Genetica di popolazioni 11: DNA antico

DNA antico

1.Breve storia degli studi di DNA antico (1985-2014)2.Tecniche per lo studio del DNA antico3.Un esempio: le mummie di Linzi4.Modelli di storia demografica umana5.Cosa ci dice il DNA di Neandertal?

Studying ancient DNA is tricky

1984. In Allan Wilson’s laboratory, the mtDNA sequence is determined of an extinct Mammal, the quagga, and its systematic position

1985. Svante Pääbo obtains the first ancient human sequence, from an Egyptian mummy

1989. A replication of the experiments shows that the 1985 sequence contained two errors

1994. Svante Pääbo and Bryan Sykes extract and type the mtDNA of the Similaun iceman (Ötzi)

Further DNA analyses lead to identification of his parasites and to reconstruction of the main component of his diet.

1994. Scott Woodward announces to have sequenced DNA from an 80-million-years-old Dinosaur bone

1995. S. Blair Hedges, Svante Pääbo and Marc Allard demonstrate that Woodward really amplified human DNA

1997. In Svante Pääbo’s lab the first Neandertal mtDNA sequence is typed, very different from modern human sequences

Location of the main Neandertal samples from which amplifiable DNA was obtained

Briggs et al. (2009)

mtDNA trees place Neandertals out of the range of modern human variation

2005. The evolutionary relationships of the sabretooth tiger (Smilodon) are identified in Alan Cooper’s lab

2006. Hendrik Poinar’s mtDNA analysis shows a closer relationship between Mammoth and Asian elephant than between the two elephant species

2006. Edward Rubin’s and Svante Pääbo’s labs publish, respectively, 60,000 and 1 million base nuclear sequences of a Neandertal individual

2007. Wall and Kim demonstrate errors in the 1 million base Neandertal nuclear sequence

Estimates of the divergence time for Neandertals and Europeans

2003, 2008. The mtDNA of the anatomically modern Cro-Magnon people is shown to differ from the mtDNA of the almost contemporary Neandertal people

Green et al. (2007)

2007. First draft of Neandertal genomic DNA

2010. A new human species, Denisovans, identified from DNA evidence

Tecniche per lo studio del DNA antico

1. Estrazione2. Prima amplificazione3. Clonaggio4. Seconda amplificazione e sequenziamento

Materiale di partenza

costole

ossa lunghe

denti

• OSSA

• DENTI

• TESSUTI MUMMIFICATI

• COPROLITI

TAGLIO del FRAMMENTO

PULIZIA

POLVERIZZAZIONE

Preparazione dei campioni

Mettere 1 gr di polvere d’osso in un tubo da centrifuga di polipropilene da 15 ml e aggiungere:3.5 ml di SSC 1X con PipetusSDS 10% pari allo 0.5% del volume finale (175 µl) con una P1000

Chiudere bene i tubi e mescolare su rotore per 5 minuti a temperatura ambiente

Aggiungere un volume equivalente di fenolo saturo in Tris-HCl pH 8Mescolare su rotore per 45 minuti a temperatura ambienteMettere in centrifuga per 15 minuti a 5500 rotazioni per minuto (rpm) e a 4°C

Recuperare il surnatante (fase acquosa) e metterlo in un nuovo tubo da 15 ml pulitoAggiungere un volume equivalente di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico saturo in Tris-HCl pH 8Mescolare su rotore per 5 minuti a temperatura ambienteCentrifugare per 10 minuti a 4000 rpm e a 4°C

Recuperare il surnatante e metterlo in un nuovo tubo da 15 ml pulitoAggiungere un volume equivalente di cloroformio-alcool isoamilicoMescolare su rotore per 5 minuti a temperatura ambienteCentrifugare per 10 minuti a 4000 rpm e a 4°C

Recuperare il surnatante (circa 2 ml) in cui è contenuto il DNA, e metterlo in un nuovo tubo

Estrazione con il metodo del fenolo-cloroformio

ACIDI UMICI

TANNINI

Possibili inibitori della Taq polimerasi presenti nel suolo

Purificazione dell’estratto

La PCR aumenta esponenzialmente il numero di molecole di DNA

Occorre conoscere almeno in parte la sequenza nucleotidica del frammento di DNA che vogliamo amplificare, e in particolare le sue estremità:

1) Denaturazione a 94°C

2) Appaiamento dei primers a 50-60°C

3) Estensione a 72°C

Il meccanismo della PCR

Il meccanismo della PCR

Per una PCR di 35 cicli: 34 miliardi di copie

Il risultato della PCR

Evoluzione della PCR

Con la clonazione si creano copie identiche (cloni) di un frammento di DNA

DIFFERENZE con la PCR:

• è una reazione in vivo

→ sfrutta l’apparato di replicazione del DNA delle cellule batteriche

non necessita nessuna conoscenza a priori della sequenza del frammento di DNA da clonare

→ non si usano primers

• è un processo più accurato

→ le copie di DNA ottenute sono esattamente identiche l’una all’altra

→ sistemi di ‘correzione degli errori’ cellulari

Come funziona il clonaggio del DNA?

1. Il DNA da clonare viene tagliato con un enzima di restrizione

4. Il PLASMIDE RICOMBINANTE viene inserito in una cellula batterica e al suo interno si duplica

2. inserito in un plasmide tagliato con lo stesso enzima

3. ad opera della LIGASI o della TOPOISOMERASI

ENZIMA di RESTRIZIONE

PLASMIDE

LIGASI - TOPOISOMERASI

PLASMIDE RICOMBINANTE

CELLULA BATTERICA

Clonaggio negli studi di DNA antico

Negli estratti di DNA sono presenti più copie di ogni regione del genoma → dipende dal numero di cellule del tessuto di partenza

In un estratto ottenuto da un reperto antico alcune copie di una determinata regione sono integre, altre sono degradate:

ATTGC ATTCGCTAACGTTAAGCG

ATTGC ATTCGCTAACGTTAAGCG

ATTGC ATTCGCTAACGTTAAGCG

ATTGCAATTCGCTAACGTTAAGCG

ATTGCAATTCGCTAACGTTAAGCG

RISULTATO

file visualizzato al computer

Mol. Biol. Evol. 17(9):1396–1400. 2000

Distribuzione geografica dei 6 gruppi nel continente asiatico centro-orientale.I 3 blocchi di Linzi, che rappresentano 3 periodi storici distinti, sono molto diversi tra di loro

Distribuzione geografica degli alleli mitocondriali

Neighbor-joining delle popolazioni

Popolazioni:1 Linzi (2500 anni); 2 Linzi (2000 anni); 3 Linzi (attuali); 4 Giapponesi (mainland); 5 Coreani;6 Ainu; 7 Giapponesi (Okinawa); 8 Mongoli; 9 Altai; 10 Kazaki; 11 Kirgizi (Talas);12 Kirgizi (Sary-Tash); 13 Uighurs; 14 Turchi; 15 Portoghesi; 16 Islandesi;17 Tedeschi; 18 Finlandesi; 19 Gallesi

Popolazioni moderne europee

Popolazioni modernecentro-asiatiche

Popolazioni moderneasiatico-orientaliLinzi (2500

anni)

Linzi (2000 anni)

Linzi (moderni)

Multi-dimensional scaling

CAMPIONI ANALIZZATI MINOR DISTANZA GENETICA

Linzi: campioni di sangueprelevato da 50 abitanti moderni

Mongoli, Giapponesi, Coreani…

Linzi (sito di Yixi):reperti umani di 2000 anni fa

Kirghizi, Kazaki, Uighuri…

Linzi (sito di Liangchun):

63 reperti umani di 2500 anni faTurchi, Islandesi, Finlandesi…

C’è una buona affinità genetica negli attuali abitanti di Linzi con le moderne popolazioni orientali (Mongoli, Giapponesi, Coreani…)

Diversa è la situazione mostrata dai reperti di 2000 anni fa, i quali indicano una somiglianza con le popolazioni centro asiatiche (Kirgizi, Kazaki, Uighurs…)

Ancor più singolare è la situazione indicata dai reperti di 2500 anni fa, con la minor distanza genetica verso popolazioni europee (Turchi, Islandesi, Finlandesi…)

Il background genetico dei 3 blocchi di reperti studiati è sostanzialmente diverso e si presenta ben distinto sui vari blocchi

Andando indietro nel tempo si ha una variazione nella struttura genetica, che diventa più simile a quella delle popolazioni oggi dislocate nell’Asia centrale e in Europa

I periodi storici considerati furono epoche molto travagliate: durante l’epoca dei “Regni combattenti” Linzi, capitale del regno feudale di Quin, conquistò altri regni, formando il primo nucleo di quello che sarà, in Cina, il futuro Celeste impero. E’ lecito supporre che vi fu un notevole rimescolamento nella popolazione, dovuto alle inevitabili deportazioni e migrazioni di un gran numero di persone

Una popolazione simil-europea doveva vivere nella zona di Linzi, 2500 anni fa, ma, 500 anni dopo, la situazione era già parecchio cambiata, con una struttura genetica più simile a quella delle attuali popolazioni centro-asiatiche

In conclusione

Coon: 5 sottospecie nella nostra specie

“A subspecies meets two tests: (1) it occupies a distinct geographical territory; (2) it differs from other subspecies in measurable characteristics to a considerable degree”.

L’ipotesi del candelabro (Coon)

• Le razze umane si sono separate molto tempo fa (>500 mila anni fa) e si sono evolute in sostanziale isolamento

Differenze attese fra continenti: molto grandiNeandertal diretti antenati degli europei

Neandertal

L’ipotesi multiregionale (Wolpoff)

• I gruppi umani si sono separati molto tempo fa (1 milione di anni fa) e si sono evoluti come una sola specie attraverso continui scambi migratori

Differenze attese fra continenti: grandiNeandertal diretti antenati degli europei, almeno in buona parte

Neandertal

L’ipotesi out-of-Africa (Stringer)

• I gruppi umani che si sono separati molto tempo fa (>1 milione di anni fa) sono stati rimpiazzati di recente da un gruppo uscito dall’Africa

Neandertal

Differenze attese fra continenti: piccoleNessuna relazione genealogica fra Neandertal ed europei

Quattro modelli

Contributo genetico delle popolazioni africane ai pool genici non africani secondo i quattro modelli

Fagundes et al. (2007)

Models with an African population replacing previous human continental groups explain genetic data better than any

alternative models

Neandertals, the closest evolutionary relatives of present-day humans, lived in large parts of Europe and western Asia before disappearing 30,000 years ago.

We present a draft sequence of the Neandertal genome composed of more than 4 billion nucleotides from three individuals.

Comparisons of the Neandertal genome to the genomes of five present-day humans from different parts of the world identify a number of genomic regions that may have been affected by positive selection in ancestral modern humans, including genes involved in metabolism and in cognitive and skeletal development.

We show that Neandertals shared more genetic variants with present-day humans in Eurasia than with present-day humans in sub-Saharan Africa, suggesting that gene flow from Neandertals into the ancestors of non-Africans occurred before the divergence of Eurasian groups from each other.

Riassunto

1. In tutti i campioni, test per la presenza di mtDNA neandertaliano2. mtDNA di Vi33-26 e Vi33-16 indistinguibili, ma diff(entro) < diff(tra)3. Piattaforma 454, selezionate sequenze con un match migliore con i primati che

con qualunque altro organismo (contaminazione batterica)4. Fra il 95% e il 99% di sequenze provengono da non primati5. Arricchimento delle libraries con enzimi che tagliano preferenzialmente i genomi

batterici6. Prevalente selezione di regioni ricche di GC

Analisi preliminari

Sequenziamento e allineamento del genoma

1. Circa 4 miliardi di bp sequenziate2. Sequenze allineate con le sequenze di riferimento umane o di scimpanzè3. Ogni frammento sequenziato su entrambe le eliche, e in genere più di una volta4. Contaminazione inferiore allo 0.5%5. Sequenze aggiuntive (in quantità molto minore) da 3 altri campioni neandertaliani6. Cinque sequenze moderne ex-novo: San, Yoruba, Papua NG, Han, Francese

Divergenza da umani moderni

Divergence human-Neandertal = 12.7% (11.9 to 12.4% for the X-chromosome). Assuming a DNA divergence of 6.5 Myears between human and chimpanzee genomes, point estimate for the average divergence of Neandertal and modern human autosomal DNA sequences of 825,000 years.

At the genomic, but not mtDNA, level, Neandertals fall inside the variation of present-day humans.

Mutations in several genes in Table 3 have been associated with diseases affecting cognitive capacities. It may thus be that multiple genes involved in cognitive development were positively selected during the early history of modern humans.

Mescolanza fra Neandertal e moderni

1. Identified SNPs by comparing one randomly chosen sequence from each of twopresent-day humans and asking if the Neandertals match the alleles of the two individuals equally often (H0, expected if gene flow between Neandertals and modern humans ceased before differentiation between present-day human populations began

2. H0 insensitive to demographic history. When single chromosomes are analyzed in two present populations, differences in demographic histories in the two populations will not affect the results even if they may profoundly influence allele frequencies.

3. Under the alternative model (H1) of later gene flow between Neandertals and modern humans, we expect Neandertals to match alleles in individuals from some parts of the world more often than the others.

4. Analysis restricted to biallelic SNP where two humans carry different alleles and Neandertals carry the derived (non-chimp) allele.

5. Comparison with 2 Eur. Americans, 2 East Asians, 4 Yoruba from HapMap ??

Il test D di introgressione a quattro taxa (ABBA – BABA)

Pop 1 Pop2 Neand Outgr Pop1 Pop2 Neand Outgr

Se i livelli di somiglianza genetica con Neandertal sono uguali per Pop1 e Pop2, E(D) = 0. D>0 suggerisce introgressione con Pop 2, D<0 suggerisce introgressione con Pop1

Han

Papuan

French

Yoruba

San

Segmenti di genoma neandertaliano in genomi non africani

Segmenti di genoma neandertaliano in genomi non africani

1. Statistic: D= Difference in shared alleles shared with Neandertals between two humans.

2. D(Asia-Europe) = -0.53, P=0.25

3. D(Europe-Africa) = 4.57, D(Asia-Africa) = 4.81, both P<10-12

4. The greater genetic proximity of Neandertals to Europeans and Asians than to Africans is seen no matter how we subdivide the data: (i) by individual pairs of humans, (ii) by chromosome, (iii) by transitions or transversions, (iv) by hypermutable CpG versus all other sites, (v) by Neandertal sequences shorter or longer than 50 bp.

5. Contamination of the Neandertal sequences with non-African DNA? However, the magnitude of contamination necessary to explain the Europe-Africa and Asia-Africa comparisons are both over 10% and thus inconsistent with estimates of contamination in the Neandertal data, all below 1%

Quattro processi che potrebbero spiegare i dati

Between 1 and 4% of the genomes of people in Eurasia are derived from Neandertals

1. Da erectus a Neandertal

2. Da tardi Neandertal ai primi europei o asiatici

3. Da Neandertal agli antenati di tutti i non africani

4. Antica struttura di popolazione, conservata da prima dell’origine dei Neandertal

Forse nel nostro genoma ci sono le tracce di un’ibridazione con forme umane scomparse?

Forse nel nostro genoma ci sono le tracce di un’ibridazione con forme umane scomparse?

Stoneking and Krause (2011) Nature Rev Genet 12: 603-614

Abi-Rached et al. (2011) Science 334: 89-94

Population Freq.

Papua Wosera 20.5 %

Australia Kimberley 8.3 %

China Yunnan 9.0 %

Israeli Jews 3.0 %

Albanians 2.5 %

Finnish 1.1 %

Ibridazioni a più non posso

Una possibile distribuzione delle forme umane, 70 mila anni fa

floresiensis

sapiens

erectus

neandertalensis

denisova

Campioni neandertaliani studiati a livello genetico

Testing for genetic continuity between Neandertals and modern Europeans by coalescent simulation and ABC

Confronto fra sequenze mitocondriali neandertaliane e la CRS

Confronto fra sequenze mitocondriali neandertaliane , cro-magnoidi , e contemporanee

Confronto fra modelli

Confronto fra modelli

Model 2 Prior distributiona

Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}Ne Neandertal (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}Separation Time {U: 40,575 - 900,000}Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}Ancestral Ne Cro-Magnoid {U: 5 - 5,000}Ancestral Ne Neandertal {U: 5 - 5,000}

Model 3 Prior distributiona

Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}Ne Cro-Magnoid (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}Separation time {U: 40,575 - 900,000}Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}Ancestral Ne Modern {U: 5 - 5,000}Ancestral Ne Neandertal {U: 5 - 5,000}

Model 4 Prior distributiona

Ne Modern {U: 1,000,000 - 10,000,000}Ne Neandertal (before extinction) {U: 5,000 - 100,000}Time Out of Africa {U: 50,000 - 80,000}Separation Time {U: 80,025 - 900,000}Mutation Rate {U: 0.0002 - 0.008}Ancestral Ne Cro-Magnoid {U: 5 - 5,000}Ancestral Ne Neandertal {U: 5 - 5,000}Ne before Out Of Africa {U: 5,000 - 100,000}

Distribuzioni delle probabilità a priori dei parametri

Distribuzioni delle probabilità a posteriori dei parametri

% of model attribution

MOD1 MOD2 MOD3 MOD4Type I error

SIMULATED MODEL

MOD1 0.992 0.005 0.003 0 0.008MOD2 0.031 0.947 0.009 0.012 0.052MOD3 0.015 0.022 0.962 0.001 0.038MOD4 0.002 0.031 0.002 0.963 0.035

Table 3.Power of the AR procedure to recover the true model, estimated as the proportion of cases in which data generated by the models listed on the Y-axis were attributed to the models listed on the X-axis . Type I error , in the last column, is the fraction of cases in which the true model was not identified.

Una possibile interpretazione

Le cose si complicano: la Southern route

Henn et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109: 17758-17764

Scally and Durbin (2012) Nature Rev Genet 13: 745-753

Se gli antenati dei papuani sono arrivati prevalentemente attraverso la Southern route, sono passati a 1500 km dal Neandertal più vicino con cui

ibridarsi

Qualche ipotesi migliore?

I modelli di ibridazione hanno un piccolo problema

E se contasse la struttura della popolazione antica?

NeandertalsAncestors of EurasiansAncestors of Africans