorume em
fermentação semi-solida. Material e métodos: Foram utilizadas duas linhagens de
fungos basidiomicetos coletadas na região de Parintins/AM, codificados em FI-03 e
FV-12. Para o meio de cultivo foi utilizado chorume coletado do lixão municipal de
Parintins/AM, previamente autoclavado e oxigenado por 2 horas e posteriormente
centrifugado a 2000 rpm por 10 min. O crescimento fúngico foi avaliado em teste de
placa Petri, contendo apenas Agar e chorume nas concentrações: 0,5, 1,0, 2,0 e 2,5%
nas faixas de pH 3, 5, 7, 9 e 11. Os tratamentos foram incubados em estufa BOD a
30°C e o crescimento mensurado a cada 24 horas durante cinco dias. Resultados e
discussão: Em valores absolutos os maiores crescimentos radiais em ordem
decrescente ocorreram para o fungo FV-12 na concentração 2,5% em pH 5 (1,58cm),
seguido do fungo FI-03 na concentração 0,5% em pH 9 (1,45cm), por conseguinte
FV-12 concentração 0,5% em pH 11 (1,40cm) e 1,35 cm para o fungo FI-03 na
concentração 1% em pH 7. Portanto, o fungos testados suportaram condições de
estresse nutricional em variadas faixas de pH, apontando que cada fungo tem suas
exigências especificas. Não houve diferença estatística entre os crescimentos nas
faixas de pH e concentrações testadas. Conclusão: Portanto, o pH e a acidez do meio
podem ser fatores determinantes no crescimento radial e em nos demais
comportamentos fisiológicos dos fungos amazônicos testados.
93
PRODUÇÃO DE BIOMASSA POR FUNGOS AMAZONICOS UTILIZANDO
CHORUME COMO FONTE DE CARBONO
Autores: SOUZA, P. L, NUNES, A.S, SOARES, E.P, VALENTE, P.M.R, SILVA,
A.V, GALÚCIO, V.A, CASTRO E SILVA, A, KATAK, R.M.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: O lixo urbano é um dos problemas ambientais mais preocupantes da
atualidade, por sua produção acelerada e seu descarte na maioria das vezes
indiscriminado em locais inapropriados causando impactos negativos ao meio
ambiente e a população, pela presença do chorume, líquido percolado de alta
toxicidade e odor desagradável gerado a partir da biodeterioração da matéria orgânica.
Pesquisas recentes utilizando fungos de podridão branca evidenciam a versatilidade
destes microorganismos em biodeteriorar a matéria orgânica e até inorgânica,
apresentando-se como potenciais degradadores deste líquido rico em metais
potencialmente tóxicos. A exploração da atividade dos microrganismos é a principal
estratégia utilizada em tratamento biológico para recuperação de ambientes poluídos e
a Amazônia mostra-se como um enorme laboratório capaz de fornecer fungos capazes
de degradar chorume. Portanto, o presente projeto visou avaliar fungos amazônicos
com potencial para produção de biomassa em meio acrescido de diferentes
concentrações de chorume. Material e métodos: Carpóforos de fungos
basidiomicetos foram coletados na região de Parintins/Am, codificados em FV-12, FI-
02 e Pycnoporus sanguineus. Para produção de biomassa fúngica foi utilizado meio
contendo água estéril e chorume (total 150 mL) nas concentrações 1%, 2% e 4% em
erlenmeyer de 250 mL coletado no lixão de Parintins, previamente esterilizado a
121ºC, centrifugado e oxigenado. A produção de massa micelial foi avaliada pelo
crescimento em meio líquido em condição estacionária, em período de 60 dias à 30ºC,
utilizando-se o método de filtragem alíquota em papel filtro para quantificação em
porcentagem da biomassa produzida. Resultados e discussão: Em valores absolutos a
maior produção de biomassa fúngica em meio acrescido de chorume ocorreu para a
linhagem de Pycnoporus sanguineus na concentração 2% (2,27%), seguida da
linhagem FI-02 na concentração 1% (2,04%) e de Pycnoporus sanguineus na
concentração 4% (1,86%). A menor produção foi da linhagem FV-12 na concentração
1% (0.70%). No teste de ANOVA ao nível de 5% não houve diferença estatística
entre os tratamentos. Conclusão: Todas as linhagens fúngicas amazônicas testadas
apresentaram crescimento positivo em meio contendo apenas chorume in natura como
fonte de carbono. Com destaque para o fungo Pycnoporus sanguineus, possível
degradador de compostos recalcitrantes do chorume.
94
PRODUÇÃO DE BIOMASSA POR FUNGOS AMAZÔNICOS NO PROCESSO
DE DEGRADAÇÃO DO POLITEREFTALATO DE ETILENO EM MEIO
SUPLEMENTADO COM FARINHA DE TUCUMÃ (Astrocaryum aculeatum
Meyer).
Autores: SILVA, A.V, SOARES, E.P, NUNES, A.S, TAVARES, B.P, DIAS, R.A,
SOUZA, E.A, SOUZA, E.G, SILVA, M.A, CASTRO E SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Introdução: Pesquisas científicas estão sendo realizadas utilizando a biomassa
fúngica na biodegradação de plásticos, biorrememediação de solos e efluentes
contaminados por metais de difícil degradação. Ressalta-se, que a produção de
biomassa micelial pode estar estreitamente relacionada com os requisitos nutricionais
de cada fungo, conhecimento este que pode contribuir para o melhoramento da
produção. Considerando o potencial fúngico inexplorado da região amazônica, este
trabalho tem como objetivo verificar a produção de biomassa por fungos
basidiomicetos em meio acrescido com farinha da casca de tucumã (Astrocaryum
aculeatum Meyer) no processo de degradação do polietileno tereftalato (PET).
Metodologia: Foram utilizadas três amostras de fungos da classe dos Basidiomicetos
coletados em Parintins/AM, Pycnoporus sanguineaus, FV12, FBL e o consórcio entre
os mesmos. Para a realização dos testes de degradação do polímero foi utilizado meio
contendo 20g farinha da casca de tucumã e 500ml de água destilada. Amostras do
polímero PET foram preparadas previamente (corte 1x1cm, peso e assepsia) e
submetidas à temperatura de 35ºC, em estufa durante 72 horas e como controle foram
utilizados partículas de polímeros sem tratamento físico, temperatura de + 28ºC.
Erlenmeyers de 125 ml receberam 50ml do meio previamente autoclavado, 5 amostras
dos polímeros e os microrganismos em estudo. A produção de massa micelial foi
avaliada pelo crescimento em fermentação submersa, condição estacionária durante
30 dias e incubados à 30º C, utilizando o método de filtragem alíquota em papel filtro.
Resultados e discussão: O fungo FBL apresentou a maior produção de biomassa
(28,4%) no teste com PET temperatura de + 28ºC. Por outro lado no teste PET 35ºC a
maior produção de biomassa ocorreu para o consórcio Pyc.+FBL+FV12 (25,1%). De
modo geral os tratamentos com consórcios apresentaram maior produção de biomassa
no teste PET 35º, sendo 15,5% e 10,8% para Pyc+FBL e Pyc+FV12 respectivamente.
Pode-se enfatizar que houve correlação positiva para o consórcio Pyc+FBL+FV12 no
tratamento PET + 28ºC entre a degradação do PET (14,4%) e a produção de biomassa
(12,8%).Nos tratamentos individuais PET 35ºC o Pyc. sanguineaus e FV12
apresentaram maior produção de biomassa, exceção para o fungo FBL que neste
tratamento apresentou produção de biomassa 1,7 vezes maior em relação ao teste PET
+ 28ºC. Neste tratamento também houve correlação positiva para o fungo Pyc.
sanguineaus entre a degradação do PET (15,2%) e a produção de biomassa (14,8%).
Para a produção de biomassa em meio acrescido com a farinha de tucumã o teste de
ANOVA a 5% de significância não apresentou diferenças estatística. Conclusão: O
meio acrescido com a farinha da casca do tucumã como fonte de carbono apresentou
relação positiva com a produção de biomassa fúngica e degradação de PET pelos três
fungos amazônicos testados.
95
SECREÇÃO DE LACASE POR FUNGOS AMAZÔNICOS UTILIZANDO
MEIO ACRESCIDO COM CHORUME IN NATURA
Autores: NUNES, A.S, SOUZA, P.L , CASTRO E SILVA, A , SOARES, E.P ,
VALENTE, P.M.R, SANTOS, I.C.C, MELO, J.L.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Microorganismos como fungos e bactérias têm tomado destaque nos últimos anos, no
que diz respeito à recuperação ou minimização de áreas contaminadas por metais
potencialmente tóxicos. Pesquisas recentes mostram que enzimas oxidativas
produzidas por fungos basidiomicetos de decomposição branca estão envolvidas na
degradação e mineralização de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, herbicidas,
corantes azo, polifenóis entre outros. Podendo representar uma alternativa viável na
degradação de compostos recalcitrantes presentes no chorume, devido ao seu
complexo e diversificado potencial enzimático. Os fungos da região amazônica são
em sua magnitude desconhecidos em relação à sua vasta região territorial e riquezas
naturais apresentando-se como potenciais deterioradores de substancias
potencialmente tóxicas, como o chorume. Portanto, o objetivo desta pesquisa foi
avaliar a atividade da enzima Lacase produzida por fungos da Amazônia em meio
acrescido de chorume proveniente do lixão municipal de Parintins/Am. Linhagens de
fungos basidiomicetos codificados em: FV-12, FI-02 e Pycnoporus sanguineus foram
utilizadas nos tratamentos enzimáticos em meio acrescido das concentrações 1%, 2%
e 4% de chorume. As culturas foram incubadas em BOD à 30º C durante 60 dias e sua
determinação enzimática realizada em espectofotômetro. O controle foi realizado com
a ausência de chorume. A mistura reacional foi composta de 50 µL da amostra
filtrada; 0,95 mL tampão tartarato de sódio pH 4,5; 0,1mL seringaldazina e 0,1mL de
água destilada, sendo monitorado o aumento da absorbância em 525 nm durante 60
segundos, utilizando-se o coeficiente de extinção ɛ = 6,5x104 cm¹.M¹. De modo geral
a enzima lacase foi produzida tanto no controle quanto nos tratamentos com chorume.
A linhagem FV-12 apresentou no controle 1.14 U/L-¹, paralelamente na concentração
2% apresentou 1.70 U/L-¹, seguida da concentração 1% com 1,20 U/L-¹ e 1,14 U/L-¹
na concentração 4%. Para as demais linhagens a atividade não foi significativa. Ao
nível de 95% de probabilidade não houve diferença na atividade enzimática entre as
três linhagens testadas. Todos os fungos testados apresentaram potencial para
produção de lacase em estado de fermentação líquida nas concentrações 1%, 2% e 4%
de chorume, com destaque para a linhagem FV-12.
96
AVALIAÇÃO DE ENZIMAS OXIDATIVAS PRODUZIDAS POR FUNGOS
AMAZÔNICOS EM BIORREATOR DE COLUNA UTILIZANDO RESÍDUO
AGRO-INDUSTRIAL
Autores: TAVARES, B. P; NUNES, A.S; SOARES, E.P; CASTRO E SILVA, A;
SOUZA, E.A; TRINDADE, D.B; DIAS, R.A; MELO, J.L; VALENTE, P.M.R.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Da decomposição da matéria orgânica e inorgânica resulta o chorume,
liquido viscoso, de odor forte e desagradável, que apresenta em sua composição
metais potencialmente tóxicos e compostos recalcitrantes danosos ao homem e ao
ecossistema como um todo. Podendo atingir lençóis freáticos, rios e córregos,
levando a contaminação destes recursos hídricos. Nesse contexto, tratamentos
biológicos utilizando enzimas fúngicas têm apresentado êxito na degradação ou
mineralização de compostos de elevada massa molecular. No que diz respeito a
região amazônica pouco ou quase nenhum estudo nessa área tem sido realizado com
os fungos dessa região, que possivelmente apresentam potencial para aplicações em
biorremediação ambiental. Portanto o objetivo dessa pesquisa foi avaliar um fungo
amazônico e seu potencial para degradação do chorume obtido do lixão a céu aberto
do município de Parintins/AM em sistema de biorreator de coluna acrescido de
resíduo agro-industrial. Material e métodos: O experimento ocorreu em colunas de
20x4cm, utilizando uma linhagem de fungo Basidiomiceto, codificado em FI-03.
Fragmentos foram incubados em colunas contendo 20g do resíduo agroindustrial
(cana-de-açúcar ou casca de tucumã). O sistema foi suplementado com 20ml de
chorume previamente autoclavado, centrifugado e oxigenado. As colunas foram
mantidas a 30ºC e oxigenadas a cada 12 horas por um período de 100 dias. A leitura
enzimática foi realizada em espectrofotômetro sendo monitorado o aumento da
absorbância em 525 nm durante 60 segundos para Lacase, 270 mn para Mn-
Peroxidase e 310 nm para Li-Peroxidase. Resultados e discussão: O resíduo da
casca de tucumã apresentou uma perda de massa de 37,75% e o bagaço cana-de-
açúcar 22,75%. Na análise da atividade enzimática, Li-P nos resíduos da casca de
tucumã e bagaço de cana-de-açucar apresentou atividade de 52,80 U/L¬-¹ e 30,22
U/L-¹ respectivamente, seguida da atividade de Mn-Peroxidase em casca de tucumã
com 11,11 U/L-¹ e bagaço de cana-de-açúcar 9,80 U/L-¹. Já a atividade de Lacase foi
registrada em 0,185 U/L-¹ no resíduo da casca do tucumã e em 0,492 U/L-¹ no
bagaço de cana-de-açúcar. Conclusão: O fungo amazônico apresentou potencial para
produção de enzimas oxidativas (L.Peroxidase, M. Peroxidase e Lacase) nos dois
resíduos agroindustriais testados, podendo atuar em processos de biorremediação
ambiental como a degradação de compostos recalcitrantes do chorume.
97
CRESCIMENTO DE FUNGOS AMAZÔNICOS EM DIFERENTES FAIXAS
DE pH EM MEIO DE CULTIVO SUPLEMENTADO COM Dioecorea trifida
L.F
Autores: GALUCIO, V.C.A.; SOUZA, E.A.; NUNES, A.S; SILVA, N.P.; SOARES,
E.P.; SILVA, M.A.; DIAS, R.A.; CASTRO E SILVA, A.
1. Centro de Estudos em Energia, Ambiente e Biodiversidade-CEAB. 2.
Universidade do Estado do Amazonas-UEA. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM-CESP.
Resumo
Introdução: Os fungos tem, comparativamente, uma ampla faixa de pH sobre a qual
podem crescer e o pH ótimo para a maioria dos fungos está no lado ácido da escala,
abaixo do pH 7. Qualquer curva de pH – crescimento é o sumário de todos os efeitos
do pH sobre inúmeros fatores que controlam o crescimento e não representa um efeito
unitário. Fungos invariavelmente alteram o pH do meio onde crescem. Por outro lado,
os fungos necessitam de alguns elementos nutricionais que são essenciais para seu
crescimento onde encontram-se os macro-elementos (carbono, nitrogênio, hidrogênio,
oxigênio, enxofre, etc.) os quais são requisitados em grande quantidade pelos fungos e
podem ser fatores determinantes no rendimento e na produção de biomassa, onde esta
pode ser empregada na biosorção de metais pesados. Poucos trabalhos nesse sentido
são realizados com fungos da região do Médio Amazonas, portanto, o objetivo dessa
pesquisa foi avaliar o crescimento micelial de sete fungos amazônicos em meio
regional de cará (Dioecorea trifida L.F) em diferentes faixas de pH. Materiais e
métodos: Sete linhagens de fungos basidiomicetos FBL, FI-3, CV-50, FV-12, FV-6
FI-2 e Pycnoporus sanguíneos foram cultivados em meio regional de cará (Dioecorea
trifida L.F) em placa de Petri. Foi realizado o ajuste do pH com NaOH para as faixas
6, 8, 10 e 12. As linhagens foram incubadas a 30ºC e mensuradas através da
progressão linear da fronteira micelial a cada 24 horas durante 8 dias. Resultados e
discussão: As sete linhagens de fungos toleraram variações de pH. As linhagens
testadas FV-6, FI-3, CV-50 e FV-12 apresentaram crescimento nas faixas 6, 8, 10 e
12, porém os fungos Pycnoporus sanguineos, FBL e FI-2 não apresentaram
crescimento na faixa de pH 12 . As maiores médias de produção foram de
P.sanguineos nas faixas de pH 6 (2,31 cm) e pH 8 (2,30cm), seguido de FV-12 em pH
10 (2,10cm). Ao nível de 95% de probabilidade não houve diferença no crescimento
entre os fungos testados nas diferentes faixas de pH. Conclusão: Fungos
basidiomicetos ocorrentes na região amazônica, toleram variações de pH, podendo
também se desenvolver em faixa de pH 8, 10 e 12, em oposição ao relatado em
bibliografias, onde esta classe de fungos cresce entre pH 5.5 a 7. Faz-se necessário
estudos com quantidades maiores de fungos para conhecer os diferentes
comportamentos dos fungos amazônicos.
98
CRESCIMENTO MICELIAL E DESCOLORAÇÃO DO CORANTE
ALARANJADO DE METILA POR FUNGOS DA AMAZÔNIA.
Autores: SOUZA, E.G; NUNES, A.S; GALUCIO, V.C.A; SOARES, E.P;
VALENTE, P.M.R; TRINDADE, D.B; CASTRO E SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Os processos industriais de tingimento de tecidos e a obtenção da
celulose são atividades que produzem uma grande quantidade de resíduos sólidos,
líquidos e gasosos, extremamente daninhos ao meio ambiente por conterem metais
potencialmente tóxicos como cloroligninas e clorofenóis. Por apresentarem enorme
habilidade para oxidar especificamente compostos fenólicos, por meio de seus
diversificados sistemas enzimáticos os fungos de podridão branca vêm sendo cada
vez mais utilizados para biorremediação dos ecossistemas em geral através da
degradação de compostos recalcitrantes. O grande potencial fúngico existente na
região amazônica vem estimulando cada vez mais o aprofundamento e as novas
descobertas da biotecnologia que se faz necessário devido o vasto campo de atuação
desses organismos. Dessa maneira o objetivo desta pesquisa foi avaliar o crescimento
micelial de fungos amazônicos e seu potencial de descoloração do corante
metilorange em estado de fermentação semi-sólida. Metodologia: Foram utilizadas
seis linhagens de fungos: Pycnoporus sanguineos, FV-12, FI-2, FI-3, FV-6, FI-9,
FI-11, CV-29 e FBL. O meio de cultivo foi composto de 500 mL de água destilada
estéril, 7,5 g de ágar e corante metilorange na concentração de 0,0002%. Fragmentos
fúngicos de 5 mm de diâmetro foram inoculados no centro da placa de Petri e
incubados a 30ºC no escuro. A avaliação do crescimento foi realizada através da
progressão da fronteira micelial a cada 24 horas por um período de 15 dias.
Resultados e discussão: Em valores absolutos o maior crescimento ocorreu para a
linhagem FI-3 (3,76cm) seguido de P. sanguineus (3,52cm), FI-2 (3,50cm) e FI-11
(2,77cm) respectivamente. Os menores crescimentos foram das linhagens FV-6
(2,24cm) e CV-29 (2,28cm). As linhagens FI-02, FI-03, FBL e Pycnoporus
sanguíneos apresentaram descoloração total em um período de 5 dias em estado de
fermentação semi-sólida, seguidas das linhagem FI-11 em um período de 12 dias e o
FV-12 em 13 dias. De acordo com teste ANOVA ao nível de 95% de probabilidade
não houve diferença estatística entre os tratamentos. Conclusão: Das nove linhagens
de fungos testadas seis apresentaram potencial para aplicação em bioprocessos de
remoção de cor de efluentes têxteis em baixas concentrações ou no tratamento de
outros resíduos sólidos coloridos, Porém, ainda existe a necessidade de um amplo
conhecimento tecnológico para o aproveitamento desses organismos e suas
estruturas.
99
CONSORCIO DE FUNGOS AMAZONICOS PARA A PRODUÇÃO DE
BIOSSURFACTANTES.
Autores: SILVA, A.V; SOARES, E.P; NUNES. A.S; ARAUJO S.P; VALENTE,
P.M.R; GALUCIO, V.A; SOUZA, E.A; MELO, J.L; CASTRO E SILVA, A.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Atualmente, a grande maioria dos surfactantes disponíveis é sintetizada a
partir de derivados do petróleo, entretanto, as novas legislações de proteção ao meio
ambiente, bem como, a preocupação ambiental entre os consumidores tem elevado a
procura por surfactantes naturais como alternativa aos produtos existentes. As
vantagens dos biossurfactantes quando comparados aos quimicamente sintéticos
reside na biodegradabilidade, baixa toxicidade, biocompatibilidade, digestabilidade e
produção econômica aceitável, tornando os biossurfactantes adequados para várias
aplicações industriais. Neste sentido, a região do Baixo Amazonas apresenta-se como
um grande laboratório, com uma biodiversidade fúngica em sua magnitude ainda
inexplorada que apresenta possibilidades de aplicações nos mais diversos setores
industriais. Portanto, o presente resumo visa avaliar a produção de biosurfactante por
fungos amazônicos com a utilização de polímeros sintéticos em meio suplementado
com resíduo agroindustrial. Material e métodos: Para os ensaios foram utilizados
consórcio de três fungos Basidiomicetos: Pycnoporus sanguineaus, FV12, FBL, os
quais foram incubados em meio de cultivo contendo 20g farinha da casca de tucumã
(Astrocaryum aculeatum Meyer)e 500ml de água destilada. Amostras do polietileno
tereftalato PET foram submetidas à temperatura de 35ºC, em estufa durante 72 horas e
como controle foram utilizados partículas de polímeros sem tratamento físico.
Erlenmeyers de 125 ml receberam 50ml do meio, 5 amostras dos polímeros e os
fungos em estudo, e incubados à 30º C. As atividades de emulsificação foram
determinadas através de agitação vigorosa em agitador magnético de tubos de 3,5 ml
de caldo de cultura previamente filtrado em lã de vidro e 2,0 ml de hidrocarboneto de
tolueno. Após 1 hora, a densidade óptica da emulsão óleo em água foi medida em
espectrofotômetro a 610 nm. Após 24 horas, as emulsões água em óleo foram
expressas em centímetros relativos à altura do halo e compactação máxima das bolhas
formadas. Resultado e discussão: De modo geral, todos os fungos mostraram-se
capazes de produzir biossurfactantes após 30 dias de fermentação submersa
estacionária. A maior atividade de emulsificação ocorreu com o consórcio Pyc+FBL
(Abs:0,802) para o ensaio PET +28ºC. Em média a atividade de emulsificação com os
consórcios foi 0,33 e 0,12 de absorvância para o teste PET +28ºC e PET 35ºC
respectivamente. A maior formação do halo ocorreu com o consorcio dos fungos
Pyc+FBL+FV12 (PET +28ºC) e para Pyc+FBL (PET 35ºC) com 3 cm
respectivamente. Conclusão: A presença de biossurfactantes no meio de cultura
composto por farinha de tucumã pode estar favorecendo a utilização dos substratos
plásticos como fonte de energia para os microorganismos, tornando os polimeros mais
acessíveis ao processo de degradação.
100
AVALIAÇÃO DE FUNGOS AMAZONICOS COM POTENCIAL PARA
DEGRADAÇÃO DO POLIETILENO TEREFTALATO – PET
Autores: SOARES, E.P; SILVA, A.V; NUNES, A.S; SOUZA, P.L; ARAUJO, S.P;
VALENTE, P.M.R; MELO, J.L; CASTRO E SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Pesquisas comprovam a eficácia da utilização de microorganismos para
degradar embalagens plásticas, ou pelo menos parte delas, em especial o polietileno
tereftalato que apresenta-se como um dos principais causadores de impactos
ambientais. Sendo de grande importância o estudo das condições ótimas de
crescimento dos microorganismos aliado à combinação de outros fatores físico-
quimicos que podem auxiliar ou maximizar o processo de degradação (temperatura,
pH, luz UV, entre outros). Portanto, este trabalho tem como objetivo avaliar fungos
amazônicos com potencial para degradar polietileno tereftalato(PET). Metodologia:
Três amostras de fungos Basidiomicetos coletados em Parintins/AM: Pyc.
sanguineaus, FV12, FBL e o consórcio entre os mesmos foram utilizados para os
testes de degradação do polímero em meio contendo 20g farinha da casca de tucumã
(Astrocaryum aculeatum Meyer) e 500ml de água destilada. As amostras do polímero
PET foram preparadas previamente (corte 1x1cm, peso e assepsia) e submetidos à
temperatura de 35ºC, durante 72 horas e como controle foram utilizados partículas de
polímeros sem tratamento físico. Erlenmeyers de 125 ml receberam 50ml do meio, 5
amostras dos polímeros e os microrganismos em estudo, e após autoclavados foram
incubados à 30º C. A degradação do PET foi avaliada em fermentação submersa
estacionária durante 30 dias. Após o período de incubação, a determinação da perda
de massa dos polímeros foi baseada na metodologia ASTM D5247-92 (1992) que
consiste na análise da diferença do peso final menos o peso inicial. Resultados: Em
termos absolutos o maior percentual de perda de peso no tratamento com PET
(+28ºC) ocorreu para o consórcio Pyc+FBL (28,7%). No tratamento individual o
maior percentual ocorreu para Pyc. sanguineaus (11,4%) e o menor para FV12
(0,40%). Nos testes com PET 35ºC o consórcio Pyc+FBL também apresentou o maior
percentual de perda de massa (19,7%), porém, 45,6% menor do que no teste PET
+28ºC. Neste tratamento ocorreu um aumento na perda de massa para todos os ensaios
individuais sendo 33%, 41% e 420% para Pyc. sanguineaus, FBL e FV12
respectivamente. Por outro lado, o consórcio no tratamento PET 35ºC apresentou um
menor percentual de perda de massa para Pyc+FBL+FV12 e PYC+FBL, 58,1% e
45,7% respectivamente. Exceção para o consórcio de fungos Pyc+FV12 onde a perda
de massa foi 3,9 vezes maior no tratamento PET 35ºC. Conclusão: Todos os fungos
amazônicos testados apresentaram potencial para degradar o polietileno tereftalato,
sendo que os testes “consórcios” com PET sem tratamento físico apresentou maior
perda de massa do polímero.De uma forma geral, o meio composto da farinha de
tucumã possivelmente influenciou o processo de degradação do PET, visto que
apresenta requisitos nutricionais para o crescimento fúngico.
101
CRESCIMENTO LINEAR DE FUNGOS DE DECOMPOSIÇÃO BRANCA EM
MEIO ACRESCIDO DE CHORUME
Autores: NUNES, A.S; SOARES, E.P; SOUZA, P.L; SANTOS, I.C; TAVARES,
B.P; MELO, J.L; GALÚCIO, V.A; CASTRO E SILVA.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: O lixão é uma forma inadequada de disposição final de resíduos sólidos,
acarretando vários problemas ambientais, gerados pela simples descarga do lixo sobre
o solo, sem medidas de proteção ao meio ambiente ou à saúde pública. Da
decomposição química e microbiológica dos resíduos sólidos depositados em um
lixão forma-se o chorume - líquido de elevada carga orgânica e forte coloração que se
torna extremamente poluente, sendo potencial contaminante de lençóis freáticos e
corpos d’água, comprometendo a saúde da população. Portanto, pesquisas vêm sendo
realizadas no sentido de amenizar os impactos ambientais causados por esse descarte
indiscriminado. Neste contexto os fungos produtores de enzimas oxidativas tomam
destaque, uma vez que estes microorganismos possuem um “pool” enzimático
diversificado capaz de degradar compostos recalcitrantes presentes no chorume. Neste
sentido o objetivo desta pesquisa foi avaliar o crescimento linear de fungos
amazônicos em meio contendo chorume como principal fonte de carbono. Material e
métodos: Foram utilizados cinco fungos da classe dos basidiomicetos codificados em
FI-02, FV-12, FI-03, FBL e Pycnoporus sanguineus coletados na zona rural do
município de Parintins/Am. Para obtenção da cultura pura fragmentos dos carpóforos
foram inoculados em meio BDA. O chorume utilizado foi coletado no lixão municipal
de Parintins/AM, em seguida autoclavado, oxigenado por 2 horas e posteriormente
centrifugado a 2000 rpm por 10 min. O crescimento fúngico foi avaliado em teste de
placa Petri, contendo apenas Agar e chorume nas concentrações: 1%, 1,5% e 2%. Os
tratamentos foram incubados em estufa BOD à 30°C e seu crescimento mensurado a
cada 24 horas durante cinco dias. Resultados e discussão: As linhagens testadas
apresentaram correlação positiva quanto ao crescimento em meio contendo chorume
nas concentrações 1%, 1,5% e 2%, sua principal fonte de carbono. Em valores
absolutos os maiores crescimentos foram para as linhagens FI-02 na concentração 2%
(2,22 cm), seguida de FI-02 na concentração 1% (2,16 cm) e FV-12 na concentração
2% (2,14 cm) respectivamente. Paralelamente os menores desempenhos ocorreram
para Pycnoporus sanguineus na concentração 1,5% (1,15 cm) e Pycnoporus
sanguineus em concentração 1% (1,10 cm). Não houve diferença estatística entre os
tratamentos. Conclusão: As cinco linhagens fúngicas amazônicas testados
apresentaram relação positiva com o crescimento radial em meio de cultivo acrescido
de chorume como principal fonte de carbono.
102
ESPÉCIE AMAZÔNICA COM POTENCIAL FUNGICIDA FRENTE A FUNGO
FITOPATÓGENO QUE ATACA HORTALIÇAS NO MUNICÍPIO DE
PARINTINS-AM
Autores: VALENTE, P.M.R; SOARES,E.P; NUNES,A.S; ARAUJO,S.P;
GALUCIO,V.A; ROCHA,E.M; SCUDELLER,V.V; CASTRO E SILVA,A;
MELO,J.L.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Nas últimas décadas vem se utilizando alternativas menos agressivas de
controle de pragas agrícolas garantindo o controle de doenças e a sustentabilidade da
atividade agrícola. O fungo Fusarium sp causa grande prejuízo as culturas de hortaliças e
respectivamente a outros espécies agrícolas causando prejuízo econômico. No município
de Parintins-Am, produtores de hortaliças sofrem o ataque desses fitopatógenos,
comprometendo sua produção e deixando em risco a saúde da população. A diversidade
de espécies vegetais na Amazônia torna importante a investigação de novas moléculas
químicas capazes de serem utilizadas como controle biológico amenizando a agressão ao
meio ambiente. O Caryocar villosum é uma espécie bastante encontrada na Amazônia
Central, sendo conhecida regionalmente como piquiá. As folhas, casca da árvore e polpa
do fruto são ricas fontes de taninos. Estas substâncias contribuem para a defesa das
plantas contra o ataque de insetos e tem sido relacionada com inibição do crescimento de
microrganismos. O estudo teve como objetivo desenvolver pesquisa em torno da planta
Amazônica com potencial fungicida, capaz de realizar controle biológico, e tornando
menos agressivo ao meio ambiente. Material e método: O trabalho utilizou folhas
coletadas de uma população de piquiá (Caryocar villosum(Aubl)/.Pers),coletada no
município de Parintins no Estado do Amazonas. As amostras das folhas foram pesadas e
secas em estufa a 30°C,em seguida moídas. Na realização dos testes com o extrato do C.
villosum,o extrato bruto das folhas foi obtido através do método de extração à quente.As
amostras dos patógenos foram obtidas de folhas apresentando sintomas de fusariose em
plantas comerciais.Os patógenos foram cultivados em placa de petri em meio de cultura
BDA (batata-dextrose-agar). A atividade antifúngica das concentrações do extrato foliar
foi avaliada através da inibição do crescimento miceliano do patógeno. Utilizou-se o
extrato foliar da espécie vegetal nas concentrações de 1, 10, 100 e 1000 µg/mL-1. A
avaliação do efeito das diferentes concentrações do extrato foliar sobre o crescimento
miceliano foi realizada quando o crescimento da testemunha cobriu totalmente a
superfície do meio de cultura. Resultados e Discussão: Constatou-se que o extrato de
C.villosum nas concentrações 10,100 e 1000 µg/mL-1 testadas inibiram em 100% a
germinação dos esporos de Fusarium sp. Sete dias após a avaliação verificou-se que os
esporos permaneceram sem germinar, não ocorrendo, consequentemente, o crescimento
micelial do fungo e, comprovando-se, portanto, o efeito fungicida do extrato foliar. Na
concentração 1µg/mL-1 não houve crescimento micelial, constatando que a concentração
é baixa para inibição do patógeno. Conclusão: O extrato bruto foliar obtido do Caryocar villosum apresenta potencial fungicida.
103
ISOLAMENTO DACTÉRIAS PROVENIENTES DO CHORUME DA
LIXEIRA PUBLICA DE PARINTINS-AM E AVALIAÇÃO DA PRESENÇA
DE COLIFORMES
Autores: ANDRADE, F.S; GALUCIO, V.C.A; SANTOS,I.C.C;
BITTENCOURT,V.S; MUNIZ,V.A; NUNES, A.S; SOARES,E.P; SILVA,A.
MOREIRA; PROCOPIO,A.R.L.
1.Universidade do Estado do Amazonas. 2. Centro de Estudos Superiores de
Parintins/AM.
Resumo
Introdução: Parintins é a segunda maior cidade do estado do Amazonas, localizada
na maior Bacia hidrográfica do mundo, é circundada pelo Rio Amazonas formando
uma ilha com diversos lagos. Nestas mediações está localizada a lixeira pública, onde
é depositado todo o resíduo doméstico e industrial gerado pela cidade. Com uma
grande produção de chorume, um líquido resultante da degradação de resíduos sólidos
urbanos, sendo que a percolação deste líquido em lixões sem impermeabilização do
solo pode provocar poluição das águas subterrâneas e superficiais, e consequente
alteração da fauna, flora e microbiota. Material e métodos: As amostras de chorume
foram coletadas no período de vazante e de enchente dos rios, em quatro diferentes
pontos do entorno da lixeira. Foram retirados 50 ml de cada poça e transportados para
o laboratório de Biologia da UEA/Parintins-AM. Para avaliar a presença de
coliformes, distribuiu-se 10 mL de cada amostra em tubos de ensaio com 10 mL de
meio contendo caldo lactosado com púrpura bromocresol, e encubou-se por 24 horas
em BOD a 35°C ± 2°C. Como controle positivo foi utilizado o meio TSB acrescido de
10 μl de cultura de E. coli ATCC 25922. Para o isolamento de bactérias foi semeado
com alça drigalski 100 μL de cada amostra com diferentes diluições em placas de
Petri contendo meio de cultivo TSB e NA e incubadas em BOD a 30°C por 24h. Após
o crescimento, fez-se a purificação das colônias por esgotamento com estrias
cruzadas. As bactérias purificadas foram preservadas em meio de cultivo TSB liquido
suplementado com glicerol a 15%, e estocadas a -20ºC. Resultados e discussão: Após
o período de incubação avaliou-se a produção de gás pela presença de bolhas no meio
de cultivo e a mudança de coloração do mesmo pela produção de ácido.
Características de crescimento de bactérias do grupo coliformes, observado em todas
as amostras coletadas nos diferentes períodos. A presença de E. coli foi confirmada
pela observação crescimento de colônias com brilho verde metálico após o
plaqueamento em meio EMB, sendo positiva em 14 das 24 amostras avaliadas. Destas
amostras também foram isoladas 96 diferentes colônias de bactérias, indicando a
diversidade bacteriana do chorume. Estas bactérias foram depositadas na coleção de
culturas do programa de Mestrado em Biotecnologia da UEA. Conclusão: chorume é
um líquido tóxico, podendo ser um veiculo de transmissão de doenças, pela presença
de uma diversidade de microrganismos patogênicos ou não, os resultados mostram a
potencialidade de ocorrência de doenças disentéricas pela indicação da presença de
Escherichia coli. Além de ser uma fonte de microrganismos com potencial
biotecnológico a ser explorado.
104
APROVEITAMENTO DE RESÍDUO AGROINDUSTRIAL DA AMAZÔNIA COMO FONTE DE
CARBONO PARA FUNGOS DETERIORADORES DE MADEIRA
AUTORES: NUNES, A.S (UEA) ; GONÇALVES, M.S (UEA) ; SOUZA, E.G (UEA) ; SOARES, E.P
(UEA) ; CASTRO, N.F (UEA) ; CASTRO E SILVA (UEA)
RESUMO: O objetivo desta pesquisa foi testar a farinha da casca do tucumã (Astrocaryum aculeatum
Meyer) no crescimento de fungos deterioradores de madeira em diferentes concentrações e faixas de pH.
Para os testes de crescimento utilizou-se a farinha da casca de tucumã como suplemento nas concentrações
1% e 2% e ajustado o pH inicial para 4, 6, 8, 10, 12. Os fungos estudados foram coletas na zona rural de
Parintins/AM e codificados em: FV-12, FV-6, FI-9, FI-3 e Pycnoporus sanguineos. O crescimento foi
mensurado através da progressão linear da fronteira micelial. A concentração ótima para o crescimento dos
fungos testados apresentou-se em 1% de farinha da casca de tucumã. Referente ao pH a faixa ótima para o
crescimento dos fungos testados ocorreu entre 4 e 6.
PALAVRAS CHAVES: casca de tucumã, fungos amazônicos, crescimento
introdução: O tucumã (Astrocaryum aculeatum Meyer), também conhecido como tucumã-do-amazonas ou
tucumã-açu, é uma palmeira de crescimento monopodial, arborescente e monóica (CAVALCANTE, 1991).
Seus frutos são ricos em vitamina A, ácidos graxos saturados e glicerídeos trissaturados, podendo substituir o
dendê e o babaçu na indústria de óleos (VILLACHICA et al. 1996). No Amazonas, especialmente em
Manaus, esse produto agrícola tem significante valor financeiro, representando uma atividade econômica
crescente. Porém, apenas a polpa do tucumã é utilizada, gerando grandes quantidades de resíduos da casca,
que é desperdiçada sem nenhum aproveitamento. Nos últimos anos tem ocorrido um interesse maior na
utilização eficiente de resíduos agroindústrias (PANDEY et al., 1999; ROSALES et al., 2002). Muitos
bioprocessos têm sido desenvolvidos baseados nesses materiais como substratos em bioprocessos para
produção de enzimas isoladas, ácidos orgânicos, etanol, cogumelos comestíveis, enzimas e metabólitos
secundários biologicamente importantes (PANDEY et al., 1999; MASSADEH et al., 2001; LAUFENBERG
et al., 2003). Neste sentido, as enzimas de fungos tem se mostrado úteis na degradação numa variedade de
persistentes poluentes ambientais. Muitas dessas enzimas são extracelulares e, na natureza, provavelmente
estão envolvidas na degradação da madeira (MAYER & STAPLES, 202). O desenvolvimento da capacidade
lignolítica requer condições nutricionais e culturais, incluindo substrato metabolizável, níveis elevados de
oxigênio, um limite de nitrogênio e várias outras condições de cultivo (KIRK & FARREL., 1987;
BUSWELL, 1991). Neste contexto, o objetivo desta pesquisa foi testar a farinha da casca do tucumã no
crescimento de fungos deterioradores de madeira em diferentes concentrações e faixas de pH. Material e
métodos: Para os testes de crescimento linear utilizou-se a farinha da casca de tucumã (Astrocaryum
aculeatum Meyer) previamente seca em estufa a 50ºC e esterilizada em autoclave a 1,5 atm. Os meios de
cultivo foram preparados com farinha da casca de tucumã nas concentrações 1% e 2%, com o acréscimo de
1g de glicose e 15g de ágar a cada 1000 mL de água destilada. O pH foi ajustado com NaOH ou H2SO4 nas
faixas de pH: 4, 6, 8, 10, 12. Os fungos deterioradores de madeira estudados foram coletados na zona rural
do município de Parintins/AM, codificados em FV-12, FV-06, FI-09, FI-03 e Pycnoporus sanguineos. Para
obtenção de cultura pura, pequenos fragmentos dos carpóforos foram crescidos em meio de cultura BDA.
Nos bioensaios com a farinha da casca do tucumã a medição do crescimento foi realizada a cada 24 horas
por um período de cinco dias. O crescimento foi mensurado através da progressão linear da fronteira
micelial, feita com régua milimetrada na base de cada placa de Petri, com medidas tomadas em duas direções
perpendiculares. As culturas foram incubadas em estufa BOD à temperatura de 30º C. Todos os tratamentos
foram realizados em duplicata. Resultados e discussão: Em termos de valores absolutos os melhores
desempenhos ocorreram na concentração 1% de farinha da casca de tucumã para todos os fungos testados
nas faixas de pH 4, 6, 8, 10, 12. Na concentração 1% de farinha da casca de tucumã o maior crescimento
ocorreu para o fungo Pycnoporus sanguineos nas faixas de pH 4 (2,5cm), seguida do pH 6 (2,3cm) e pH 12
(2,0cm) respectivamente, seguido dos fungos FI-3 e FV-12 nas faixas de pH 6 (2,28cm), pH 8 (2,22cm) e pH
10 (2,06cm). Os menores crescimentos foram de FV-6 e FI-09 no pH 10 (1,9 cm) e (1,8 cm)
respectivamente. Na concentração 2% de farinha da casca de tucumã o maior crescimento foi de FV-6 pH 6
(2,0 cm), seguido de FV-12 pH 12 (1,35 cm). Possivelmente a casca do tucumã contém substâncias
macromoleculares que foram utilizadas como fonte de nutrientes, para isto as enzimas hidrolíticas,
secretadas pelos fungos, hidrolisaram estas macromoléculas e liberaram, assim, pequenas moléculas solúveis
que puderam ser utilizadas para o crescimento destes microorganismos. O teste ANOVA não mostrou
diferença estatística entre os tratamentos ao nível de 5% de significância.
Conclusões: A concentração ótima para o crescimento dos fungos testados apresentou-se em 1% de farinha
da casca de tucumã. Referente ao pH a faixa ótima para o crescimento dos fungos testados ocorreu entre 4 e
6.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BUSWELL, J.A. Fungal degradation of lignin. In: ARORA, D.K. et
105
al. Handbook of applied mycology: Soil an plants. New York: Marcel Dekker, vol. 1, p. 425-480, 1991.
CAVALCANTE, P.B. 1991. Frutas comestíveis da Amazônia. 5.ed. Belém: Edições CEJUP/Museu
Paraense Emílio Goeldi. 279pp. (Coleção Adolfo Ducke).
KIRK, T.K.; FARREL, R.L. Enzymatic “combustion”. The microbial degradation of lignin. Annual Review
of Microbiology, Palo Alto, v.41, p. 564-505, 1987.
LAUFENBERG, G.; KUNZ, B.; NYZTROEM, M. Transformation of vegetable waste into value added
products: (A) The upgrading concept; pratical implementation. Bioresource Technology. Essex, v 87, p. 167-
198, 2003.
MASSADEH, M. et al. Synergism of cellulose enzymes in mixed culture solid substrat fermentation.
Biotechnologycal Letters, Hull, v. 23, p. 1771-1774, 2001.
MAYER, A.M., STAPLES, R.C. Lacase: new functions for and old enzymes. Phytochemistry, New York, v.
60, p. 551-565, 2002.
PANDEY, A. et al. Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Currente Sciences,
Bangalore, v. 77, p. 149-162, 1999.
ROSALES, E.; COUTO, R.; SAROMAN, A. New uses of food waste: application to lacase production by
Trametes hirsute. Biotechnological Letters, Hull, v. 24, p. 701-704, 2002.
VILLACHICA, H.; CARVALHO, J. E. U.; MÜLLER, C. H.; DÍAZ, S. C. & ALMANZA, M. 1996. Frutales
y hortalizas promisorias de la Amazonía. Pp. 264-267. Tratado de Cooperacción Amazonica, (TCA-SPT,44),
FAO, Lima, Peru. Versão eletrônica.
106
CRESCIMENTO RADIAL DE FUNGOS AMAZÔNICOS EM MEIO DE CULTIVO
SUPLEMENTADO COM CORANTE AZUL DE METILENO
AUTORES: SOUZA, E.G (UEA) ; NUNES, A.S (UEA) ; TRINDADE, D.B (UEA) ; PONTES, M.P. (UEA)
; CASTRO E SILVA, A (UEA) ; SOARES, E.P (UEA)
RESUMO: O objetivo desta pesquisa foi selecionar fungos amazônicos com potencial de crescimento e
descoloração em meio acrescido com o corante azul de metileno. Foram utilizadas nove linhagens de fungos
basidiomicetos: Pycnoporus sanguineos, FV-12, FI-2, FI-3, FV-6, FI-9, FI-11, CV-29 e FBL. Os bioensaios
ocorreram em placa de Petri na concentração 0,002% do corante. A avaliação foi feita durante 17 dias. As
melhores médias de crescimento ocorreram respectivamente para: P. sanguineos (3,54cm), FI-2 (2,70 cm),
CV-29 (2,47cm) e FV-12 (2,43cm). Quanto à descoloração, P. sanguíneos e FV-12 apresentaram 100% de
descoloração, seguidas de FI-2, FI-11, FBL com 98%, FV-06 e FI-3 com 95%. Portanto, os fungos estudados
apresentam potencial para aplicação em processo de biorremediação de áreas contaminadas.
PALAVRAS CHAVES: azul de metileno, fungos basidiomicetos, amazônia
Introdução: Uma das maiores preocupações enfrentadas hoje no mundo industrial diz respeito aos custos,
tratamentos e destino dos efluentes gerados pela aplicação de corantes químicos durante o tingimento e
beneficiamento dos de derivados industriais, acarretadas pelo fato de tratar-se de compostos recalcitrantes.
Devido a preocupação ambiental, vem aumentando o interesse por métodos alternativos, com o uso de
microrganismos para biorremediação de áreas contaminadas por metais potencialmente tóxicos (KOTRBA;
RUML, 2000). Nos últimos anos, os fungos da podridão branca (FPB) têm sido aplicados inclusive em
estratégias de biorremediação devido a sua capacidade em mineralizar uma grande variedade de compostos
altamente tóxicos encontrados no meio ambiente, como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, corantes azo,
herbicidas, entre outros (CLEMENTE, 2002; NEVES, 2002). Por se tratar de uma região rica em
microrganismos, a Amazônia tornou-se um referencial em pesquisas para reduzir os gastos, o tempo e as
consequências desses contaminantes. Desse modo, o objetivo desta pesquisa foi selecionar fungos amazônicos
com potencial de crescimento e descoloração em meio de cultivo acrescido com o corante sintético azul de
metileno. Material e métodos: Foram utilizadas nove linhagens de fungos basidiomicetos coletados na zona
rural do município de Parintins/AM: Pycnoporus sanguineos, FV-12, FI-02, FI-03, FV-6, FI-9, FI-11, CV-29
e FBL. Para aquisição da cultura pura fragmentos foram isolados em meio BDA. Para o bioensaio com o
corante o meio de cultivo foi composto de 500 mL de água destilada estéril, 7,5 g de ágar, 50mL de
ampicilina, 2,5mL de gentamicina e corante azul de metileno na concentração de 0,002%. Fragmentos
fúngicos de 5 mm de diâmetro foram inoculados no centro da placa de Petri e incubados a 30ºC em estufa
BDO no escuro. A avaliação do crescimento foi realizada através da progressão da fronteira micelial a cada
24 horas por um período de 17 dias. Também foram observadas as mudanças na coloração das culturas.
Resultados e discussão: Em termos de valores absolutos as melhores médias de crescimento ocorreram
respectivamente para as linhagens: Pycnoporus sanguineos (3,54cm), Fi-02 (2,70 cm), CV-29 (2,47cm), FV-
12 (2,43cm) e FI-03 (2,26cm). Por outro lado as menores médias foram registradas para as linhagens FI-11
(2,12cm) e FV-06 (1,95cm). No que diz respeito à descoloração do corante, as linhagens Pycnoporus
sanguíneos e FV-12 apresentaram 100% de descoloração em 17 dias, seguidas de FI-02, FI-11, FBL com
98%, e FV-06 e FI-03 com 95% de descoloração.Possivelmente enzimas produzidas por estas linhagens
fúngicas estejam atuando no processo de quebra molecular do corante, formando novos produtos de peso
molecular menor ou ainda, absorvendo em sua massa micelial os compostos do corante, agindo assim no
processo de descoloração.Os compostos presentes no efluente atuam como substratos para as bactérias,
leveduras e fungos filamentosos que metabolizam os nutrientes para crescimento e manutenção celular
durante o tratamento biológico (UZURA et al., 2000 apud GUARATINI, ZANONI, 2000). Conclusões: Os
fungos amazônicos testados apresentaram correlação positiva quanto ao crescimento micelial em meio de
cultivo suplementado com o corante sintético azul de metileno, bem como a descoloração por sete dos nove
fungos estudados. Apresentando potencial para aplicação em processo de biorremediação de áreas
contaminadas.
Referências bibliográficas: CLEMENTE, A.R. 2002. Degradação de Hidrocarbonetos Aromáticos
policíclicos por Fungos. Tese de Dourado, Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Campinas -
SP.
GUARATINI, C. C.I.; ZANONI, M. V. B. Corantes têxteis. Química Nova. V. 23, n. 1, 2000, p 71-78.
KOTRBA, P.; RUML, T. 200. Bioremediation of heavy metal pollution exploiting constituents, metabolites
and metabolic pathways of livings. A review. Coll. Czech. Chem. Comm., 65:1205-1247.
NEVES, E.B. 2002. Degradação de Hidrocarbonetos Aromáticos policíclicos por Bacterias. Tese de Dourado,
Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP, Campinas - SP.