This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz. F r e k s a 33 zur Diskussion gestellte Möglichkeit eines „ Reißverschlußmechanismus " durchaus an- nehmbar. Bei Vorliegen eines solchen Mechanismus wären nach F r i e d r i c h - F r e k s a zumindest bei einem Teil der Fälle von Chromosomenkonjugatio- nen keine weitreichenden Kräfte erforderlich, deren Deutung uns ja vorerst unmöglich ist. Die Paarung könnte durch intermolekulare Kräfte erklärt werden, sofern die beiden Chromosomen an irgendeiner homologen Stelle in Kontakt gekommen sind, wo- nach die weitere Anlagerung von der Berührungs- stelle aus nach Art eines Reißverschlusses fortlaufen könnte, was zu einer vollständigen Paarung der bei- den Chromosomen fuhren müßte. Da nicht alle Erscheinungen bei der Chromosomen- konjugation auf diese Weise erklärt werden können, erscheint es uns wahrscheinlich, daß ein solcher Me- 33 H. F r i e d r i c h - F r e k s a , Naturforsch. Med. Dtschl. 1939—1946, 21, 44. 34 A.v. B u z ä g h , Kolloid-Z. 101, 149 [1942]. 35 S. E d l b a c h e r , Schweiz, med. Wschr. 19, 959 [1938], 36 A. F r e y - W y s s l i n g , Arch. exp. Zellforsch. 22, 477 [1939], 37 A. F r e y - W y ss l i n g , Submicroscopic morphology of protoplasm and its derivates, New York 1948. 38 E. H e r z f e l d u. R. K 1 i n g e r , Biochem. Z. 99, 204 [1919], 3i > F. K r ü g e r , K. E. W o h l f a r t h - B o t t e r m a n n u. G. P f e f f e r k o r n , Z. Naturforschg. 7 b, 407 [1952], chanismus nur von zusätzlicher Bedeutung ist. Die Elektronenbilder rekristallisierter Kollagen-Fibrillen sprechen zwar insofern für einen Reißverschluß- mechanismus, als an Verzweigungsstellen die schon erwähnten Verlagerungen homologer Elemente zu- einander auftreten, sofern die Elemente kurz vor der Berührung miteinander stehen. Zur Überbrückung von Entfernungen von mehreren hundert Ä bleiben aber weitreichendere Kräfte unerläßlich, als es die intermolekularen Kräfte darstellen. Der Beyersdorfer-Effekt bietet uns jetzt die Mög- lichkeit, solche weitreichenden Kräfte an einfach zu untersuchenden Modellen wie dem Kollagen näher zu analysieren. Die Bedeutung dieser Kräfte für zahlreiche grundlegende Lebensvorgänge ist heute noch nicht zu übersehen und sollte nicht unterschätzt werden. 40 A. G. P a s y n s k i j , Dokl. Akad. Nauk. SSSR 77, 863 [1951]. 41 P. R o n d o n i , Verh. Ges. dtsch. Naturforscher Ärzte 95, 93 [1939]. 42 P. R o n d o n i, Enzymologia 9, 380 [1940/41], 43 P. R o n d o n i , Erg' Enzymforsch. 10, 65 [1949]. 44 W. ]. S c h m i d t , Arch. exp. Zellforsch. 6, 350 [1928]. 45 W. J. S c h m i d t , Die Doppelbrechung von Karyo- plasma, Zytoplasma und Metaplasma. Protoplasma-Mono- graphien 11, Berlin 1937. 46 K. E. W o h l f a r t h - B o t t e r m a n n u . F . K r ü g e r , Protoplasma (im Druck). 47 H. Z a h n , Angew. Chem. 64, 295 [1952]. Gewebewachstum und Vermehrung von Coxsackie-A,-Virus Von GISELA RUCKLE Aus dem Institut für Virusforschung in Heidelberg (Z. Naturforschg. 9 b, 35—41 [1954]; eingegangen am 12. Oktober 1953) Coxsackie-A.j-Virus kann auf Rollkulturen von Mäuseskelettmuskel-Fibroblasten mit hoher Ausbeute vermehrt werden. Gewebezuwadis und Virusvermehrung gehen dabei einander im wesentlichen parallel. Die Größe der Virusproduktion ist ebenso wie der Gewebezuwachs durch dem Gewebe innewohnende Faktoren bedingt. Beide nehmen mit dem Alter der Kulturen ab. Die Gesetzmäßigkeit dieser Abnahme kann nur wenig modifiziert werden. Einbringen des Virus in die Gewebekultur ruft in allen untersuchten Fällen eine starke vorübergehende Abnahme der Zellteilungs-Frequenz hervor, von der noch nicht feststeht, ob sie auch durch andere neurotrope Viren erzeugt werden kann. Aussehen und Lebensdauer der Kulturen weichen nicht von denjenigen unbeimpfter Kon- trollen ab. E s ist bekannt, daß zur Vermehrung von Virus in der Gewebekultur ein aktiver Stoffwechsel der Wirtszellen erforderlidi ist. Dagegen ist weniger sicher, ob und für welche Viruskörper die Teilungs- fähigkeit des Wirtsgewebes erhalten sein muß. Ins- besondere ist diese Frage kaum bearbeitet für die Züchtung neurotroper Viren in der Gewebekultur, die seit den Arbeiten von E n d e r s 1 und seiner Schule besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. A. E. F e 11 e r , J. F. E n d e r s u. T. H. W e l - ler, J. exp. Medicine 72, 367 [1940], ib J. F. E n d e r s , T. H. W e 11 e r u. F. C. R o b - bins, Science [New York] 109 ,85 [1949]. ic F. C. R o b b i n s u. J. F. E n d e r s , Amer. J. med. Sei. 220, 317 [1950]. (Siehe dort weitere Literatur.)
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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
F r e k s a 33 zur Diskussion gestellte Möglichkeit eines „Reißversch lußmechanismus " durchaus an-nehmbar. Bei Vorliegen eines solchen Mechanismus wären nach F r i e d r i c h - F r e k s a zumindest bei einem Teil der Fälle von Chromosomenkonjugatio-nen keine weitreichenden Kräfte erforderlich, deren Deutung uns ja vorerst unmöglich ist. Die Paarung könnte durch intermolekulare Kräfte erklärt werden, sofern die beiden Chromosomen an irgendeiner homologen Stelle in Kontakt gekommen sind, wo-nach die weitere Anlagerung von der Berührungs-stelle aus nach Art eines Reißverschlusses fortlaufen könnte, was zu einer vollständigen Paarung der bei-den Chromosomen fuhren müßte.
Da nicht alle Erscheinungen bei der Chromosomen-konjugation auf diese Weise erklärt werden können, erscheint es uns wahrscheinlich, daß ein solcher Me-
33 H. F r i e d r i c h - F r e k s a , Naturforsch. Med. Dtschl. 1939—1946, 21, 44.
34 A.v. B u z ä g h , Kolloid-Z. 101, 149 [1942]. 35 S. E d l b a c h e r , Schweiz, med. Wschr. 19, 959 [1938], 36 A. F r e y - W y s s l i n g , Arch. exp. Zellforsch. 22, 477
[1939], 37 A. F r e y - W y ss l i n g , Submicroscopic morphology
of protoplasm and its derivates, New York 1948. 38 E. H e r z f e l d u. R. K 1 i n g e r , Biochem. Z. 99,
204 [1919], 3i> F. K r ü g e r , K. E. W o h l f a r t h - B o t t e r m a n n
u. G. P f e f f e r k o r n , Z. Naturforschg. 7 b, 407 [1952],
chanismus nur von zusätzlicher Bedeutung ist. Die Elektronenbilder rekristallisierter Kollagen-Fibrillen sprechen zwar insofern für einen Reißverschluß-mechanismus, als an Verzweigungsstellen die schon erwähnten Verlagerungen homologer Elemente zu-einander auftreten, sofern die Elemente kurz vor der Berührung miteinander stehen. Zur Überbrückung von Entfernungen von mehreren hundert Ä bleiben aber weitreichendere Kräfte unerläßlich, als es die intermolekularen Kräfte darstellen.
Der Beyersdorfer-Effekt bietet uns jetzt die Mög-lichkeit, solche weitreichenden Kräfte an einfach zu untersuchenden Modellen wie dem Kollagen näher zu analysieren. Die Bedeutung dieser Kräfte für zahlreiche grundlegende Lebensvorgänge ist heute noch nicht zu übersehen und sollte nicht unterschätzt werden.
40 A. G. P a s y n s k i j , Dokl. Akad. Nauk. SSSR 77, 863 [1951].
41 P. R o n d o n i , Verh. Ges. dtsch. Naturforscher Ärzte 95, 93 [1939].
42 P. R o n d o n i , Enzymologia 9, 380 [1940/41], 43 P. R o n d o n i , Erg' Enzymforsch. 10, 65 [1949]. 44 W. ]. S c h m i d t , Arch. exp. Zellforsch. 6, 350 [1928]. 45 W. J. S c h m i d t , Die Doppelbrechung von Karyo-
plasma, Zytoplasma und Metaplasma. Protoplasma-Mono-graphien 11, Berlin 1937.
46 K. E. W o h l f a r t h - B o t t e r m a n n u . F. K r ü g e r , Protoplasma (im Druck).
47 H. Z a h n , Angew. Chem. 64, 295 [1952].
Gewebewachstum und Vermehrung von Coxsackie-A,-Virus V o n GISELA RUCKLE
Aus dem Institut für Virusforschung in Heidelberg (Z. Naturforschg. 9 b, 35—41 [1954]; eingegangen am 12. Oktober 1953)
Coxsackie-A.j-Virus kann auf Rollkulturen von Mäuseskelettmuskel-Fibroblasten mit hoher Ausbeute vermehrt werden. Gewebezuwadis und Virusvermehrung gehen dabei einander im wesentlichen parallel. Die Größe der Virusproduktion ist ebenso wie der Gewebezuwachs durch dem Gewebe innewohnende Faktoren bedingt. Beide nehmen mit dem Alter der Kulturen ab. Die Gesetzmäßigkeit dieser Abnahme kann nur wenig modifiziert werden.
Einbringen des Virus in die Gewebekultur ruft in allen untersuchten Fällen eine starke vorübergehende Abnahme der Zellteilungs-Frequenz hervor, von der noch nicht feststeht, ob sie auch durch andere neurotrope Viren erzeugt werden kann.
Aussehen und Lebensdauer der Kulturen weichen nicht von denjenigen unbeimpfter Kon-trollen ab.
Es ist bekannt, daß zur Vermehrung von Virus in der Gewebekultur ein aktiver Stoffwechsel der
Wirtszellen erforderlidi ist. Dagegen ist weniger sicher, ob und für welche Viruskörper die Teilungs-fähigkeit des Wirtsgewebes erhalten sein muß. Ins-besondere ist diese Frage kaum bearbeitet für die Züchtung neurotroper Viren in der Gewebekultur,
die seit den Arbeiten von E n d e r s 1 und seiner Schule besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat.
A. E. F e 11 e r , J. F. E n d e r s u. T. H. W e l -l e r , J. exp. Medicine 72, 367 [1940],
ib J. F. E n d e r s , T. H. W e 11 e r u. F. C. R o b -b i n s , Science [New York] 109 ,85 [1949].
ic F. C. R o b b i n s u. J. F. E n d e r s , Amer. J. med. Sei. 220, 317 [1950]. (Siehe dort weitere Literatur.)
Es interessierte daher — zunächst für einen Ein-zelfall — zu klären:
1. Ob Virusvermehrung und Gewebezuwachs in der Kultur einander parallel laufen, und
2. ob Infektion der Kultur mit Virus Rückwirkun-gen auf die Teilungsfrequenz ihrer Zellen hat.
Geeignet zur Bearbeitung dieser Fragen erwies sich ein System bestehend aus Skelettmuskelfibro-blasten-Kulturen der Maus und Coxsackie-A2-Virus *. Coxsackie-Virus ist erstmalig von D a l l d o r f 2 iso-liert worden. Es handelt sich um ein zur Poliomyeli-tis-Gruppe gehörendes Virus, dessen Stamm A2 durch Zerstörungen vorwiegend an der Skelettmuskulatur säugender Mäuse gekennzeichnet ist. Zur Coxsackie-A-Gruppe gehörende Stämme lassen sich, wie von S l a t e r 3 und W e 11 e r 4 nachgewiesen worden ist, in Maitlandkulturen und anscheinend auch in Roll-kulturen aus menschlichem Gewebe fortzüchten. Doch sind nach unseren Befunden auch Rollkulturen aus Skelettmuskelgewebe der Maus ohne Einschrän-kung zur Propagation des Virus geeignet.
Das auswachsende Gewebe bildet nadi kurzer Zeit über der Innenwand des Züditungsgefäßes einen zu-sammenhängenden, teilweise mehrschichtigen Schleier. Der Gewebezuwachs kann dann nicht mehr als Zunahme des Flächenareals der Kultur, sondern nur noch als Tei-lungsfrequenz ihrer Zellen gemessen werden. Die Mitose-Rate in Gewebekulturen erreidit bei optimalem Wadis-tum noch nidit 3%, sie sinkt bei einige Zeit in vitro ge-haltenen Kulturen unter 1%. Ihre Berechnung fordert dann die Durchmusterung einer immer größeren Zellzahl. Wahrscheinlich aus diesem Grunde ist bisher kaum systematisch versucht worden, Gewebezuwachs und Virus-vermehrung miteinander zu vergleichen.
Die Bestimmungen werden wesentlich erleiditert, wenn statt der im Zeitpunkt der Messung gerade ablaufenden Mitosen der Prozentsatz sich teilender Zellen während einer längeren Zeitspanne (z. B. während einer Zeit von 12 Stdn.) als Maßstab für das Kulturwachstum genom-men wird. Dies ist möglich durch Arretierung der Zell-teilungen mit Colchicin. Colchicin ist nach den bisheri-gen Erfahrungen ein Zellgift, das selektiv den Aufbau der achromatischen Teilungsfigur hemmt und dadurch das Fortschreiten der Zellteilung über die Metaphase hinaus unterbindet. Darüber hinaus hat Colchicin in mitosewirksamen Konzentrationen keinen nennenswerten Einfluß auf den Zellstoffwechsel. Insbesondere hemmt es die Zellteilungen nur, solange es mit den Kulturen in Berührung ist, und hat, wenn es aus der Nährlösung
Das Virus verdanken wir dem Direktor der Kinder-klinik Freiburg i. Br., Herrn Prof. Dr. K e l l e r .
2a G . D a l l d o r f u. G. S i c k l e s , Science [New York] 103. 61 [1948],
2,) G. D a l l d o r f , Die Coxsackie-Viren, ihre Isolie-rung u. Charaktereigenschaften, 2. Internat. Poliomvelitis-kongreß [1951].
entfernt wird, keine Nachwirkung mehr 3. Die prakti-schen Erfahrungen zeigen, daß im teilungsaktiven Ge-webe die Zahl der unter Colchicin angehäuften Meta-phasen'einen zuverlässigen Maßstab zur Beurteilung der Zellvermehrung abgibt.
In die Kultur gebrachtes Säugergewebe ist nur in seltenen Fällen unbegrenzt fortzuzüchten. Skelett-muskel-Fibroblasten der Maus zeigen unter den von uns verwandten Züchtungsbedingungen optimales Wachstum unmittelbar nach dem Einsetzen in die Kultur und nach 20 Tagen allmähliches Nachlassen der Teilungsaktivität. Die Kulturen sterben etwa am 35. Tage ab. Diese Änderung des Gewebewachs-tums mit der Zeit erfolgt bei allen Kulturen gleich-sinnig und ist auch bei Kulturen verschiedener Her-kunft von ähnlicher Größe. Stehen Zellteilung und Virusvermehrung überhaupt in Beziehung zueinan-der, so ist zu erwarten, daß audi die Fähigkeit einer Kultur, Virus zu reproduzieren, sich mit ihrem Alter ändert.
Methodik G e w e b e z ü c h t u n g : Die Züditung lehnte sich an
die von E n d e r s 1 angegebene Technik an. Skelett-muskelgewebe fast reifer Mäuse-Embryonen wuide mit wenig Plasma auf schmale Glasstreifen ausgepflanzt und 3 soldier Streifen mit insgesamt 18 Explantaten in jedes Glas eingesetzt. Die Züditung erfolgte bei 37° C in Rollkulturen.
I. H e r s t e l l u n g der N ä h r l ö s u n g : Sie wird gemisdit aus 7 Teilen Simmslösung (S), 2 Teilen Embryo-nal-Extrakt (E), 1 Teil Rattenserum (R). In späteren Ver-suchen wurde die Simmslösung durch eine Misdiung von 3 Teilen Simmslösung und 1 Teil Ultrafiltrat (UF) er-setzt ( = 1,75 UF/5,25 S). 1 ccm Nährlösung enthält ferner 100 y Streptomycin und 100 Einheiten Penicillin.
Die frische Nährlösung hat ein pjj von 7,6—7,8, das bei Kontakt mit dem Gewebe bis pjj 6,5—6,8 sinken darf. Die Nährlösung wird gewediselt, wenn die Indikator-farbe von karmin- zu orangerot umgesdilagen ist, d. h. in stoffwediselaktiven Kulturen alle 24—48 Stunden.
Füllung der Kulturgefäße mit einer aus 0 2 , CO., und N„ gemischten Gasphase definierter Zusammensetzung erwies sich als nicht erforderlich. Füllung mit Luft ge-nügt.
II. Z u s a m m e n s e t z u n g der S i m m s l ö s u n g : 0,137-»?. NaCl
0,00267-ni. KCl 0,001-?7i. CaClo 0,001-m. MgCb-6 H .O 0,012-777. NaHCO;i
0,0012-m. Na5HPO, 0,0055-777. Glucose
0,00014-777. Phenolrot 3 E. A. S 1 a t e r u. J. H. S y v e r t o n , Proc. Soc.
exp. Biol. Med. 74, 509 [1950]. 4 T. H. W e l l e r , C. F. R o b b i n s u. M. B. S t o d -
d a r d , Fed. Proc. 11, 486 [1952]. 5 G. R u c k l e , unveröffentlidit.
H e r s t e l l u n g d e s U l t r a f i l t r a t s : Rinder-serum wird durch Seitzfilter vorfiltriert und mit 2 At. Druck durch Ultracellafilter „fein" der Membranfilter-gesellschaft, Göttingen, gepreßt. Die Eiweißproben im Ultrafiltrat waren negativ.
H e r s t e l l u n g d e s E m b r y o n a l e x t r a k t e s : 9—10-tägige Hühnerembryonen werden zerkleinert, das Gewebe mit der gleichen Menge Simmslösung versetzt, 30 Min. bei 37° C bebrütet und der Überstand vom ab-zentrifugierten Gewebe abgetrennt.
B e s t i m m u n g d e r M i t o s e - R a t e : 1 Glasstreifen wird der Kultur entnommen und in ein neues Kultur-gefäß mit 1,5 ccm Nährlösung eingesetzt. Die Nährlösung enthält 0,1 g Colchicin pro ccm. Nach 12 Stdn. Bebrü-tung werden die Kulturen 15 Min. in Eisessig/Alkohol fixiert und in Glycerin im Phasenkontrastmikroskop un-tersucht. Getrennte Untersuchungen5 zeigen, daß bei dieser Konzentration und bei dieser Einwirkungsdauer alle anfallenden Zellteilungen arretiert und interphasische Zellen nicht erkennbar geschädigt werden und daß das Umsetzen der Kultur auf ihrem Glasträger ihre Mitose-Rate nicht beeinflußt.
B e s t i m m u n g d e r V i r u s v e r m e h r u n g : Aus-gangsmaterial für die Beimpfung der Kulturen sind Homogenate aus ganzen abgehäuteten Extremitäten ge-lähmter Mäuse oder virushaltige Nährlösung infizierter Kulturen. Das Einbringen von virusfreier Muskelsuspen-sion in den benutzten Verdünnungen ist, wie Kontrollen erwiesen, ohne Einfluß auf das Wachstum des Gewebes. Der Virusgehalt des Impfmaterials wird vor der Impfung bestimmt.
Die Virusproduktion der Kulturen wird durch Impfung säugender Mäuse mit Nährlösung, in einigen Fällen auch durch Impfung mit Suspensionen aus dem Gewebe be-stimmt. Den Tieren wird das zu testende Material in geeigneten Verdünnungen und einer Menge von je 0,025 ccm intraperitoneal injiziert. Für jede Verdünnung wird ein Wurf von mindestens 4 Mäusen benutzt. Die Errechnung der Titer erfolgte unter Benutzung der Formel von R e e d und M u e n c h 6 . Alle Werte (in Abb. 1 und in den Tabellen) bezeichnen die Zahl der LD-0 (für 50% der Mäuse tödliche Virusmenge) pro Kulturgefäß, d. h. auf 1,8 ccm Nährlösung oder in eini-gen Fällen auf das Gewebevolumen in der Kultur be-rechnet.
Für die Titerbestimmung wurden nur gestorbene Mäuse berücksichtigt. Wurden die Tiere nur lahm oder blieben sie nach der Impfung klein, so ist dies in einigen Tabellen gesondert aufgeführt. Für die Bestimmung der LD, 0 wurden diese Tiere als negativ gewertet.
Ergebnisse
WTird Skelettmuskel von Mäuseembryonen in die Kultur gebracht, so beginnen seine Zellen sich sdion nach wenigen Stdn. in rascher Folge zu teilen Schon nach Ablauf von 24 Stdn. beträgt die Mitose-
6 L. J. R e e d u. H. M u e n c h . Amer. J. Hvg. 27. 493 [1938],
Rate 2 % , der Anteil der im Laufe von 12 Stdn. in Teilung eintretenden Zellen (12-Stdn.-Rate) etwa 2 0 % . Der durch Coldiicinvergiftung der Metapha-sen bestimmte Wert wäre dann zu niedrig, wenn das Intervall zwischen 2 Teilungen für einen nen-nenswerten Anteil der sich vermehrenden Zellen unter 12 Stdn. läge. Nach den bisherigen Erfah-rungen 7 trifft dies auch für rasch wachsendes Ge-webe nicht zu.
Die Geschwindigkeit der Zellvermehrung nimmt etwa bis zum 4. Tage zu. Die Kultur hat dann ihre maximale Flächenausdehnung erreicht und beginnt von nun ab mehrere sich übereinander schiebende Zellagen auszubilden. Die Kulturunterlage ist von einem zusammenhängenden Zellschleier überzogen. Mit dem Beginn mehrschichtigen Wachstums ver-schlechtern sich für einen Teil der Zellen die Lebens-bedingungen. Die Teilungsgesdiwindigkeit des Ge-webes sinkt. Am 10. Tag teilen sich innerhalb von 12 Stdn. etwa 9 % , am 20. Tag nur noch 5 % aller Zellen (Abb. 1). Degenerative Veränderungen (Ab-sterben und Auflösung einzelner Zellen) werden sichtbar. Der Stoffwechsel der Kultur, gemessen an der Säuerung des Mediums, ist aber noch unverän-dert lebhaft. Vom 20. Tag ab treten die degenerati-ven Veränderungen in den Vordergrund. Der Stoff-wechsel der Kultur läßt nach, morphologisch sind die Zellen durch kleine, dichte Kerne, z. T. aber auch durch geblähte Kerne mit besonders deutlichen heterochromatischen Anteilen gekennzeichnet. Das Cytoplasma ist vakuolisiert, enthält Fett-Tröpfchen, zahlreiche Zellen sind in Auflösung begriffen.
Die genannten Veränderungen sind z. T. durch die Versdilechterung der Lebensbedingungen für die einzelne Zelle, insbesondere anscheinend durch das mehrschichtige Wachstum bedingt — aber nicht durch diese Faktoren allein.
Werden angewachsene Kulturen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Explantation ausgeschnitten, zerkleinert und auf neue Glasunterlagen in neue Kulturgefäße umgesetzt, so zeigt sich (Tab. l b ) , daß auch durch eine solche Maßnahme zur Verbesserung des Stoffaustausches die Überlebensdauer der Kul-turen nicht gesteigert wird. Die Kulturen wachsen zwar unter den neuen Bedingungen mit der glei-chen Geschwindigkeit an, mit der sich die nicht um-gesetzten Schwesterkulturen weiter vermehren, ihr Wachstum (gemessen als 12-Stdn-Rate) läßt aber fast zum gleichen Zeitpunkt nach wie das der Schwe-
7 A. H u g h e s , Mitotic cycle, S. 88.
sterkulturen. Umgesetzte und nicht umgesetzte Kul-turen sterben schließlich fast gleichzeitig zwischen dem 30. und 40. Tag ab. Abermaliges Umsetzen rückt den Absterbetermin nur wenig hinaus. Da-gegen ist beliebige Fortzüchtung des Gewebes an-scheinend möglich, wenn die Umpflanzung sehr frühzeitig erfolgt und in die Zeit optimalen Wachs-tums, d. h. vor den 8. Tag nach der Explantation ge-legt wird. Werden Kulturen zur Zeit des optimalen Wachstums, d. h. am 4. Tag mit Coxsackie-A2-Virus beimpft, so ändern sich ihre Überlebensdauer und ihre Vermehrungsrate im ganzen gesehen nicht. Der von uns benutzte Coxsackie-A2-Stamm bewirkt we-der cytopathologische Effekte noch erkennbare Zell-zerstörungen.
Um so auffallender ist, daß nach Zugabe des Virus — bei Inokulation mit 10ä>8 bis 105 0 LD.-0
unabhängig von der Impfmenge — im Laufe der ersten beiden Tage die 12-Stdn.-Mitose-Rate der Kultur steil abfällt, von etwa 2 5 % auf 6 % und darunter (Abb. 1). Dieser Befund ist außerordentlich charakteristisch und ausnahmslos nachzuweisen. Stoff-wechsel und Morphologie der Zellen sind in dieser Zeit gegenüber den Kontrollen unverändert. In den beiden folgenden Tagen steigt die Mitose-Rate wie-der an, z. T. über diejenige der Kontrollkulturen hin-aus, und unterscheidet sich vom 6. Tag nach der Impfung nicht mehr sicher von derjenigen der Kon-trollen.
Die Virusproduktion kommt bei Impfung mit Coxsackie-Ao-Virus erheblich rascher in Gang, als es für andere Viren der Poliomyelitisgruppe besdirie-ben ist 8. Bereits 2 Tage nach der Infektion — zur Zeit der tiefsten Depression der Mitose-Rate — sind hohe Viruskonzentrationen in der Nährlösung nach-weisbar. Sie steigen bis zum 8. Tage an. Die Aus-beute ist dabei, wie schon von E n d e r s 9 für an-dere neurotrope Viren besdirieben, um eine ganze Zehnerpotenz größer, wenn die Nährlösung Ultra-filtrat aus Rinderserum enthält.
Wie Kontrollen ergeben, verliert eine Suspension von Coxsackie-A2-Virus in der den Kulturen zuge-setzten Konzentration bei 37" C nach spätestens 3 Tagen ihre Infektiosität. Gegenwart von lebendem Gewebe, in dem das Virus sidi jedoch nicht zu ver-mehren vermag (Hühnerfibroblasten), verlängert die Infektionstüchtigkeit des Virus auf etwa 6 Tage. Durch den täglichen Wechsel der Nährlösung sinkt die Konzentration des eingebrachten Virus um 9 0 % ,
8 C. F. R o b b i n s , T. H. W e 11 e r u. J. F. E n -d e r s , J. Immunology 69. 673 [1952],
wenn angenommen wird, daß der Wechsel die zu-rückbleibenden Reste der flüssigen Phase 10:1 ver-dünnt. Werden diese beiden Faktoren in Rechnung gestellt, so kann bereits am 2. Tag nach der Impfung der Anteil des mitgeschleppten Virus 1 % der ein-
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Abi). 1. Wachstum und Virusproduktion von mit Cox-sackie-Ao-Virus beimpften Rollkulturen. Skelettmuskel-Fibroblasten (Maus), am 4. Wachstumstag mit Coxsackie-A2-Virus beimpft. Abszisse: Anzahl der Wachstumstage. Ordinate: Virusvermehrung, angegeben als Anzahl der LDr.o (linke Skala) und Kulturwachstum, angegeben als Prozentsatz der Zellteilungen (rechte Skala). Beide Ska-len sind in logarithmischem Maßstab unterteilt. Kurve A: Von beimpften Kulturen in 24 Stdn. an 1,8 ccm Nähr-lösung abgegebene Virusmenge. Mittelwertskurve aus 3 Versuchsreihen (1. f ) , 2 - 3 , 3 . # ) . Die für den 4. Wachs-tumstag eingetragenen Werte bezeichnen die bei der Impfung eingebrachte Virusmenge. Bei Versuch 3 wurde der Nährlösung Serumultrafiltrat zugesetzt. Kurve B ( O ) : Virusgehalt im Gewebe beimpfter Kulturen. Züchtung mit Ultrafiltratzusatz. Kurve C ( A ) : Prozentsatz der in unbeimpften Kulturen innerhalb von 12 Stdn. in Tei-lung eintretenden Zellen. Mittelwerte aus 4 Versuchs-reihen. Versuch D ( X ) : Prozentsatz der in unbeimpften Kulturen gleidizeitig (ohne Colchizinzusatz) ablaufenden Zellteilungen. Züchtung mit Ultrafiltratzusatz. Kurve E (A): Prozentsatz der in virusbeimpften Kulturen inner-halb von 12 Stdn. in Teilung eintretenden Zellen. Mittel-
werte aus den 3 Versudisreihen der Kurve A.
gebrachten Impfmenge nicht übersteigen. Die an diesem Tage bestimmten Viruskonzentrationen sind jedoch von gleicher Größenordnung wie die einge-
9 T. H. W e 11 e r u. J. F. E n d e r s , Proc. Soc. exp. Biol. Med. 69. 124 [1948]. H. S i m ms u. M. S a n -d e r s , Arch. Path. 33. 619 [1942].
I 1
II 2
III
Wachstum vor dem Umpflanzen + + + + + -h + + + + +
Tab. 1 a. Wadistuni und Virusproduktion ein- und zweimal umgesetzter Kulturen. Skelettmuskel-Fibroblasten(Maus), am 4. Wachstumstag mit Coxsackie-Ao-Virus beimpft. Die Versuche der Kolonne II enthielten Serumultrafiltrat in der Nährlösung. Alle Zeitangaben in dieser und den folgenden Tabellen beziehen sich auf die Zahl der Tage nach dem erstmaligen Einbringen des Gewebes in die Kultur. Zeichenerklärung: stat. = stationär, abst. = absterbend, L gelähmt, K = kleingeblieben, x = die Angaben beziehen sich auf 1-proz. Homogenate aus Kulturgewebe, xx die Gegenwart von Coxsackie-Ao-Virus wurde durch Neutralisationsversuche mit Coxsackie-A2-Antiserum nach-
Tab. 1 b. Wachstum von unbeimpften Kontrollkulturen, die zwischen dem 8. und 27. Wachstumstag einmal umgesetzt wurden (Skelettmuskel-Fibroblasten, Maus).
brachten (Abb. 1). Sie sind daher fast ausschließlich als Reproduktion des Virus durch die Wirtszellen zu erklären.
Die maximale Virusvermehrung erfolgt zwischen dem 8. und 18. Züchtungstag, zu jener Zeit also, in der auch die Kultur gleichmäßig guten Zuwachs er-fährt. Der Virusgehalt der Kulturgefäße übersteigt in diesen Tagen weit die eingebrachte Virusmenge. Nach dieser Zeit sinkt die Virusproduktion rasch ab. Der Virusgehalt der Nährlösung wird unmeßbar klein, wenn weniger als 3 % der Zellen sich in 12 Stdn. teilen.
Werden beimpfte Kulturen ausgeschnitten und auf neue Träger umgesetzt, so wird die Virusproduktion für die Dauer mehrerer Tage nahezu unterbunden. Sie erreicht in keinem Falle wieder einen Umfang, wie er in nicht umgesetzten Kontrollkulturen gefun-den wird, auch dann nicht, wenn das Gewebewachs-tum der umgesetzten Kulturen bereits einige Stun-den nach dem Umpflanzen dem der Kontrollen ent-spricht (Tab. 1 a).
Nicht nur die Virusvermehrung, sondern auch das Auswachsen der Zellen ist nachhaltig gehemmt, wenn die Kulturen innerhalb von 3 Tagen nach der
Alter der Kultur bei Beimpfung (Wadistumstag)
Eingebrachte Impfmenge in LD&,
An die Nährlösung in 24 Stdn. abgegebene Virusmenge (die Zahlen am Kopf der Kolonnen bezeichnen die Wachstumstage)
Tab. 2. Virusproduktion von Kulturen, die erst am 8. Wachstumstag und später mit Coxsackie-Ao-Virus beimpft wurden (Skelettmuskel-Fibroblasten, Maus).
Beimpfung, d. h. während der durch die Impfung induzierten depressiven Phase des Gewebewachs-tums, umgesetzt werden. Das Kulturwachstum erholt sich hier nie mehr vollständig. Virusvermehrung und Kulturwadistum bleiben ebenfalls gering, wenn solche Kulturen erneut umgesetzt werden, sie blei-ben aber nachweisbar in einem Versuch (Tab. 1 a) sogar länger erhalten als in den nicht umgesetzten Kontrollen. Ältere Kulturen, in denen die Abnahme der Zellteilungshäufigkeit ausgeprägt ist, gehen beim Umpflanzen weder an (Tab. 1 a und 1 b) noch produ-zieren sie Virus (Tab. l a ) .
Ist eine Abgabe von Virus an die Kulturflüssigkeit nicht mehr meßbar geworden, kann doch in Zell-homogenaten nodi tagelang Virus nachgewiesen wer-den (Abb. 1, Tab. 1 a). Die Virusausbeute ist maxi-mal, wenn die Kulturen am 4. Tag nach dem Aus-pflanzen beimpft werden. Sie wird um so geringer, je mehr die Wachstumstendenz der Kulturen ab-nimmt, d. h. je später die Beimpfung erfolgt (Tab. 2). Kulturen, die nach dem 20. Tag beimpft werden, produzieren keine nachweisbaren Virusmengen mehr. Kulturen, die um den 10. Tag herum beimpft wer-den, produzieren Virus ebenfalls nicht über den Zeit-punkt hinaus, in dem auch in frühzeitig beimpften Kulturen die Virusproduktion unmeßbar klein wird.
Die Vermehrung von Coxsackie-A2-Virus gelingt nicht auf Hühnerfibroblasten und nicht auf Fibro-blasten aus dem Intrascapular-Fett embryonaler Mäuse, obwohl beide Gewebe in der Kultur beson-ders gut wachsen. Auf der zuletzt genannten Ge-webeart konnte S t u 1 b e r g 10 einen Coxsackie-B-
C. S t u 1 b e r g , Proc. Soc. exp. Biol. Med. 81. 642 [1952],
Stamm (Connect. 5) fortzüchten. Dagegen gelang uns die Virus-Züchtung eines Coxsackie-B-Virus-stammes unbekannter Zugehörigkeit auf diesem Ge-webe nicht. Er vermehrte sich ebenfalls nicht auf den zur Vermehrung von Coxsackie-A2-Virus geeig-neten Skelettmuskel-Fibroblasten der Maus. Auf keinem der genannten Gewebe konnte L a n s i n g -Virus fortgezüchtet werden.
Wie schon erwähnt, bewirkt der von uns benutzte Coxsackie-Ao-Virusstamm auf Mäuseskelettmuskel-Fibroblasten keine cytopathologischen Veränderun-gen. Morphologisdi gleichen sich infizierte und nicht infizierte Zellen in allen Stadien des Kulturwachs-tums. Auch mit färberischen Methoden und im ultra-violettmikroskopischen Bild (/ = 265 raw) kann das Auftreten cytologischer Besonderheiten, die für die Virusinfektion kennzeichnend wären, nicht festge-stellt werden. Dies steht in auffallendem Gegensatz zu den ausgedehnten morphologischen Veränderun-gen, die das gleidie Virus am gleichen Gewebe des Ganztieres hervorruft. Diese sind anfänglich durch Hyperaktivität des eiweißproduzierenden Systems der Zelle, später durch schwere Schädigung dieses Systems und durch massive Zerstörung von Muskel-gewebe gekennzeichnet11.
Besprechung der Ergebnisse
Teilungsaktivität des Gewebes und Virusvermeh-rung laufen in dem benutzten System aus Skelett-muskel-Fibroblasten und Coxsackie-Ao-Virus einan-der weitgehend parallel. Beide werden unter den
n G . A . K a u s c h e u. H. H o f f m a n n - B e r l i n g, Z. Naturforschg. 7 b, 519 [1952],
gewählten Züchtungsbedingungen durdi dem Ge-webe eigene, nicht näher erklärbare Faktoren ge-steuert und durch äußere Eingriffe nur wenig modi-fiziert. Etwa vom 5. Tage nadi der Impfung an hat die Virusvermehrung durch die Kultur eine Größe, die durch den Zustand des Gewebes und nicht mehr durch Impfmenge, Zeitpunkt der Impf ung und Alter der Infektion bestimmt wird. Die Teilungsgeschwin-digkeit des Gewebes ist dann ein Maßstab für je-weils möglidie Virusproduktion. Doch ist wahr-sdieinlich, daß nicht die Zellteilung als solche Vor-aussetzung für die Virusvermehrung ist, sondern daß beide — Zellzuwachs und Virusvermehrung — Ausdruck der gleichen synthetischen Fähigkeiten des Gewebes sind. Diese Fähigkeiten nehmen gesetz-mäßig mit dem Alter der Kultur ab. Hieraus erklärt sich, daß das Umpflanzen der Kulturen einen so ge-ringen Einfluß auf die Überlebensdauer des Gewebes hat und daß eine Beimpfung älterer Kulturen mit herabgesetzter Teilungsaktivität eine Virusproduk-tion gleicher Größe hervorruft, wie sie frühzeitig be-impfte Kulturen zum gleichen Zeitpunkt zeigen. Da-gegen kann nicht erklärt werden, warum in umge-setzten virusinfizierten Kulturen trotz ausgiebigen Zellwachstums die Virusvermehrung so spät wieder einsetzt und so gering bleibt.
Gewebewachstum und Virusvermehrung laufen nicht parallel in einem Zeitabschnitt von wenigen Tagen unmittelbar nach der Infektion. Bei stark her-abgesetzter Zellteilungsaktivität des Gewebes erfolgt
Produktion großer Mengen Virus. Eine einleuchtende Erklärung für diese Ausnahme vermögen wir nicht zu geben. Ebensowenig kann erklärt werden, warum das Gewebe in unserem Falle sich gewissermaßen an das Virus gewöhnt und darüber hinaus sogar einen Teil der Zellteilungen nachholt, welche die Infektion zunächst unterdrückte.
Es steht noch nidit fest, ob die virusinduzierte vorübergehende Senkung der Teilungs-Rate auch dann eintritt, wenn die Infektion zu einem späteren Zeitpunkt, unter Umständen zu einem Zeitpunkt er-folgt, in dem eine meßbare Virusproduktion nicht mehr möglidi ist. Desgleichen bleibt zu klären, ob eine zeitweilige Senkung der Mitose-Rate auch durch andere neurotrope Viren erzeugt wird, die sich in dem Gewebe vermehren können. Dies wäre von hohem Interesse gerade bei jenen neurotropen Viren, bei denen die Latenzperiode der Vermehrung groß und die morphologisch faßbare Rückwirkung auf die Wirtszelle gering ist, d. h. bei denen der rasche diagnostische Nachweis mit den Mitteln der Ge-webekultur bisher noch besondere Schwierigkeiten bereitet.
Herrn Reg.-Rat Dr. G. A. K a u s c h e , dem Direktor des Instituts für Virusforschung in Heidelberg, danke ich für die Überlassung des Themas und manche Anregung. Herr Dr. H o f f m a n n - B e r l i n g gab wertvolle Rat-schläge, für die ich ihm sehr zu Dank verpflichtet bin. Ebenso danke ich Fräulein L. K i 11 i s c h und Frau P. E h m für ihre bereitwillige technische Hilfe.
