HPLC – High Performance Liquid Chromatography - 7 נושא

פאזות עיקריות:2 קיימות HPLCבשיטת ה

פאזה נעה )ממס( – הפאזה הנעה היא ממס נוזלי או תערובת של ממסים אשר נעה בקולונת.1

הכרומטוגרפיה ונושאת את האנליט )מומסים(.

פאזה נחה – פאזה מוצקה שמכילה חלקיקים פורוזיביים קטנים, החלקיקים בעלי פני שטח.2

עם כימיה מיוחדות – תכונות שאנו מעוניינים בהם.

?HPLCמהי שיטת ה

תהליך כרומטוגרפי יכול להיות מוגדר כטכניקת הפרדה המערבת העברת מסה בין הפאזה

הנחה והפאזה הנעה.

שיטת הHPLC.כוללת פאזה נעה נוזלית להפרדת המרכיבים של התערובת

המרכיבים )או האנליטים( קודם כל מומסים בממס )פאזה נעה( ואז האנליט "נאלץ" לזרום

(.400barדרך הקולונה הכרומטוגרפית תחת לחץ גבוה )עד

בקולונה, התערובת מופרדת למרכיביה. רמת ההפרדה או הרזולוציה חשובה ותלויה במידת

האינטראקציות הקיימות בין מרכיבי המומס לבין הפאזה הנחה.

.הפאזה הנחה מוגדרת כחומר מוצק ארוז בקולונה

האינטראקציות בין החומר המומס לבין הפאזה הנעה והפאזה הנחה יכולות להשתנות על ידי

בחירה שונה של ממסים ופאזות נייחות.

-כתוצאה מכך, שיטת הHPLCבעלת רמה גבוהה של מגוון אשר לא קיים במערכות

כרומטוגרפיות אחרות ובעלת היכולת לבצע הפרדה קלה של מגוון תרכובות כימיות.

Partitioning :

הפרדה המבוססת על המסיסות היחסית של

האנליט בין שתי הפאזות. כל הזמן יש חלקוה

בין הפאזה הנעה לנחה.

יתרונות:

.שיטה מהירה יחסית

.רזולוציה טובה

.רגישה יותר

.קולונות הניתנות לשימוש חוזר

.קל להשיב את החומרים - לאסוף

.אידיאלית ליונים והפרדת מולקולות גדולות בעלות נדיפות נמוכה

יישום בתעשיית המזון:

ניתן להפריד–

.סוכרים – מולק' עם משקל מולקולרי גבוה, בלתי נדיפות נמוכה, הידרופיליות

.ויטמינים – מולק' גדולות ולא מסיסות

.חומצות אורגניות

.חומצות אמינו

.)טוקסינים )למשל אפל וטוקסין בבוטנים

.חומרי הדברה

:HPLCמרכיבים בסיסיים של מערכת ה

אשר נחוץ להשגת זמני יציאהpsi 6000מערכת שאיבה – הפאזה הנעה נדחסת עד ללחץ של .1

מ"ל בדקה.10 ל-0.1סביר מהקולונה )של כמה דקות(. קצב זרם אופייני הוא

צריך מערכת הזנה שתזין את הפאזה הנעה בקצב ומהירות מתאימים, אחידים ורציפים.

מיקרוליטר( לתוך הזרם500 עד 0.1מערכת ההזרקה – משמשת להכנסת נפח דוגמא קטן ).2

הנושא וזאת תחת לחץ גבוה.

מיכל )ממסים( – בדרך כלל עובדים עם שני ממסים. המשאבה צריכה לדאוג לאחד את.3

הממסים בצורה הומוגנית. מספר ממסים נחוצים ליצירת גרדיאנט יציאה )בכך יש שינוי של

בפולריות הפאזה הניידת במהלך ההרצה(. הממסים יוצרים רעש רקע ולכן צריכים להיות

ברמת ניקיון מאוד גבוהה בכדי שלא יפריעו לקריאה )קיימים ממסים שמוגדרים בעלי רמה

אשר עוברים סינון להרחקת חומרים מפריעים(.HPLCהמתאימה ל-

ס"מ ומכילה מילוי חלקיקים בקוטר של10-30קולונה כרומטוגרפית – אורכה האופייני הינו .4

מיקרומטר. קיימים מספר סוגים של קולונות אשר השימוש בהם תלוי בסוג5-10

הכרומטוגרפיה הנוזלית הרצויה.

, אינדקס רפרקציה, פלורוסנציה, מוליכות סגולית,UV, IRגלאי – קיימים סוגים רבים הכוללים .5

ספקטרומטרית מסות ואלקטרוכימיה.

כאשר סריקת כל אורכי הגל רצויה.Diode Arrayמשתמשים בגלאי ה

:HPLCמערכת ה

מערכת השאיבה:

מ"ל לדקה בצורה מבוקרת אחידה ורציפה.1מספקת את הפאזה הניידת בקצב

.זרם קבוע בלחץ קבוע עם מינימום פולסים במערכת

-בוכנות. בוכנה אחת שעובדת נותנת פולסים של2הגבלת הפולסים במערכת – שימוש ב

משאבות שעובדות במקביל ובצורה הפוכה2שאיבה – לא רצוי – משפיע לרעה על ההפרדה.

אחת לשניה, נקבל השטחה של הגל.

– מעין בולםdampherככל שיהיו יותר בוכנות, יהיה שיטוח יותר טוב. ישנו מרכיב נוסף,

זעזועים. קולט את הזעזועים מהמשאבה.

.שליטה בזרימה לקבלת הדירות

המשאבה צריכה להיות עמידה בפני קורוזיה שיכולה להתרחש )במיוחד בהפרדה של יונים

בהם יש שימוש בבופרים בעלי מלחים המגבירים קורוזיה(.

המשאבה צריכה לאפשר עבודה בגרדיאנט, מערכת הממסים לא מורכבת מחומר אחד. בד"כ

עובדים עם שני חומרים, ניתן לשנות את ריכוזם עם הזמן.

מערכת הזרקת הדוגמא:

( לתוך הזרם הנושא תחת לחץ גבוה.10-50משמשת להזריק נפח דוגמא קטן )מיקרוליטר

.קיים שסתום מזרק

.קיימת לולאה חיצונית לנפח קבוע - דוגמא

השסתום/בוכנה מסובב לפי מצב המזרק והופך לחלק ממערכת ההזרקה )הדבר מתרחש

מהר מאוד בצורה המאפשרת את ההזרקה תחת הלחץ הגבוה(. ההזרקה היא לא ישירות

לקולונה, אלא לצינור חיצוני. לפני ההזרקה הבאה מחליפים שוב למצב ההתחלתי שבו הלופ

לא קשור לצינור הממסים וכך ניתן להזריק שוב.

:HPLCקולונת ה

.חייבת לתפקד בלחצים גבוהים – בדר"כ מורכבת ממתכת

ס"מ, קוטר פנימי של פחות מס"מ אחד.10-30מימדים אופייניים – אורך של

.מכילה חומר מילוי אשר מהוה את הפאזה הנחה

- קיימים מספר סוגים של פאזה נייחת.

מיקרומטר.5-10- חומרי מילוי אופייניים הם בקוטר של

משתמשים בדר"כ בקולונת הגנה המוצבת לפני קולונת הHPLCואשר מאריכה את חיי

הקולונה. מטרתה היא להגן על קולונת המכשיר מפני זיהומים ולכלוכים שיכולים להתקע

בקולונה ולהרוס אותה. קולונת ההגנה מורכבת מאותו חומר מילוי אך הרבה יותר קטנה ולכן

זולה יותר. על המילוי להיות זהה בכדי שלא תיווצר הטיה בהפרדה.

קולונות:

-הפאזה הנחה בHPLCמיוחסת לחומר מוצק המוכל בקולונה אשר על פניו עוברת הפאזה

הנעה בזרם רציף.

חשוב שהקולונה תהיה ממולאת בצורה אחידה והומוגנית וכי הקישור בין החומרים יהיה טוב

וזאת בכדי לקבל הפרדה טובה וכי המערכת תחת לחץ גבוה.

נתונים:

ס"מ25, 15, 10אורך של

מ"מ5, 4.6קוטר פנימי של

מיקרומטר.10, 5, 3גודל חלקיקים של

מיליליטר לדקה.1-2קצב זרימה של

חומר מילוי הקולונה:

.חומר המילוי יוצר "קרקע" דחוסה

.יכול או לא להיות מעורבת בתהליך ההפרדה – לרוב כן

חלקיקים בעלי גודל מוגדר היטב, בעלי פיזור מינימלי )שכל החלקיקים יהיו כמה שיותר זהים

זה לזה(.

החומר צריך להיות בעל חוזק מכני – נרצה שלא ידחסו או יעברו שינוי למרות העבודה בלחץ

גבוה.

.יציבות מבחינה כימית

:Liquid Chromatographyסוגי

1 .liquid-bonded phase chromatographyהפאזה הנחה הינה חומר אורגני הקשור למשטח –

מוצק. זוהי פאזה נייחת בעלת קבוצות פונקציונליות שעוזרות בהפרדה.

2 .liquid solid or adsorption chromatographyהפאזה הנחה הינה מוצק. החלקיקים הם –

חלקיקים מוצקים אשר לא עברו דריווטיזציה, הינם הידרופיליים במידה שונה )ספיחה שונה של

חומרים( ולכן עוזרים בהפרדה.

3 .ion exchange chromatograohyהפאזה הנחה היא רזינה מחליפת יונים. הפאזה הנחה –

מכילה יונים טעונים וההפרדה היא על סמך קשרים אלקטרוסטטיים. הפאזה הנחה טעונה חיובית

והממס טעון שלילית.

4 .size exclusion or gel permration chromatographyהפאזה הנחה היא נוזל הנמצא בין –

מרווחי מוצק פולימרי. הפאזה מאוד פורזיבית וההפרדה מתבצעת על סמך גודל החלקיקים:

החלקיקים הקטנים עוברים לאט יותר והגדולים עוברים מהר יותר.

מילוי הקולונה:

היתרון: חלקיקים קטנים מקטינים את המרחק

שהמומס צריך לעבור בין הפאזה הנחה והפאזה

הנעה. הדבר מקל על הגעה לשיווי משקל וקבלת

תוצאות ביעילות קולונה גבוהה.

החיסרון: קיימת התנגדות גדולה יותר לזרימה.

קיימת השפעה של גודל הפלטות התיאורטיות.

כאשר גודל החלקיקים עולה ההפרדה פחות טובה אך עם זאת יש עליה בעמידות ללחץ גבוה.

ככל שגודל חלקיקי המילוי קטן, יש יותר פלטות תיאורטיות ולכן יעילות ההפרדה עולה אך גם

דרישות הלחץ עולות.

הפזה הנחה:

OHהחלקיקים שמרכיבים את פאזה זו הם בדרך כלל חלקיקי סיליקה, בעלי הרבה קבוצות

קבוצות פונקציונליות נוספות בהתאם לדרישות.OHחופשיות )קבוצות פולריות(. ניתן לקשור ל-

.חלקיקים פורוזיביים - חדירים לממס

שטח פנים של.

משתמשים בpH בלבד. ב 8 נמוך מ pH.בסיסי יש פירוק של חלקיקי הסיליקה

בpH משתמשים בחלקיקי פוליסטירן.8-12 בסיסי של

תכונות כימיות –

חופשיות כך שניתן להוסיף חומרים שונים שיוצרים קשר קוולנטי ובכךOHלסיליקה קבוצות

.C18 C8 C4 C1 CN Phenylלהשפיע על ההפרדה. החומרים יכולים להיות

Bonded stationary phase –

קישור קוולנטי של הפאזה הנחה מניב פאזה קשורה אשר יציבה תרמית ויציבה מבחינה

הידרוליטית.

– Bonded stationary phaseקבוצות פונקציונליות נפוצות עבור ה

קולונה פולרית תעדיף קישור של אנליטים פולריים אליה, ולהפך.

קושרים קבוצותOHמרבית ההפרדות נעשות על גבי פאזה א-פולרית ולכן על קבוצות ה

פונקציונליות א-פולריות.

וכךOHלא חייב להיות כיסוי מלא של הסיליקה - אפשר לשלוט באחוז הכיסוי של קבוצות ה

עם קבוצות א-פולריות אז הפרדת חומריםOHלהשפיע על הפולריות. ככל שנתמיר יותר קבוצות

א-פולריים תהיה טובה יותר )עקב זמן שהייה גבוה יותר( אך עם זאת הפיקים יהיו מרוחים ונמוכים

ויקח זמן רב לבצע את ההפרדה.

תכונות גאומטריות –

קיימים שני סוגי חלקיקים בקולונה: צורה כדורית וצורה לא סדירה.

הסיליקה פורזיביות. ההפרדה תלויה בגודל הנקבוביות, בצורת החלקיקים ובפיזור.

כאשר החלקיקים קטנים וזהים זה לזה האריזה טובה יותר ולכן יעילות ההפרדה טובה.

גודל הנקבוביות מגדיר את יכולת מולקולות האנליט לחדור לתוך החלקיקים וליצור אינטראקציות

עם החלק הפנימי של שטח הפנים שלהם. הדבר חשוב בעיקר בגלל שהיחס של חוץ שטח פני

. השטח בו מתרחשות האינטראקציות הוא בדר"כ השטח1:1000החלקיק לחלקו הפנימי הינו

הפנים הפנימי של החלקיקים.

פרטי הקולונה:

דוגמא -

:HPLCמצבי

( המצב הנורמליnormal phase.הפאזה הנחה הינה פולרית והממס הוא א-פולרי – )

( מצב הפוךreverse phase.הפאזה הנחה הינה א-פולרית והממס הוא פולרי – )

מתרחשות במצב ההפוך.HPLC מההפרדות על ידי ה-70%

: HPLCעקרונות ההפרדה ב

כלל אצבע: פולריות האנליט שווה בערך לפולריות הפאזה הנחה ושונה מפולריות הפאזה הנעה.

להשגת הפרדה טובה האנליט צריך לעבור אינטראקציות עם הפאזה הנחה אבל לא בצורה

חזקה מידי או כך שזמן היציאה יהיה ארוך מידי.

Normal Phase :

.)פאזה נחה פולרית מאוד )סיליקה או אלומינה אוקסיד

ממס יחסית לא פולרי )למשל הקסאן ואיזו פרופיל אלכוהול ביחסים שונים בהתאם לפולריות

הממס הרצויה. הקסאן מאוד הידרופובי(.

החומר המומס הכי פחות פולרי יצא ראשון )חומרים א-פולריים יוצאים עם הממס כי לא יוצרים

אינטראקציות עם הפאזה הנחה(.

עליה בפולריות הפאזה הנעה מורידה את זמן יציאת החומרים )חומרים פולרים נשארים

בפאזה הנעה יותר זמן(.

Reverse phase:

פחמימן כגון( פאזה נחה א-פולריתC18 או C8.)

פאזה נעה יחסית פולרית - בדרך כלל מים ושילוב של ממס נוסף כגון מתנול, טטרהידרופוראן

או אצטוניטריל. העירבוב עם ממס נוסף הוא לקבלת מידת פולריות שונה של הממס בהתאם

להפרדה והחומרים המופרדים. ניתן לשנות גם את סוג הממס הנוסף וגם את אחוזו.

דוגמא:

לפי הציור רואים שעבור אותו אחוז של ממס נוסף, בממסים שונים מקבלים זמן יציאה שונים

וטיב הפרדה שונה.

החומר המומס הפולרי ביותר יוצא ראשון )חומרים פולריים יוצאים עם הממס כי לא יוצרים

אינטראקציות עם הפאזה הנחה(.

.הורדת פולריות הפאזה הנעה מורידה את זמן היציאה

pH משפיע על יינון הקבוצות ולכן חשוב במיוחד כאשר רוצים להפריד חומרים העוברים –

יינון.

התמיסה ניתן לקבל )הקולונה לא עובדת על הפרדת יונים(:pH החומר ו-pkaבהתאם ל-

אשר בצורה זו המופעים לא-A ו +Hחומצה חלשה - במקום חומר אחד נקבל תערובת של

ברורים כי החומרים די דומים זה לזה. נקבל במצב זה פיק מרוח ולא ברור מבחינת הרזולוציה.

HA( ואז נבטיח כי רוב החומר יהיה בצורה של 2-2.5 נמוך )pHבמקרה זה נרצה לשמור על

.pHונקבל פיק אחד. ניתן לעשות זאת על ידי הוספת חומר לממס המוריד את ה

( בכדי10 גבוה )pH אשר אינו רצוי ולכן יש לעבוד ב +HB נמוך נקבל את היון pHבסיס חלש – ב

.+Bלקבל את

סוג הבופר – ניתן להשתמש בסוגי בופר שונים כגון פוספט או אצטט כאשר בופרים שונים יתנו

הפרדה שונה.

חוזק יוני – בדרך כלל נעדיף חוזק יוני נמוך כך שאין המצאות גדולה של מלחים במערכת

ונמנע קורזיביות.

האיור מתאר את היחס בין פולריות ולזמני יציאה עבור מצב נורמלי ומצב הפוך.

השונים:HPLCדוגמאות לחומרים העוברים הפרדה במצבי ה

Normal Phase.חומצות אמינו, פחמימות, ויטמינים הידרופיליים –

סדר יציאת

החומרים הפוך

שינוי פולריות הפאזה הנעה מקטין את זמני

היציאה – סדרהיציאה לא משתנה!

Reverse Phase .שומנים, ויטמינים המסיסים בשומן ופיגמנטים –

ניתן למצוא גם דוגמאות הפוכות.

אפליקציות אופייניות של השיטה:

Adsorption or Liquid Solid Chromatography:

-1900הצורה הבסיסית של כרומטוגרפיה נוזלי הוצגה ב.

פאזות נחות נפוצות – סיליקה )הנפוצה ביותר( ואלומינה – ללא דריוטיזציה.2ישנן

.הפאזה הנחה הינה פולרית מאוד ואילו הפאזה הנעה פחות פולרית

.הפרדה מתרחשת על בסיס חוזק הממס בהחזקת הדוגמא בו

שימוש בצורה חופפת עםNormal phase chromatography.

הפאזה הנעה:

קיימים סוגים רבים – יותר סוגים מאשר בGC.

-הפאזה הנעה יוצרת אינטראקציות עם מרכיבי הדוגמא – הדבר שונה מהGCששם את

הפאזה הנעה ומטרתה היא רק להניע את הדוגמא ללא יצירת אינטראקציות.

.זמן יציאה הינו פונקציה של סוג הממס

.פולריות חשובה עבור החומר המומס, הפאזה הנעה והפאזה הנייחת

isocratice vs מערכת בעלת גרדיאנט ממיסים לעומת מערכת שאינה משתנה במהלך ההרצה )

gradient :)

Isocratice.לא משתנה לאורך ההרצה –

ביצירת גרדיאנט מתאפשר זמן הפרדה קצר יותר,

שיפור הרזולוציה, צורות הפיקים טובות יותר ושיפור

הרגישות.

מידת חוזק הגרדיאנט ישפיע על מהירות יציאת

החומרים אך לא ישפיע על סדר היציאה!

:HPLCגלאי ה

.אין גלאי אוניברסאלי

:סוגים

- כללי: מגיב לשינויים בפאזה הנעה, כאשר הסיגנל משתנה בנוכחות מומס.

דוגמא: אינדקס רפרקציה.

- ספציפי: מגיב לתכונה כלשהי של המומס )לא מעובד על ידי הפאזה הנעה(. דוגמא:

.UVבליעת

-Hyphenated detector (LC-MS).יכולות לעבוד ביחד, אבל לא חייבות –

גלאי אינדקס רפרקציה )גלאי כללי(:

( גלאי אינדקס הרפרקציהRI-הינו הגלאי הכללי היחיד ב )HPLC.

עיקרון הגילוי כולל מדידת השינוי באינדקס הרפרקציה של הזרם היוצא מהקולונה. ככל

של הדוגמא והפאזה הנעה גדול יותר כך גדל הריכוז. RIשהשוני ב-

כשהנוזל נכנס לתא ומוקרנת עליו הקרן נקבל סיגנל מסוים. ככל שריכוז החומר גדול יותר,

השבירה תהיה גדולה יותר.

עבור הממס נקבל שבירת אור אחת ועבור הדוגמא+הממס נקבל שבירת אור שונה כתלות

בריכוז הדוגמא.

-יישום אופייני של גלאי הRI.הינו לאנליזת פחמימות

-פחמימות לא בולעות בתחום הUVולא עוברות יינון. למרות שניתן ליצור נגזרות

פלורוסנטיות התהליך מעייף ולוקח זמן רב.

דוגמא ליישום היא בהפרדת התוצרים של הידרוליזת.

-הדטקטור הוא בעל הרגישות הנמוכה ביותר מבין גלאי הLC .

גלאי אינדקס הרפקציה מאוד רגיש לשינויים בטמפרטורה, בלחץ, בקצב הזרימה ולכן לא

ניתן להשתמש בו בגרדיאנט )כל שינוי יימדד ולא נוכל להבחין בסיגנל הרצוי(.

למרות החסרונות הרבים, הגלאי יעיל מאוד לגילוי המרכיבים אשר לא עוברים יינון, אשר לא

ואשר לא זורחים פלורוסנטית.UVבולעים אור

גלאי בליעה:

UV/Vis source.בדרך כלל באים ממונוכרומטור כך שאורכי הגל ספציפיים יכולים להיבחר

.הבליעה גדלה כאשר מומס יוצא מהקולונה

-ניתן לקבל מבנה דומה לזה שבIRאך הדבר לא נפוץ מכיוון שקיימים מעט מאוד ממסים

קשור יותר לחוזק הקשרים ולוויברציות ולכן לכל חומרIR. IRאשר לא משנים את ערך ה-

אין בליעה לכל חומר.Vis או ב UV בעוד שב IRכמעט יש בליעה ב-

.לא קוראים בקיווטות אלא בתא זרימה – המערכת רציפה

ככל שיש ריכוז יותר גבוה נקבל פיק יותר גדול עקב

סיגנל יותר גדול.

-רוב החומרים האורגניים בולעים בUV.

אם יש שני חומרים בעלי ספקטרום בליעה שונה ורוצים

לכמת אותם, נוכל לראות רק חומר אחד.

Diode – Array Detector (DAD):)הנפוץ ביותר(

כל דיודה קוראת באורך גל מסוים, כך

שבכל רגע נתון ניתן לקבל את כל הספקטרום

ומתקבלת תמונה תלת מימדית. ניתן להגדיר

גם אורכי גל ספציפיים בהם נרצה לקבל את

הכרומטוגרפיה )נבחרים בהתאם לאורך הגל

בו הבליעה של החומרים מקסימלית(.

זהו פיק של אורך גל מסוים אך הנתונים ניתנים בתמונה תלת מימדית המאפשרת צפייה בפיק

בכל אורכי הגל. בצורה זו מתקבלות כל בליעות החומרים באורכי הגל השונים. גודל הפיק תלוי

בקרבה לבליעה המקסימלית של החומר )באורך גל הנותן את הבליעה המקסימלית הפיק

יהיה הגדול ביותר(.

לכל חומר יש לעשות עקום כיול באורך גל המקסימלי שלו וכך ניתן לתרגם את השטח מתחת

לפיק לריכוז.

עקום הכיול מציג תלות לינארית בין הריכוז לשטח הפיק.

זיהוי החומרים על פי הספקטרום שהתקבל:

.ניתן לזהות את החומרים על ידי ספקטרום הבליעה שמתקבל והשוואה לסטנדרטים ידועים

.ניתן להשוות חומרים על מנת לזהות אותם עם ספקטרום בליעה מספריה

ניתן להבחין באם הפיק שייך לחומר אחד או שני חומרים על ידי החסרת הספקטרומים אחד

, כלומר קבלת קו0מהשני )במידה ומדובר באותו ספקטרום תוצאת החיסור צריכה להיות

הבסיס(.

0שימוש באלגוריתם המחשב – זהות מושלמת תיתן זווית התאמה של .

לממס בשיטה זו אין בליעה בUV.

טוהר הפיק:

לעיתים מתקבלתCoelutionהתחברות( של שני פיקים: מתרחשת במדידה הנעשית באורך(

גל אחד. מוגדרת כסכום הבליעות של שני פיקים שונים. הקולונה לא הפרידה בין החומרים.

ניתן לזהות האם הפיק טהור על ידי זוית התאמה וזוית טוהר.

זוית התאמה -

מעלות מעידה על שוני ספקטרומים גדול. 53זוית התאמה של

מעלות מעידה על ספקטרום מאוד 0.5זוית התאמה של

דומה )שוני למשל בקבוצת מתיל אחת(.

– Coelutionרזולוצית הכרומטוגרפיה וזיהוי

להערכת טוהר הפיק, הספקטרום מוערך במספר נקודות שונות לאורך הפיק שמתקבל. אם

קיימת התאמה מלאה אז הפיק כנראה טהור.

גורמים שמשפיעים על טוהר הפיק:

.מספר הנקודות אותן דוגמים – אם דוגמים מספיק נקודות ניתן לקבל קביעה יותר מדויקת

חדות המכשיר מבחינת הדגימה של אורכי הגל )מדידה בכל ננומטר לעומת מדידה במספר

ננומטרים(.

.עבודה בתחום הליניארי – ביציאה מתחום זה מקבלים פיקים מרוחים ולא נקיים

ההחסרה של רעשי הרקע לא תמיד מדויקת כי הבייסליין לא תמיד לינארי, בעל קפיצות

קטנות שנובעות מפעולת המכשיר. ייתכן בייסליין שונה עקב שימוש בגרדיאנט.

רעשי רקע – יש להזריק סטנדרט נקי וכך רואים מהי קריאת הרעשים ומוודאים שהזנב לא

התקבל כתוצאה מהם.

בעיות במערכת - בעיות בהרצה, תנאיpHלא מתאימים ועל כן יינון המולקולות, קולונה לא

טובה, מנורת הגלאי לא תקינה, סתימה קטנה שלא מאפשרת מעבר אחיד של ממסים. גם

פיק טהור יכול לתת ספקטרומים שונים בנקודות שונות עקב סיבות אלו.

דוגמא לפיק שאינו טהור:

בכלUVהפיק נראה בסדר, אבל כדי לוודא אם הוא טהור או לא, בודקים את ספקטרום ה-

מיני נק'.

אם החומר טהור, הספקטרום אמור להיות זהה בכל הנקודות.

ניתן לראות כי בדגימות מהזנב מתקבל ספקטרום שונה מהספקטרום של הפיק המרכזי. יש

שני איזורים של מקסימות.

מסיקים כי החומר אינו טהור וכי ההפרדה שבוצעה לא הייתה טובה מספיק על מנת לכמת את

החומר.

גם אם הפיק נראה כפיק טהור אין זו הוכחה מספקת לזיהוי או לטוהר ועל כן דרושה

אנליזה נוספת בשימוש בשיטה שונה.

UV-vis זאת תכונה של חומר, אבל לא טביעת אצבע כמו IR.

גלאי המבוסס על פלורוסנציה:

-גלאי מסוג זה הינו קרוב לוודא הגלאי הרגיש ביותר בקרב גלאי הHPLCהמודרניים

הקיימים.

.ניתן לגלות בעזרתו אפילו הופעה של מולקולת אנליט בודדת בתא הזרימה

פעמים גדולה יותר מזו של גלאי ה-10-1000רגישות הפלורוסנציה היא פי UVעבור חומר

בצורה חזקה.UVהבולע

-אחוז מכל המרכיבים יש פלורסנציה טיבעית – שימוש מוגבל.15בכלליות, ל

נוכחות של אלקטרוני פאי מצומדים, במיוחד במרכיבים ארומטיים, נותנת את העוצמה

הפלורוסנטית הגבוהה ביותר. גם לחומרים אליפטיים ואליציקליים עם קבוצות קרבוניל וכן

למרכיבים עם הרבה קשרים כפולים מצומדים יש עוצמה פלורוסנטית אך נמוכה יותר.

כאשר קבוצות פונקציונליות ספציפיות עוברים עירור על ידי אורך גל קצר ופולטים קרינה

באורך גל גדול יותר הדבר נקרא פלורוסנציה.

.בדרך כלל הפליטה נמדדת בזוית ישרה לעירור

סיכום:

HPLC.היא שיטה מדויקת ורב תכליתית

.שיטה זו מבוססת על חלוקת האנליטים בין הפאזה הנעה לפאזה הנחה

( ההפרדה מבוססת על שוני בפולריותnormal phase ו reverse phase.)