GUIA DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS ZIKA CURSO DE ENTRENAMIENTO Instructores y Organizadores: Dr. Amadou A Sall Dr. Carlos Arias Dra. Gamu Fall Dra. Susana López Mr. Moussa Mosie Diagne Mr. Oumar Ndiaye Ms. Arame Ba Instituto Pasteur Dakar Senegal Instituto de Biotecnología UNAM Elaborado por: Dra. Martha Yocupicio, UACM Dra. Victoria Pando, INSP Dra. Rosalía Lira, IMSS Dr. Edgar Sevilla, INER, MIEMBRO INMUNOCANEI, Capacitará a todos los integrantes de la Red Dr. Jesús Torres, ENCB Dr. José Gdp. Rendón, UAS Ciudad de México, Junio 2016
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GUIA DE LABORATORIO PARA EL
DIAGNOSTICO DEL VIRUS ZIKA
CURSO DE ENTRENAMIENTO
Instructores y Organizadores: Dr. Amadou A Sall Dr. Carlos Arias Dra. Gamu Fall Dra. Susana López Mr. Moussa Mosie Diagne Mr. Oumar Ndiaye Ms. Arame Ba Instituto Pasteur Dakar Senegal Instituto de Biotecnología UNAM
Elaborado por:
Dra. Martha Yocupicio, UACM
Dra. Victoria Pando, INSP
Dra. Rosalía Lira, IMSS
Dr. Edgar Sevilla, INER, MIEMBRO INMUNOCANEI, Capacitará a todos los integrantes de
la Red
Dr. Jesús Torres, ENCB
Dr. José Gdp. Rendón, UAS
Ciudad de México, Junio 2016
INDICE
I. Introducción
II. Transmisión
III. Muestras
IV. Recomendaciones de Bioseguridad
V. Métodos diagnósticos
VI. Manual de laboratorio diagnóstico del virus Zika
1. PLATAFORMA DE AISLAMIENTO VIRAL
2. PLATAFORMA DE RT-PCR TIEMPO REAL
3. PLATAFORMA DE ELISA
4. PLATAFORMA DE SERONEUTRALIZACION
5. ANEXOS
Cultivo de células
Cultivo de virus
Ensayo de IFI
Congelación y descongelación de virus
Inoculación en ratones
Soluciones
Aislamiento viral
José G. Rendón
1. Objetivo.- Aislamiento viral en líneas celulares a partir de muestras de suero, órganos o
mosquitos, remarcando 3 pasos:
Preparación de la muestra (inóculo)
Inoculación en células y recuperación de sobrenadantes de cultivo
Detección mediante inmunofluorescencia indirecta (IFA)
2. Materiales.-
Nombre Proveedor Referencia Embazado Almacenami
ento
Reactivos
Anticuerpo
(Penicilina +
Streptomicina
GIBCO 15140-122 Bote 100 ml -20°C
+4°C
Antifúngico
(Anfotericina B)
GIBCO 15290-018 Bote 20 ml -20°C
+4°C después
de abierto TBP (Caldo
Triptosa-Fosfato)
GIBCO 260300 Bote 500 g +4°C
Medio L-15
Leibovitz 15)
GIBCO 011415-049 Bote 500 ml +4°C
Suero Fetal Bovino
(SFB)
GIBCO 10106-169 Bote 500 ml -20°C
+4°C después
de abierto Acetona PROLABO 0060-17-8 Frasco de 1L -20°C
Amortiguador PBS (Solución
amortiguadora de
Fosfatos)
GIBCO 16000-044 Bote 500 ml Temp
ambiente
Material
Biológico
Muestras
(Mosquitos,
sobrenadantes,
sueros)
Tubos
-80°C
Lineas celulares
Vero, AP61 y
C6/36
Monocapa AP61 &
C6/36 28°C
Vero 37°C
Cuadro 1: Reactivos y Soluciones amortiguadoras
Células Vero Celda AP61 (Aedes pseudocutellaris) / Celda
C6-36 (Aedes albopictus)
Mosquito
triturado
L15 + 20% SFB + 1% antibiótico +
0.05% Fungicida
L15 + 20% SFB + 1% antibiótico + 0.05%
Fungicida + 10% TPBROTH
Medio de
cultivo
L15 + 5% FBS + 1% antibiótico
+ 0.05% Fungicida
L1 + 10% SFB + 10% TPB + 1% antibiótico +
0.05% de Fungicida
Medio de
crecimiento
L15 + 5% SFB + 1% antibiótico
+ 0.05% Fungicida
L15 + 10% SFB + 10% TPB + 1% antibiótico
+ 0.05% de Fungicida
Medio de
supervivencia
L15 + 3% SFB + 1% antibiótico
+ 0.05% Fungicida
L15 + 5% SFB + 10% TPB + 1% antibiótico +
0.05% de Fungicida
Agente de
Dispersión
Tripsina EDTA (Gibco BRL 25300-054;
almacenar a -20 ° C y/o + 4 ° C después
de haberlo abierto)
Esparcimiento mecánico usando una
espátula o golpee los bordes de la botella
Cuadro 2: Materiales específicos para el aislamiento viral de la célula
Designación Proveedor Referencia Envase Almacén
Reactivos
Glicerol 3% PROLABO 24-387-292 Envase de
1L
Temperatura
ambiente
Evans Azul (Dilución
1/100)
SIGMA G
2129
Envase
+4°C
Anticuerpos fluorescentes
anti-IgG de Ratón
BIO-RAD
74641
Envase de
2 ml
+4°C
Materiales
Biológicos
Cepas virales (etapa de aislamiento) Tubos
NUNC 1.8
ml
-80°C
Soluciones Solución amortiguadora de Glicerina (2/3 Glicerol + 1/3
PBS 1X esterilizado)
Envase Temperatura
ambiente
Cuadro 3: Materiales específicos para IFA
Consumibles
Frascos de cultivo de células (NUNC o Falcon)
Tubos Eppendorf 1.5 y 2 ml
Tubos NUNC de 4.5 y 1.8 ml
Portaobjetos
Cubre objetos
Tubos de Hemólisis
Raspador de células
Pipeta 10 ml
Pipeta 5 ml
Pipeta 25 ml
Jeringa y Filtro de 0.22 µm
Equipo
Homogeneizador (Trituradora de tejidos ex TissueLyser II) o manual de Triturador
Microscopio invertido
Microscopio de Fluorescencia
Pipeta
Puntas
Cámara húmeda o incubadora de CO2
Centrifugadora
Incubadora 37°C para células Vero
Incubadora 28°C para células AP61
Congelador -80°C y – 20°C
Campana de Extracción
Pistón y cilindros
Raspador
Cronómetro
Secador (secadora de cabello)
Guantes
Mascarilla
Gafas de protección
Bata
Agitador magnético
3. PROTOCOLO
Preparación de las cajas de células: Día 1
Desinfectar la superficie de la campana de extracción antes y después de cada
experimento.
Preparar material de vidrio, reactivos y medios de cultivo.
Etiquetar cada recipiente de cultivo, el tipo de célula usada, fecha y número de pasajes
de células.
Células VERO utilizando cajas T80
- Vaciar el medio de cultivo celular con una pipeta
- Añadir 2 ml de Tripsina EDTA
- Incubar durante 1-2 minutos a temp. Ambiente
- Retirar la Tripsina e incubar la caja a 37°C
- Comprobar el desprendimiento de las células
- Re-suspender las células en 10 ml de medio de crecimiento
- Separar las células por succión y descarga utilizando la pipeta Falcon varias veces
- Distribuir la suspensión en recipientes, ejemplo: por cada recipiente T25 agregar 1 ml de
la suspensión celular en 4 ml de medio de crecimiento
- Incubar los recipientes de células VERO a 37°C
Células AP61/C6-36 utilizando usando cajas T80 ó T175
- Vaciar el medio de cultivo celular con una pipeta
- Utilice un raspador para células y mecánicamente raspar las células adheridas a los bordes
del recipiente
- Resuspender las células con 10 ml de medio de cultivo
- Separar las células por succión y descarga utilizando la pipeta Falcon varias veces
- Distribuir la suspensión en recipientes, ejemplo: por cada recipiente T25 agregar 1 ml de
la suspensión celular en 4 ml de medio de crecimiento
- Incubar los recipientes de células AP61 a 28°C
Tamaño del recipiente 25 cm² 75 cm² 150 cm²
Solución de lavado:
Tripsina EDTA
5 ml
5 ml
10 ml
Tripsina EDTA 2 ml 3 ml 5 ml
Medio de Crecimiento 5 ml 25 ml 50 ml
Cuadro 4: Volumen de los productos para los diferentes tamaños de los recipientes
Tamaño del recipiente 25 cm² 80 cm² 175 cm²
Suspensión de células 5 ml 20 ml 40 ml
Cuadro 5: Volumen de la suspensión celular para diferentes tamaños de los recipientes
Preparación del inóculo de muestras de mosquitos
A. Tritura mosquito manualmente de triturador
Triturar el mosquito en 3 ml de medio de molienda
Transferir el sobrenadante en tubos Eppendorf y centrifugar a 12,000 g durante 20
minutos a 4°C
Filtrar el sobrenadante y almacenar a -80°C hasta su utilización (para el aislamiento
del virus en células/ratón por PCR)
B. Trituradora automática (mosquito + perlas + 2 ml de medio de molienda)
Triturar el mosquito en 2 ml de medio de molienda durante 2 minutos con una
frecuencia de 30 Hz/s
Centrifugar los tubos a 12,000 g durante 20 minutos a 4°C
Filtrar el sobrenadante y almacenar a -80°C hasta su utilización (para el aislamiento
del virus en células/ratón por PCR)
Para las muestras de suero
Diluir las muestras de suero 1/10 usando medio L-15 suplementado con SFB al 10%
utilizando filtro millipore de 0,22 µM
Inoculación Celular: Día 2
Revisar la monocapa en la caja de cultivo utilizando el microscopio invertido
(objetivo 40 X), las células deben ser confluentes (80% de confluencia)
Retirar el medio de crecimiento con una pipeta estéril
A continuación las células se infectarán con los preparados, ejemplos:
Virus de mosquitos: 200 µl / recipiente
Virus de suero: 500 µl de suero diluido en 1/10/recipiente
Incubar 1 hora a 28°C (AP61 y C6-36) y 37°C para Vero. Agitar el recipiente cada
15 minutos
Agregar 5 ml de medio de supervivencia
Prepare recipiente para control negativo y control positivo como se ha descrito
previamente.
Incubar el recipiente y observar efecto citopático (CPE) diariamente
Recolección de Células infectadas
Esperar de 8 a 10 días para la recolección de células en ausencia de efecto citopático
(CPE)
Recuperar el sobrenadante del cultivo en un tubo Nunc y almacenar a -80°C
Agregar 5 ml de 1X PBS en la caja del cultivo celular
Agitar el recipiente y después recoger las células desprendidas en tubos de
hemólisis
Lavar las células tres veces usando PBS 1 X (para cada lavada, centrifugar los tubos
a 1500 g durante 5 minutos)
Re-suspender la pastilla celular con 5 ml de PBS y vortexear.
Poner una gota de la suspensión de células en un portaobjetos de 12 pocillos o 10
pocillos del portaobjetos por duplicado
Secar las gotas en incubadora a 37°C
Ensayo de Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Fijar las células en el portaobjetos utilizando acetona durante 20 minutos a -20°C
Poner una gota de líquido ascítico diluido 1/10 en los pozos de cada portaobjetos
Incubar a 37°C durante 30 minutos en cámara húmeda o incubadora de CO2
Lavar 3 veces durante 5 minutos con 1X PBS y secar los portaobjetos
Poner una gota del anticuerpo IgG anti-ratón-FITC previamente titulado
(dependiendo del lote) con azul de Evans (diluido con 1X PBS en 1/10) Azul de
Evans se prepara 50grs/200 ml de agua destilada).
Incubar a 37°C durante 20 minutos en una cámara húmeda o incubadora de CO2
Lavar 3 veces durante 5 minutos con 1X PBS y secar los portaobjetos
Poner una gota de Glicerol 70% en 1X PBS
Observar la presencia del virus utilizando un microscopio de fluorescencia (40 X
objetivo sin inmersión). El filtro que debe utizarse para observar el resultado debe
tener el espectro para observar el azul Evans (rojo) y el FITC (verde-amarillo)
Explicación de los resultados
Los portaobjetos examinados por microscopio de fluorescencia pueden tener una coloración
de intensidad variable. La fluorescencia observada (depende del porcentaje de células
infectadas) esto se indican como sigue:
+: Intensidad Baja
++: Intensidad Media
+++: Intensidad Alta
++++: Intensidad muy Alta
Interpretación de Resultados
-Prueba negativa: Se observa ausencia de antígeno de células infectadas, por lo tanto es
específica contra un virus sin fluorescencia (las células son de color rojo)
-Reacción no específica: coloración irregular o se siguen manchas de células, estas son
consideradas como negativas
-Prueba positiva: La presencia de células infectadas y por tanto de antígenos específicos
contra el virus de fluorescencia (las células son de color verde)
Nota: Artefactos verdes pueden ser considerados como falsos positivos
Validación de pruebas
No hay células fluorescentes para el control negativo (las células son rojas)
La presencia de células fluorescentes para el control positivo (las células son verdes)
A. Si no hay CPE después de 8 días de que se cosecharon las células
B. Si hay un CPE
Realizar un segundo paso de la pileta de mosquitos positivos
Valorar la positividad de cada muestra (de 1/10 a 1/2560)
Nota: Para mayor comodidad, considere los virus aislados de diferentes vectores
Medidas de seguridad
Utilizar equipo de protección personal apropiado (overoles, guantes, máscara). Infección de
las células, así como la preparación de los portaobjetos debe realizarse bajo nivel de cabina
de bioseguridad 2, debiendo ser observadas. Las buenas prácticas de laboratorio: Está
estrictamente prohibido comer, beber o fumar dentro del laboratorio, así como la pipetear
con la boca.
Comentarios
Después de un número severo de pasajes, las células pueden perder su sensibilidad. Por esta
razón, el laboratorio debe mantener un stock de células con el paso bajo congelados en
nitrógeno líquido un poco con el 10% de DMSO y medio de crecimiento del 90% enriquecido
un poco con SFB.
INMUNOFLUORESCENCIA
1. Sembrar en los slides 50 ul de células (provienen de un F25 confluente, diluidas en 2ml). Dejar secar 1 hora o toda la noche.
2. Fijar e inactivar las células infectadas en acetona fría (-20C) por 30 minutos a -20C 3. Luego agregar una gota del 1er anticuerpo ( policlonal específico para el virus que se va a
detectar), incubar a 37C por 30 minutos 4. Lavar 3 veces con PBS 5. Agregar el 2do anticuerpo-conjugado con FICT, incubar a 37C por 30 minutos(usan una
dilución 1/80 del anticuerpo en PBS y le agregan 1/100 de azul de Evans) (Azul de Evans se prepara 50grs/200 ml de agua destilada).
Trypsine-EDTA (GIBCO 25300-054 ; -20ºC, +4°C después de abierto)
Despegar mecánicamente
usando gendarme (scrapper)
Inóculo
Muestras de Mosquitos
a). Homogenizar el mosquito con homogenizador manual
o Homogenizar el mosquito en 3 ml de medio de homogenización
o Transferir el sobrenadante en tubos eppendorf y centrifugar a 12,000 g por 20 min a 4oC
o Filtrar el sobrenadante y almacenar a 80oC hasta su uso (aislamiento viral en cultivo
celular/ratones, RT-PCR)
B. Homogenizador Automático (mosquito + perlas + medio de homogenización)
o Homogenizar el mosquito en 2 ml de medio de homogenización por 2 min a frecuencia de
30 Hz/s
o Filtrar el sobrenadante y almacenarlos a 80oC hasta su uso (para el aislamiento viral en
cultivo celular/ratones, RT-PCR)
Para muestras de suero
o Diluir las muestras de suero 1/10 usando medio L-15 suplementado con 10% de SFB y
filtrar usando filtros Millipore de 0,22 μM
Inoculación del cultivo celular
Día 2
Verificar que las células se encuentren a una confluencia del 80%. Usar microscopio invertido en el
objetico 40X)
Retirar el medio de crecimiento con una pipeta estéril
Infectar las células con las muestras preparadas previamente
o Para mosquitos: 200 μl/frasco
o Para suero: 500 μl (diluido 1:10)/frasco
Incubar por 1 h a 28oC para células AP61 y C6/36 y 37oC para células Vero
Agitar suavemente el frasco de cultivo cada 15 min
Añadir 5 ml de medio de sobrevivencia para los frasco de 25 cm2
Preparar un frasco como control negativo y otro como control positivo como se ha descrito
previamente
Incubar el frasco y observar en busca de la aparición del efecto citopático o CPE
Plataforma de RT-PCR en tiempo real Jesús Torres
1. OBJETIVO
Este protocolo describe la técnica de RT-PCR basada en la detección y cuantificación de una sonda molecular fluorescente (Ver Figura).
2. MATERIALES
Producto Fabricante Número de Catálogo
Presentación Almacenamiento
Quantitect probe RT-PCR kit
Quiagen 204443
Para 200 reacciones de 50 µl: 3 con volumen de 1.7 ml de 2x QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix, 100 µl de QuantiTect RT Mix, 2 x 2 ml de RNase-Free Water
-20 °C
Oligonucleótidos (Faye) Secuencias 5´-3´ Posición Referencia
Sonda FAM-CTYAGACCAGCTGAAR-BBQ 9304-9320 Faye et al. 2013
Forward AARTACACATACCARAACAAAGTGGT 9271-9297 Faye et al. 2013
Reverse TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG 9352-9373 Faye et al. 2013
Observaciones
Los oligonucleótidos están diseñados a partir de las secuencias de NS5 de ZIKV [Africa (KF38304-KF383114), Malaysia (NC_012532) y Micronesia (EU545988)] La sonda contiene: Fluoróforo: 6-carboxi-fluoresceína (FAM) en el extremo 5′ Quencher: 6-carboxi-tetra metil rodamina (TAMRA) en el extremo 3′.
Oligonucleótidos (Lanciotti)
Primer set de iniciadores Secuencias 5´-3´ Posición Referencia
Sonda CGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAG 860–886 Lanciotti et al. 2008
ZIKV 835 (Fwd)
TTGGTCATGATACTGCTGATTGC 835–857 Lanciotti et al. 2008
ZIKV 911c (Rev)
CCTTCCACAAAGTCCCTATTGC 911–890 Lanciotti et al. 2008
Oligonucleótidos (Lanciotti)
Segundo set de iniciadores Secuencias 5´-3´ Posición Referencia
Sonda AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA 1107–1137 Lanciotti et al. 2008
ZIKV 1086 (Fwd)
CCGCTGCCCAACACAAG 1086–1102 Lanciotti et al. 2008
ZIKV 1162c (Rev)
CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT 1162–1139 Lanciotti et al. 2008
Observaciones
Los oligonucleótidos están diseñados a partir de la secuencia ZIKV MR 766 (número de acceso: AY632535) La sonda contiene: Fluoróforo: 6-carboxi-fluoresceína (FAM) en el extremo 5′
3. EQUIPO
• Cabina de seguridad biológica • Vórtex • Centrifuga de mesa • Termociclador (ABI 7500, Smart Cycler, etc)
4. CONSUMIBLES
• Micropipetas (10 L, 200 L, 1000 L) • Microplaca de 96 pozos / tubos de PCR
• Puntas 10, 20, 100, y 1000 L
5. PROTOCOLO A. Preparación de la mezcla de reacción
Solución (stock) Concentración final 1x [µl] 4 x [µl]
QuantiTect 2x RT Master Mix
1 x 10 40
QuantiTect RT Mix 0,2 0.8
H2O 6,8 27,2
FP 10 µM 500nM 1,25 5
RP 10 µM 500nM 1,25 5
P 10 µM 200nM 0,5 2
RNA 5 --
Total 25 80
* Abreviaturas FP: Iniciador Forward RP: Iniciador Reverso P: Sonda A.1. Si los iniciadores y la sonda están en un mismo tubo, se prepara la mezcla de reacción como sigue:
Solución (stock) Concentración final 1x [µl] 4 x [µl]
QuantiTect 2x RT Master Mix
1 x 10 40
QuantiTect RT Mix 0.2 0.8
H2O 9,3 37,2
FP/RP/P 10 µM 0,5 2
RNA 5 --
Total 25 80
A.2. Si los iniciadores y la sonda están liofilizados, se prepara la siguiente mezcla de
reacción y se le añaden 20 L a cada liofilizado.
Solución (stock) Concentración final 1x [µl] 4 x [µl]
QuantiTect 2x RT Master Mix
1 x 10 40
QuantiTect RT Mix 0,2 0.8
H2O 9,8 39,2
RNA 5 --
Total 25 80
B. Adición del RNA. Se añaden 5l de RNA en cada tubo de reacción.
C. Preparación de Controles
Se añaden 5 l de control positivo y negativo de RNA en los tubos o pozos correspondientes. D. Condiciones de reacción: Programar el termociclador con las siguientes temperaturas y tiempos:
Retrotranscripción 50oC 10 minutos
Activación 95oC 15 minutos
Amplificación 40 ciclos 95oC 60oC
15 segundos
60 segundos
6. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Los resultados válidos se basan en el principio del Ciclo Umbral o “Threshold cycle” (CT). Para esto, se define un valor umbral (Threshold) que corresponda a un nivel suficientemente bajo de fluorescencia que indique que las curvas de amplificación se encuentran en la fase exponencial pero suficientemente alto para estar por encima del ruido de fondo. De este modo, las curvas que resulten por encima del umbral se consideran positivas. El número de ciclos que produce una curva capaz de superar el valor umbral se conoce como Ct. Así, un bajo valor de Ct es indicativo de una alta carga de material viral en una muestra. ANEXO: Extracción de RNA Este procedimiento describe la técnica de extracción de RNA que consiste en la separación de proteínas de los ácidos nucleicos mediante el uso de un agente desnaturalizante. Se utiliza el kit de Extracción de RNA QIAamp Viral RNA Mini Kit de Quiagen (Número de católogo 52906). Para llevar a cabo la extracción se siguen las instrucciones en el kit. Notas:
La lisis viral debe relizarse en una campana de seguridad biológica tipo B2.
Los pasos de extracción posteriores se realizan en una campana de flujo laminar para biología molecular.
Plataforma de deteccio n de anticuerpos, ELISA
Rosalía Lira
El ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) es el método utilizado para detectar un
anticuerpo o un antígeno en un fluido biológico mediante el uso de un marcador. El método permite
la detección de inmunoglobulinas (anticuerpos) dirigidos contra el virus y nos permite saber si una
persona ha estado expuesta al patógeno o no.
El método de ELISA tiene una buena sensibilidad y especificidad. Es una técnica rápida,
automatizada con un tiempo máximo de realización de 5 hrs. (Fig. 1).
Figura 1. Principio de la técnica de ELISA.
OBJETIVO.
El procedimiento describe la técnica de ELISA que es un método para la detección y /o cuantificación
de una proteína (antígeno o anticuerpo) en un fluido biológico mediante el uso de un marcador.
Como parte de la prueba diagnóstica, el ELISA permite la detección de inmunoglobulinas
(anticuerpos) dirigidos contra el virus.
MATERIAL
2. Tabla del Material
Nombre Proveedor Referencia Presentación Almacenamiento Reactivo
químico
Sustrato para
revelado TMB SIGMA T-0440 Frasco 100 ml +4°C ABTS KPL 50-66-01 Frasco 100 ml +4°C
Acido Sulfúrico 4N
VWR
BDH3068 Frasco 500 ml
à 95-98 % Temp amb
Buffers Buffer d e
l a v a d o PBS
PBS
GIBCO 16000-
044
Frasco 500 ml
+4°C
Tween 20 SIGMA P-1379 Frasco 500 ml +4°C
Buffer para
dilución
Buffer de lavado
- Temp amb
Leche descremada en polvo
- Temp amb
Buffer para
cubrir (2
opciones)
1 Carbonato
de sodio
BDH0284 Frasco 500 g
(Powder) Temp amb
Bicarbonato
de sodio
SIGMA
S-7277 Frasco 1 kg
(Powder) Temp amb
Agua destilada
estéril
-
-
- Temp amb
2
cápsulas
SIGMA
C3041 Frasco 100
gelules
+4°C
Agua destilada
estéril
-
-
- Temp amb
Materiales
biológicos
Anti-ratón IgG marcado con peroxidasa
CAPPEL
55558 Liofilizado
(falcon)
-20°C
Cabra anti Human IgM
KPL
01-10-03 Liofilizado
(flacon)
-20ºC
Suero problema
Tubo -80°C
-20°C si esta en
uso
Suero de controles negativos y positivos
Tubo -80°C
-20°C si esta en
uso
Antígeno viral específico
Tubo -80°C
esta en uso Negativo antigeno
Tubo -80°C
-20°C si esta en
uso Ascitis de ratón (Immunoascites)específico del virus
Tubo -80°C
-20°C si esta en
uso Equipo • Tubos esteriles Falcon de 5, 10 o 50 ml para las diluciones • Pipetas estériles (1 ml, 5 ml, 10 ml) (Falcon) • Puntas estériles (SORENSON) • micropipetas (Pipetman) • Pipetas multicanal • Pipetas automáticas 10 μl, 20 μl, 200 μl, 1000 μl • Incubadora a 37 ° C • Agitador Vortex • Placas de 96 pozos • Timers • vasos de precipitados o botes y charolas para los deshechos. • Material para protección del personal: guantes y batas • Microplaca de 96 pozos para ELISA Maxisorp (NUNC 43 9454) • Cubre placas • Papel absorbente • Films adhesivos (Sigma).
PROTOCOLO.
Ag específico control
Inmunoascitis específico
Figura 2. Colocación de antígenos en la placa
5.1 Día 1.
» Cubrir la placa
• Diluir el anticuerpo anti-humano IgM 1/500 o 1/1000 en un buffer de bicarbonate-carbonato pH 9.6, 5μl o 10 μl de anti-humano respectivamente en 5 ml del buffer.
• Vortex
• Colocar 100 μl en cada pozo (coating step)
• Cubra la placa (film adhesive o una tapa) e incube toda la noche (on) a 4 ° C.
5.2 Día 2:
» Adicionar el suero
Nota: recuerde cambiar las puntas para cada suero
• Lavar la placa 3 X, llenando los pozos con 350 μl de buffer de lavado (PBS 1 X con
0,05% de Tween20), golpee la placa contra la mesa sobre un papel absorbente para
remover el líquido residual para cada lavado.
• Diluir el suero a probar, el suero control positivo y el control negativo a 1/100; 10 μl suero en 990 μl de buffer de lavado (Buffer de lavado con 1% de leche descremada).
• Adicione 100 μl /pozo de suero diluido, dos veces. Un pozo para el antígeno viral específico y el otro para el antígeno control que será utilizado en el siguiente paso.
• Cubrir la placa con un film adhesivo o papel aluminio.
•Incubar la placa a 37 ° C, 1 h.
5.3
» Adicionar los antígenos
Nota: recuerde cambiar las puntas para cada suero
• Lavar la placa 3X con buffer de lavado como se describió en 5.2
• Diluir los antígenos de acuerdo a su respectivo título con el buffer de dilución
• Agregar 100 μl/pozo del antígeno específico diluido en un par de columnas (una
columna para cada antígeno específico), y 100 μl de antígeno negativo diluido en las
columnas impares (ver figura 3).
• Cubrir la placa con un film adhesivo o papel aluminio.
• Incubar la placa a 37°C, 1hr.
5.4
»Adicionar el ascites immune Nota: recuerde cambiar las puntas para cada suero de ascitis inmune (fluido ascítico de
ratón)
• Lavar la placa 3X con buffer de lavado (ver 5.2.1) • Diluir el ascites immune obtenido de acuerdo a los titulos obtenidos de acuerdo a sus titulos respectivos en el buffer de dilución.
• Adicione 100μl / pozo de ascitis diluida, coloque cada ascitis en la columna que corresponda a cada virus por probar (también antígenos positivos y negativos).
• Cubrir la placa con un film adhesivo o papel aluminio.
• Incubar la placa a 37°C, 1hr.
➢ Adicionar el conjugado
• Lavar la placa 3X con buffer de lavado (ver 5.2)
• Diluir el conjugado anti-ratón IgG marcado con peroxidasa en un buffer de dilución adecuado al título.
• Adicionar 100µl del conjugado diluido en cada pozo.
Cubrir la placa con film adhesivo o papel aluminio.
• Incubar la placa a 37 ° C por 1 h
➢ Adicionar el substrato y leer la placa
• Lavar la placa 3X con buffer de lavado.
• Adicionar 100 µl de sustrato (TMB o ABTS) a temp ambiente en cada pozo de la placa.
• Cubrir la placa con un film adhesivo o papel aluminio.
• Incubar la placa sobre la mesa para el revelado durante 2 a 30 min, cubrir con papel aluminio.
• Detener la reacción adicionando 100 µl / pozo de ácido sulfúrico 4 N si se utiliza TMB. Si
se usa ABTS no se requiere detener la reacción.
• Leer la OD a 450 nm / 620 nm si TMB es utilizado
Leer a OD (405-410 nm) / 620 nm, si ABTS es utilizado
INTERPRETACION Y VALIDACION DE LOS RESULTADOS
➢ Validación de la prueba
• Controles de los pozos positivos deben colorearse.
• Ausencia de tinción en los controles negativos.
• Ausencia de fondo (no debe presentar amarillo inespecífico en todos los pozos de
la placa).
➢ Interpretación.
Para interpretar los resultados, reste el valor de la lectura OD de los pozos de control de
antígeno (correspondiente al ruido basal) al valor OD de la lectura del antígeno específico
(un antigeno y un suero dado).
Cálculo de ΔDO
Si ΔDO es ≥ 0.2: IgM (+)
Si ΔDO es <0.2: IgM (-)
ANEXOS
Preparación de buffers.
➢ Buffer de lavado (0.05% Tween 20). Adicione 0.5 ml de Tween 20 en 1 litro de
PBS 1X.
➢ Buffer de dilución (puede conservarse máximo 2 días a 4°C).
Leche descremada
Buffer de lavado (0.05% Tween 20)
El buffer de dilución se prepara disolviendo la leche en el buffer de lavado a una
proporción final de 1% de leche. (1g de leche en 100 ml de buffer de lavado).
➢Buffer de cubrimiento de antígeno (carbonato-bicarbonato pH 9.6 (almacenar a 4 ° C)
• 1.59 g de carbonato de sodio y 2.93 g de bicarbonato de sodio.en agua destilada para
hacer un litro. Disolver el carbonato de sodio y el bicarbonato en agua destilada.
• o si utiliza capsulas: Disolver el contenido de una cápsula en 100 ml de agua destilada,
siguiendo las instrucciones que acompañan las cápsulas.
Equipo de protección personal Puntas con filtro 1000μl, 100μl
Incubadora a 37°C con CO2 e incubadora a 37°C Timer
Marcador permanente Tubo Falcon 50 ml
Microscopio invertido Vortex
Bote para desechos líquidos Bolsa roja para desechos sólidos
Comentado [ES1]: *: las VeroE6 directamente originales del CDC crecen MUY poco en medio L15 en estas condiciones. En L15 se tardaban 1 semana completa. Tal vez las Vero de Dakar ya están muy acostumbradas a L15, pero en mi experiencia DMEM es MUCHO mejor para llegar a confluencia a partir de un pase 1:4 en dos-tres días.
3. Protocolo Este protocolo puede realizarse en placas de 24 pozos para la mayoría de los virus; o de
96 pozos, pero esto último es para dengue. De hecho el protocolo para todos los virus,
excepto para dengue, es el mismo. Se tienen 5 etapas fundamentales: I) neutralización
(incubación suero-virus), II) infección, III) cubrir el cultivo (overlay), IV) tinción y V) lectura
de resultados.
Etapa I: Neutralización
1. Inactivar las muestras de suero por calentamiento a 56°C por 30 min. o 60°C por
20 min y posteriormente diluir cada suero 1:10 con medio L15 con 3% SFB.
2. Preparación del reactivo DT
a. Diluir un stock de virus titulado cuanto sea necesario, en medio L15 con 3%
SFB, hasta obtener el reactivo DT. De preferencia usar varias diluciones
1:10 y evitar las diluciones mayores a 1:100 para disminuir los errores del
pipeteo.
i. Para dengue DT = 800 PFU/mL.
ii. Para los demás DT = 1000 PFU/mL.
3. Curva de calibración viral
a. Preparar las siguientes diluciones a partir del DT (son diluciones de virus
que simularán la inhibición) como sigue:
Placa 24 pozos Placa 96 pozos
Dilución Concentración
final virus (PFU/mL)
Virus Medio
L15+3%SFB Virus
Medio L15+3%SFB
D50 500 400uL DT 400uL 100uL DT 100uL
D70 300 480uL D50 320uL 120uL D50 80uL
D90 100 266.8 uL D70 533.2uL 66.7uL D70 133.3uL
D95 50 400 uL D90 400uL 100uL D90 100uL
D99 10 40 uL D95 160uL 40uL D95 160uL
4. Preparar diluciones seriadas de cada suero inactivado a probar. Colocar 20uL
suero 1:10 en 180uL medio L15+3%SFB y continuar con las diluciones seriadas:
1:20 (transferir 100uL de la anterior y agregar 100uL medio)
1:40 (transferir 100uL de la anterior y agregar 100uL medio)
1:80 (transferir 100uL de la anterior y agregar 100uL medio)
1:160 (transferir 100uL de la anterior y agregar 100uL medio)
1:320 (transferir 100uL de la anterior y agregar 100uL medio)
Comentado [E2]: No se si todos estos que se mencionan (hacia abajo) son MEDIO DE MANTENIMIENTO (CON FUNGIZONA Y ANTIBIOTICO)
Comentado [E3]: No concuerda la dilución de Moussa. En la placa de 96 pozos es OK, pero en la de 24 escribió 200 D70 y 520 medio y con eso salen 83PFU/mL. Ya está corregido.
5. Etiquetar una placa de cultivo (24 o 96 pozos) de la siguiente manera:
Curva de calibración
Negativo (sin virus)
D50 D70 D90 D95 D99
DT D50 D70 D90 D95 D99
Muestra 1 (duplicado)
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320
6. En caso de todos los arbovirus, excepto dengue, hacer una mezcla de suero
diluido, reactivo DT (virus) y medio de cultivo en la placa de cultivo, de acuerdo
con la siguiente tabla:
Material Placa 24 pozos Placa 96 pozos
Suero inactivado diluido 100uL 30uL
Reactivo DT 100uL 30uL
L15 + 3%SFB 100uL 30uL
7. Mezclar por pipeteo 7 u 8 veces cada pozo.
8. Agregar 100/30 uL de la curva de calibración viral a los pozos respectivos.
9. Sellar la placa con masking tape
10. Incubar a 37°C por 1 hora.
Etapa II: Infección
1. Retirar el sobrenadante del frasco de cultivo T-75 por decantado.
2. Hay dos maneras de desprender las células
Desprender las células por golpe al frasco.
Agregar 2 a 5mL tripsina y hacer que el líquido enjuague todas las
superficies internas del frasco. Retirar la tripsina y desecharla en la
solución de hipoclorito de sodio (1%). Agregar 2 mL tripsina e incubar a
37°C (par de minutos o hasta que se observe desprendimiento celular).
3. Resuspender en 4 o 5 mL medio L15 + 3% SFB y disociar mediante pipeteo
vigoroso, evitando formar espuma.
4. Contar células en cámara de Malassez
5. Ajustar la suspensión celular a una concentración de 106 células / mL en L15
+3%SFB. Necesario considerar que se requieren al menos 7 mL de tal suspensión
por placa de cultivo.
6. Agregar 60μl (placa 96 pozos) o 200uL (placa de 24 pozos) de la suspensión
celular en cada pozo de la placa que contenía el suero y DT o la curva de
calibración viral, resuspendiendo frecuentemente para homogenizar.
7. Resellar la placa con cinta masking
8. Incubar a 37°C por 4 horas.
Comentado [E4]: No entiendo por qué dice esto… con la de 24 pozos apenas se requieren 5 mL.
Etapa III: Cubrir el cultivo (Overlay) – RED MEXICANA DE VIROLOGÍA
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA - UNAM - MAY 9-22, 2016.
1. Agregar en cada pozo 120uL medio para cubrir, haciéndolo con cuidado de no
alterar la monocapa celular recién adherida.
2. Resellar la placa con cinta masking
3. Incubar a 37 °C for cuatro a cinco días. No agitar la placa, pues esto puede alterar
la forma de las placas.
Etapa IV: Tinción
• Invertir la placa sobre una charola con hipoclorito al 1%
• Enjuagar con 150μL (placa de 96) o 500uL (placa de 24) 1X PBS. Desechar el PBS por
inversión.
• Agregar 150μL (placa de 96) o 500uL (placa de 24) de colorante blue black.
• Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos o más.
• Retirar el colorante por inversión de la placa.
• Enjuagar los pozos con agua destilada o con agua de la llave.
• Dejar secar las placas, colocándolas invertidas sobre la mesa.
Etapa V: Lectura
El colorante fijará y teñirá las células que estuvieron vivas. Las placas o espacios libres
mostrarán las células infectadas.
El título de neutralización se obtiene al identificar la última dilución de suero donde el
número de placas sea igual o menor a las observadas en la dilución D90 de la curva de
calibración viral. El valor de corte (D90 en este caso) debe determinarse en cada sede
según la probabilidad de reacción cruzada.
Criterio de validación
En D90 el número de placas debe ser fácilmente contable (aprox. 3 placas).
La monocapa celular debe teñir azul y mostrar confluencia en el control negativo.
Control positivo es positivo
Control negativo es negativo
FALTA EL ENSAYO DE NEUTRALIZACION PARA DENGUE
Comentado [E5]: No estoy seguro
Comentado [E6]: Eso dice el protocolo
Comentado [E7]: Eso hicimos
Comentado [E8]: Juro que así dice el manual…
ANEXOS
Guía para la propagación del virus del dengue en ratones neonatos. Victoria Pando
Ratones neonatos (1-3 días de nacidos). Cepa: BALB/c.
Materiales:
Jeringa de 1ml con aguja.
Papel absorbente.
Etanol 70%.
Hielo (escarcha).
Virus dengue 10 µl 106 por ratón.
Medio DMEM como control. Equipo de protección personal:
Lentes de seguridad.
Guantes.
Bata. Recomendaciones:
Pedir los ratones para el día jueves (tomando en cuenta que el fin de semana será difícil su monitoreo).
Infectar los ratones, preferentemente a los 3 días de nacidos.
Limpiar el área de trabajo, antes y después de usarse.
Se recomienda estar alerta para realizar el procedimiento para evitar alguna pinchadura con la jeringa.
Para guardar los ratones, no olvidar rotular el tubo con todos los datos correspondientes (fecha de inoculación, fecha de colecta, virus con el que se inoculó).
Signos de ratón enfermo:
Comezón (es decir, se rasca).
Estado de letargo (provocando movimiento lento y torpe).
Dificultad para voltearse cuando se coloca a decúbito supino (boca arriba). ¿Qué hacer en caso de derrame de virus?
Si tienes algún derrame de virus, inmediatamente cubrir con papel absorbente y aplicar etanol para inactivar durante al menos 5 minutos.
¿Qué hacer en caso de autoinoculación?
Es muy importante permanecer tranquilo. Asegurar el área de trabajo o encargar a algún compañero de laboratorio.
Sangrar la zona afectada en agua corriente.
Notificar a Dra. Victoria Pando y al encargado del bioterio.
¿Cuándo es tiempo de sacrificar al ratón?
Cuando su movimiento es casi nulo en respuesta a cualquier clase de estímulo. Esto puede ser aproximadamente al 5to día post-inoculación (puede ser antes o después de ese tiempo, dependiendo los signos y reacción del ratón). No todos los ratones de la camada reaccionarán del mismo modo y en el mismo tiempo.
¿Qué hacer si aparece un ratón muerto?
Si aparece un ratón muerto, sacar de la caja y llevar al congelador horizontal, el cual se encuentra en el cuarto de desechos del bioterio, poner el ratón dentro del bote con bolsa amarilla.
Pasos a seguir para la inoculación del virus del dengue en ratones neonatos.
1. Colocar el equipo de protección personal: bata, lentes de seguridad y guantes. 2. Limpiar con etanol el área de trabajo a utilizar y poner papel absorbente sobre la mesa. 3. Sacar el virus del hielo y descongelar al momento, cargar la jeringa con el virus (Figura 1).
4. Antes de tocar los ratones, debes impregnar muy bien las manos con la viruta que contiene orina de ratón (Figura 2).
Figura 1. Jeringa cargada con virus del dengue.
5. Poner a todos los ratones en la mesa sobre el papel absorbente (Figura 3).
6. Inocular los ratones por vía intracraneal con 10 µl del virus, inmediatamente presionar la punta de su cola para provocar un choque de adrenalina (Figura 4), regresarlos a la caja.
Figura 3. Ratones neonatos, cepa BALB/c.
Figura 4. Se observa la inoculación a), b) y como se presiona la cola del ratón c),d).
a)
Figura 2. Viruta que contiene orina de ratón.
b)
c) d)
7. Llenar la etiqueta/ficha con la información necesaria (Figura 5).
8. Monitorear los ratones en los siguientes días y continuar con el llenado de ficha. 9. En un promedio de 5 días post-inoculación los ratones estarán muy enfermos (débiles y con
movimientos casi nulos); cuando esto pase, sacar de la caja, poner en tubo Falcon de 50 ml y guardar a -70˚C.
10. Cuando todos los ratones se sacan de la caja no olvidar escribir en la ficha/etiqueta la leyenda “sacrificar” (Figura 6), para que los encargados del bioterio lleven a cabo la disposición final de la ratona madre.
CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN DE VIRUS
Figura 5. Ficha/etiqueta de datos
Figura 6. Ficha/etiqueta de datos que muestra la leyenda “Sacrificar”
