UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
ESCUELA DE GRADUADOS
ANALISIS DE LA EXPRESION DE TRANSPORTADORES DE HEXOSAS
EN CANCER, CON ESPECIAL ENFASIS EN NEOPLASIAS DE LA MAMA.
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGISTER EN
CIENCIAS BIOLOGICAS CON MENCION EN FISIOLOGIA
ALEJANDRO SAMUEL GODOY SANCHEZ
2000
UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
ESCUELA DE GRADUADOS
Esta tesis ha sido realizada en el Departamento de Histologa y Embriologa de la Facultad
de Ciencias Biolgicas.
Profesor Gua: Dr. Francisco Javier Nualart Santander
Ha sido por la siguiente Comisin Evaluadora.
1.- Dr. Carlos Figueroa (U
2.- Dr. Jorge Roa (U
3.- Dr. Francisco Nualart (U
Jefe de programa: Dr. Clemente Gonzlez.
AGRADECIMIENTOS
Concluida esta etapa, no puedo dejar de agradecer, a quienes de una u otra manera, colaboraron para hacer posible, este, mi primer gran sueo:
- A mi tutor, el Dr. Francisco Nualart, cuya experiencia cientfica ha sido el alero bajo el cual me he formado durante todos estos aos.
- A la Prof. Karin Reinicke, por su constante apoyo, crtica cientfica y organizacin del laboratorio.
- A los miembros del Departamento de Histologa y Embriologa, por permitir el desarrollo de mi trabajo en un ambiente cmodo y agradable.
- A CONICYT, por confiar en m y brindarme apoyo econmico.
- Al Dr. Juan Carlos Vera, por su apoyo y sabios consejos.
- A la Sra. Mara de la Luz, por compartir su gran experiencia tcnica conmigo.
- A mi amigo Emilio, con quien compart gratos momentos de mi vida.
- A mis compaeras de laboratorio: Mnica, Esther, Carolina, Sofia, Mara de los Angeles y Maite, quienes con su sincera amistad, hicieron ms grata mi estada en esta ciudad.
- Al Dr. David Golde, por el apoyo brindado fruto de la colaboracin entre ambos laboratorios.
- A Viviana y Rosita, por su apoyo incondicional.
- A mi amigo Juan Carlos Tapia, por su chispeante y grata amistad.
A todos quienes me apoyaron, escucharon y soportaron durante todo este tiempo.
A todos ellos... Muchas Gracias.
Esta Tesis de Grado ha sido financiada por los Proyectos de la Direccin de Investigacin de la Universidad de Concepcin DIUC 96035001-1 y 98035001. En forma adicional, parcialmente financiada por el Proyecto FONDECYT 1980130.
A mis padres, Samuel y Nidia A mis hermanos, Karina, David y Germn
A mi amiga y compaera, Vivi
AlrmaPezoC. Q.E.P.D.
INDICE GENERAL
Pginas
Indicegeneral. . ...................................................................... ... ......... 1
Indicede figuras ................................................... . ............................. V
Indicede tablas ................... . ... . .......................................................... VIII
Abreviaturas............................................................. . ..... . ..... . ...... . ... IX
RESUMEN.................. ... ................................................. .. ............... X
SUMMARY............... . ................. . .............................................. ..... XII
1. INTRODUCCION ......... ... ...................... ...................................
1.1 Aspectos generales. ............................................................... . .. 1
1.2 Sistemas transportadores de glucosa...............................................3
1.2.1 Co-transportadores Na/glucosa .................................................... 3
1.2.2 Transportadores facilitativos: estructura molecular..............................3
1.2.3 Transportadores facilitativos: distribucin y propiedades .............. . ...... 6
1.2.3.1 GLUTI/isoforma del eritrocito.....................................................6
1.2.3.2 GLUT2/isoforma heptica ...................... . ................................... 6
1.2.3.3 GLUT3/isoforma cerebral.. . ......... . ............................................... 7
1.2.3.4 GLUT4/isoforma adiposo-muscular ................ . ............................... 7
1.2.3.5 GLUT5/isoforma del intestino delgado ........... . ............................... .. 7
1.3 Generalidades sobre neoplasia...................................................... 9
1.3.1 Cambios proliferativos ........................... . ........... .. ...... . ............... 10
1.3.2 Alteraciones de la apoptosis ... . .................................. . .................. 11
1.3.3 Alteraciones metablicas ............. . ....... . ... . .............. . .................... 13
1.4 Aspectos generales sobre el cncer de mama ... . ................................... 15
1.5 Expresin de GLUTs en cncer de mama..... ................. . .................. .. 17
1.6 Hiptesis de trabajo 19
1.7 Objetivos ..... . ...... . ................... . ............. . ............. . ........... . ....... 20
2. MATERIALES Y METODOS ........................... ... .... . .................. 21
2.1 Materiales biolgicos ......................................... . .................. .... 21
2.1.1 Anticuerpos ............ . ................................................ . .... ... ...... 21
2.1.2 Tumores de archivo y tejidos normales .... . ..... . .......................... . ...... 21
2.1.3 Clulas en cultivo ............................... . .......... . .......................... 21
2.1.4 Aislamiento de membranas de eritrocitos ..................... ... .................. 21
2.2 Mtodos .................................... ........... . ......................... . ..... 23
2.2.1 Procesamiento de muestras ............................. . ............................ 23
2.2.1.1 Fijacin ............................ . ........................ . ........................... 23
2.2.1.2 Deshidratacin y aclaramiento ... . ................................... .. ... . ......... 23
2.2.1.3 Inclusin............................................................................... 23
2.2.1.4 Obtencin y montaje de los cortes. ............ . ................................... 23
2.2.2 Pretratamiento de las muestras ..... . ............ .................................... 24
2.2.2.1 Desparafinacin y rehidratacin de los cortes.................................... 24
2.2.2.2 Inhibicin de peroxidasa endgena.................................................. 24
2.2.2.3 Exposicin a microondas ............................................................. 24
2.2.2.4 Digestin con proteinasa K.......................................................... 24
2.2.3 Mtodos morfolgicos ...... . ...................................... .................. 24
2.2.3.1 Inmunolocalizacin ........... . ... . ........... . ............................. . .......... 24
2.2.3.1.1 Mtodos PAP ................. . ........................................................ 25
2.2.3.1.2 Mtodos de segundo anticuerpo marcado ........................... . .... ....... ... 25
2.2.3.1.3 Mtodo de avidina-biotina .................................................... ........ 25
2.2.3.2 Inmunolocal izacin ultraestructural ........ . . ...................... ... .............. 26
2.2.4 Mtodos de biologa molecular. . .................................. . .................. 26
II
2.2.4.1 Marcaje de sondas 26
2.2.4.2 Obtencin de sondas de RNA por transcripcin in vitro ................... . .... 26
2.2.4.3 Hibridacin insitu ................................. ... ... ... ........................... 27
2.2.4.4 RT-PCR in situ ........ . .......................................................... . ..... 28
2.2.4.5 Inmunodeteccin de protenas inmobilizadas en
membranas de nitrocelulosa despus de la electroforesis........................28
2.2.4.5.1 Electroforesis ..................... .. ................................................... 29
2.2.4.5.2 Electrotransferencia ................................... . ... ... .... . .................... 29
2.2.4.5.3 Inmunodeteccin de protenas.......................................................29
2.2.4.6 Determinacin de apoptosis mediante la tcnica de TUNEL ................. .. 30
3. RESULTADOS .... . ............. . ........................ . .... . .......... . ........... 31
3.1 1 PARTE: estandarizacin y anlisis de expresin de GLUTs
en tumores humanos .................................... ... ........................... 31
3.1.1 Anlisis de la especificidad de los anticuerpos hechos contra GLUTs.........31
3.1.2 Estandarizacin de diferentes mtodos inmunocitoqumicos
y clasificacin de su reactividad....................................................34
3.1.3 Expresin de GLUT 1 en diferentes tumores humanos...........................38
3.1.4 Anlisis de otras isoformas de GLUT (GLUT2-GLUT5) en
diferentes tumores humanos ................................................... ......41
3.2 II PARTE: anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en
cncerde mama........................................................................44
3.2.1 Anlisis de expresin del RNA mensajero para GLUT1 y GLUT5
en mama normal y tumoral .................................... . ...... . ............... 47
3.2.2 Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de las isoformas
GLUT1 y GLUT5 a nivel de microscopia ptica y electrnica................50
ifi
3.2.3 Anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en clulas de cncer
de mama en cultivo (MDA-468 y MCF-7) ....................................... ..58
3.3 III PARTE: Anlisis preliminares de la correlacin entre la
expresin de GLUTI, grado de diferenciacin del tumor,
proliferacin celular y apoptosis ................................................. . .............. . ... 62
3.3.1
Correlacin de la expresin de GLUT1 con el grado de diferenciacin
del tumor y marcadores de proliferacin celular en carcinoma
demama.. ........ ...................................................................................... 62
3.3.2 Correlacin de la expresin de GLUT1 con el ndice de muerte
celular programada en carcinoma de mama ..................................... . .... 64
3.3.3 Correlacin de la expresin de GLUT1 con el ndice de muerte celular
programada en tumores inducidos en ratones "nude".. .. . .... ... .................. 65
4. DISCUSION ......... ... ........................................... . ...................... 73
4.1 1 PARTE: estandarizacin y anlisis de expresin de GLUTs
en tumores humanos............ .......................................................... 73
4.2 II PARTE: anlisis de la expresin de GLUT1 y GLUT5 en
cncer de mama... ........................................................................ 77
4.3 III PARTE: Anlisis preliminares de la correlacin entre la
expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular y apoptosis........82
5. CONCLUSIONES ...................................................... ... .............. 87
6. BIBLIOGRAFIA... ....................................................... . ........... ... 89
My
INDICE DE FIGURAS
Pgina
Figura 1. Modelo propuesto para la orientacin del transportador
facilitativo de glucosa (GLUT1) en la membrana plasmtica................................. 5
Figura 2. Control de la especificidad de anticuerpos que reconocen
transportadores de glucosa ............................................. . ...... . ....... . .......... 33
Figura 3. Mtodos inmunocitoqumicos para la deteccin del
transportador de glucosa GLUT1 ...............................................................36
Figura 4. Criterios de clasificacin de la reaccin inmunocitoqumica.....................37
Figura S. Tumores malignos con elevada expresin de GLUT1... ......................... 40
Figura 6. Tumores malignos con dbil o moderada expresin de GLUTI...............43
Figura 7. Anlisis de la localizacin de GLUT2, GLUT3 y GLUT5 en tumores
malignos.............................. ... ........................................... ... ............. 46
Figura 8. Anlisis de la especificidad de los partidores, mediante RT-PCR
iii vitro.... ...................... ............................................. . .... . ................ 49
Figura 9. Anlisis de RT-PCR in situ para la deteccin del mensajero
de GLUT1 en tejido mamario normal y tumoral.. ................................... . ... . ... 51
Figura 10. Anlisis de RT-PCR in sita para la deteccin del mensajero
de GLUT5 en tejido mamario normal y tumoral ...... . ...................................... 52
kTA
Figura 11. Deteccin inmunocitoqumica de GLUT 1 en tejido mamario
normaly tumoral .......... . ................................... ................................... 55
Figura 12. Anlisis de expresin a nivel ultraestructural de GLUT1 en cncer
demama................ ...................................................... . ..................... 57
Figura 13. Deteccin inmunocitoqumica de GLUT5 en tejido mamario
normaly tumoral ... ... ...................... ........................................ . .... .......... 59
Figura 14. Anlisis de expresin a nivel ultraestructural de GLUT5 en cncer
demama............................ . .............. . .......................... . ........ .............. 60
Figura 15. Expresin de GLUTs en la lnea celular de cncer de mama
MDA-468 .......... . .......................................................... .. ... . ................ 61
Figura 16. Expresin de GLUTI y PCNA en cncer de mama con diferentes
grados de diferenciacin ...... ... .................................................................. 67
Figura 17. Anlisis comparativo del ndice de muerte celular programada
en tumores de mama con diferentes grados de diferenciacin histopatolgica.............68
Figura 18. Anlisis ultraestructural de tumores inducidos en ratones "nude .............. 69
Figura 19. Anlisis de muerte celular programada y expresin de p53
Entumores "nude ............................... . ... . .......................................... . ... 70
Figura 20. Anlisis inmunocitoqumico de la expresin de GLUTI,
GLUT2 y GLUT5 en tumor inducido en ratones "nude ............... . .......... . ........... 72
Figura 21. Esquema integrativo de la relacin entre carcinomas mamarios
de diferentes grados de diferenciacin con el grado de apoptosis, proliferacin
y expresin del transportador de glucosa 1..........................................................86
VII
INDICE DE TABLAS
Pgina
Tabla 1. Comparacin entre los tipos de muerte celular, apoptosis
y necrosis, desde el punto de vista morfolgico y bioqumico.... . ........................... 12
Tabla 2. Panormica de los tipos histolgicos tumorales segun
la clasificacin de la organizacin mundial de la salud...........................................16
Tabla 3. Anticuerpos y complejos enzirnticos utilizados en los
mtodos de inmunodeteccin in situ e in vitro ..................... ................................ 22
Tabla 4. Expresin de GLUT1 en tejidos normales y tumorales
(j)rimera parte) ...... ... ............................................. . ................................. 39
Tabla 5. Expresin de GLUT1 en tejidos normales y tumorales
(segunda parte) ............... ............ . ............. . .......................... . ................... 42
Tabla 6. Expresin de GLUT2-GLUT5 en tejidos normales y tumorales.................... 45
Tabla 7. Niveles de expresin de GLUTI en Carcinoma Ductal
Invasor con diferentes grados de diferenciacin..... ......... . ................... . ................. 63
Tabla 8. Niveles de expresin de PCNA e ndice de apoptosis en Carcinoma Ductal Invasor con diferentes grados de diferenciacin..............................66
Vm
ABREVIATURAS
ABC complejo avidina-biotina-peroxidasa AEC 3-amino-9-etilcarbasole AP fosfatasa alcalina ATP trifosfato de adenosina BC IP bromo-cloro-indol ii-fosfato BSA albmina de suero de bovino CDI carcinoma ductal invasor de mama DAB 3,3-diaminobencidina DEPC dietilpirocarbonato DTT ditiotreitol dUTP trifosfato de deoxiuridina EDTA etilendiamintetraacetato FITC isotiocianato de fluoresceina GLUT transportador facilitativo de glucosa IgG inmunogiobulina G Km constante de M ichael is-Menten NBT azul de nitrotetrasolio PA P complejo peroxidasa anti-peroxidasa PBS tampn fosfato salino PCNA antgeno nuclear de proliferacin celular PEG polietilen glicol POD peroxidasa SBR clasificacin Scar-Blom-Richardsoon SDS dodecil sulfato de sodio SGLT transportador de Na7glucosa SSC tampn citrato de sodio standart TdT transferasa deoxinucleotidil terminal TEMED N,N,Nt,N'-tetrametiletilendiamina TUNEL terminal; dUTP; nick; end; labeling
RESUMEN
La glucosa es incorporada a las clulas por medio de los transportadores facilitativos
de hexosas (GLUT), de los cuales se han descrito 5 isoformas (GLUT1-5). Las clulas
tumorales poseen un metabolismo de glucosa incrementado, lo que ha sido asociado a una
elevada expresin de GLUT1, y en algunos casos, de otras isoformas de GLUTs. Hasta el
momento, no se ha establecido claramente qu isoformas de GLUTs se encuentran presentes
en los distintos tipos tumorales, y menos an, si la sobre-expresin de GLUT1 y/o de otras
isoformas constituye una propiedad general de los tumores o se relaciona especialmente con
neoplasias de mayor agresividad. En este trabajo llevamos a cabo un anlisis detallado de la
expresin de diferentes isoformas de transportadores de glucosa en diversos tumores de
origen humano. Como una primera etapa, estandarizamos diferentes protocolos de
inmunocitoqumica para el anlisis de muestras frescas y de archivo, adems de las
condiciones de uso de los anticuerpos policlonales preparados contra cada isoforma de
GLUT. Posteriormente, analizamos mediante inmunocitoqumica, la expresin de GLUTs en
una serie de 110 muestras de tumores humanos, incluyendo 31 muestras de tumores de
mama. En este tipo tumoral, estudiamos la expresin de GLUT1 y GLUT5 a nivel de
microscopa ptica y electrnica, as como tambin a nivel de ARN mensajero, mediante RT-
PCR iii situ. Adems, intentamos correlacionar la expresin de GLUT1 con parmetros
biolgicos determinantes de agresividad tumoral, como la expresin de marcadores de
proliferacin celular (PCNA y Ki-67) y los ndices de apoptosis. Por ltimo, analizamos la
expresin de GLUT1 y GLUT5 en la lnea celular MDA-468 la que ha sido ampliamente
utilizada para modelar el comportamiento de clulas de cncer mamario in vitro, y en un
modelo biolgico de cncer de mama inducido en ratones "nude". Se encontr una relacin
directa entre la sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias y la expresin de otras
isoformas de transportadores de glucosa (GLUT2-GLUT5); los tumores que no expresan
GLUT1 tampoco sobre-expresan otras isoformas. En cncer de mama, los anlisis de RT-
PCR in situ mostraron una sobre-expresin del mensajero para GLUTI y GLUT5 con
respecto al tejido normal. GLUT1 se estudi realizando inmunocitoqumica a nivel ptico y
electrnico, observandose una localizacin preferencial en membranas plasmticas que
forman estructuras semejantes a "canaliculos intercelulares". Esta adaptacin indicara que la
clula tumoral realiza un "sorting" diferencial de GLUTI a regiones particulares de la
membrana de la clula tumoral. GLUT5 en cambio se localiz a nivel citoplasmtico y
especificamente en estructuras de tipo vesicular. Los estudios en clulas MDA-468 en
cultivo confirmaron los resultados obtenidos in vivo, observndose en este caso un "sorting"
diferencial de GLUT1 a regiones de membrana que contactan clulas adyacentes. La
x
expresin de GLUTI no se relacion directamente con el grado de diferenciacin de los
tumores de mama, siendo los tumores de indiferenciacin intermedia los que mostraron la
mayor expresin. Tampoco se observ una relacin directa con el grado de proliferacin ni
con el ndice de apoptosis. Tumores inducidos en ratones "nude" mostraron caractersticas de
indiferenciacin intermedia y el anlisis de expresin de GLUT1 revel un comportamiento
similar al de los tumores in situ. La sobre-expresin de los transportadores GLUT1 y
GLUT5 en las clulas tumorales de mama permitira que estas clulas puedan metabolizar
glucosa y fructosa. La sobre-expresin y el "sorting" diferencial de GLUT1 no parecen ser
una propiedad general de los tumores de mama sino que corespondera a una caracterstica
que se observa fundamentalmente en tumores de grado de indiferenciacin intermedia con la
formacin de brotes slidos. De esta forma la alta expresin de GLUT1 en cncer de mama
estara asociado al tipo de crecimiento e invasin de las clulas tumorales y no directamente
relacionado con el grado de indiferenciacin de las clulas.
xl
SUMMARY
Facilitative glucose transporters are a family of transmembrane proteins that mediate the
transport of glucose across cellular membranes and include five isoforms,
GLUT 1 /erythrocyte, GLUT2/liver, GLUT3/brain, GLUT4/muscle-fat, and GLUT5/sma!1
intestine. Tumor celis show increased uptake of glucose compared to normal celis, due to
enhanced metabolic needs and aerobic glycolysis. Although it has been established that the
increased uptake of glucose in sorne human malignant tumors is related to the over-
expression of glucose transporters, no detailed study of the simultaneous expression of
distinct transporter isoforms in different tumors has been presented. Moreover, no
ultrastructural analysis of glucose transporter expression in tumors is available. In this
work, we standarized a number of imrnunocytochemical methods to study the expression of
glucose transporters in human samples. We analyzed the expression of different GLUTs
isoforms in 110 human tumor samples and additionally performed a detailed analysis of
GLUT1 and GLUT5 expression in malignan breast tumors at the optical and ultrastructural
levels. The expression of GLUT1 and GLUT5 mRNAs was confirmed by iii situ reverse
transcription coupled to a polymerase chain reaction (in situ RT-PCR). We also studied the
presence of different GLUTs in breast cancer ccli unes MDA-468 and MCF-7. GLUT1
expression was correlated with markers of cellular proliferation (PCNA) and apoptosis in
breast tumors during several stages of differentiation. The analysis of human breast tumors
was compared with tumors xenografted in nude mice injected with MDA-468 cells.
Immunocytochemical analysis revealed low to undetectable !eve!s of GLUTI
immunoreactivity in normal cells, with a clear increase in immunoreactivity in the tumor
cells. Wc observed a positive correlation between GLUT1 expression and the presence of
other GLUTs isoforms in the same tumors. Thus, the tumors that showed a low level of
GLUT1 expression did not show expression of glucose transporter isoforms. In breast
tumors, GLUTI immunoreactivity was localized in the celi periphery in 22% of the tumors.
GLUT 1 was preferentially localized in lateral membrane domains involved in ccli to ccli
contact between adjacent tumor cells, and was less evident in membranes in contact with
connective tissue. A similar GLUTI subcellular localization was observed in MCF-7 and
MDA-468 ce!ls grown in vitro, suggesting that it represents an intrinsic property of the
tumor ce!is that is maintained in the tumor celi unes. Ultrastructural analysis revealed the
presence of GLUT1 in specia!ized ceil membrane areas of adjacent ce!ls maintained in close
opposition by junctiona! complexes. We observed increased GLUT5 immunoreactivity iii
breast tumor cells as compared to normal tissue, and the expression of GLUT5 mRNA was
confirmed by in situ RT-PCR. Ultrastructural analysis revealed GLUT5 immunoreactive
MI
material associated to intracellular vesicle-like structures, but no immunoreaction was
associated to the plasma membranes. The increased expression and membrane localization
of GLUT 1 are consistent with the idea that this transporter is important in the uptake of
glucose by breast tumor celis. Thus, the preferential subcellular distribution of GLUT 1 at
lateral membrane domains may represent a physiological specialization of breast tumor celis
linked to their enhanced glucose metabolism suggesting that GLUT1 is subjected to a
differential sorting in these celis. On the other hand, the cytoplasmic localization of GLUT5
suggests that it may be involved not only in the uptake of extracellular fructose, but may
also participate in subcellular transport. Finally, we did not find a relationship between
GLUT1 expression and the differentiation grade of the breast tumor. The increased
expression of GLUT 1 and the differential sorting of the molecule to cellular membranes
involved in the formation of "canalicular-Iike" structures were especially evident in tumors
with solid celi masses where the celis do not have direct contact with the connective tissue.
Therefore, elevated expression of GLUTI in breast tumors is mainly associated to the
growth rate and malignancy of tumor celis within the connective tissue, and not directily
with the differentiation grade of the tumor.
1. INTRODUCCION
1.1 Aspectos generales.
Los carbohidratos estn ampliamente distribuidos en vegetales y animales, donde
desempean funciones estructurales y metablicas muy vanadas. Glucosa, el carbohidrato
ms abundante, corresponde a una molcula altamente hidrofilica, y es considerada como el
principal combustible metablico requerido por las clulas para la produccin oxidativa y no
oxidativa de ATP (Lienhard y cols,, 1992; Mueckler, 1994; Mueckler, 1995).
En los mamferos, la absorcin de glucosa y otros monosacridos, se realiza en el
intestino delgado (Ferraris y Diamond, 1989), siendo la glucosa almacenada principalmente
en el hgado, msculos y tejido adiposo. Su concentracin a nivel sanguneo est regulada en
todo momento, por factores como la ingestin diaria y el balance homeosttico realizado por
hormonas secretadas en las clulas A y B del pncreas, entre otras.
La gliclisis es la principal va metablica para la utilizacin de glucosa, y se lleva a
cabo en todas las clulas en algn momento de su desarrollo. Es una va nica, ya que puede
utilizar oxgeno si est disponible (aerbica) o puede proseguir sin l (anaerbica). En
condiciones anaerbicas, la gliclisis prosigue hasta la formacin y acumulacin de lactato,
con produccin de 2 moles de ATP por molcula de glucosa hidrolizada. Sin embargo,
cuando se introduce el oxgeno, no hay acumulacin de lactato y el piruvato se convierte en
el principal producto final. Este ltimo no se acumula, debido a que prosigue a travs de la
va de la piruvato dehidrogenasa, hasta el ciclo de los cidos tricarboxlicos, en donde se lleva
a cabo el catabolismo de los residuos acetilos, en forma de acetil-coA, producidos a partir
del piruvato. En este proceso se liberan equivalentes de hidrgeno, los que al ser
introducidos a la fosforilacin oxidativa, permiten aumentar considerablemente la
produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (36 moles de ATP/mol de glucosa).
De este modo, la presencia y utilizacin de oxgeno por la clula, permite optimizar en gran
medida la produccin de energa a partir de la metabolizacin de esta hexosa.
Gliclisis no slo es la va principal para el metabolismo de glucosa, si no que
tambin, proporciona una ruta importante para metabolizar fructosa y galactosa
procedentes de los alimentos. Sin embargo, poco se conoce sobre los procesos que median la
incorporacin y metabolismo de estos monosacridos, los cuales son utilizados por un
reducido nmero de tejidos en el organismo humano.
Todos los procesos relacionados, tanto con la regulacin de la concentracin
sangunea de glucosa, as como su metabolismo celular, presentan como requisito principal,
que esta molcula sea incorporada a las clulas, para lo cual, debe atravesar la membrana
plasmtica. No obstante, la glucosa es una molcula altamente hidrofilica, por lo que no tiene
la capacidad de atravesar la membrana plasmtica por si sola, lo que hace necesario la
presencia de sistemas especiales que puedan hacer factible este proceso.
La capacidad para transportar glucosa a travs de la membrana plasmtica es un
rasgo comn en todas las clulas, desde las bacterias, hasta clulas de mamferos altamente
especializadas como las neuronas. Pese a ser ste, un fenmeno generalizado en los diversos
tipos celulares, requiere de mecanismos especficos que aseguren un grado de selectividad y
eficiencia adecuados para permitir la vida de la clula.
Se sabe que determinadas sustancias entran o salen de la clula a travs de portadores
o canales especficos que son protenas intrnsecas de la membrana plasmtica. El transporte
a travs de tales portadores o canales recibe el nombre de transporte mediado. Entre los
sistemas de transporte mediado se cuentan los procesos de transporte activo y transporte
facilitado, que tienen varias propiedades en comn, dentro de las cuales, una de las ms
importantes es acelerar notablemente el transporte de molculas, que por su tamao y
liposolubilidad, les sera muy dificil o prcticamente imposible sortear la barrera que impone
la membrana plasmtica. La principal distincin entre estos dos procesos es que el
transporte activo es capaz de bombear una sustancia en contra de un gradiente
electroqumico, esto requiere de energa, por lo que los procesos de transporte activo han de
estar conectados de algn modo con el metabolismo energtico. El transporte facilitado, en
cambio, tiende a equilibrar las sustancias a ambos lados de la membrana, por movimientos a
favor de sus gradientes electroqumicos, por lo tanto, no es dependiente del metabolismo
energtico.
Los sistemas de transporte activo pueden emplear ATP directamente (transporte
activo primario), o estar conectados de manera indirecta al metabolismo, generalmente
impulsados por el gradiente de otra especie molecular (transporte activo secundario), por
ejemplo, el acoplamiento a cationes monovalentes como el sodio (Na) e hidrgeno (H4T).
1.2 Sistemas transportadores de glucosa.
La glucosa se transporta a la clula utilizando sistemas activos y equilibrativos,
segn sea el tipo de protena transportadora que medie el proceso. Hasta el momento se
conocen dos grandes sistemas para el transporte de glucosa en clulas de mamferos: Los co-
transportadores Na/Glucosa (SGLTs), expresados principalmente en la membrana apical de
las clulas epiteliales del intestino delgado y rin (tbulo contorneado proximal), y la
familia de transportadores facilitativos de hexosas (GLUTs) expresados en la gran mayora
de los tejidos.
1.2.1 Co-transportadores Na+/Glucosa.
Los co-transportadores Na+/Glucosa, tienen la particularidad de transportar esta
hexosa en contra de un gradiente de concentracin, aprovechando la gradiente del sodio. Este
tipo de proceso se denomina transporte activo secundario o ligado al sodio. Hediger y cols
en 1987, public sus estudios de donacin del transportador Na/glucosa intestinal de
conejo (SGLTI), a lo cual prosiguieron estudios de caracterizacin ms detallados, como la
determinacin de la topologa del transportador y anlisis funcionales mediante estudios
electrofisiolgicos de SGLT1 expresado en oocitos de Xenopus laevis (Hediger y cols.,
1989; Ikeda y cols., 1989; Birnir y cols., 1991; Parent y cols., 1992). Estudios realizados en
vesculas de membranas apicales aisladas de clulas epiteliales de absorcin del rion
humano y de conejo (Turner y Silverman, 1977; Turner y Moran, 1982a; Turner y Moran,
y en tbulos renales de rata perfundidos in vitro (Barfuss y Schafer, 1981),
revelaron la presencia de, al menos, dos isoformas diferentes para el co-transporte de
Na7glucosa, SGLT1 y SGLT2. Estudios realizados por Mackenzie y cols. en 1994,
identificaron otra isoforma de co-transportador Na/glucosa en rin de porcino, la cual
denominaron inicialmente, SAAT-pSGLT2. Posteriormente, You y cols. en 1995,
basndose en el patrn de distribucin tisular, sugiri que SAAT-pSGLT2 podra ser una
nueva isoforma que es expresada, principalmente, en tejidos no renales, la cual denomin
SGLT3.
1.2.2 Transportadores facil itativos: estructura molecular.
Los estudios sobre el transportador de glucosa se remontan a la dcada de los 70,
especficamente a los trabajos realizados por Kasahara y Hinkle (1977) y Sogin y Hinkle
(1978), los que desarrollaron tcnicas de aislamiento del transportador de D-glucosa desde
3
membranas de eritrocitos y realizaron estudios de unin de citocalasina 13, determinando la
accin de molculas tales como floretina, maltosa y D-glucosa sobre la unin. En estos
estudios se pudo determinar que la glucosa inhibe competitivamente la unin de citocalasina
B al transportador en eritrocitos, al igual que maltosa y floretina. Estos trabajos, permitieron
postular adems, que est molcula transportadora alternara su accin entre dos estados de
conformacin, el primero, con el sitio de unin al sustrato orientado hacia el exterior y el
segundo, con el sitio de unin al sustrato orientado hacia el interior de la clula.
Posteriormente, Sogin y Hinkle en el ao 1980, lograron purificar un anticuerpo policlonal
hecho contra una fraccin purificada del transportador de glucosa, el cual fue utilizado para
determinar la migracin de esta molcula en geles de poliacrilamida-SDS, establecindose una
masa molecular de aproximadamente 55 kDa.
En el ao 1985, Mueckler y cols., a partir del carrier purificado desde la lnea celular
de hepatoma (HepG 2), lograron determinar la secuencia aminoacdica del transportador y
proponen un modelo para la estructura bidimensional del mismo, sugiriendo que esta
molcula est inmersa en la membrana a travs de 12 dominios. Pessin & Bell en 1992, a
travs de perfiles hidropticos y determinaciones de estructura secundaria, aport nuevas
evidencias para reafirmar que estos transportadores son altamente hidrofbicos, sugiriendo
que ms del 50% de los aminocidos estn inmersos en la membrana. En el modelo
propuesto por Mueckler para estos transportadores, la protena atraviesa 12 veces la
membrana y sus extremos amino y carboxilo terminal se encuentran orientados hacia el
interior celular. En este ltimo, se presentan secuencias consenso para fosforilacin por
protenas quinasas serinaltreonina, que podran regular la funcin del transportador (Begum
y cols., 1993; Reusch y cols., 1993). Una extensa asa extracelular conecta los segmentos
transmembrana M 1 y M2 y es donde se encuentra un sitio de glicosilacin que se cree es
necesario para el adecuado procesamiento de la protena y podra relacionarse con la afinidad
de esta molcula por su sustrato (Kitagawa y col., 1995; Noto y col., 1997). Otra asa
estructural de gran tamao y orientado hacia el medio intracelular, est presente entre los
segmentos M6 y M7. Los restantes segmentos transmembrana estn conectados por
pequeas secuencias de 7 a 14 aminocidos. A pesar de la similitud estructural, estos
transportadores entre si presentan una gran variabilidad con solo un 39-65% de identidad
aminoacdica. En general, las regiones de mayor diversidad entre las diferentes isoformas se
presentan en los extremos amino y carboxilo terminal y el segmento extracelular entre Ml y
M2. (Ver fig. 1).
4
O1igosacrido
Fig 1. Modelo propuesto para la orientacin del transportador facilitativo de glucosa
(GLUT1) en la membrana plasmtica. En este modelo, las regiones de trans-membrana son
numeradas (Ml-M12) y mostradas como rectngulos. Los dominios amino y carboxilo
terminal se encuentran orientados hacia el citoplasma celular y se postula la presencia de dos
asas de gran tamafio, una orientada hacia el extracelular, entre Ml y M2, en donde se
encuentra un potencial sitio de glicosilacin del transportador y la otra orientado hacia el
intracelular, entre M6 y M7.
5
1 .2.3 Transportadores facilitativos: distribucin y propiedades.
La familia de transportadores facilitativos de glucosa (Simpson y Cushman, 1986;
Carruthers, 1990; Mueckler, 1994), est compuesta de al menos 6 miembros (GLUT1-
GLUT5 y GLUT7), producto de genes distintos. Hasta el momento no existe evidencia que
seale la creacin de variantes adicionales de isoformas producto de "splicing" alternativo
(Pessin & Bell, 1992). Todas las isoformas tienen un patrn de expresin caracterstico,
tanto de localizacin tisular como de nivel de expresin, lo que permite diferenciar a una
isoforma de otra (Mueckler, 1985; Brot-Laroche y cols., 1988; Silverman, 1991; Klip y
cols., 1994). Cada una de estas isoformas ha sido expresada en sistemas heterlogos
(bacterias, oocitos de xenopus y clulas de mamferos cultivadas), lo que ha permitido
examinar independientemente las propiedades bioqumicas de cada una de ellas (Pessin &
BelI, 1992).
1.2.3.1 GLUT1/isoforma del eritrocito: Esta isoforma se encuentra en todos los tejidos y es
muy abundante en eritrocitos, tejidos fetales, clulas endoteliales y en los plexos corodeos.
Tambin fueron encontrados altos niveles de expresin en las clulas endoteliales del
cerebro, sealando que esta molcula es un componente importante de la barrera hemato-
enceflica (Pardridge y cols., 1990). Durante el desarrollo del cerebro fetal humano se ha
localizado GLUT 1 en clulas endoteliales involucradas en barrera en estadios previos a las
10 semanas de desarrollo (Nualart y cois., 1999). Se postula que esta isoforma sera
responsable de la captacin basal de glucosa por parte de la gran mayora de las clulas del
organismo (Mueckler y cois., 1985; Birbaum y cols., 1986; Thorens, 1988). Estudios de las
propiedades cinticas de GLUT 1 de rata y humano, expresados en oocitos de xenopus
laevis, han mostrado una Km de 6.9 mM para 2-deoxy-D-glucosa y 20.1 mM para 3-0-
metilgiucosa en GLUTI de rata, y una Km de 17.2 mM para 3-0- metilglucosa en humanos
(Kayano y cois., 1988; Gould y Lienhard, 1989; Gould y cols., 1991).
1.2.3.2 GLUT2/isoforma heptica: Esta isoforma posee una expresin ms restringida que la
de GLUT 1, encontrndose mayoritariamente en hgado, membranas basolaterales del
epitelio de absorcin del intestino delgado y rin y en clulas 3 del pncreas (Flier y col.,
1987; Thorens y col., 1988). A nivel cerebral se ha localizado en algunos grupos de
astrocitos, neuroblastos del cerebro, clulas de Mller de la retina y en epndimo del
hipotlamo (Vannucci y col, 1997; Nualart y col, 1999, Garca y col, 1999). La distribucin
tisular de GLUT2 sugiere que esta isoforma media la captacin y liberacin de glucosa por
los hepatocitos y que participa en el transporte transepitelial de la glucosa absorbida y
reabsorbida por el intestino delgado y rion, respectivamente. La expresin de GLUT2 en
los islotes pancreticos, puede ser muy importante en la mantencin de los niveles de
glucosa sangunea, actuando conjuntamente con la enzima glucoquinasa para regular el
control de la secrecin de insulina por las clulas B (Heimberg y cols., 1996). Se ha
demostrado que esta isoforma posee un 55% de identidad con la secuencia de GLUT1
humano.
Estudios de expresin in vitro de GLUT2 han demostrado que esta isoforma posee
una Km de 13.2 mM para 2-deoxy-D-glucosa, y de 42.3 mM para 3-0- metilglucosa, las
cuales son significativamente ms altas que las presentadas por las otras isoformas (Gould y
cols., 1991).
1.2.3.3 GLUT3/isoforma cerebral: Kayano y cois. en 1988, usando la estrategia de
hibridacin a baja especificidad con una sonda de cDNA para GLUT1, logr aislar un cDNA
desde una librera de msculo fetal humano, el cual codificaba para una protena de 496
aminocidos, la que tena un 64% y 52% de identidad con GLUTI y GLUT2
respectivamente. A esta protena la denominaron GLUT3. El ARN mensajero para este
transportador est presente en todos los tejidos, pero es expresado mayoritariamente en
rin, placenta y cerebro, considerndose incluso, el transportador de glucosa neuronal
(Kayano y cols., 1988; Nagamatsu y cols., 1993; Haber y cols., 1993). Es considerado
adems, un transportador de elevada afinidad, con un K m de 1.8 y 10.6 mM para 2-deoxy-
D-glucosa y 3-O-metilglucosa, respectivamente (Gould y cols., 1991).
1.2.3.4 GLUT4/isoforma adiposo-muscular: Esta isoforma fue aislada casi simultneamente
por 4 grupos de investigadores, los que trabajando en modelos humanos, de rata y ratn
(Birbaum, 1989; Charron y cols., 1989; Fukomoto y cols., 1989; James y cols., 1989),
lograron aislar un cDNA que codifica para un transportador de glucosa sensible a insulina, al
cual denominaron GLUT4. GLUT4 humano tiene un 65, 54 y 58% de identidad con
GLUT1, GLUT2, y GLUT3 humano, respectivamente. Altos niveles de ARN mensajero
para GLUT4 han sido detectados en tejido adiposo, msculo cardiaco y esqueltico.
(Birnbaum, 1989; Fukomoto y cols., 1989; Kaestner y cols., 1989). Estudios cinticos han
demostrado que su Km para 2-deoxy-D-glucosa es de 4.6 mM.
1.2.3.5 GLUT55soforma del intestino delgado: Uno de los ms recientes miembros de la
familia de genes de transportadores facilitativos de glucosa en ser identificado es GLUT5
(Kayano y col, 1990). GLUT5 humano muestra un 42, 40, 39 y 42% de identidad con
7
GLUT 1-4, respectivamente. Es expresado predominantemente en intestino delgado,
eritrocito, prstata y espermatozoides (Burant y cols., 1992; Davidson y cois., 1992;
Hundal y cols., 1992; Mahraoui y cois., 1992; Rand y cols., 1993; Concha y cois., 1997).
La distribucin subcelular de esta isoforma es an desconocida. De particular inters, es el
hecho de que esta isoforma no transporta glucosa y solo se relaciona con el transporte de
fructosa, que es una molcula utilizada por muy pocos tejidos en el organismo humano y de
la cual se conoce poco sobre su captacin y metabolismo. Estudios cinticos y de
inmunodeteccin, han determinado la expresin de este transportador (GLUT5) en lneas
clulares de cncer de mama (MCF-7 y MDA-468) y en tejidos mamarios tumorales, pero
no en tejidos normales de glndula mamaria, lo que sugiere que el proceso de transformacin
neoplsica de la clula mamaria, podra activar otras rutas metablicas, con el objetivo de
incorporar nuevos sustratos a la clula (Zamora-Len y cols., 1996). No obstante, la
explicacin para la incorporacin de fructosa por la clula neoplsica, se maneja an en un
mbito especulativo.
Otras Isoformas de GLUTs han sido postuladas hasta el momento, es el caso de
GLUT7 el que se encuentra restringido a sistemas de endomembranas (Waddell y cols.,
1992) y se cree, facilitara el transporte de glucosa a travs de los distintos organelos
citoplasmticos, como retculo endoplsmico y aparato de Golgi. GLUT6, se ha
determinado que corresponde a un pseudo-gen (Kayano y cols., 1990).
En relacin a la especificidad de los transportadores, GLUT1, GLUT3 y GLUT4,
son transportadores de glucosa (Gould y Holman, 1993) y de la forma oxidada de la
vitamina C, el cido deshidroascrbico (Vera y cols., 1993; Vera y cols., 1994). GLUT2,
adems de glucosa transporta fructosa y galactosa, pero con baja afinidad (Gould y Holman,
1993), mientras que GLUT5 es un transportador de fructosa de alta afinidad y no
transporta glucosa (Burant y cols., 1992; Gould y Holman, 1993).
Farmacolgicamente, estos transportadores no pueden ser distinguidos por agonistas
y antagonistas especficos, sin embargo, es posible clasificarlos de acuerdo a sus parmetros
cinticos para diferentes sustratos; es as como GLUT3 es de mayor afinidad que GLUTI,
GLUT2 y GLUT4 usando 2-deoxi-D-glucosa y 3-O-metilglucosa como sustrato.
1.3 Generalidades sobre neoplasia.
Una neoplasia es una proliferacin incontrolada de clulas que expresan diversos
grados de fidelidad a sus precursores y cuyo crecimiento excesivo contina an despus de
cesar el estmulo que origin el cambio (Robbins y cols., 1995). Las neoplasias pueden
clasificarse primariamente en dos grandes grupos: neoplasias benignas y malignas. Los
criterios para establecer esta clasificacin, estn basados en variados aspectos de su
comportamiento biolgico, tales como: diferenciacin y anaplasia, tasa de crecimiento,
invasin local e invasin a distancia o metstasis.
Aunque no existe claridad absoluta en cuanto a la etiologa de las neoplasias, existe
consenso en sugerir que una gran parte de ellas, corresponde a una enfermedad de tipo
gentica, dada principalmente por lesiones (mutaciones) de diversa naturaleza, en genes que
regulan los procesos normales de crecimiento, diferenciacin y muerte celular,
transformndose estos, en genes que inducen un aumento descontrolado en el nmero de
clulas, y que han sido denominados comnmente, como oncogenes celulares (c-oncs). No
obstante, existen evidencias para sugerir que algunas neoplasias pudiesen tener un origen
viral, ya que se ha demostrado que ciertos retrovirus introducen, en su clula husped, genes
que promueven la proliferacin celular descontrolada, estos genes alterados han sido
denominados comnmente como oncogenes virales (v-oncs).
La clula normal mantiene un absoluto control de su proliferacin, mediante la accin
conjunta de dos grandes grupos de genes, estos son: los proto-oncogenes y los genes
supresores de tumores. Los proto-oncogenes promueven el crecimiento celular actuando en
variados puntos de las vas de transduccin de seales, estimulando la proliferacin de una
manera regulada. Por otra parte, la clula controla negativamente su crecimiento, mediante la
accin de los genes supresores de tumores, cuyos productos regulan la proliferacin celular
y aseguran la estabilidad del genoma. Hasta el momento, se han identificado un gran nmero
de proto-oncogenes y genes supresores de tumores, y se ha encontrado que muchos de ellos
son blancos de mutaciones involucradas en los eventos de transformacin neoplsica.
Se debe tener presente, que la carcinognesis es un proceso en mltiples pasos tanto
a nivel fenotpico como gentico, es as como el crecimiento excesivo, la invasin local y la
capacidad de formar metstasis, se adquieren paso a paso, un fenmeno denominado
progresin tumoral. A nivel molecular, la progresin tumoral resulta de la acumulacin de
mutaciones genticas en una misma clula. De esta forma, la clula neoplsica expenmenta
diversas alteraciones con respecto a su equivalente normal, como son: a) cambios
proliferativos, b) alteracin en su sobrevida y c) cambios metablicos (Rubin y Farber,
1990; Robbins y cols., 1995).
1 .3.1 Cambios proliferativos: Los tejidos normales controlan su nmero celular, regulando
por un lado, la proliferacin, y por otro, la tasa de recambio. Estos procesos, como se
mencion anteriormente, estn bajo el control de los proto-oncogenes, genes supresores de
tumores y genes que inducen y regulan la muerte celular (apoptosis). Las alteraciones que
pueden experimentar los proto-oncogenes son numerosas y a distintos niveles en las vas de
transduccin de seales, resultando generalmente, en la sobre-estimulacin de la actividad de
estas molculas y por ende en una proliferacin descontrolada y anormal. Por otro lado,
mutaciones en los genes supresores de tumores se traducen por una parte, en una falla de la
inhibicin del ciclo celular en los puntos de restriccin especficos, con lo cual el ciclo
prosigue sin control, aumentando el nmero celular, y por otra, en una falla en el control de
la estabilidad del ADN, con lo cual, las posibles mutaciones no pueden ser reparadas y la
clula aumenta sus probabilidades de una futura transformacin maligna. Uno de los genes
supresores de tumores ms estudiados hasta el momento, ha sido el gen P53, cuyo producto
de expresin tiene como funcin, supervisar la integridad del genoma sirviendo como un
punto de control a nivel de G1IS. Si p53 detecta alguna alteracin en el material gentico,
activa la maquinaria de reparacin del ADN y la secuencia del material gentico es
restaurada. Sin embargo, cuando las alteraciones son demasiado extensas y no pueden ser
reparadas, p53 activa la cascada de proteasas especficas (caspasas) las que conducen a la
muerte de la clula daada, asegurando de esta forma, que estas mutaciones no se transmitan
a las futuras generaciones celulares (Shostak y cois., 1999). Ahora bien, cualquier mutacin
en el gen P53 se traducir en la produccin de una protena alterada, incapaz de cumplir su
funcin adecuadamente, por lo que las probabilidades de desarrollar una neoplasia aumentan
considerablemente, ms an, se ha documentado alta expresin de la protena p53 mutada en
neoplasias malignas de mama y colon (Soong y cols., 1997).
Est bien establecido que el aumento en la proliferacin es un evento comn en la
gran mayora de las neoplasias, siendo considerado adems, como un factor pronstico en
algunos tipos tumorales. La determinacin del estado proliferativo de un tumor, es un
anlisis de rutina en patologa, y se realiza mediante la determinacin inmunohistoqumica de
ciertos marcadores o indicadores de proliferacin, los cuales corresponden a protenas
nucleares, que tienen la particularidad de ser expresadas en clulas que estn en cualquier
10
etapa del ciclo celular, pero que no se expresan en aquellas clulas que estn en estado Go.
Dentro de estos indicadores, los ms conocidos son Ki-67 y el antgeno nuclear de
proliferacin celular (PCNA) (Takasaki y cols., 1981; Veronese y cols., 1993). La deteccin
inmunocitoqumica de estos marcadores permite establecer con bastante claridad el nivel de
proliferacin in situ, que presenta un determinado tumor en un momento dado y de esta
manera poder evaluar su comportamiento y desarrollar terapias adecuadas, considerando el
estado proliferativo real del tumor (Veronese y cols., 1993).
1.3.2 Alteraciones de la apoptosis: La regulacin del nmero celular en los tejidos, se realiza
en parte, por un proceso fisiolgico denominado muerte celular programada o apoptosis.
Este proceso se caracteriza por la expresin de un conjunto de genes activados por diversos
estmulos, los que se traducen en cambios morfolgicos y bioqumicos de la clula. Estos
cambios le dan a la clula apopttica una caracterstica morfolgica muy particular (ver tabla
1). Como se dijo anteriormente, apoptosis es un evento fisiolgico, lo que implica que existe
una homeostasis constante en los tejidos en los cuales se est desarrollando este proceso, a
diferencia de la necrosis, que es un tipo de muerte celular inducida por un proceso de injuria
tisular.
Se ha determinado que la apoptosis se produce por la accin concertada de un
conjunto de proteasas que han sido denominadas caspasas, y cuya activacin desencadena
variados eventos en la clula. Un evento temprano y caracterstico en apoptosis, es la
fragmentacin internucleosomal del ADN celular, lo que ha servido para el desarrollo de
metodologas destinadas a identificar las clulas apoptticas in situ, mediante el uso de una
enzima (TdT), que aade nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del ADN fragmentado,
pudiendo estos nucleotidos ser detectados por mtodos inmunolgicos.
Se ha establecido adems, que el proceso de apoptosis est regulado negativamente
por un conjunto de genes, de los cuales Bcl-2 ha sido uno de los ms analizados hasta el
momento, y cuyo producto de expresin ha sido relacionado con la inhibicin de muerte
celular en modelos biolgicos in vivo e in vitro (Larsen, 1994).
Teniendo en cuenta los antecedentes presentados anteriormente, se puede deducir
que cualquier mutacin en los genes que promueven la apoptosis o en los inhibidores de los
genes represores, produce el bloqueo de los eventos de apoptosis, con el consecuente
aumento en la sobrevida de las clulas del tejido sometido a este tipo de alteracin, lo que
Tabla 1. Comparacin entre los tipos de muerte celular, apoptosis y necrosis, desde el
punto de vista morfolgico y bioqumico.
APOPTOSIS 1 NECROSIS CRITERIOS MORFOLGICOS
Delecin de clulas nicas Muerte de grupos celulares
No hay respuesta inflamatoria Existe respuesta inflamatoria
La membrana no pierde integridad Prdida de integridad de la membrana
Lisosomas intactos Ruptura de lisosomas
Formacin de cuerpos apoptticos Lisis completa de la clula
CRITERIOS BIOQUIMICOS
Inducida por estmulos fisiolgicos No fisiolgica
Requiere de energa No requiere de energa
Transcripcin de nuevos genes No se transcriben nuevos genes
Requiere sintesis de macromolculas Precisa de sintesis de macromolculas
12
sumado a un elevado ndice proliferativo, favorecera notoriamente el desarrollo y
crecimiento tumoral.
1.3.3 Alteraciones metablicas: Entre los cambios metablicos destacan, bsicamente, las
modificaciones en el metabolismo glicoltico, el cual se hace principalmente anaerbico, lo
que conlieva a una menor produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (Robbins
y cols., 1995; Younes y cols., 1996a). Este cambio en la actividad glicoltica celular, persiste
an en presencia de oxgeno; siendo el consumo de oxgeno, notoriamente reducido en estas
clulas. Anlisis tumorales in vitro e in vivo, han demostrado que la captacin y consumo de
glucosa por parte de clulas neoplsicas aumenta en un 300%, con respecto a sus
equivalentes normales, mientras que el consumo de oxigeno disminuye dramticamente.
Estudios de medicin de la actividad de las enzimas del ciclo de Krebs y la fosforilacin
oxidativa han evidenciado una dramtica disminucin, sugiriendo incluso, que algunas de
estas enzimas dejan de funcionar, lo que resulta en una excesiva acumulacin de piruvato y
un aumento notable de la concentracin de lactato en la clula. Ms an, tanto las enzimas
del ciclo de Krebs, como las de la fosforilacin oxidativa estn localizadas en las
mitocondrias, organelos que se encuentran muy disminuidos en la clula tumoral con
respecto a la normal. No obstante, an no se tiene una explicacin satisfactoria del por qu
de esta modificacin en las rutas metablicas de la clula neoplsica. Sin embargo, se postula
que uno de los mecanismos de sobrevivencia de los tumores anaplsicos, es la utilizacin de
rutas metablicas menos complejas, de manera de simplificar al mximo su metabolismo
para poder obtener ventajas comparativas sobre su tejido huesped.
En estas condiciones anaerbicas, la actividad metablica de la clula neoplsica
depende, mayormente, de la captacin de glucosa que del consumo de oxgeno, por lo tanto,
la clula tumoral debe incorporar mayor cantidad de glucosa que las clulas normales para
suplir sus elevadas necesidades metablicas, producto de su intenso y descontrolado estado
proliferativo (Loike y cols., 1992; Robbins y cols., 1995; Younes y cols., 1996).
Considerando lo sealado anteriormente, se ha determinado que algunas neoplasias, al igual
que la mayora de las clulas tumorales en cultivo sobre-expresan transportadores
facilitativos de glucosa (Silverman, 1991; Mueckler, 1994; Younes y cols., 1996a; Haber y
cols., 1998). Esta propiedad de la clula tumoral ha sido utilizada para el desarrollo de
mtodos de diagnstico no invasivos como la tomografia de emisin de positrones (PET), en
la que se utiliza un anlogo de glucosa fluorado (1 8-fluoro-2-deoxy-D-glucosa) que tiene una
13
tasa de incorporacin mayor en las clulas tumorales que en el tejido normal (Nieweg y
cois., 1993), pudindose detectar con bastante certeza, la localizacin y magnitud de una
determinada masa tumoral. Este mtodo se ha utilizado principalmente para el diagnstico y
evaluacin del curso clnico experimentado por los pacientes con neoplasias de esta
naturaleza (Nieweg y cols., 1993b)
Anlisis de expresin realizados por Younes y cols., (1996) y resultados obtenidos
por nuestro grupo de investigacin (Godoy y cols., 1996, Godoy y cols., 1997) permiten
sugerir que GLUT 1 es una isoforma sobre-expresada en diferentes tipos de neoplasias, sin
embargo, no existen anlisis detallados de la expresin de todas las isoformas de GLUTs en
distintos tipos tumorales y, menos an, estudios tendientes a establecer la correlacin entre
expresin de GLUT1, estadios de desarrollo tumoral y aspectos proliferativos y de muerte
celular programada. Con respecto a las otras isoformas de GLUTs, se ha encontrado que
algunas de ellas tienen una expresin restringida a ciertos tipos tumorales (Zamora-Len y
cols., 1996; Younes y cois., 1997a). Yamamoto y cols. (1990), detect altos niveles de
RNAs mensajeros para GLUT3 en cncer de colon, sin embargo, hasta el momento no se ha
podido detectar la expresin de la protena en este tipo tumoral. No obstante, se ha
determinado la expresin de GLUT3 en tumores gstricos, testiculares y de ovario (Younes
y cois., 1997b) Tzukamoto y cols. (1997), trabajando en lneas celulares de retinoblastomas
(WERI-Rbl e Y79), ha detectado la expresin de GLUT1 en ambas lneas celulares y
expresin de GLUT4 en la lnea celular Y79, sugiriendo que ests clulas tumorales en
cultivo poseen diferentes mecanismos para la incorporacin de glucosa.
Si bien, se ha obtenido un marco importante de informacin en relacin a la biologa
de la clula neoplsica, an no existen patrones que permitan predecir con certeza el
comportamiento biolgico que adoptar una determinada neoplasia durante las diferentes
etapas de su evolucin. No obstante, es un hecho que para comprender de mejor manera el
comportamiento de la clula neoplsica, se debe abordar el conocimiento de la biologa
tumoral de una manera ms integral, es decir, considerando variados aspectos que influyen
en su evolucin, como son: aspectos proliferativos, actividad metablica e ndice de muerte
celular programada.
14
1.4 Aspectos generales sobre cncer de mama.
El tumor mamario es una de las causas ms frecuentes de muerte en la mujer a nivel
mundial (Rubin y Farber, 1990; Arraztoa, 1993; Robbins y cols., 1995), con una tasa que
flucta entre 5.8 en pases como Japn y 28.4 en pases como Inglaterra (tasa por 100.000
mujeres). En Chile, no estamos ausentes de estas estadsticas, siendo el cncer de mama, una
de las tres primeras causas de muerte en la mujer.
El cncer de mama, es una enfermedad muy heterognea, tanto desde el punto de
vista clnico, como patolgico. Estudios estadsticos han evidenciado la presencia de
numerosos factores predisponentes para este tipo de enfermedad, sin embargo, anlisis
realizados en tumores mamarios in vitro e inducidos en animales de experimentacin
apuntan a 3 series de influencias que puediesen contribuir mayoritariamente a la gnesis del
cncer de mama, estos son: a) factores genticos, b) desequilibrios hormonales y c) factores
ambientales. No obstante, el mayor nmero de evidencias se ha obtenido en relacin a la
contribucin que realizan los oncogenes y genes supresores de tumores a la gnesis del
cncer de mama, como es el caso del gen supresor de tumores P53, el que se ha establecido
que se encuentra mutado en ms de un 50% de los tumores mamarios, y en un porcentaje no
menos considerable en otros tumores, como por ejemplo, en cncer de colon,
establecindose incluso, como un marcador de malignidad en neoplasias mamarias (Tsuda y
col, 1994; kawazaki y cols., 1997). Sin embargo, ninguno de estos criterios es vlido, por si
solo, para explicar la gnesis de todos los tipos de carcinoma de mama existentes.
Los carcinomas mamarios han sido clasificados, por la Organizacin mundial de la
salud, en dos grandes grupos: No invasores e infiltrantes (ver tabla 2).
En nuestro estudio nos hemos avocado principalmente, al anlisis del carcinoma
ductal invasor (CDI), dado que, de los tumores mamarios malignos, el CDI corresponde al
grupo ms importante, constituyendo un 65 a 80% de todos los carcinomas mamarios
(Robbins y cols., 1995; Rossen, 1996).
El carcinoma ductal invasor forma, invariablemente, un tumor slido. A simple vista,
este carcinoma puede presentar necrosis acompaada usualmente de hemorragia. L.a
apariencia histolgica del carcinoma ductal es muy heterognea, consiste bsicamente de
clulas malignas de revestimiento de los conductos dispuestas en cordones, nidos slidos de
clulas, tbulos, glndulas, masas anastomosadas y mezclas de todos ellos. En muchos
15
Tabla 2. . Panormica de los tipos histolgicos tumorales segn la clasificacin de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
Carcinomas no invasoresa
la. Carcinoma intraductal.
lb. Carcinoma intraductal con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lubulillar ,z situ.
Carcinomas Invasoresa
la. Carcinoma ductal, sin otra especificidad.
lb. Carcinoma ductal infiltrante con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lobulillar infiltrante.
3.- Carcinoma medular.
4.- Carcinoma coloide (mucinoso).
5.- Carcinoma tubular.
6.- Carcinoma adenoide qustico.
7.- Carcinoma apocrino,
8.- Carcinoma papilar infiltrante.
aRbbflS S (1995) Patologa estructural y funcional. Cap 24, P1215.
16
casos pueden verse tambin componentes intraductales. Las clulas malignas invaden el
estroma de tejido conectivo, siendo, frecuentemente fcil, observar invasin de espacios
perivasculares y perineurales, as como de vasos sanguneos y linfticos, lo que sin duda
pone de manifiesto la presencia de clones metastsicos en estas neoplsias.
La graduacin de estos tumores obedece a una estimacin de su diferenciacin, la que
est limitada a la porcin invasiva del tumor. Hasta el momento, esta clasificacin se realiza
segn dos criterios ampliamente establecidos. El primero de ellos evala el grado de atipia
nuclear y el segundo, la diferenciacin histolgica (tabla 2).
La primera clasificacin (atipia nuclear), considera la citologa de los ncleos
tumorales en comparacin con los ncleos de las clulas epiteliales normales, reportndolos
en trminos de tres categoras: Bien diferenciados (grado III), intermedio (grado II) y
pobremente diferenciado (grado 1). La graduacin nuclear no proporciona informacin sobre
el patrn de crecimiento del tumor, por lo tanto, esta clasificacin puede ser aplicada,
indistintamente, a los carcinomas ductales invasores, como a cualquier otro subtipo de
carcinoma mamario (Rossen, 1996). El segundo tipo de clasificacin (histolgica), describe el
patrn de crecimiento microscpico de los CDI, as como tambin, los rasgos citolgicos de
diferenciacin. El grado histolgico es, usualmente, expresado en tres categoras: Bien
diferenciado (grado 1), moderadamente diferenciado (grado II) y pobremente diferenciado
(grado III). Con respecto a este tipo de clasificacin, existen muchas variantes, dentro de las
cuales, una de las ms utilizadas es la propuesta por Scar-Bloom-Richardsoon (SBR). Esta
clasificacin es ampliamente utilizada en los servicios de patologa y es la que se ha
considerado para la evaluacin de las muestras tumorales proporcionadas para nuestro
estudio.
1.5 Expresin de GLUTs en cncer de mama.
El cncer de mama, al igual que la gran mayora de las neoplasias, tiene la
caracterstica de poseer una actividad metablica y de captacin de glucosa elevada (Brown
y Wahl, 1993). Diferentes estudios (Brown y Wahl, 1993; Younes y cols., 1996a; Zamora-
Len y cols., 1996) y resultados obtenidos en nuestro laboratorio (Godoy y cols., 1996;
Castro y Nualart, 1997; Godoy y cols., 1997), evidencian una sobre-expresin de la
isoforma GLUT1 en este tipo tumoral. Referente a la expresin de las otras isoformas,
Brow y Wahl (1993) detectaron GLUT2, GLUT3 y GLUT4 en adenocarcinoma de mama,
no observando expresin de GLUT5. Anlisis posteriores (Zamora-Len y cols., 1996) han
17
propuesto que la clula tumoral de mama tambin expresa GLUT5, y por lo tanto, posee la
capacidad de metabolizar fructosa. Este hecho, como se mencion anteriormente, tiene
particular importancia puesto que se tiene muy poca informacin sobre el metabolismo de
esta hexosa en el organismo humano y adems, se sabe muy poco sobre el metabolismo de
hexosas, diferentes de glucosa, por la clula mamaria tumoral. La expresin de GLUT5 en
cncer de mama sugiere, por tanto, que esta neoplasia tiene la capacidad potencial de
incorporar fructosa, la cual podra ser utilizada como una fuente alternativa para la
obtencin de energa metablica por parte de estas clulas. Este hecho, abre nuevas
posibilidades para una mejor comprensin de las adaptaciones metablicas que pudiesen
realizar las clulas neoplsicas mamarias.
Si bien se han realizado diferentes estudios tendientes a determinar la expresin de
GLUTs en cncer de mama, no existen anlisis detallados de la expresin y distribucin de
GLUTs en cncer de mama a nivel celular y subcelular, como tampoco, estudios que
permitan correlacionar estos hallazgos con parmetros de progresin tumoral, proliferacin
celular y muerte celular programada. Es fundamental realizar estudios que permitan dilucidar
estas interrogantes y que ayuden a comprender en parte, la biologa de la clula tumoral de
una manera ms completa y globalizada, considerando todos los aspectos que determinan el
comportamiento ms o menos agresivo de una determinada neoplasia, para as poder abordar
su tratamiento clnico de manera ms integral. Estos estudios permitirn, adems, avanzar en
la bsqueda de nuevos criterios para la clasificacin de estas neoplasias, basndose no solo
en las caractersticas morfolgicas de la clula, sino que tambin en aspectos moleculares,
propios de la neoplasia. Junto con esto, se abren perspectivas para la aplicacin de nuevas
tcnicas de diagnstico precoz y tratamiento del cncer.
lo
1 .6 Hiptesis de trabajo.
Existe un conjunto de estudios tendientes a establecer la expresin de
transportadores de hexosas en diferentes tipos de neoplasias. Estos anlisis han permitido
observar que algunos tumores expresan altas concentraciones de GLUT 1, sin embargo, no se
han considerado importantes preguntas relacionadas con la localizacin de la expresin de
GLUT1 en estos tumores y su relacin con malignidad tumoral. Anlisis iniciales realizados
en cncer de colon, permiten sugerir que a medida que avanza el tumor y aumenta su
malignidad existe una mayor expresin de GLUT1, sugiriendo que la expresin de esta
isoforma puede ser utilizada como un marcador de malignidad tumoral (Younes y cols.,
1996b) Si bien existen algunos estudios relacionados con la expresin de GLUTI, poco se
conoce sobre la expresin y funcin de otras isoformas de GLUTs en cncer, as como
tambin de la relacin que pudiese existir entre la expresin de las diferentes isoformas de
GLUTs y marcadores de proliferacin celular y apoptosis.
En nuestro estudio, nos hemos propuesto la siguiente hiptesis de trabajo: " La
sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias humanas est directamente relacionada
con el grado de agresividad tumoral. La expresin de otras isoformas de GLUTs es una
propiedad particular de cada tumor, permitiendo a estas neoplasias metabolizar hexosas
diferentes de glucosa, que presentan vas metablicas menos reguladas".
19
1.7 Obtjetivos.
Los objetivos planteados en nuestro estudio, son los siguientes:
Estandarizar diferentes mtodos inmunohistoqumicos y de hibridacin in situ para la
deteccin de GLUTs a nivel de protena y RNA, respectivamente.
2.- Analizar la expresin de transportadores de hexosas GLUTI-5 en diversas neoplasias
humanas y establecer su correlacin con el tejido normal.
3.- Determinar la expresin, a nivel celular, de GLUT1 y GLUT5 en neoplasias de mama
con diferentes grados de desarrollo tumoral.
4.- Determinar la expresin de GLUT1 y GLUT5 en cncer de mama a nivel subcelular
utilizando microscopa electrnica.
5.- Analizar y correlacionar la expresin de marcadores de proliferacin celular Ki-67 y
PCNA con la expresin de GLUT1, en cncer de mama.
6.- Correlacionar el nivel de expresin de indicadores de muerte celular programada con
expresin de GLUT1, en cncer de mama.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1- Materiales biolgicos.
2.1.1 Anticuerpos: Nuestro laboratorio dispone de una completa batera de anticuerpos
primarios para la deteccin de las diferentes isoformas de GLUTs, as como tambin, para
diferentes tipos de marcadores celulares. Poseemos adems, un conjunto de anticuerpos
secundarios conjugados a diferentes enzimas, fluorocromos y partculas de oro, adems de
complejos multienzimticos (PAP) para la deteccin de los anticuerpos secundarios
respectivos (ver tabla 3).
2.1.2 Tumores de archivo y tejidos normales: Para el estudio de neoplasias de diversos
orgenes, se analiz un conjunto de muestras de archivo provenientes de 20 tumores
diferentes. Estas muestras fueron facilitadas por los Servicios de Anatoma Patolgica del
Hospital Regional de Valdivia, Departamento de Patologa de la Universidad de Concepcin
y el Programa de Farmacologa Molecular del Memorial Sloan-Kettenng Cancer Center
(MSKCC), Nueva York, USA. En el caso del cncer de mama, se analizaron 33 muestras de
carcinoma ductal invasor, con diferentes grados de diferenciacin histopatolgica (2
muestras SBR 1, 17 de grado SBR II y 11 de grado SBR III). La totalidad de las muestras de
carcinoma ductal invasor de mama, fueron facilitados por el servicio de Patologa de la
Universidad de Concepcin. Las muestras de 5 tumores de mania inducidas en ratones
"nude" fueron donadas por el MSKCC. Paralelamente, se analizaron tejidos controles,
provenientes de 17 muestras de mama humana normal, donadas por el MSKCC.
2.1.3 Clulas en cultivo: Para los anlisis de expresin in vitro, se utilizaron las lneas
celulares de cncer de mama MDA-468 y MCF-7 (American Type Culture Collection), las
que fueron donadas por el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York. USA. Las
clulas se hicieron crecer en una mezcla de medio Eagle modificado por Dulbecco, el cual
contiene glucosa 17.5 mM y medio F- 12 (1:1 vollvol), suplementado adems con suero
bovino fetal 10% y penicilinalestreptomicina 1%.
2.1.4 Aislamiento de membranas de eritrocitos: Se obtuvo sangre fresca por puncin venosa
y se centrifug a 3000 rpm por 10 min para separar los eritrocitos del resto de los
componentes sanguneos. El sobrenadante se elimin por aspiracin y el "pellet" de
21
Tabla 3. Anticuerpos y complejos enzimticos utilizados en los mtodos de
inmunodeteccin in situ e in vitro.
Nombre Especie Dilucin Marca
- GLUTI conejo 1:1000
- GLUT2 conejo 1:1000
- GLUT3 conejo 1:1000
- GLUT4 conejo 1:1000
- GLUT5 conejo 1:1000
- Antgeno Nuclear de
Proliferacin Celular ratn 1:100 DAKO
- Antgeno Ki-67 humano conejo/ratn 1:500 DAKO
- Protena p53 humana ratn 1:200 DAKO
- Inmunoglobulina de conejo cerdo 1:100 DAKO
- Inmunoglobulina de ratn conejo 1:100 DAKO
-PAP conejo conejo 1:100 DAKO
- PAP ratn ratn 1:50 DAKO
- Digoxigenina-POD oveja 1:500 B. Mannheim
- Digoxigenina-AP oveja 1:500 B. Mannheim
- FITC-AP oveja 1:50 B. Mannheim
- Inmunoglobulina de conejo
biotinilada cerdo 1:400 DAKO
- Inmunoglobulina de ratn
biotinilada conejo 1:200 DAKO
- Inmunoglobulina de conejo-
FITC cerdo 1:30 DAKO
- Inmunoglobulina de conejo-
AP cabra 1:500 SIGMA
- Sistema ABC DAKO
- Inmunoglobulina de conejo-
Partculas de oro cabra 1:50 BBlnternational
22
eritrocitos se lav 3 veces en PBS 150 mM (pH 7.4) para eliminar el resto de plasma.
Luego, los eritrocitos fueron usados en fosfato de sodio 5 mM (pH 7.4) y se centrifug la
muestra a 10.500 rpm por 30 mm. Posteriormente, el "pellet" se lav en fosfato de sodio 10
mM (pH 7.4) 4 a 5 veces y luego se alicuot y almacen a 70C hasta su uso como control
positivo en la metodologa de "immunoblotting".
2.2 Mtodos.
Los mtodos que comprenden, el procesamiento previo y posterior anlisis de las
muestras, son los siguientes:
2.2.1. Procesamiento de las muestras.
2.2.1.1 Fijacin: Las muestras se fijaron por inmersin en formalina acuosa al 10%, durante
un perodo de 24 a 48 hrs, luego de lo cual, se lavaron en agua corriente por 1 hr
aproximadamente. Algunas de las muestras se fijaron por inmersin en solucin Bouin,
durante un perodo de 72 hrs.
2.2.1.2 Deshidratacin y aclaramiento: Previo a la inclusin en parafina, las muestras se
sometieron, indistintamente, a los procesos de deshidratacin y aclaramiento:
- Deshidratacin: Las muestras fueron pasadas por una batera de etanoles a concentraciones
crecientes (etanol 70%, etanol 95%, etanol 100% 1-1V) por 15-20 min cada vez.
- Aclaramiento: Las muestras se pasaron por benzoato de metilo (1411), por 30 min cada
vez, luego de lo cual, se incluyeron en benzol (141) por 5 mm.
2.2.1.3 Inclusin: Una vez sometidas al proceso de aclaracin, las muestras fueron incluidas
en parafina o paraplast a 60C y luego enfriadas rpidamente en agua, para solidificar el
paraplast.
2.2.1.4 Obtencin y montaje de los cortes: De cada muestra, incluida en bloque de paraplast,
se obtuvieron cortes de 7 ptm de espesor con un micrtomo Reichert jung 2040, luego, los
cortes se montaron en porta-objetos cubiertos en poli-L-lisina al 0.1% (Sigma) o gelatina al
1% (BDH), para favorecer la adhesin de la muestra al vidrio, en un bao termorregulado
23
(Lab Line) a 45C. Posteriormente, las muestras se almacenaron en una estufa
termorregulada (ORSA 500) a 37C por 24 hrs y finalmente, se guardaron a temperatura
ambiente.
2.2.2 Pretratamiento de las muestras.
2.2.2.1 Desparafinacin y rehidratacin de los cortes: Las muestras se sometieron a 3
lavados en xilol por 5 min cada uno, luego de lo cual, se rehidrataron en etanol a
concentraciones decrecientes (100%, 96%, 85%, 70% y 50%) por 5 min cada vez.
Posteriormente, se pasaron por agua destilada, y luego se equilibraron en el tampn
apropiado, de acuerdo a la tcnica a utilizar.
2.2.2.2 Inhibicin de peroxidasa endgena: Luego de la deshidratacin en alcohol 50%, se
incubaron las muestras en una solucin de perxido de hidrgeno al 3% en metanol absoluto
(MERCK), por un perodo de 15 min a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron en
agua destilada y posteriormente se equilibraron en tampn Tris-fosfato lO mM pH 7.8.
2.2.2.3 Exposicin a microondas: Para favorecer la inmunodeteccin de los marcadores
nucleares p53 y Ki-67, algunas muestras fueron tratadas en un horno de microonda (600 W)
durante 5 a 7 mm, sumergidas en tampn citrato 0.1 M (pH 6.4).
2.2.2.4 Digestin con proteinasa K: Algunas muestras se incubaron en una solucin de
proteinasa K (DAKO) 1 p.g/ml en PBS 150 mM, por un perodo de 5 min a 37C en estufa
termorregulada. La reaccin se detuvo por dilucin de la enzima en agua destilada estril o
con una solucin de glicina 0,1 M en PBS 150 mM.
2.2.3 Mtodos morfolgicos.
2.2.3.1 Inmunolocalizacin: Se estandarizaron 7 sistemas diferentes para la deteccin de las
distintas isoformas de GLUTs, los cuales pueden subdividirse a su vez, en 3 grandes
grupos: mtodos peroxidasa anti-peroxidas (PAP) (mtodo de PAP revelado con 3,3
diaminobencidina DAB, mtodo PAP amplificado con iones de cobalto, mtodo PAP
revelado con 3-amino-9-etilcarbasol AEC), mtodos de segundo anticuerpo marcado
(mtodo del segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina, mtodo del segundo
anticuerpo conjugado con partculas de oro y mtodo del segundo anticuerpo conjugado con
fluoresceina) y por ltimo, el mtodo de avidina-biotina (ABC). En todos los sistemas
24
utilizados, las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes (tabla
3), durante toda la noche en cmara hmeda a temperatura ambiente.
2.2.3.1.1 Mtodos PAP: Posterior a la incubacin con el anticuerpo primario, las muestras
analizadas por el mtodo de PAP, se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM (pH
7.8) por 10 min cada vez, luego de lo cual, se incubaron con el segundo anticuerpo anti IgG
de ratn o conejo, segn correspondi, durante un periodo de 2 a 4 hrs a temperatura
ambiente. Posteriormente, las muestras se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM
(pH 7.8) por 10 min cada vez y se incubaron con PAP de ratn o conejo, durante 30
minutos a temperatura ambiente. Por ltimo, la reaccin enzimtica fue revelada utilizando
diferentes sustratos:
a) 3,3 diaminobenzidina y perxido de hidrgeno, por 15 minutos (Nualart y Rodrguez,
1996).
b) Complejo "DAB/METAL concentrate" (Pierce) diluido 1: 10 en "buffer sustrato stable
peroxide" (Pierce), durante 3 a 5 mm.
e) PAP-AEC en cambio, se revel con una solucin tampn acetato 0.1 M (pH 5.2), en
presencia de 3-amino-9-etilcarbasol y perxido de hidrgeno al 3%, por 15-20 mm.
2.2.3.1.2 Mtodos de segundo anticuerpo marcado: Posterior a la incubacin del anticuerpo
primario, las muestras fueron incubadas utilizando:
a) Un segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina (tabla 3), por 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. La actividad enzimtica fue revelada con bromo-cloro-
indolil-fosfato (BCIP) y "nitro-blue-tetrazolium" (NBT) en presencia de tampn Tris-HC1
0.1 M (pH 9.5) NaC1 0.1 M, MgC1 2 0.05 M.
b) Un segundo anticuerpo conjugado con partculas de oro (tabla 3), durante 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. Este sistema fue revelado con una solucin de nitrato de
plata (Silver enhancer, SIGMA).
c) Un segundo anticuerpo conjugado a fluorescena (tabla 3) por 3 hrs, protegido de la luz
directa. La imagen fluorescente fue procesada utilizando un sistema de digitalizacin "Axon
Imagin Worbench 2.1" acoplado al microscpio de epifluorescencia.
2.2.3.1.3 Mtodo de avidina-biotina (ABC): El mtodo de deteccin ABC, incorpora el uso
del complejo avidina-biotina (DAKO), un sistema de alta sensibilidad para deteccin de
antgenos. Se utiliz un anticuerpo secundario biotinilado (DAKO) el cual fue incubado por
30 min en cmara hmeda a temperatura ambiente. Luego de lavar las muestras en tampn
Tris-fosfato 10 mM (pH 7.8), se incub con el complejo ABC [A: avidina en PBS (pH 7.2)
25
B: Peroxidasa biotinilada en PBS (pH 7.2) C: Tampn Tris-HC1 0.05 M (pH 7.6)] por 30
min en cmara hmeda. La actividad enzimtica fue revelada como el mtodo de peroxidasa
convencional (revelado DAB normal).
2.2.3.2 Inmunolocalizacin ultraestructural: Cada muestra fue fijada en Karnovsky [tampn
fosfato 0,1 M (pH 7.4), p-formaldehido 4%, glutaraldehido 2.5%], post-fijadas con
tetrxido de osmio al 1% por 1 h a 4 C, e incluida en epon-araldita. Los cortes ultrafinos
fueron contrastados, para su observacin, con acetato de uranilo y citrato de plomo al 1%.
Para inmunocitoqumica, previo a la incubacin con el primer anticuerpo, los cortes
ultrafinos se trataron con perxido de hidrgeno 3% y/y por 5 minutos para eliminar el
osmio. El suero anti-GLUT1 fue diluido 1:500 en Tris-HC1 10 mM (pH 7.4), conteniendo
BSA 1% e incubado por 16 h a 4C. Como segundo antisuero se utiliz anti-IgG de conejo-
oro (jartculas de 10 nm) diluida 1:25 en tampn-Tris-HC1 10 mM sin BSA. La incubacin
se realiz por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, los cortes fueron contrastados con
uranilo y plomo al 1%, cubiertos con una membrana de carbn y observados al microscopio
electrnico.
2.2.4. Mtodos de biologa molecular.
2.2.4.1 Marcaje de sondas: Las sondas oligonucleotdicas utilizadas en la tcnica de
hibridacin in situ con "oligo-probe" fueron diluidas a una concentracin de 2 pg/ml en
tampn Tris-EDTA 10 mM (pH 8.0). Luego, se marcaron con biotina-14-dUTP, utilizando
la enzima TdT (Gibco) por 2 h a 37C (Sambrook y cols., 1989). Esta enzima aade
nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del DNA. Las sondas oligonucleotdicas para
cada transportador corresponden a los ltimos 40 nucletidos de la regin 3' de los RNA
mensajeros respectivos.
GLUT 1: 5 'CACTTGGGAGTCAGCCCCCAGAGGGTGGAAGAGCTCCTA3'
GLUT5: 5 'CTGTTCCGAAGTGACAGGTGGAAGCTCTTTCAGTTCCTCC3'
2.2.4.2 Obtencin de sondas de RNA por transcripcin iii vitro: El proceso de transcripcin
in vitro se realiz a partir del cDNA para GLUT1 y GLUT5 donado en un vector de
expresin plasmidial (pcDNA3). El inserto para GLUTI y GLUT5 se localiz entre los
sitios de restriccin para Kpn y Xho 1 del plasmidio (pcDNA3). El vector de expresin
contiene dos sitios promotores para RNA polimerasas virales SP6 y T7, ubicados a cada
lado del inserto. Para la obtencin de la ribosonda "antisense", el plasmidio pcDNA3 se
lineariz con la enzima de restriccin Kpn 1 y se utiliz la RNA polimerasa SP6 2 U/pi en
presencia de dNTP 1 mM, dUTP-digoxigenina 0.35 mM, tampn lx, inhibidor de RNasa 2
U/pi (kit Boehringer Mannheim). En el caso de la sonda "sense", el plasmidio se lineariz
con Xho y se utiliz la RNA polimerasa T7 2 U/pi, bajo las mismas condiciones de
reaccin. La obtencin de las ribosondas se realiz por el sistema "t-un off', durante 2 hrs a
3 7C, luego de lo cual, se digiri el DNA plasmidial con DNasa 1 libre de RNasa 1 U/tl por
15 min a 37C. Finalmente, la actividad de la DNasa 1 se detuvo con EDTA 0.2 M y las
sondas fueron congeladas a -20C hasta su uso. Para la hibridacin in situ, se utilizaron 2 p.g
de sonda aproximadamente.
2.2.4.3 Hibridacin in situ: Se realiz hibridacin in situ utilizando dos tipos de sondas
diferentes. En primer lugar, se utilizaron sondas oligonucleotdicas de 17 mer, las cuales
fueron marcadas con nucleotidos conjugados a biotina (ver marcaje de sondas), y en segundo
lugar, se utilizaron ribosondas de 2 kb, obtenidas por transcripcin in vitro a partir del
cDNA donado en un vector de expresin plasmidial (ver obtencin de ribosondas).
Las muestras se trataron con proteinasa K por 5 min a 37C, luego de lo cual, se post-
fijaron en p-formaldehido al 4% por 5 min a 4C, y posteriormente, se incubaron en una
solucin de trietano!aminalanhidrido actico 0.1 M (pH 8.0) por 10 min a temperatura
ambiente. Luego, las muestras se incubaron en solucin de prehibridacin del kit Novagen
[Tris-HCI 10 mM (pH 7.5), formamida 50%, NaCI 0.6 M, EDTA 1 mM, heparina 50
.tg/ml, DTT 10 mM, PEG 8000 10%, Solucin Denhardt lx] por 30 min a 37C. Posteriormente, se incubaron en solucin de hibridacin del kit Novagen [Tris-HC1 10 mM
(pH 7.5), formamida 50%, NaC] 0.6 M, EDTA 1 mM, heparina 50 tg/ml, DTT 10 mM,
ADN carrier 0.5 mg/mI, tRNA 0.5 mg/mI, PEG 8000 10%, solucin Denhardt 1X],
conteniendo las sondas respectivas (ver sondas), por toda la noche a 3 7C. Luego de esto,
las muestras se lavaron en tampn citrato salino (SSC) a concentracin decreciente (2x SSC,
lx SSC, 0.5x SSC, y 0.16x SSC) durante 10 min cada vez, para disminuir la unin
inespecifica de las sondas. La deteccin, en el caso de sondas oligonucleotdicas, se realiz
con anti-biotina conjugado con fosfatasa alcalina, el cual se incub por 2 horas a temperatura
ambiente y se revel con bromo-cloro-indolil-fosfato (BCIP) y "nitro-blue-tetrazolium"
(NBT) en tampn Tris-HC1 0.1 M (iH 9.5), NaC1 0.1 M, MgCl 2 0.05 M (Sambrook y col,
1989). Cuando se utilizaron ribosondas marcadas con digoxigenina, las muestras se
incubaron con anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina por 2 horas a temperatura
ambiente en cmara hmeda y revelado de la misma forma que el mtodo anterior.
27
No se consider la utilizacin de hibridacin isotpica, debido al costo del mtodo y la
dificultad en la manipulacin de las muestras e interpretacin de resultados al tratar de
correlacionar la expresin de GLUTs con los parmetros histopatolgicos.
2.2.4.4 RT-PCR in situ: Cortes de 7 pim montados en portaobjetos cubiertos con
aminoalkilsilano (Perkin Elmer), fueron digeridos con proteinasa K (DAKO) 1 jig'ml por 5
min a 37C, lavados en agua-DEPC estril y en etanol absoluto por 1 min cada vez y luego
secados al aire. Posteriormente, las muestras se post-fijaron en p-formaldehido al 4% en
PBS 150 mM por 5 min a 4C, se lavaron dos veces en agua-DEPC estril y una vez en
etanol absoluto por 1 min cada vez, y luego se secaron al aire. Posteriormente, las muestras
se trataron con trietanolaminalanhdrido actico 0.1 M (pH 8.0), por 10 min a temperatura
ambiente, luego de
