Greta O´RourkeMatilde de PaolaYanina LangleLeandro Lammardo

Direccionamiento de mRNAs Aberrantes a los P-Bodies

NMD (Nonsense-Mediated-Decay)

• Degradación del mRNA mediada por PTC (Premature termination codon).

• Es un mecanismo celular de vigilancia que detecta mutaciones de terminación prematura y envia al mRNA a degradación evitando la expresión de proteínas truncadas.

• La maquinaria se compone de un CORE conservado formado por Upf1, Upf2 y Upf3.

P-Bodies (Processing Bodies)

•Se descubrieron como focis citoplasmáticos compuestos de mRNPs.

Están presentes enzimas involucradas en el Decapping (Dcp1p/Dcp2p), activadoras del Decapping (Dhh1p, Pat1p, Lsm1-7p) y la 5´- 3´Exonucleasa Xrm1p.

No hay proteínas involucradas en la traducción del mRNA.

¿Cómo llega un mRNA con un PTC al P-Body?

¿Estará envuelto el mecanismo de NMD en este direccionamiento hacia los P-Bodies?

1. El reconocimiento de un mRNA como nonsense lleva a una represión de la traducción.

2. Las enzimas que catalizan la fase degradativa del NMD se concentran en los P-Bodies.

3. Proteínas envueltas en el NMD en eucariotas superiores como son SMG5, SMG7 y Upf1 se localizan en los P-Bodies.

ANTECEDENTES

¿Upf1p, Upf2p y Upf3p son requeridas para el NMD?

Proteinas de Fusión: Upfs-GFP

Localización subcelular por Microscopía Confocal

Microscopio Confocal: incrementa el contraste de los objetos y así reconstruye mejor imágenes tridimensionales mediante la eliminación de la luz desenfocada o ajena al plano focal.

Las Upfs se distribuyen uniformemente en el citoplasma.

Modelo: las Upfs se separan rápido del mRNA porque éste es degradado.

Si se bloquea el paso catalítico de la degradación, las Upfs deberían acumularse

en los P-Bodies.

Levaduras defectuosas en dcp1Δ, dcp2Δ y xrn1Δ.

Acumulación de las Upfs en foci.

Localización de Upf-GFP y Dcp2p-RFP

Upf-GFP y Dcp2p-RFP colocalizan en el citoplasma de mutantes para la maquinaria de degradación de mRNAs.

El número de P-Bodies y el área promedio de esos P-Bodies aumenta al inhibir el paso catalítico de la degradación de mRNAs para las 3 Upfs.

Conclusión: Al bloquearse el Decapping, las Upfs se acumulan en los P-Bodies.

¿La acumulación de Upfs en los P-Bodies es específica del NMD?

Modelo: Si las Upfs son específicas del NMD no deberían acumularse en los P-Bodies al inhibir la degradación de mRNAs normales.

Mutante solo defectiva en el Decapping de mRNAs normales (Ism1Δ).

Upf1p-GFP no se acumula en los P-Bodies de la mutante Ism1Δ, mientras que sí lo hace en la Dcp2Δ.Resultados similares se ven para Upf2p y Upf3p.

Dhh1p-GFP (activadora del Decapping y degradación 5´- 3´de mRNAs normales se acumula en los P-Bodies de las Ism1Δ, Dcp1Δ y Dcp2Δ.

Conclusión Parcial

La presencia de las Upfs en los P-Bodies se debe a un defecto en el NMD e implica un direccionamiento de PTC-RNAs a los P-Bodies.

OBJETIVO: probar directamente si el NMD dirige los mRNA hacia los P-bodies

ESTRATEGIA: trabajan con ≠ mRNA PGK1 (reporter) que en su región 3´UTR tiene 16 sitios de unión a la proteína U1A. Haciendo proteína quimera

U1A-GFP ( ) veré localización del mensajero!

Sin mRNA

Con mRNA WT

Con mRNA con codón stop prematuro temprano (C22), en codón 22

Con mRNA con codón stop prematuro tardío (C225), en codón 225

fluorescente sin mRNA

Cepa WT

NO acumulación en P-bodies

fluorescente con mRNA WT

fluorescente con mRNA C22 (con codón stop prematuro

temprano)

fluorescente con mRNA C225 (con codón stop prematuro

tardío)

Incremento en la fluorescencia en los P-bodies!

Cuando se ponen los mRNA con codón stop prematuro se ve un aumento de la fluorescencia en los P-bodies.

Nº P-bodies

área P-bodies

Pero…¿Cómo prueban que esos “puntos” fluorescentes son los P-bodies?

Conclusión parcial: mRNA con codones stop prematuros se acumulan en los P-bodies

Fluorescente (verde) con mRNA C22 (con codón

stop prematuro temprano)

Proteína quimera Dcp2p-RFP

(fluorescencia roja)

Dcp2p: enzima de decapping, se sabe

que está en P-b!

Colocalizan!!!!!!!!!

Pero…¿Es esta acumulación de los mRNA con codones stop prematuros (PTC) debida a NMD?

Estrategia: ver cómo se ve afectada la localización de los mRNA con PTC en cepas mutantes para las proteínas requeridas para el NMD (upf 1,2 y 3)

Cepa WT Cepa upf1

Se reduce la acumulación de C22 y C225 (mRNA con PTC) en los P-bodies con respecto a la cepa WT:↓ Nº P-bodies, ↓ área P-bodies

Sugerencia… la proteína upf1 es requerida p/ llevar a los sustratos del NMD a los P-bodies!

Importante… se reduce la acumulación de C22 y C225 (mRNA con PTC) en los P-bodies a pesar de que C22 y C225 están aumentados en la cepa por las

fallas en la degradación por NMD…

Diferente comportamiento en las cepa upf2 y upf3…

Cepa WT Cepa upf2 Cepa upf3Cepa upf1

mRNA C22…

•C22 presenta un aumento de 2 veces en las cepas upf2 y upf3 con respecto a la

upf1.

•upf2 y upf3 no difieren significativamente de la WT

Diferente comportamiento en las cepas upf2 y upf3…

Cepa WT Cepa upf2 Cepa upf3Cepa upf1

mRNA C225…

•C225 presenta un aumento (no significativo) las cepas upf2 y upf3 con respecto a la upf1.

•upf2 y upf3 SI difieren significativamente de la WT (son menores) upf2 y 3 afectarían la

eficiencia con la que C225 es enviado a P-b (ayudarían a reconocer la terminación aberrante)

•Sugieren que C22 podría estar acumulándose más en los P-b debido a su corto marco de

lectura

Conclusión parcial:

El targetting es upf1p dependiente!

Upf1p es una proteína crítica para dirigir los mRNA a los P-bodies, y sugiere que la acción de las upf2 y

3 sería en parte, luego del targetting al P-body.

Pero… ¿ Es suficiente que upf1 dirija los mRNA con PTC para la degradación de los mismos?

NO hay degradación del

mensajero aberrante a tpo

corto

SI hay degradación del

mensajero aberrante a tpo

corto

Rta: NO es suficiente, upf2 y 3 son necesarias para activar la degración del mRNA.

¿Hay subpasos en el proceso NMD?Objetivo: analizar si c/u de las upf actúan antes o después de la formación de

los P-bodiesEstrategia: usan la proteína quimera Dcp2p-GFP (enzima del decapping) para

monitorear la formación de los P-b en las mutantes upf

Las mutantes upf2, upf3 y upf2- upf3 tienen incrementados el nº y el área de los P-b con respecto a la

WT y a cualquiera de las mutantes upf1.

Por el contrario….

Las mutantes upf1, upf1- upf2 y upf1- upf3 muestran patrón similar a la WT (NO acumulación de la

enzima del decapping formando P-b)

•Las mutantes upf2, upf3 y upf2- upf3 tienen incrementados el nº y el área de los P-b con respecto a la WT y a cualquiera de las mutantes upf1.

•Las mutantes upf1, upf1- upf2 y upf1- upf3 upf3 muestran patrón similar a la WT (NO acumulación de la enzima del decapping formando P-b)

Conclusión: la acumulación de P-b en las mutantes upf2 y upf3 es dependiente de upf 1!

Control de que las diferencias no se deban a niveles diferentes de Dcp2p-GFP

La cantidad de proteína fluorescente en las distintas cepas es la misma

Conclusión parcial:

Upf1p funciona río arriba de upf2 y 3 en el NMD.

Dhh1p-GFP

Pat1p-GFP

Nota: Dhh1p and Pat1p son activadores del decapping y funcionan como represores traduccionales y facilitadores de la formación de P bodies General Translational Repression by Activators of mRNA Decapping Cell, Volume 122, Issue 6, Pages 875-886. Coller, R.Parker

Usando otras proteínas que se acumulan en P-bodies…

Dhh1p y Pat1p se acumulan en los P-b de cepas upf2 y upf3 (upf1 normales no alterado el targetting de los mRNA al P-b)

Mecanismo posible….

Cuando upf1 dirige un mRNA a armar el p-body se reclutan un gran numero de enzimas q forman un complejo. Entre ellas:

enzimas del decapping (Dcp1p,/Dcp2p), activadores del decapping (Dhh1p, Pat1p y Lsm1-7p) y la exonucleasa (5´-

3´) Xrn1p.

Resumiendo..

Se observó que Upf1p-GFP se acumula en P–bodies en lineas upf2, upf3 y upf2 upf3. Esto respalda el modelo en que Upf1p funciona río arriba de Upf2p y de Upf3p, y de forma independiente. A su vez, también implica que Upf2p y Upf3p son necesarias para la degradación de mRNAs luego de su targetting a P-bodies.

Una segunda observación fue que Upf2p y Upf3p no se acumulan en P-bodies en líneas upf1. Es consistente con la observación anterior y con el modelo donde Upf1p actúa río arriba de Upf2p y Upf3p.

En tercer lugar, de forma contraria a Upf1p, ni Upf2p ni Upf3p se acumulan en líneas upf3 y upf2, respectivamente. Esto sugiere que la acumulación estable de Upf2p y de Upf3p en P-bodies es interdependiente.

Entonces..

Estos resultados argumentan que Upf1p es requerida para dirigirmRNAs con codones stop prematuros (PTC) a los P-bodies.

En contraste, en líneas que no tienen Upf2p y Upf3p, mRNAs y proteínas asociadas se acumulan en P-bodies,

presumiblemente por la acción de Upf1p, pero no son degradados.

Upf1p tiene un dominio con actividad ATPasa

Actividad requerida para dirigirmRNAs a P-bodies

Una línea con alelo de Upf1pdefectuoso en actividad

ATPasa

Se espera ver que:P-bodies disminuyan su tamaño,ya que los mRNAs no pueden ser

dirigidos a P-bodies.

Actividad requerida para ladegradación de mRNAs

Una línea con alelo de Upf1pdefectuoso en actividad

ATPasa

Se espera ver que:P-bodies aumenten su tamaño,

ya que los mRNAs no pueden serdegradados en P-bodies.

Estrategia: En líneas upf1 expresaron un plásmido de bajo número de copiascon el alelo upf1 wt y por otro lado con un alelo de upf1 defectuoso en actividad ATPasa (DE572AA).

Esto sugiere que la actividad ATPasa de Upf1p no es requerida para dirigirmRNAs a P-bodies, sino que en cambio, podría promover un rearreglo en las

mRNP de los P-bodies que disparen la degradación de mRNAs.

Estrategia: Sobreexpresar el alelo DE572AA en un plásmido de 2 micrones en lineas wt que expresan proteínas fusionadas a GFP: Upf1p, Upf2p, Upf3p, Dhn1p, Pat1p, y Lsm1p.

La acumulación de P-bodies en la línea que sobreexpresa el alelo mutante DE572AAes independiente de Upf2p y de Upf3p.

En contraste a Upf1p, Upf2p-GFP y Upf3p-GFP no localizan en P-bodies en líneas sobreexpresando

Upf1p wt o el alelo mutante DE572AA.

Entonces..

Estas observaciones indican que:

El alelo DE572AA upf1 puede haber perdido su habilidad para reclutar a Upf2p o a Upf3p,

o

Upf2p y Upf3p se asociarían con las mRNPs luego del paso de hidrólisis de ATP.

¿ Upf1p puede dirigir mRNAs normales a P-bodies?

La acumulación de proteínas en P-bodies en la expresión del alelo mutante DE572AA de Upf1p sugiere que en esta línea algunos mRNAs se están

acumulando en P-bodies.

Estrategia: Examinaron la localización de mRNAs normales y nonsenseen una línea upf1 expresando el alelo DE572AA de upf1.

Para visualizar mRNAs reporteros de secuencia completa:

Células wt son transformadas con un plásmido que expresa la proteína de fusiónU1A-GFP.

Plásmido que expresa un mRNA de PGK1 wt con un sitio de unión a U1A. ó Plásmido que expresa un mRNA con una mutación nonsense temprana, en la posición 22, con un sitio de unión a U1A. ó Plásmido que expresa un mRNA con una mutación nonsense tardía, en la posición 225, con un sitio de unión a U1A.

Mutación nonsense

Sitio de unión a U1A

Para ver colocalización las mismas células son transformadas con un plásmido expresando la proteína Dcp2p-RFP con un marcador de TRP.

Estos resultados muestran que la hidrólisis de ATPmediada por Upf1p no es requerida para dirigir mRNAs nonsense

o proteínas asociadas a P-bodies.

Esta observaciónimplica que Upf1p

también puede dirigir mRNAsnormales a P-bodies,

ya sea porque lahidrólisis de ATP es

requerida para su degradación o para ser liberados nuevamente

a la traducción.

¿Qué pasa con la tasa de degradación de mRNAs?

Estrategia: Experimentos de pulse-chase transcripcional, que permiten medir la tasa de decapping y de deadenilación de los mRNA.

La tasaes igual!

Se observa una misma cinética de

degradación.

Esto sugiere que la actividad de hidrólisis de ATP de Upf1p es

aparentemente requerida para liberar al pool de mRNAs normales,

que pueden ser dirigidos a P-bodies por Upf1p,

de nuevo al pool de traducción.

Entonces la actividad de hidrólisis de ATP mediada por Upf1p la actividad de hidrólisis de ATP mediada por Upf1p

no esta involucrada en la degradación de mRNAs.no esta involucrada en la degradación de mRNAs.

Ya que Upf1-p puede dirigir mRNA sin PTC a P-bodies

¿La sobreexpresión de Upf1-p puede afectar la traducción de los mRNA normales?

¿Esta represión de la traducción puede alterar la tasa de crecimiento?

Estrategia: en una línea wt se sobreexpresa upf1-p (vector vacio, wt y DE572AA) mediante un promotor inducible por Galactosa. Luego de 2hs de inducción se observó

P-bodies, polisomas y tasa de crecimiento en cultivo.

El ensayo mostró que la galactosa per se no altera la traducción, tampoco se ve afectado el numero de

P-bodies; permitiendo esto un normal

crecimiento.

En este ensayo puede verse que los polisomas

intervinientes en la traducción, no sufren alteración al inducir la

sobreexpresión de upf1 wt, ya que este permite la

liberación de los mRNAs normales para su reubicación en la

traducción.

Sin embargo esta alteración en la dinámica de los

mRNA normales entre la traducción y el NMD afecta la finalización traducción,

interviniendo en el crecimiento.

Por ultimo, este ensayo deja ver que en el sistema inducido con galactosa, la sobreexpresion de upf1-p

sin actividad ATPasa, produce una reducción de los polisomas formados, muestra también un claro aumento en el numero de

P-bodies. Lo cual, en consecuencia, no permite

un crecimiento normal debido a una marcado cese de la traducción

La actividad ATPasa de Upf1p es requerida para el normal reciclado de los mRNA sin PTC hacia la traducción.

Conclusiones

• El NMD involucra un direccionamiento de los mRNAs con PTC hacia los P-bodies.

• Cuando están bloqueados los pasos nucleolíticos de degradación, los Upfs se localizan en P-bodies y es especifico de NMD.

• Los mRNAs con PTC son direccionados a los P-bodies dependiendo de la actividad de Upf1-p.

• Upf1p actúa río arriba de Upf2p y Upf3p promoviendo la formación de mRNPs en los P-bodies. Esto es interpretado ya que en las lineas Upf2 y Upf3, se produjo la acumulación tanto de Dcp2-p como de los mRNAs reporteros, mostrando ser independiente de tales.

• Upf2p y Upf3p estarían involucrados, al menos en parte, en el subsecuente decapping y degradacion 5´-3´ de los sustratos NMD.

• La función ATPasa de las Upf1p no es requerida para el reconocimiento inicial y direccionamiento de los mRNAs hacia los P-bodies. Esta actividad es quizá necesaria para una segunda tarea, en conjunto con Upf2 y 3, en el gatillado de la degradación de transcriptos con PTC.

• La Upf1p también puede direccionar mRNAs sin PTC a los P-bodies. Esto se puso de manifiesto al encontrar mRNAs reporteros sin PTC en los P-bodies en líneas Upf1p con ATPasa defectiva. También se ve en el cese del crecimiento al sobreexpresar en esta línea.

• La observación implica que el NMD en levaduras requiere al menos de dos pasos de distinción del sustrato, uno fuera de los P-bodies durante la terminación de la traducción; y otro ya en los P-bodies seguido de la hidrólisis de ATP.

SE PROPONE

• Existen dos formas en las que la traducción cesa, una normal (donde el transcripto es traducido en su totalidad) y otra aberrante. Debido a la competencia entre Pat1p y Upf1p

• En la forma aberrante Upf1p es reclutado hacia los complejos de terminación. La presencia de este promueve que se detenga la traducción y se recluten Dcp1p, Dcp2p, Dhh1p, Pat1p y Lsm1p-7p.

• En un paso siguiente la hidrólisis de ATP por parte de Upf1p produce el reclutamiento de Upf2p y Upf3p, gatillando la degradación de mRNA.

• Como el mRNA normal es incapaz de reclutar Upf2p y Upf3p, es liberado para ser nuevamente iniciada su traducción.

• En cambio el mRNA con PTC posee una gran eficiencia en el reclutamiento de Upf2p y Upf3p (aumenta eficiencia de NMD)

• La interacción entre las Upfs en los mRNAs con PTC permite el decapping y degradación del transcripto dentro del P-body.

• Upf2 y 3 pueden estar interactuando con proteínas vinculadas al RNA, como Hrp1p. Estas proteínas de tratarse de un mRNA sin PTC habrían sido corridas por la elongación de los ribosomas en la traducción.

Fin!!!

Muchas Gracias!