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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina TropicalPrint version ISSN 0037-8682
Daniella Borges AlvesI; Inês Aparecida TozettiI,II; Flávia Almeida GattoII; Fernanda CassandriI; Alda Maria Teixeira FerreiraII; Carlos Eurico dos Santos FernandesIII; Gustavo Ribeiro FalcãoIV; Ilzia Doraci Lins ScapulatempoIII,IV; Cacilda Tezelli Junqueira PadovaniII; Maria Auxiliadora Gomes Sandim AbdoIII
IPrograma de Pós-Graduação em Doença Infecciosas e Parasitárias, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS IILaboratório de Imunologia, Departamento de Patologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS IIILaboratório de Patologia, Departamento de Patologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS IVCentro de Prevenção ao Câncer, Campo Grande, MS
Endereço para correspondência
RESUMO
INTRODUÇÃO: A resposta imune pode ser um elemento chave para a progressão ou remissão da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) no estroma da cérvice uterina. Este estudo objetivou quantificar no estroma cervical a presença de linfócitos T CD4, CD8 e células NK, por imunohistoquímica, em lesões de alto e baixo grau em pacientes infectadas por HPV MÉTODOS: Utilizou-se 56 amostras de biópsia da estroma cervical, sendo 43 amostras positivas para DNA de HPV de alto risco oncogênico e com diagnóstico histopatológico de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) de alto e baixo grau, ou negativa para lesão intraepitelial e malignidade (NILM), e 13 amostras de pacientes negativas para DNA de HPV com diagnóstico histopatológico NILM RESULTADOS: Maior quantidade de linfócitos T CD4 foi observada em amostras NIC II/III, carcinoma e NILM (p=0,04) e naquelas cuja carga viral esteve entre 10 e 1,000 RLU/PCB. O predomínio de linfócitos T CD8 ocorreu em maior proporção nas amostras NIC II/III (p=0,02) e em amostras com carga viral entre 100 e 1.000 RLU/PCB. As células NK prevaleceram nas amostras com lesões de baixo grau e com baixa carga viral CONCLUSÕES: Este estudo comprovou que nas fases iniciais da infecção, onde não há ainda alterações celulares de alto grau, não temos a presença de células que possam desencadear a fase efetora da resposta imune.
INTRODUCTION: Immune response might be a key element regarding the progression or regression of human papillomavirus (HPV) infection in the stroma of
the uterine cervix. This study aimed to quantify the presence of CD4 and CD8 T lymphocytes and NK cells in the cervical stroma, by means of immunohistochemistry, in high and low grade lesions in patients infected by HPV METHODS: Fifty-six biopsy samples from the uterine cervix were used. Forty-three samples were positive for oncogenic high-risk HPV DNA and had a histopathological diagnosis of high and low-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN) or negative for intraepithelial lesion and malignancy (NILM); while the other 13 samples were negative for HPV DNA with a histopathological diagnosis of NILM RESULTS: Higher quantities of CD4 T lymphocytes were observed in CIN II/III, carcinoma and NILM samples (p = 0.04) and in those in which the viral load was between 10 and 1.000 RLU/PCB. CD8 T lymphocytes were predominant in CIN II/III samples (p = 0.02) and also in samples with viral loads between 100 and 1,000 RLU/PCB. NK cells predominated in samples with low-grade lesions and low viral load CONCLUSIONS: This study proved that in the initial stages of the infection, in which no high-grade cell abnormalities have yet occurred, no cells that might trigger the effector phase of the immune response.
Key-words: Human papillomavirus. Immunological response. Immunohistochemistry.
INTRODUÇÃO
O papilomavírus humano (HPV) é o principal agente causador do câncer cervical. Esta neoplasia representa o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres, com aproximadamente 500.000 casos novos por ano no mundo, sendo responsável por cerca de 230.000 mortes de mulheres anualmente1. Atualmente, são reconhecidos cerca de 230 tipos de HPV, sendo que os tipos 6, 11, 42, 43 e 44 são os mais comumente associados a lesões benignas, como: condiloma acuminado e verrugas, com raros casos de evolução maligna. Os tipos 16, 18, 31, 33, 45 e 66 estão associados à lesão de alto grau e câncer cervical2. Estudo realizado na Região Centro-Oeste, em Campo Grande-MS, em pacientes encaminhadas para exame clínico de rotina ou por suspeita de infecção por HPV, detectou predomínio dos tipos virais 6, 11, 66 e 453.
O HPV não causa lise celular, geralmente produz alterações no epitélio escamoso sem induzir inflamação local. Através de microlesões na superfície, o vírus infecta as camadas basais do epitélio, entretanto, na maioria das vezes a replicação viral ocorre nas camadas mais externas4. Na maioria dos casos, a infecção viral é eliminada após a ativação da resposta imune. Ocasionalmente, as lesões não regridem e a progressão maligna da doença pode seguir sob condições apropriadas. A infecção viral persistente é necessária para a progressão neoplásica e a falha da eliminação viral é atribuída, segundo alguns autores a uma pobre resposta5.
A redução na incidência de câncer cervical e de neoplasia intraepitelial cervical (NIC), em modelos animais submetidos à imunoterapia, foram observadas por alguns autores, sugerindo o controle da infecção pelo sistema imune6. Outros autores, por sua vez, observaram falha da resposta imune em controlar a infecção e prevenir a progressão neoplásica7. Registros de anormalidades do sistema imune em casos de câncer da cérvice uterina8, e a
comprovação de que o microambiente tumoral também pode ser capaz de suprimir o sistema imune, controlando a progressão da infecção, são encontrados na literatura7.
Estudo utilizando a imunohistoquímica para marcação de células da resposta imune tais como CD4, CD8 e CD45RO no estroma da cérvice uterina, demonstrou maior densidade de marcação em pacientes com NIC I, que não tiveram progressão da lesão, do que pacientes com NIC III ou câncer invasivo9; enquanto outros autores, através da mesma técnica, constataram forte expressão de CD3, marcador de linfócitos T, em pacientes com NIC III que apresentaram recorrência da lesão10.
Com base na importância do papilomavírus humano e na necessidade da investigação sobre o papel da resposta imune no controle ou progressão da infecção, o presente estudo objetivou determinar no estroma cervical a presença de linfócitos TCD4, TCD8, e células Natural Killer (células NK), por imunohistoquímica, em lesões de alto e baixo grau.
MÉTODOS
Amostras
Foram utilizadas cinquenta e seis amostras, aleatoriamente selecionadas, de biópsia de cérvice uterina, incluídas em parafina, de mulheres atendidas no período de 2000 a 2002, no Centro de Prevenção ao Câncer de Campo Grande, MS. Sendo que destas, quarenta e três são de mulheres positivas para DNA de HPV de alto risco oncogênico, pelo método de captura híbrida (HC2-Digene) e com diagnóstico histopatológico de neoplasia intraepitelial cervical de alto (NIC II/III e carcimoma) ou baixo grau (NIC I) e negativa para lesão intraepitelial e malignidade (NILM). As treze amostras restantes são negativas para DNA de HPV de alto risco oncogênico e com diagnóstico histopatológico NILM. Dentre as amostras NIC III, 8 amostras foram classificadas como carcinoma invasivo ou in situ, e objetivando a avaliação diferenciada da resposta imune estas amostras foram consideradas a parte na análise dos resultados.
A carga viral, quantificada pelo teste HC2, foi classificada em 0, 1, 2, 3 e 4, correspondendo, respectivamente, a negativo, 1 a <10, 10 a <100, 100 a <1.000 e > 1.000RLU/PCB11. Os dados relativos à carga viral e aos achados histopatológicos são provenientes de estudos anteriores12.
Caracterização da amostra
As amostras utilizadas, neste estudo, foram obtidas de pacientes com idade entre 18 e 57 anos (média=28 anos). A classificação histopatológica e a carga viral encontram-se detalhadas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.
Imunohistoquímica
Para a marcação de linfócitos T auxiliares, linfócitos T citotóxicos e células NK, foram utilizados, respectivamente, os anticorpos monoclonais anti-CD4 (Invitrogen, clone 1F6 e cod. 18-2282), anti-CD8 (Invitrogen, clone 1A5 e cod. 18-2289), e anti-CD57 (Invitrogen, clone NK-1 e cod. 18-0167Z). A reação foi desenvolvida, utilizando recuperação antigênica em calor úmido13, com tampão citrato 10mM, pH 6,0 para a detecção dos marcadores CD8 e CD57 e tampão EDTA 0,05M, pH 8,0 para a detecção do marcador CD4. Para a revelação, foi utilizado o sistema LSAB + Sys HRP (Dako, cod. K0690) e como cromógeno diaminobenzidina 60mg%. A contracoloração foi desenvolvida em hematoxilina e as lâminas observadas em microscopia óptica comum, com objetiva de 10X e 40X, sendo consideradas positivas quando da observação de marcação de coloração marrom nas células características. Como controle foi utilizada tonsila humana, sobre o qual foi aplicado o anticorpo primário (controle positivo) ou para substituir este, apenas tampão fosfato pH 7,4 (PBS) com 1% de albumina (controle negativo).
Análise quantitativa
Os cortes foram classificados de acordo com a presença de células imunomarcadas em escores de zero a dois, correspondendo a: 0= negativo, 1= presença discreta, 2= abundante quantidade, com observação de dez campos aleatórios. A leitura foi realizada por dois observadores independentes previamente calibrados (Kappa= 0,091) e o resultado final dos casos discordantes foi obtido pela análise em comum, com a finalidade de produzir um consenso.
Análise estatística
Foi realizada através do programa SPSS 10.014. Para a análise estatística, foram considerados em conjunto os dados referentes às amostras NIC II e NIC III.
Ética
O presente estudo foi aprovado e revisado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, conforme o parecer nº1353/09.
RESULTADOS
Análise imunohistoquímica
Na Tabela 3, observa-se a distribuição dos linfócitos T CD4, T CD8 e células NK, entre as amostras analisadas, segundo os achados histopatológicos. As células T CD4 foram observadas em maior quantidade nas amostras NIC II/III e carcinoma (87,5% em cada), seguido das amostras NILM (86,3%). Ocorreu relação estatística significante entre a presença de células T CD4 e os achados histopatológicos (p= 0,04). Com relação à distribuição destes, segundo os achados histopatológicos, observa-se o predomínio (68,7%) de linfócitos T CD8 em grande quantidade nas amostras NICII/III. Houve relação estatística significante entre a presença de linfócitos T CD8 e o grau dos achados histopatológicos (p= 0,02). As células NK foram ausentes na maioria (80,4%) das amostras. Quando observadas, encontravam-se em pequena quantidade, predominando nas amostras NICII/III (18,7%) e em grande quantidade nas amostras NIC I (20%). Não ocorreu relação estatística significante entre a presença de células NK e os achados histopatológicos (p>0,05).
Observou-se predomínio de linfócitos T CD4, poucos linfócitos T CD8, e raras células NK nas amostras NILM e negativas para a pesquisa de DNA de HPV (nº= 13), quando analisadas isoladamente.
Nas amostras com diagnóstico histopatológico de carcinoma, houve predomínio de linfócitos T CD4 (87,5%) em grande quantidade e em relação à presença de linfócitos T CD8 (50%).
A distribuição dos linfócitos TCD4, T CD8 e células NK, entre as amostras analisadas, segundo a carga viral pode ser observada na Tabela 4. Os linfócitos T CD4 predominaram em grande quantidade nas amostras com carga viral entre 10 e 1.000 RLU/PCB (100%), seguido das amostras negativas para a pesquisa de DNA de HPV (94,1%). Os linfócitos T CD8 por sua vez, tiveram maior expressão nas amostras com carga viral entre 100 e 1.000 RLU/PCB, enquanto as células NK predominaram, em pequena quantidade, neste mesmo grupo de amostra.
Não houve correlação estatística entre a presença de linfócitos T CD4, TCD8, células NK e a carga viral (p>0,05). Na Figura 1A, B e C observa-se a marcação imunohistoquímica de linfócitos T CD4, T CD8 e células NK, respectivamente, em biópsia do estroma cervical uterino.
DISCUSSÃO
Associação significativa entre o número de células imunocompetentes e o grau da neoplasia intraepitelial cervical foi demonstrada por alguns estudos, indicando que a resposta imune no estroma da cérvice é um fator chave para a regressão da lesão ou sua progressão para o câncer cervical10,15.
Monnier-Benoit e cols9, avaliando populações celulares em lesões malignas e pré-malignas da cérvice uterina, verificaram que a quantidade de linfócitos T CD4 era maior em lesões de baixo grau e menor nas lesões de alto grau e câncer invasivo. Maluf e cols10, por outro lado, encontraram em pacientes com lesões de alto grau recorrentes forte expressão de CD3, marcador da população total de linfócitos T. No presente estudo, observou-se que com relação à presença de linfócitos T CD4, estes distribuíam-se quase que equitativamente entre as amostras NIC II/III, carcinoma e NILM.
Outros estudos, que também avaliaram a presença de células T CD4, observaram o predomínio destas em lesões de baixo grau e associados às lesões verrugosas9,16,17. Estudos realizados em pacientes com deficiência de linfócitos T CD4, resultaram em maior prevalência de HPV, presença de lesões pré-invasivas e maior risco de progressão nesta população, evidenciando que a presença deste tipo celular seria
importante para o controle da replicação viral e a supressão da transformação maligna18,19.
Ao avaliar a presença de linfócitos T CD8, deve-se considerar que, para estas células estarem presentes, o reconhecimento antigênico e ativação, realizado pelos linfócitos T CD4, provavelmente já ocorreu. Este fato, permite a produção de citocinas cruciais para o recrutamento e ativação das células CD820. Neste estudo, a presença de linfócitos T CD8 foi mais evidente nas lesões de alto grau (p=0,02). Concordando com este achado, alguns pesquisadores observaram elevada presença desses linfócitos em amostras NIC III. Tais autores deduziram que o início da fase efetora da resposta imune poderia ocorrer em NIC III, e nas etapas anteriores, NIC I e II, os sinais necessários para ativação de linfócitos T CD8, tais como produção de interleucina-2 (IL-2) e presença de moléculas co-estimulatórias, poderiam estar ausentes15.
Foi demonstrado que a deficiência na produção de IL-2, por linfócitos T CD8 e CD4, em pacientes com lesão cervical intraepitelial de alto grau, poderia limitar a expansão de clones de linfócitos T CD8 específicos para o HPV7,21. Tal ocorrência prejudicaria a capacidade das pacientes em sustentar respostas competentes mediadas por células.
A literatura demonstra que em infiltrados linfocíticos de lesões pré-cancerosas, o número de linfócitos T CD4 parece ser maior que o número de TCD8, demonstrando um perfil que favoreceria a regressão da lesão, enquanto o predomínio de T CD8 poderia significar a persistência da infecção e risco de progressão da lesão para a forma maligna22. A determinação por alguns autores da presença expressiva de CD3 em lesões recorrentes10 pode refletir a presença mais evidente de CD8 em lesões de alto grau. Tal fato foi demonstrado neste estudo, uma vez que o marcador CD3 está presente em toda população de linfócito T, tanto helper como citotóxico.
O predomínio das células T CD8 nas alterações NIC II/III, e com carga viral acima de 100 RLU/PCB, demonstra que seu surgimento ocorre na fase efetora da resposta imune, após existência da replicação viral e na presença de linfócitos T CD4, os quais poderiam fornecer os elementos necessários a sua ativação. Portanto, o surgimento de maneira efetiva das células T CD4 nas fases iniciais da infecção, na presença de alterações celulares de baixo grau e em baixa carga viral, asseguraria a presença precoce de células efetoras (T CD8) para eliminação do vírus9. Alguns autores observaram que a quantidade de células T CD8 ultrapassou largamente a presença de células T CD4 em amostras de cânceres invasivos9.
No presente estudo, ocorreu o contrário. A presença de linfócitos T CD4 foi observada em 87,5% das amostras com diagnóstico histopatológico de carcinoma, enquanto apenas cerca de 50% destas mesmas amostras demonstram igual proporção de células T CD8. Por outro lado, em outro estudo não houve diferença na densidade de células T CD4 e CD8 nas lesões intraepiteliais de baixo e alto grau22. A diferença com maior proporção de linfócitos T CD4 é esperada, uma vez que estas células seriam necessárias à ativação e proliferação dos linfócitos T CD8, através de ampla produção de citocinas20.
Células NK têm sido descritas, em pequena quantidade, em condiloma acuminado e em lesões de baixo grau, comparada a quantidade observada em lesões de alto grau23. A progressão da lesão para a forma maligna costuma ser acompanhada pela resistência das células neoplásicas à lise pela célula NK, fato reversível através da imunoterapia24. A resistência das células neoplásicas à lise pode ocorrer pela diminuição da expressão de moléculas de classe I (MHC I), necessária à discriminação pela NK da célula alvo ou mesmo pela produção de fatores supressores da NK25. A modulação da resposta imune poderia então, estimular a
expressão de MHCI ou a produção de citocinas tóxicas para a célula alvo, por parte da NK.
A presença da NK, portanto, é de grande importância nas fases iniciais da infecção, quando a paciente apresenta baixa carga viral, nos períodos que ainda não existe alteração celular ou esta é de baixo grau20. Neste estudo, foi constatado que as células NK estavam presentes nas amostras NIC I,NICII/II e com carga viral entre 100 e 1.000 RLU/PCB, ainda que em pequena quantidade, tal fato nos permite sugerir uma tentativa de controle da progressão da infecção pela resposta imune.
A análise da distribuição de células T CD4, TCD8 e células NK, segundo a carga viral, não revelou correlação estatística. Entretanto, como alguns estudos demonstraram que a carga viral de pacientes, de alto risco oncogênico, pode ser usada como marcador de progressão para lesão pré-cancerosa, a investigação da presença destas células em um número maior de amostras poderia elucidar melhor esta relação13,26,27.
A análise isolada das amostras NILM, também, negativas para a pesquisa de DNA de HPV, demonstrou raras células NK, predomínio de linfócitos T CD4, e poucos linfócitos T CD8, confirmando os achados da literatura que demonstram, normalmente, uma razão 2:1 de linfócitos T CD4 em relação ao T CD8, em amostras normais22.
Com os resultados deste estudo, consideramos que a estimulação adequada da resposta imune local, por estratégias como a utilização de vacinas terapêuticas, ou de tratamentos que estimulem a imunidade local no início da infecção, poderá contribuir para o controle da progressão neoplásica. Estudos em paralelo, investigando o papel das células T regulatórias (CD4/CD25), estão em desenvolvimento em nosso laboratório, para elucidar aspectos tais como a participação benéfica ou não dos linfócitos T CD4 na infecção pelo HPV.
Concluindo, de acordo com o estudo realizado, encontrou-se maior quantidade de linfócitos T CD4 em amostras NIC II/III, carcinoma e NILM, com associação estatística significante entre a presença destas células e o grau da alteração histopatológica. O predomínio de linfócitos T CD8 ocorreu em maior proporção nas amostras NIC II/III e em amostras cuja replicação viral está ocorrendo. As células NK, por sua vez, prevaleceram nas amostras com lesões de baixo grau e em amostras com baixa carga viral.
Este estudo comprovou que nas fases iniciais da replicação viral, onde não há ainda alterações celulares de alto grau, não temos a presença de células que possam desencadear a fase efetora da resposta.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
SUPORTE FINANCEIRO
O presente estudo foi financiado pela FUNDECT/MS (Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso do Sul).
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Endereço para correspondência: Profª Inês Aparecida Tozetti Deptº de Patologia/CCBS/UFMS Cidade Universitária s/n, Caixa Postal 549 79070-900 Campo Grande, MS Tel: 55 67 3345-7388 e-mail: [email protected]
Recebido para publicação em 25/02/2010 Aceito em 12/03/2010
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Jornal Brasileiro de Doenças InfecciosasVersão impressa ISSN 1413-8670
Braz J Infect Dis vol.8 no.1 Salvador fevereiro 2004
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-86702004000100001
MINI-REVIEW
Resposta imune celular ao HPV: conceitos atuais
Maria Alice Guimarães Gonçalves; EduardoAntonio Donadi
Divisão de Imunologia Aplicada, Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Correspondência
RESUMO
Embora a imunidade celular essencial para a eliminação de vírus do papiloma humano (HPV), os mecanismos envolvidos são ainda mal compreendidas. Resumimos os principais mecanismos envolvidos na resposta imune celular às infecções por HPV. Imunoterapias para cancros relacionados com HPV exigem a disrupção de células T de mecanismos de controlo de resposta, associada com a estimulação da resposta de citocinas tipo Th1.
Palavras-chave: vírus do papiloma humano (HPV), neoplasia intra-epitelial cervical (NIC), o câncer cervical uterino, a resposta imune celular, citocinas.
Os vírus são microorganismos intracelulares obrigatórios que infectam as células através de várias moléculas presentes na sua superfície, e através de outros receptores. A replicação viral interfere com a síntese de proteínas das células normais, levando a lesão e a morte das células infectadas (efeito citopático), a infecção é considerada líticos porque a célula infectada sofre lise. Não-citopáticos podem causar infecções latentes, durante o qual o vírus vivo intracelularmente e produzir as proteínas que podem ou não alterar as funções celulares. O objectivo da inata e adaptativa respostas imunes a vírus é bloquear a infecção e para eliminar as células infectadas [1].
Imunologia da infecção causada pelo papilomavírus humano (HPV) eo câncer de colo do útero
Mais de 80 tipos de papilomavírus humano (HPV), capazes de infectar seres humanos são conhecidas atualmente.Em tumores, e na maioria das lesões cancerosas do canal uterino, e menos frequentemente em lesões da vulva, ânus, pénis e de alto risco, o ADN do HPV são encontradas, ao passo que em lesões de menor gravidade, de baixo risco, o ADN do HPV são mais frequentes , por vezes associada a maior risco de ADN [2,3].
O HPV é um vírus de DNA dupla fita que contém cerca de 8.000 pares de bases. Duas regiões principais foram descritas: a região mais cedo, com 7-8 genes (E1-E8) e da região tarde, com dois genes (L1-L2). O primeiro contém a função de replicação viral de ADN (E1, E8), o controlo de transcrição (E2, E8), e transformação celular (E5, E6, E7 e). O L1 e L2 codificam para as proteínas de genes primários e secundários da cápside do respectivamente. A replicação do ADN viral ocorre nas células basais da epiderme, onde permanece em múltiplas cópias de uma forma estável, garantindo a persistência de células proliferativas no epitélio do [4].
A infecção pelo HPV tem um padrão de transição, em que a maioria dos indivíduos (70% a 90%) eliminar o vírus 12 a 24 meses após o diagnóstico inicial [4]. A persistência de HPV em 10% a 30% dos casos, é mais comum em casos oncogénicos e está fortemente associada ao desenvolvimento de alto grau intra-epiteliais escamosas de lesões (SIL) [5]. Há evidências de que a resposta humoral ou celular do hospedeiro imune é responsável pela progressão da infecção pelo HPV [6], uma vez que a vigilância imunitária afeta a susceptibilidade a lesões associadas ao HPV e sua regressão [7].
Embora a resposta imunológica a infecções pelo HPV cervicais não é completamente compreendido, sabe-se que o local e sistémica de vigilância imunitária pode explicar a latência da infecção por HPV genital. A infecção pelo HPV 16 manifesta-se, na grande maioria dos casos de grau I e II cervicais neoplasias intra-epiteliais (NIC), mesmo quando o vírus está associado com as outras potencialmente oncogénicos tipos virais, que regride espontaneamente na maior parte dos casos [2]. Por outro lado, o vírus é encontrada não associada com alterações histopatológicas, infecções latentes de HPV ocorre de forma assintomática em cerca de 30% a 40% das mulheres adultas sexualmente activos e em recém-nascidos [8], o que demonstra a actividade de mecanismos de defesa funcionais.
Papulose bowenóide é um exemplo típico da importância da reação imune para infecções genitais por HPV; apesar da associação com o HPV 16 e alterações histológicas, regressão espontânea ocorre com freqüência em pacientes jovens. Modificadores de resposta biológica e algumas citoquinas têm sido isolados
a partir de linhagens celulares a partir de papulose bowenóide vulvar. A regulação da libertação de citocinas (especialmente TNF- ), e a resposta à sua acção entre carcinogénico e não carcinogénica (HPV 16) + linhagens celulares, são indicações da função de vigilância imunológica local no controle da progressão tumoral [9]. Em outras palavras, a interacção de citocinas / quimiocinas libertado durante humoral / celular reacção imune é responsável pela regressão, persistência, ou o progresso de lesões associadas ao HPV.
A polarização da resposta imune para Th2 (Th) T-helper foi observado em mulheres com infecções por HPV, que evoluem para lesões de alto grau [6]. Estes desequilíbrios podem ter várias origens: hereditária (HLA induzido); adquiriu (devido à imunodeficiência adquirida - HIV), ou desencadeada em função da oncogenicidade do tipo de HPV encontrado. Se SILs e carcinomas in situ sair do controle imunológico parece depender de alterações no sistema celular do antigénio de apresentação, nos receptores de HLA, e no reconhecimento celular de oligopéptidos [10].
Existem outras formas de controlo, em células proliferativas infectadas pelo HPV que protegê-los contra a transformação maligna: 1) inibição da função de oncoproteína virai, e 2) bloqueio da transcrição do DNA do HPV (factor de interferência celular - CIF). No primeiro caso, a interrupção consistente da função do gene CDKN2A em células imortalizadas E6 indica que interfere INK4a funcionalmente com a actividade de transformação de E6. O segundo caso envolve uma modificação do factor de transcrição AP1, essencial para a expressão do gene do HPV e a indução da síntese endógena de antiviral do interferão- . Esta sequência não funcionar em células de cancro, o que indica que o TNF- cascata mediada é interrompida quando há transformação maligna [10].
A penetração do vírus no tracto genital
Recentemente, duas moléculas da família das integrinas, 6 e 1 6 4, expresso onthe superfície das células basais, têm sido identificados como receptores de HPV [11]. Devido à abrasão ou microlesões na superfície mucocutânea, HPV afeta camadas basal, em que as células proliferativas são mais susceptíveis, a junção escamo-colunar é a região mais comum para lesões associadas ao HPV. O vírus replica-se em seguida, expressar as suas proteínas precoces na camada proliferativa e mais tarde, em células mais diferenciadas, em que a síntese de proteínas da cápside tem lugar e as partículas virais são estruturados [12].
O epitélio é uma interface entre o vírus e o ambiente exterior, por um lado, e o sistema imunológico, por outro. O efeito da barreira imune é reforçada por outros elementos da imunidade local natural, ou seja, os bacilos Doderlein, acidez vaginal, secreção de defensinas (péptidos com actividade bacteriana e viricida) pelas células epiteliais, e a drenagem através do muco cervicovaginal. Este conjunto de factores na presença de uma infecção viral activa uma resposta imune adaptativa e específica [4,13].
Associado à mucosa tecido linfóide (MALT)
Tal como acontece com todos os compartimentos de MALT, mucosa genital tem locais de ambos os indutores e os locais efectoras envolvidas na resposta imune. O trato genital feminino tem poucos folículos linfóides, que são unidades ativas do sítio indutor da resposta imune MALT [14]. O acesso a antigénios microbianos, a este nível também parece ser limitada, uma vez que este não tem epitélio M (Microfold) células, que se especializam no transporte de antigénios e são uma
parte essencial do principal meio de acesso de patogénios virais para os folículos linfóides [4].
Portanto, os caminhos indutor aferentes no tracto genital feminino envolvem principalmente células de Langerhans, macrófagos, e formações linfóides no cório [13]. MALT consiste de várias populações de células linfóides, incluindo as células de Langerhans múltiplas. Estas células, assim como os queratinocitos do epitélio cervical, expressar os de histocompatibilidade maior (MHC) de classe II, e participam activamente na apresentação de antígenos [15]. A infecção pelo HPV cervical aparentemente causa uma disfunção imune local, com uma diminuição de células apresentadoras de antigénio intraepiteliais [16] e os linfócitos T [17]. Assim, a infecção por HPV podem interferir com os mecanismos locais de vigilância imune, tanto na fase de indução (apresentação de antigénio) e na fase efectora (geração de células T citotóxicas e de células B produtoras de anticorpos). O mecanismo desta interferência é desconhecida, no entanto, dados recentes sugerem que a acção imunomoduladora de citocinas é um factor determinante [18].
As células apresentadoras de antigénio (APC-)
As células de Langerhans
As múltiplas camadas do epitélio da mucosa cervical conter as células de Langerhans, que possuem HLA classe I e II e as moléculas de participar activamente na apresentação de antígenos [15].
Células de Langerhans estão localizados principalmente na camada de epitélio escamoso cervical e eles reagem positivamente a antígenos HLA-DR [19]. A sua concentração no epitélio cervical é mais elevada do que na vagina, o que indica um indutor da imunidade localizada genital [4]. Células de Langerhans capturar o antígeno no epitélio e enviá-lo para os nódulos linfáticos, onde CD 4 linfócitos são ativados, estes em seguida, multiplicar e diferenciar. O aumento no número de células de Langerhans ocorre devido ao factor de necrose tumoral (TNF- ), produzido pelos queratinócitos [20]. A diminuição da síntese de TNF- ocorre em infecções por HPV, associada a uma diminuição na expressão da molécula co-estimuladora B7.1 [12], o que resulta numa diminuição da capacidade de apresentação de células de Langerhans.
Diversas subpopulações de células de Langerhans são conhecidos, e há controvérsias sobre a forma como eles são afetados por HPV e NIC. Tem sido sugerido que a infecção por HPV 16 e 18 reduz o número de células de Langerhans. [20] Por outro lado, a densidade média de S100 + células de Langerhans é significativamente maior em pacientes com carcinoma cervical uterino do que naqueles com cervicite [16]. No entanto, alguns estudos demonstraram uma diminuição e outros um aumento no número de células de Langerhans, com as alterações da sua morfologia em pacientes em diversas fases de CIN. Este fenómeno pode ser devido a diferentes tipos de infecções por HPV, criando diferentes efeitos citopáticos. Enquanto certos tipos de infecções por HPV levar a proliferação celular, a progressão para NIC e câncer invasivo é mediada por outros fatores de iniciação, como tabagismo e infecção pelo herpes vírus. No caso de infecções persistentes do HPV, com coilocitose associada com CIN, o esgotamento contínuo de resultados em densidades de células de Langerhans intermediários. Se a infecção se torna não permissiva, o efeito citopático do vírus é perdido; não mais coilócitos são observados e o aumento do número de células de Langerhans é relacionada com a presença de CIN [16,21].
A expressão de moléculas HLA-DR por aumentos de células de Langerhans, em lesões e na koilocytic CIN I e II, bem como a expressão de HLA-DQ é também significativamente mais elevada em todos os graus de NIC, embora seja mais evidente na CIN I [21].
Queratinócitos
Queratinócitos têm o potencial para apresentar péptidos virais, uma vez que o HPV multiplica dentro destas células sem induzir a lise. Contudo, os queratinócitos não expressam moléculas de HLA de classe II de forma constitutiva, mas apenas de forma indutiva, especialmente sob o efeito de IFN- . Por outro lado, também não expressam B7.1 (CD 80 ) e B7.2 (CD 86 ) moléculas costimulant, que são essenciais para a indução de uma resposta específica do tipo destrutivo e, portanto, essas células são mais susceptíveis a um estado de tolerância específica ou anérgica [11]. Em suma, os queratinócitos são ambos a principal fonte de citocinas epiteliais e o principal alvo dos HPVs [18].
Macrófagos
As populações de monócitos / macrófagos foram encontrados na mucosa do tracto uterino e na vagina [14]. Em lesões de alto grau, um aumento no número de macrófagos tem sido observada em paralelo com uma diminuição de células de Langerhans, ao contrário do que ocorre em tecidos não-infectados. A presença de macrófagos pode ser um indicador da regressão da lesão. Participação de macrófagos em uma resposta imunitária protectora é evidente através do seu papel indirecto no controlo negativo da transcrição dos genes que codificam oncoproteínas E6 e E7, e através das suas funções anti-tumorais em células transformadas por HPV-[22].
Papel de moléculas de MHC na resposta ao HPV
No início de uma resposta imune eficiente, as proteínas virais são apresentados por APCs e as células infectadas por vírus são destruídas. Antigénios virais são fragmentados pelas proteossomas nas sequências peptídicas curtas, exportadas para o retículo endoplasmático do TAP1 e TAP2 moléculas de transporte, e são finalmente associado com a classe I de moléculas MHC. Depois de passar através do aparelho de Golgi e passando por glicosilação, o complexo resultante é rapidamente expressa na membrana celular e o péptido é apresentado aos CD 8 linfócitos-T. A interacção entre o antigénio / molécula de MHC de classe I e do TCR (receptor de linfócitos T) ativa os CTLs. A síntese e libertação de perforina e granzima pelos linfócitos activados provoca a lise das células infectadas [13,23].
No entanto, mesmo quando as proteínas E6 e E7 são fortemente expressas pelos queratinócitos, os CTLs que parecem não reconhecer. Isto pode ocorrer como resultado de uma deficiência na apresentação de epitopos virais durante o longo período de latência entre o início da infecção e ao aparecimento de cancro, independentemente do tipo de APC. Por conseguinte, a actividade de moléculas de MHC parece ser um factor determinante na indução de uma resposta imune adaptativa [13].
No entanto, nas lesões pré-cancerosas e cancerosas, um defeito da apresentação do antigénio, devido a uma diminuição na expressão de moléculas MHC classe I e proteínas TAP, seria responsável pela ineficiência da imunidade celular [23]. Esta deficiência está directamente relacionada com uma alteração na expressão de genes do MHC. Uma vez que a integração do ADN de HPV de alto risco no genoma celular, por vezes, ocorre próximo doc-myc gene, a sobre-expressão deste gene
poderia diminuir a expressão das moléculas de HLA-A e B genes [24].A expressão dos genes e das proteínas de proteassoma TAP localizadas nos genes de MHC também pode ser reduzida. Uma redução na expressão de proteínas TAP podem por sua vez impede a formação de, ou desestabilizar o péptido viral / complexo MHC de classe I, comprometendo a apresentação dos péptidos virais, e as alterações dos proteossomas de degradação de proteínas virais pode modificar a imunogenicidade da péptidos virais.
A imunidade inata contra vírus
Os interferões (IFNs)
Os interferões são moléculas (IFN- , IFN- ) que são sintetizadas por células infectadas, que luta contra a replicação do vírus nas células hospedeiras. Eles agem estimulando a síntese de uma proteína-quinase que bloqueia a iniciação da tradução de proteínas virais e de uma 2'-5 'A sintetase que, ao activar endoribonucleases, permite que a degradação do mRNA viral e celular. Eles também activar a síntese e expressão de moléculas MHC classe I, o que facilita a apresentação de epitopos virais e o aumento da capacidade citotóxica dos linfócitos T e as células NK. Outra molécula de IFN (IFN- ), produzido pela T activadas e células NK, induz a expressão de moléculas de MHC de classe II na superfície dos queratinócitos e os monócitos / macrófagos, permitindo-lhes actuar como APC, e, subsequentemente, eles activam o resposta imune anti-viral. Verificou-se que IFN- bloqueia a expressão do mRNA do HPV 18 das células derivadas do cancro do colo do útero. [25]
Fatores de necrose tumoral (TNF)
Estas citocinas, codificadas pelos genes situados no centro do MHC, é essencialmente sintetizado por monócitos / macrófagos (TNF- ) e por linfócitos T (TNF- ), mas especificamente por ajudantes T com um perfil Th1. Eles têm uma forte ação antiviral e antitumoral. TNF- reduz a expressão dos genes E6/E7 em células infectadas por HPV 16 ou 18, que ainda não tenham sido transformadas, no entanto, durante a progressão tumoral, as células infectadas por HPV-se insensível ao TNF- [9].
TGF-
Este factor de crescimento é produzida pelas células epiteliais e tem um papel importante na imunossupressão, a inibição da actividade das células NK, a expressão de moléculas de MHC de classe II, e a produção de linfócitos T citotóxicos. Inibe a proliferação de células, incluindo a maioria das pessoas infectadas pelo HPV [26], que podem ou não inibir a expressão do mRNA de proteínas E6 e E7, uma vez que toda a progressão tumoral, as células tornam-se resistentes ao TGF- [18].
Células natural killer (NK)
Um pequeno número de células NK foram observados no condiloma acuminado e, ligeira a moderada, displasias, enquanto que em displasias graves ocorre um aumento de [27]. À medida que estas lesões progridem para o cancro, que se tornam resistentes a células NK. No entanto, eles são sensíveis à lise de linfócitos activados por linfoquinas. Esta lise pode ser reforçada quando as células cervicais são tratados com leukoregulin. Em contraste, o tratamento com IFN- pode resultar em menor sensibilidade a linfoquina activada por lise, que ilustra a influência que exercem sobre as citocinas podem controle imunológico de cervical cancer [7].
Em pacientes portadores de estágio I ou II carcinoma invasivo do colo do útero, atividade das células NK é reduzida. Em muitos casos de cancro do colo do útero, as células NK foram detectados, mas eles são dispersos e a sua frequência não está relacionada com o grau do câncer e prognóstico [27]. No entanto, os doentes com tumores que não são muito diferenciados ou disseminada têm uma menor actividade das células NK do que aqueles com tumores bem diferenciados ou localizada. [27] A redução na atividade de células NK em pacientes com câncer não é, contudo, um fenômeno irreversível, uma vez que esta atividade pode ser restaurada através de imuno resposta imune adaptativa a infecções de vírus terapia. Activação celular pode ser aumentada através de células NK activadas por linfocina, bem como através do aumento de IFN- níveis [27].
Resposta imune adaptativa a infecções por vírus
Os linfócitos T
Mais linfócitos T no epitélio cervical pertencem ao CD 8 subgrupo supressoras / citotóxicas e, em menor número, ao CD 4 subgrupo auxiliar / indutor, ambas as quais são encontradas exclusivamente nas camadas basais do epitélio escamoso e também pode ocorrer em grandes números na zona de transformação ectocervical [13].Endocérvix contém células T, células B e macrófagos intra-epiteliais, com alguns CD 4 e CD 8 células (<2%) que expressa o CD 25 molécula (receptor IL-2), que é um sinal bem conhecida da activação celular [ 15].
A activação de uma célula citotóxica ou auxiliar é um processo complexo em que um APC deve fornecer pelo menos dois sinais. Sinal 1 é fornecido por um peptídeo estranho ligado à molécula de MHC de classe II na superfície da célula que apresenta, que activa o complexo receptor da célula T (TCR). Sinal 2 é proporcionada por um sinal quimico, pela interleucina-1, ou pela molécula B7, sendo esta última ligada à membrana plasmática do APC. Esta molécula é reconhecido por um co-receptor proteico denominado CD 28 , presente na superfície da célula T-helper e um membro da superfamília de IgG [12,28].
Em mulheres saudáveis, a estimulação de linfócitos periféricos com fragmentos antigénicos de E6, E7 e L1 de HPV a induz a proliferação de células específicas, especialmente células de memória [29]. Linfócitos CTL específicos para as regiões antigénicas de E6 e E7 de HPV 16 e 18 foram detectados no sangue periférico de pacientes com lesões de alto grau [30] e aqueles com infiltração de tumores cervicais HPV + [31]. Alguns autores observaram que um CD 4 resposta linfoproliferativa para a porção C-terminal da E2 [3], foi associada a uma maior probabilidade de eliminar a infecção pelo HPV. A infiltração celular, composto essencialmente de CD 4 e macrófagos, é frequentemente encontrada em condilomas sob regressão espontânea [32], enquanto que em pacientes com adquirido ou iatrogénica celular prevalência de imunodeficiência maior de lesões associadas ao HPV é observada, bem como uma maior progressão lesões pré-invasivas para [33].
A imunidade celular desempenha um papel determinante na fase inicial da infecção e é a única resposta eficaz contra HPV não-líticos, que também está envolvida na resposta imune a neoplasia. Normalmente, cerca de 60% dos linfócitos T do sangue periférico são CD 4
+ e de 20% a 30% são CD 8 + (2/1), no entanto, em doentes com
CIN / cancro da proporção de CD 4 / CD 8 é diminuir (1,4). Localmente, no infiltrado linfocítico, ocorre o inverso, uma vez que em lesões pré-cancerosas do número de CD 4 é maior do que o número de CD 8 , a qual mostra que a predominância de CD 4 células favorece regressão, enquanto CD 8 linfócitos pode significar a persistência e progressão da infecção viral [34].
Citocinas
As citocinas são produtos de várias células linfóides e não linfóides e constituem uma importante rede de mediadores solúveis que facilitam a célula-a-célula no sistema de interacções MALT e no tecido linfóide associado à pele (SAL) [35]. Com base no padrão de produção de citocinas, células Th são classificados em dois grupos distintos: Th1 e Th2. Células Th1 produzem IL-2, IFN- , e linfotoxina, promovem a imunidade celular, e são necessárias para as respostas eficazes em casos de agentes patogénicos intracelulares (tais como vírus), e para as células tumorais. As células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, e que favorecem a imunidade humoral contra patógenos extracelulares e respostas alérgicas [9]. A regulação da resposta imunológica também é controlada por citocinas produzidas por não-T-células, conhecidas como sendo do tipo 1 e 2 de citocinas. Por exemplo, IL-2 é produzida por APCs (monócitos e células dendríticas) e células B, e é necessário para a diferenciação de células Th1 eficaz [36]. Outra classificação de citocinas é baseado no tipo de efeito produzido: citocinas (IL-1, TNF- ), por exemplo, exercer efeitos pleomórficas in vivo e são conhecidas como citoquinas primárias. Eles têm a capacidade de induzir a síntese de outros mediadores, as citocinas ditas secundárias ou quimiocinas, que são, por sua vez responsável pela activação das células linfóides e para a quimiotaxia [37].
As células do epitélio estratificado e queratinócitos são as principais fontes de citocinas [37]. Citocinas actuam através de receptores específicos, que podem ser expressas de várias formas em que as células infectadas por HPV ou eles podem ser libertados para o espaço intracelular, e dali para a microcirculação. Essas formas solúveis de receptores de citocinas podem afectar significativamente a actividade imunorreguladora de citocinas, não apenas intermediar a reacções imunes e inflamatórias, mas também regula a proliferação, diferenciação celular e apoptose [1].
Polarização para o padrão de Th2 explica uma resposta imune celular deficiente contra HPV e neoplasias, e parece facilitar a progressão tumoral [20], uma vez que o desvio para Th2 estimula a resposta imune humoral e inibe a resposta celular. Em pacientes com lesões pré-neoplásicas [38], desequilibradas respostas mytogenic foram detectados, bem como a redução da expressão de TCR- receptor [39], e da produção de citoquinas alterada após activação celular [40]. Verificou-se que o padrão de tipo Th1 (IL-2, IFN- e TNF- ) está associado com a regressão de verrugas [41], enquanto que os níveis baixos de IFN- estão relacionados com carcinoma cervical com um prognóstico pior [ 42]. Além disso, a produção de IL-2 em lesões pré-invasivas diminui à medida que a gravidade dos aumentos de doenças [43].
Imunes mecanismos de evasão em vírus
Vírus, bem como células de tumor, são também capazes de desenvolver mecanismos de escape a partir da resposta imunitária. Barnard & McMillan [44] mostraram que a proteína E7 de HPV 16 inibe a indução de IFN- , genes activados, mas não a indução de IFN- genes indutíveis, portanto, interferir com a eliminação eficaz do HPV. Shneider et al. [45] também observada uma resposta fraca ao tratamento com IFN- em HPV 16 e 18 lesões em comparação com a resposta a HPV6 e 11 lesões induzidas.
Embora alguns pacientes HPV apresentar uma resposta Th1 significativa visando E7 e E2 e eficazmente eliminar o vírus em outros pacientes com NIC ou carcinoma das respostas de células T para o E7 de HPV de não resolver a lesão. Este fato pode ser um reflexo de mecanismos de escape ao nível efetor [46] ou a um nível-alvo [47].
CTL é a célula efectora mais comum e é responsável pelo reconhecimento do complexo MHC de classe I e os péptidos virais presentes. No entanto, em CINs e em carcinoma cervical há uma diminuição significativa na expressão de MHC de classe I
de moléculas. Ao mesmo tempo, verifica-se que as células metastáticas apresentar um maior número de MHC de classe I de células em comparação com as células do tumor primário, o que sugere a existência de uma selecção de células tumorais, que são resistentes à acção dos CTLs. Recentemente, os estudos com as células cancerosas mostrou que estas alterações na regulação da expressão de moléculas de MHC I resultam de vários mecanismos genéticos e ocorrem em cerca de 90% dos tumores [48].
Os queratinócitos infectados por HPV pode modificar a resposta imune de várias formas: por meio da secreção de várias citocinas (IL-1 , IL-6, IL-8, TNF- , TGF- ) [26] e os receptores solúveis de TNF- [9], ou através da produção de citocinas do tipo Th2 (IL-4 e 10), em carcinomas epidermóides, a configuração de um mecanismo de evasão contra a resposta de células T mediada imune [49].
Imunoterapias e vacinas
O propósito de estudar factores que regulam a resposta imune ao HPV é ajudar a desenvolver imunoterapias / vacinas que combate associadas ao HPV vírus e tumores. Quando a profilaxia da infecção é desejada, L1 partículas são utilizados sozinhos, ou os vários tipos de HPV de partículas tipo vírus (VLPs) de L1 e L2, no entanto, se o foco é um efeito terapêutico, algumas proteínas precoces E6, em particular, e E7, têm sido propostos como antigénios vacinais, porque eles estão directamente envolvidos na proliferação descontrolada e transformação celular [50].
Recentemente, os ensaios clínicos têm mostrado resultados promissores, quando uma vacina VLP L1 profiláctico é usado para reduzir o aparecimento de novos casos de infecção por HPV. Soroconversão foi observada em 99,7% das mulheres vacinadas, e os efeitos adversos e toxicidade são desprezíveis [51]. No entanto, é importante que as vacinas focar os 4 ou 5 tipos mais comuns de HPV de alto risco, a fim de tratar de 80% a 90% dos cancros cervicais [10]. Vacinas profiláticas deve ser utilizado em mulheres jovens no início de sua vida sexual, especialmente nos países em desenvolvimento, porque eles são considerados a maior população de risco. No entanto, algumas questões práticas ainda precisam ser resolvidas antes de uso em larga escala terapêutica deste tipo de vacina [52].
Vacinas imunoterapêuticas podem ser baseadas em peptídeos, proteínas, partículas VLP quiméricas, DNA, vectores virais e bacterianas, células dendríticas e células tumorais modificadas. Em contraste com as vacinas de vírus vivos atenuados, que estimulam a imunidade através de replicação aberrante, vacinas baseadas em DNA são incapazes de propagação, e na sua capacidade para produzir imunidade é limitada. Alguns esforços foram feitos para resolver este problema, como a concepção de uma vacina contra o HPV16 ligado a M. tuberculosis proteína de choque térmico 70. Esta composição foi testada em animais e um aumento de 30 vezes foi observada em CD 8
+ células específicas para oncoproteína E7. No entanto, o uso de oncoproteínas em seres humanos é ainda controversa, devido ao seu potencial mutagénico. [53]
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Correspondência para o Dr. Maria Alice G. Gonçalves Divisão de Imunologia Clínica, Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo Av. Prof. Bandeirantes, 3,9 mil 14049-900 Ribeirão Preto, SP, Brasil Telefone: (55 16) 602-2566, Fax: (55 16) 633-6695 E-mail: [email protected]
Recebido em 20 de setembro de 2003 revisto 15 dez 2003
Pais e médicos precisam conhecer e recomendar as vacinas contra HPV
As vacinas contra os tipos mais agressivos de Papilomavírus Humano (HPV) são muito bem-vindas, pois vão reduzir a incidência do câncer cervical uterino, diminuirão o estresse provocado por resultados anormais nos exames citológicos ou pelo diagnóstico de uma doença infecciosa sexualmente transmitida e pouparão gastos referentes aos cuidados com a saúde1. Mas para atingir tais benefícios, é indispensável que a vacina seja realmente aceita pelos grupos de pessoas nos quais ela será indicada, isto é, nos jovens ou crianças pré-adolescentes. Esta aceitação envolve aspectos muito peculiares, sendo indispensável avaliar a percepção do problema pelos diversos atores envolvidos como os usuários, suas famílias, os profissionais da área da saúde (com suas respectivas instituições) e a sociedade em geral2.
Nas decisões sobre o emprego da vacina deve-se encarar a progressiva redução da idade com que rapazes e moças do mundo ocidental iniciam a atividade sexual. Um estudo de 2005, nos Estados Unidos, constatou que 5,7% das meninas e 7,9% dos meninos já tinham se iniciado nas práticas sexuais. Desta forma, a vacinação deve ser indicada para pré-adolescentes ou jovens no início da adolescência para obter o maior benefício possível da prevenção3.
Recentes estudos de campo procuram esclarecer o grau de conhecimento das mulheres sobre o HPV e as principais variáveis que têm influência na citada percepção quanto ao emprego da vacina. Muitos destes estudos procedem da Europa e América do Norte, pois não existem trabalhos brasileiros correspondentes, encontrando-se apenas os realizados com mulheres já portadoras de HPV.
Como o benefício da vacina só ocorre para pessoas que ainda não contraíram a infecção pelo HIV, os alvos principais das campanhas de vacinação deverão ser jovens na pré-adolescência e na adolescência precoce. Pesquisas feitas com a vacina contra hepatite B nestes grupos etários mostram que os indivíduos confiam nos pais para questões de vacina4.
Os profissionais da área da saúde têm papel importante no sentido de influenciar os pais e os usuários para a aceitação da vacina contra HPV. É preciso que eles desenvolvam conhecimentos e habilidades para tal tarefa. Além disso, nos Estados Unidos já se demonstrou que o grau de endosso destes profissionais às imunizações, de modo geral, depende muito da recomendação das associações de classe.
PAULO ALIGIERI
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Associação Médica Brasileira
R. São Carlos do Pinhal, 32401333-903 São Paulo SP - Brazil
Cadernos de Saúde PúblicaPrint version ISSN 0102-311X
Cad. Saúde Pública vol.27 no.4 Rio de Janeiro Apr. 2011
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-311X2011000400016
ARTIGO ARTICLE
Prevalência de infecção genital pelo HPV em populações urbana e rural da Amazônia Oriental Brasileira
Prevalence of genital HPV infection in urban and rural women in the Eastern Brazilian Amazon
Denise da Silva PintoI ,II; Hellen Thais FuziiI; Juarez Antônio Simões QuaresmaI, III
INúcleo de Medicina Tropical, Universidade Federal do Pará, Belém, Brasil IICentro Universitário do Pará, Belém, Brasil IIIUniversidade do Estado do Pará, Belém, Brasil
Correspondência
RESUMO
Foram investigados a prevalência e os fatores associados à infecção genital pelo HPV em mulheres de população urbana e rural de duas regiões da Amazônia Oriental brasileira. Foi um estudo transversal com 444 mulheres submetidas ao rastreamento para câncer cervical, sendo 233 urbanas e 211 rurais, de janeiro de 2008 a março de 2010. Coletaram-se amostras da cérvice uterina para a pesquisa de DNA do HPV pela PCR. Todas responderam a um formulário epidemiológico. Análise bivariada e por regressão logística foram empregadas na investigação dos fatores associados ao HPV. A prevalência geral de HPV foi de 14,6%. Entre as populações, não houve diferença significativa, 15% urbana e 14,2% rural. O único fator de risco explorado no estudo significativamente associado ao HPV foi a situação conjugal de mulheres residentes na zona rural na faixa de 13 a 25 anos, com maior prevalência de infecção entre solteiras, separadas ou viúvas. Conclui-se
que, apesar das prevalências entre as populações serem semelhantes, as estratégias preventivas a serem aplicadas seriam específicas para cada população.
Infecções por Papillomavirus; Colo do Útero; Mulheres
ABSTRACT
This study investigated the prevalence and risk factors for genital infection with HPV in women from rural and urban areas in two different regions of the Eastern Brazilian Amazon. A cross-sectional survey was performed in Pap screening programs, with a total sample of 444 women (233 urban and 211 rural). Uterine cervical swabs were collected for the detection of HPV DNA with the established PCR assay using MY09-MY11. All volunteers answered an epidemiological questionnaire. Bivariate and multivariate logistic regression analyses were performed to identify risk factors associated with HPV infection. Overall prevalence of HPV infection was 14.6% (15% in urban women and 14.2% in rural). The only factor associated with HPV was marital status in the 13-25-year-old rural population, with higher HPV prevalence among single and divorced women and widows. The findings indicate the need for risk factor control strategies targeted specifically to women in rural and urban areas.
Papillomavirus Infections; Cervix Uteri; Women
Introdução
No Brasil, estima-se que o câncer do colo uterino seja o terceiro mais comum na população feminina, sendo superado pelo câncer de pele não melanoma e pelo câncer de mama. Representa a segunda causa de óbito por câncer entre mulheres, com uma taxa de mortalidade de aproximadamente 4,61 por 100 mil mulheres, no ano de 2002, sendo o pico de incidência por idade entre 40 e 60 anos. As estimativas do Instituto Nacional de Câncer (INCA) apontam 18.430 novos casos de câncer do colo do útero no Brasil para o ano de 2010, sendo 1.820 novos casos somente na Região Norte. No Estado do Pará, localizado na Região Norte do país, que representa uma das áreas mais acometidas, deverão surgir, no mesmo ano, 790 novos casos da doença, sendo 330 somente na capital, Belém 1,2.
Diversos fatores já foram apontados na literatura como predisponentes ao desenvolvimento de lesões do colo do útero. Aspectos sociodemográficos, comportamentais, sexuais, contraceptivos, reprodutivos e/ou clínicos tornam a mulher mais susceptível a outros fatores mais diretamente envolvidos na carcinogênese cervical, tais como inflamação local e infecção por HPV. O último é apontado pela literatura como condição necessária ao desenvolvimento de lesão intraepitelial de alto grau e câncer invasivo do colo do útero, pois o DNA viral do HPV está presente em mais de 90% das lesões pré-neoplásicas e neoplásicas cervicais 3,4,5,6.
O Estado do Pará, localizado na porção oriental da Amazônia brasileira, apresenta uma das maiores prevalências de câncer cervical no Brasil. Sua população apresenta peculiaridades sociais e comportamentais distintas entre agregados
urbanos e rurais. Este estudo objetivou investigar os diferentes fatores de risco envolvidos no desenvolvimento do câncer cervical tais como fatores sociodemográficos, comportamentais e clínicos peculiares de população urbana e rural, juntamente com a detecção molecular do HPV, a fim de fornecer subsídios específicos para programas regionalizados de prevenção e manejo desta morbidade.
Metodologia
Trata-se de um estudo analítico do tipo transversal, realizado em duas regiões distintas da Amazônia Oriental Brasileira, sendo uma considerada urbana e a outra considerada rural.
A amostra urbana foi composta por mulheres atendidas na Unidade Materno-Infantil do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade do Estado do Pará, localizada no Município de Belém. A unidade é uma das referências para prevenção de câncer uterino, atendendo à demanda dos diversos bairros de Belém e região metropolitana.
O tamanho da amostra foi calculado tendo em conta um grau de 95% de confiança e uma taxa de erro absoluto de 5% para uma população infinita. No cálculo foi utilizada uma prevalência geral estimada da infecção genital por qualquer tipo de HPV de 25% em mulheres brasileiras de 18 a 60 anos residentes em meio urbano, de acordo com os estudos de Franco et al. 7. Dessa forma, para esta população, estimou-se o recrutamento inicial de 289 mulheres, mas permaneceram no estudo 233 amostras com material cervical viável para os testes moleculares de pesquisa do HPV, coletadas no período de janeiro a junho de 2008.
A amostra rural foi composta por mulheres residentes no Município de Tucuruí, situado a 426km a sudeste de Belém. Foram incluídas no estudo mulheres cadastradas no Programa Saúde da Família da região do lago da Usina Hidrelétrica de Tucuruí - Pará (UHE), sendo esta população composta por mulheres residentes nas margens esquerda e direita do lago da UHE, incluindo as ilhas e a porção continental. De acordo com os dados obtidos no Sistema de Informação da Atenção Básica (SIAB; http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?siab/cnv/SIABFpa, acessado em 30/Mar/2009), a população feminina de 15 a 79 anos cadastrada na área de abrangência no início do estudo era de aproximadamente 1.119 mulheres.
O tamanho da amostra para esta população foi calculado com um grau de 95% de confiança e uma taxa de erro absoluto de 5% para uma população finita de 1.119 habitantes do sexo feminino. No cálculo foi utilizada uma prevalência geral estimada da infecção genital por qualquer tipo de HPV de 26,6% em mulheres brasileiras de 15 a 63 anos residentes em zona rural, de acordo com os estudos de Soares et al. 8. Assim, para esta população, foi estimado um recrutamento inicial de 235 mulheres, permanecendo 211 amostras com material cervical viável para os testes moleculares de pesquisa do HPV, coletadas no período de março de 2009 a março de 2010.
As participantes que compuseram as amostra urbana e rural do estudo foram selecionadas entre mulheres sexualmente ativas que compareceram para rastreamento de rotina do câncer cervical em serviços de atenção básica de saúde das regiões envolvidas no estudo no período de janeiro 2008 a março de 2010, sendo incluídas mulheres que aceitaram voluntariamente realizar o teste de rastreamento molecular do HPV e responder ao formulário do estudo, com idade entre 13 e 75 anos, com útero e/ou colo presente e funções cognitivas preservadas no momento da coleta de dados.
O instrumento utilizado consistiu em um formulário clínico e epidemiológico padrão, aplicado antes da realização da consulta ginecológica, dividido nas seguintes partes: informações sociodemográficas e comportamentais; história sexual; história anticoncepcional; história reprodutiva; história ginecológica e dados laboratoriais (resultados dos exames). A coleta dos dados se deu por entrevistadores previamente treinados a fim de se evitar o viés de informação.
Os procedimentos da colpocitologia foram realizados com a mulher em posição ginecológica. Introduziu-se em sua vagina o espéculo de Collins para a visualização do colo do útero e do conteúdo vaginal. Nesse momento foram coletadas as amostras cervicais para a colpocitologia e biologia molecular. Os resultados da citologia foram classificados de acordo com o Sistema de Bethesda (2001) adotado pela Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais 9,10.
Para a obtenção de DNA das células cervicais, após a realização do esfregaço celular em lâmina, a escova cervical estéril (citobrush) contendo o material coletado foi mergulhada em um tubo de 15mL com PBS (solução salina tamponada com fosfato), no qual foi lavada em PBS para que as células ficassem em suspensão. Em seguida, o tubo foi centrifugado a 2.000rpm para a precipitação das células cervicais, sendo então lavadas três vezes em PBS. Na última lavagem, ficaram 200μL de PBS sobre o pellet de células e, em seguida, a amostra foi congelada em freezer -20ºC. A extração do DNA foi realizada utilizando o kit GFX (GE Healthcare).
Em seguida, para a pesquisa do DNA do HPV, foi empregado o método de reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo utilizado para controle da extração um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) R e F, que amplificaram o gene da globina, com a presença da globina atestando a qualidade da amostra cervical coletada, ou seja, existia DNA adequado para a PCR.
Ao longo do procedimento de PCR, para cada 1μL de amostra testada, a cada reação foram utilizados 100ng de DNA em 20μL de tampão 10x buffer composto por 20mM de Tris-HCl (pH 8,4 ou 8,6), 0,25-1,5mM de MgCl2, 50mM de KCl; além disso foram acrescentados à reação 0,02mM de DNTP, 200nM de primers universais MY9 e MY11 para detecção geral de HPV e 0,25 unidades de Taq DNA polimerase. Os primers universais MY9 e MY11 são capazes de detectar os diferentes tipos de HPV em razão de seu anelamento em uma área bem delimitada e conservada do genoma viral (L1). A seguir, no aparelho termociclador, estas reações consistiram em um ciclo de desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos e de 35 ciclos de amplificação de PCR. Cada ciclo consistiu em 94ºC por 30 segundos, 52ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos. A extensão final do DNA amplificado ocorreu a 72ºC por 5 minutos. Em seguida, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1% em TBE 1x. As amostras foram consideradas positivas quando o produto da PCR em gel de agarose apresentou uma banda de 440 pares de base à visualização fotográfica no Genlianse da PerkinElmer (Waltham, Estados Unidos) pelo programa GeneSnap (Syngene; http://www.syngene.com/genesnap). Tais procedimentos foram realizados de acordo com o protocolo descrito por Bernard et al. 11.
O programa Excel 2007 (Microsoft Corp., Estados Unidos) foi adotado para entrada dos dados, bem como para a confecção das tabelas e gráficos, e a análise estatística foi realizada por meio dos programas Epi Info 3.5.1 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Estados Unidos) e BioEstat 5.0 (Sociedade Civil Mamirauá, Manaus, Brasil). Na análise univariada, obteve-se para todo o grupo e separadamente nas duas populações estudadas, a prevalência da infecção pelo HPV, bem como a distribuição de frequências, medidas de dispersão e de tendência central das variáveis independentes.
Para uma investigação mais detalhada dos fatores de risco possivelmente associados à infecção por HPV para todo o grupo e separadamente nas duas populações estudadas, procedeu-se a uma estratificação dos dados por três faixas etárias (13 a 25 anos, 26 a 44 anos e 45 ou mais anos), sendo então empregado, na análise bivariada, o cálculo das razões de prevalências (RP) com a significância estatística verificada pelo teste do qui-quadrado (χ2) e/ou exato de Fisher, considerando-se nível alfa de 5%. As variáveis independentes com valor de p < 0,2 na análise bivariada estratificada por faixa etária foram incluídas em um modelo de regressão logística múltipla não condicional, sendo realizado apenas o ajuste da variável "número de parceiros sexuais durante a vida" pela variável "uso de preservativos" no modelo final em todas as faixas etárias.
O presente estudo esteve inserido no projeto Infecção pelo HPV e Câncer Cervical: Correlação Clínico-Epidemiológica e Fatores de Risco em Populações Distintas da Amazônia Brasileira, da Universidade Federal do Pará (UFPA) e contou com o apoio financeiro do Ministério da Saúde e da Organização das Nações Unidas para a Educação, Ciência e Cultura (UNESCO), estando aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa para Seres Humanos do Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará (parecer nº. 171/2005-CEP/NMT).
Resultados
Das 444 mulheres recrutadas, 233 mulheres (52,5%) constituíram a amostra urbana e 211 (47,5%) compuseram a amostra rural, sendo a somatória das duas a população denominada geral. A média e a mediana de idade das mulheres de área urbana foram de 36,9 ± 11,4 anos e 34 anos, respectivamente, ao passo que as mulheres da área rural tinham média e mediana de idade de 34,1 ± 12,5 anos e 33 anos, respectivamente.
Entre 444 mulheres estudadas, 14,6% (IC95%: 11,4%-17,9%) apresentavam infecção genital pelo HPV, e a prevalência dessa infecção variou entre 15% (IC95%: 10,7%-20,3%) para a amostra urbana e 14,2% (IC95%: 9,8%-19,7%) na amostra rural, não ocorrendo diferença significativa entre os locais de recrutamento, mesmo considerando a estratificação por faixas de idade.
Em relação à citologia cervical, 2,9% das 444 amostras coletadas nas referidas populações da Amazônia Oriental foram consideradas insatisfatórias para o exame, ficando, portanto, sem o resultado citológico. No geral, entre as 431 mulheres com amostras satisfatórias para o exame, 97,2% tiveram um resultado normal ou inflamatório na citologia e 2,8% com alterações. Dentre estas, 0,9%, 0,2%, 0,9% e 0,5% tiveram ASCUS, ASGUS, LSIL e HSIL, respectivamente, e 0,5% das mulheres apresentou carcinoma de células escamosas.
Em toda a amostra estudada, o DNA do HPV foi detectado em 33,3% das mulheres com ASCUS; 100% das mulheres com ASGUS; 50% das mulheres com LSIL, 50% das mulheres com carcinoma de células escamosas e em 23,1% das mulheres sem resultado laboratorial de citologia cervical. Entretanto, não foi detectado DNA do HPV nas mulheres com HSIL em nenhuma das populações estudadas.
Analisando as prevalências de infecção por HPV, tendo como base o resultado da citologia cervical, verificou-se que as amostras que apresentaram anormalidades citológicas possuíam maiores prevalências de infecção genital pelo HPV. Contudo, tal resultado se mostrou estatisticamente significante somente na faixa etária de 26 a 44 anos, tendo em conta ambas as amostras do estudo (RP = 4,0; IC95%: 1,67-9,57).
Em mulheres com citologia normal ou inflamatória, para todas as faixas de idade, a maior prevalência de HPV ocorreu na amostra urbana, sendo assim distribuídas: 17,5% nas de 13 a 25 anos; 12,9% nas de 26 a 44 anos; e 14,5% nas de 45 ou mais anos, porém não houve diferença estatística na comparação entre as amostras urbana e rural para essa variável.
Os principais fatores associados à infecção genital por HPV entre as mulheres na faixa etária de 13 a 25 anos considerando ambas as populações na análise bivariada foram número de parceiros sexuais na vida e novos no último ano, assim como o uso de preservativos e situação conjugal. Todavia, observou-se associação significante somente em relação à situação conjugal das mulheres jovens da zona rural, uma vez que mulheres solteiras, separadas ou viúvas tiveram uma prevalência 4,3 (p = 0,0097) maior de infecção pelo HPV do que mulheres que moravam com um companheiro ou eram casadas (Tabelas 1 e 2).
Em relação às mulheres de 26 a 44 anos de idade, os principais fatores associados à infecção genital por HPV na análise bivariada foram a coitarca, número de parceiros sexuais durante a vida e no último ano, bem como história de sintomas genitais, sendo tais associações evidentes somente na amostra urbana (Tabela 1). As mulheres urbanas que tiveram sua iniciação sexual aos quinze anos ou menos e aquelas com relato de três ou mais parceiros sexuais durante a vida, tinham maior prevalência de infecção pelo HPV, no entanto tais associações não apresentaram significância estatística.
Por fim, as mulheres a partir dos 45 anos apresentaram especialmente os seguintes fatores associados à infecção genital por HPV na análise bivariada: número de parceiros sexuais durante a vida e novos no último ano, bem como uso de anticoncepcional oral; história de DST e tabagismo atual, e tais fatores se comportaram de forma diferenciada nas amostras urbana e rural (Tabelas 1 e 2). Mulheres urbanas que fizeram uso de anticoncepcionais orais ao longo da vida, fumantes declaradas, menor número de parceiros sexuais durante a vida e história de DST pregressa tiveram uma prevalência maior de infecção pelo HPV, sendo constatada associação significante somente em relação à história pregressa de DST (p = 0,0331). Já na amostra rural os principais fatores associados ao HPV foram maior número de parceiros sexuais novos no último ano e tabagismo atual, e o hábito de fumar se associou significativamente à infecção por HPV com uma prevalência 6,9 (p = 0,0344) vezes maior em relação às não fumantes.
Os principais fatores que se mostraram associados à infecção pelo HPV com p-valor menor que 0,2 na análise bivariada, foram inseridas no modelo de regressão logística multivariado, sendo ajustada a variável "número de parceiros na vida" pela variável "uso de preservativos" na amostra urbana (Tabela 3). O ajuste se deveu ao fato de que 74,2% das mulheres urbanas com 45 anos ou mais, com menor número de parceiros sexuais durante a vida (1 a 2 parceiros), afirmaram nunca utilizar preservativo, enquanto entre as mulheres com 3 ou mais parceiros na vida o percentual caiu para 28%, representando o "uso de preservativos" um fator de confundimento nessa análise.
Após o ajuste das variáveis, foi possível constatar a permanência de uma única associação significante: mulheres solteiras, separadas ou viúvas, de 13 a 25 anos, da amostra rural permaneceram independentemente associadas à infecção genital pelo HPV (Tabela 4).
Discussão
A saúde da mulher hoje no Brasil é um tema que abrange vários aspectos que tangem direta ou indiretamente as dimensões social, educacional e das políticas públicas de saúde. Estudos que envolvem todos esses pontos podem subsidiar estratégias mais coerentes e sinérgicas voltadas aos novos campos de atuação das políticas públicas, com uma abordagem ampliada dos processos de saúde-doença da população alvo. Neste contexto, vale ressaltar a importância da Pesquisa Nacional de Demografia em Saúde da Mulher e da Criança 12, financiada pelo Ministério da Saúde e executada por uma equipe da área de População e Sociedade, e que tem traçado os avanços na área de saúde da mulher e da criança, permitindo, inclusive, comparações com estudos internacionais.
Atualmente, são considerados aspectos importantes para o incremento da vulnerabilidade feminina à ocorrência de altos índices de morte por câncer de colo no Brasil aspectos socioculturais e político-econômicos, com destaque para a escolaridade, acesso aos serviços de prevenção e manejo do câncer cervical, hábitos de vida, bem como os diferentes grupos etários e sua região de residência. Os dois últimos fatores têm sido apontados como significativos determinantes sociais em saúde, uma vez que mulheres vivendo em áreas geográficas com pouco ou nenhum acesso aos serviços públicos de promoção, prevenção e recuperação da saúde; associados a traços psicossociais característicos da mulher adolescente, adulta ou idosa, podem interferir de maneira interdependente no perfil de morbimortalidade por câncer cervical 13,14.
Em nosso estudo investigamos a epidemiologia da infecção genital pelo HPV em relação aos fatores de risco sociodemográficos, comportamentais, sexuais e reprodutivos de duas populações distintas da Amazônia Oriental Brasileira, composta de mulheres que vivem em aglomerado urbano e rural, assim como fatores clínicos relativos à colpocitologia (PCCU) e diagnóstico molecular da presença genital do DNA do HPV.
Tendo em conta as idades de todas as mulheres incluídas no estudo, houve um predomínio da faixa de 26 a 44 anos, seguida pela faixa de 13 a 25 anos e pela de 45 e mais, mas a distribuição de mulheres nessas faixas de idade se comportou de maneira semelhante no aglomerado urbano e no rural. Em estudo realizado por Molano et al. 6 também foram recrutadas mulheres em uma larga faixa de idade, entre 13 a 85 anos, a fim de se estudar a história natural do HPV em uma coorte colombiana, ocorrendo predomínio da faixa compreendida entre 25 e 34 anos. Além disso, sabe-se que nos serviços públicos de saúde a busca pela realização de rastreamento para o câncer cervical é maior entre mulheres abaixo de 35 anos 1.
A grande maioria era casada ou vivia com um companheiro, tanto na amostra urbana quanto na rural, permitindo a dedução da existência de maior atividade sexual monogâmica e fixa, a exemplo das participantes dos estudos de Silva et al. 15 no Paraná, onde as casadas ou que viviam em união estável representavam o maior percentual em análises epidemiológicas de amostras de PCCU de rotina.
O DNA do HPV foi detectado em 14,6% da amostra geral da Amazônia Oriental brasileira, estando dentro do perfil de prevalência encontrada em estudos realizados em diversas regiões. Em estudo de coorte realizado por Molano et al. 6 com diagnóstico por PCR, foi verificada uma prevalência de 14,9% em colombianas de 13 a 85 anos. No Brasil, Trottier et al. 16 apontaram uma frequência de 10,6% de HPV em mulheres de 18 a 60 anos, enquanto Franco et al. 7 apontaram a prevalência inicial de HPV de 13,8% para mulheres na mesma faixa de idade e de 25% acumulada ao final do seguimento do seu estudo.
A considerar a realidade urbana versus rural, encontrar-se-á uma maior prevalência de HPV na amostra urbana em contraposição à rural. Porém, em estudos realizados por Soares et al. 8 em área rural do Nordeste brasileiro foi detectada positividade
para o HPV de 26%, embora não tenham sido empregados neste estudo técnicas moleculares de diagnóstico do HPV.
Para um melhor entendimento da ocorrência do HPV nas duas populações estudadas, as mulheres foram divididas em três faixas de idade, e a maior ocorrência de HPV se deu entre as mulheres de 13 a 25 anos para todos os grupos do estudo. Além disso, houve um segundo pico de prevalência entre as mulheres de 45 anos ou mais na amostra urbana, não ocorrendo o mesmo com a amostra rural. Tal fato também foi berificado por Franceschi et al.17, em um grande estudo Transversal com 18.498 mulheres de 15 regiões do mundo, utilizando diagnóstico por PCR, um comportamento bimodal de prevalência do HPV em mulheres da América Latina, estando o primeiro pico concentrado entre mulheres de 15 a 25 anos e o segundo a partir dos 45 anos.
O primeiro pico de prevalência entre adolescentes e mulheres jovens pode ser explicado por ser este o grupo etário no qual se inicia a vida sexual, sendo característica a maior frequência de atividade sexual, rotatividade de parceiros e procura por parceiros novos, uso irregular de métodos contraceptivos de barreira e fragilidade da cérvice uterina no início da vida sexual, além dos traços psicossociais desse grupo etário, que normalmente não procura os serviços de saúde com a mesma regularidade que as mulheres mais velhas para fins preventivos.
O segundo pico entre mulheres de meia idade e idosas ocorre, segundo Trottier & Franco 18 e Herrero et al. 19, em razão de uma provável reativação de infecção latente pela perda gradual da imunidade tipo específica pós-menopausa, possível aquisição de novas infecções provenientes de novos parceiros sexuais ou simplesmente relacionada ao efeito de coorte de nascimento. O último consistiria numa diversidade de exposição ao HPV de acordo com os diferentes momentos históricos de nascimento da mulher, mas a moral e os costumes sexuais de cada época podem modular a exposição a diversos fatores de risco normalmente relacionados à aquisição e à persistência viral.
O único fator de risco explorado no estudo que se mostrou significativamente associado à infecção pelo HPV e permaneceu no modelo final de regressão logística foi "a situação conjugal de mulheres residentes na zona rural na faixa de 13 a 25 anos", pois se encontrou prevalência de infecção genital significativamente maior em mulheres solteiras, separadas ou viúvas.
As limitações do estudo se relacionaram sobretudo ao uso de formulários para a coleta de dados referentes aos fatores de risco para aquisição e manutenção do HPV, uma vez que as associações estatísticas foram realizadas exclusivamente com base nas informações relatadas pelas mulheres com possibilidade de ocultação da verdade e mascaramento de resposta. Além disso, o delineamento transversal não permitiu a utilização da temporalidade como critério de causa para o HPV, uma vez que fatores de risco e desfecho foram vistos em um mesmo momento e o viés da causalidade reversa não pôde ser eliminado.
Por fim, acredita-se que os resultados obtidos neste estudo podem subsidiar a reorganização de estratégias voltadas à saúde da mulher no tocante à prevenção e ao manejo específico da infecção por HPV tendo em vista as particularidades de cada grupo etário e seu local de trabalho e residência. O maior conhecimento, por parte da mulher, sobre as formas de aquisição, fatores de risco e frequência da infecção por HPV em grupos etários e populacionais distintos pode, provavelmente, contribuir para que ela tenha maior percepção em relação ao seu risco de desenvolver lesões pré-neoplásicas cervicais e, consequentemente, influenciar a sua adesão permanente às atividades de PCCU e/ou estimular modificações de comportamentos e estilos de vida considerados de risco para o HPV.
Colaboradores
D. S. Pinto, H. T. Fuzii e J. A. S. Quaresma participaram da concepção e projeto do artigo, delineamento do estudo, análise e interpretação dos dados, revisão crítica e redação do manuscrito.
Agradecimentos
À Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde e, à UNESCO e à ELETROBRAS/ELETRONORTE pelo apoio financeiro.
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Correspondência: J. A. S. Quaresma Núcleo de Medicina Tropical Universidade Federal do Pará Av. Generalíssimo Deodoro 92
Anais Brasileiros de DermatologiaPrint version ISSN 0365-0596
An. Bras. Dermatol. vol.85 no.5 Rio de Janeiro Sept./Oct. 2010
http://dx.doi.org/10.1590/S0365-05962010000500027
COMUNICAÇÃO
Caracterização clínica e histopatológica e tipagem do papilomavírus humano das verrugas vulgares nos receptores de transplante renal
Flavia Martelli-MarzagãoI; Alberto Shodi YamashiroII; Marilia Marufuji OgawaIII; Gildo Francisco dos Santos JrIV; Jane TomimoriV; Adriana Maria PorroVI
IAluna do programa de pós-graduação em dermatologia clínica e cirúrgica - Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - São Paulo (SP), Brasil IIAluno de iniciação científica do curso de medicina da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - São Paulo (SP), Brasil IIIMédica e mestre do Departamento de Dermatologia da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - São Paulo (SP), Brasil IVBiomédico e doutor - Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (Afip) Medicina Laboratorial - São Paulo (SP), Brasil VProfessora associada do Departamento de Dermatologia da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp), orientadora dos alunos de iniciação científica e pósgraduação - São Paulo (SP), Brasil VIProfessora adjunta do Departamento de Dermatologia, coorientadora dos alunos de iniciação científica e pós-graduação da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - São Paulo (SP), Brasil
Endereço para correspondência
RESUMO
Os pacientes receptores de transplante renal apresentam elevada prevalência de lesões cutâneas por HPV. Foram estudados 20 receptores de transplante renal com diagnóstico de verruga vulgar. A detecção do HPV foi realizada pela polimerização em cadeia (PCR) com os primers MY09/MY11 e RK91. A tipagem do HPV foi feita por meio da restrição enzimática e do sequenciamento automatizado. Identificamos a presença do HPV em 10 pacientes (50%) e os tipos identificados foram: HPV-2, 27, 29, 34 e 57.
Palavras-chave: Infecções por papilomavírus; Transplante de rim; Verrugas
Os pacientes receptores de transplante renal identificar os tipos de HPV presentes nas lesões. (RTRs) apresentam de 15 a 50% de chance de Estudamos 20 pacientes RTRs com diagnóstico desenvolver verrugas vulgares (VVs) relacionadas ao clínico e histopatológico de VV, que foram submetidos papilomavírus humano (HPV) no primeiro ano do à detecção (por meio de PCR com primers transplante e de 77 a 95% em cinco anos.1 Com MY09/MY11 e RK91) e tipagem do HPV (por meio de relação à detecção e tipagem do HPV em lesões de VV, restrição enzimática e/ou sequenciamento). existem poucas publicações no nosso meio: estudo A média de idade dos pacientes foi de 47,9 em população infectada pelo HIV e anos. Não observamos predomínio da incidência em imunocompetentes2 e pacientes com nenhum dos sexos (Tabela 1). epidermodisplasia verruciforme.3 Nesse contexto, A presença de mais de uma lesão de VV este estudo teve como objetivo avaliar aspectos predominou entre esses pacientes (80%), sendo que clínicos e histopatológicos das VVs nos RTRs e 25% apresentavam mais de 20 lesões. Confirmam-se dessa forma a facilidade de infecção e o comportamento disseminativo do HPV nos RTRs (Figura 1).
Após seis meses de terapia imunossupressora em altas doses (fase de indução), o paciente submetido ao transplante renal passa a receber doses menores de imunossupressores, entrando na chamada fase de manutenção. É nessa fase, semelhante ao relatado na literatura,4 que observamos maior frequência de verrugas virais. O tempo médio de transplante neste estudo foi de 76,9 meses.
À histopatologia, os achados típicos de VV em indivíduos imunocompetentes, tais como hiperqueratose, hipergranulose e papilomatose, foram também vistos nos RTRs. Em relação aos sinais histopatológicos de atividade viral nas lesões dos RTRs, encontramos frequência elevada de coilocitose (85%) e, em menor frequência, observamos a presença de clumps de grânulos de querato-hialina (70%). A paraqueratose esteve pouco presente (20%). Isso poderia representar o aspecto histológico de verrugas antigas e, indiretamente, a cronicidade desse processo nos RTRs, coincidindo com o tempo prolongado de evolução relatado pelos pacientes. Analisando a presença de vacuolização dos queratinócitos, que também caracteriza a infecção viral, ela foi observada principalmente nas camadas mais altas da epiderme, como nas lesões descritas na literatura (Figura 2).5
Os tipos de HPV descritos como mais frequentes nas lesões de VV de indivíduos imunocompetentes, segundo a literatura mundial, são o HPV-2, o HPV-27 e o HPV-57.6
No presente estudo, identificamos a presença de HPV em 10 pacientes (50%). O HPV-2, o HPV-34 e o HPV-57 foram detectados em duas amostras cada, enquanto o HPV-27 e o HPV-29, em uma amostra cada (Tabela 2). Em dois pacientes, não foram identificados os tipos de HPV, mesmo com positividade para os primers MY09/MY11 e RK91. Os tipos HPV-2, HPV-27, HPV-29 e HPV-57 já haviam sido anteriormente descritos em VVs de RTRs.7-9 Um achado interessante, observado em dois dos nossos pacientes, foi a identificação do HPV-34, que é um alfapapilomavírus, frequentemente descrito nas infecções de mucosa. Já os tipos HPV-2, HPV-27, HPV-29 e HPV-57 têm sido encontrados em todo o tegumento. Com o uso dos primers MY09/MY11 e RK91, os pacientes deste estudo não apresentaram os tipos descritos na epidermodisplasia verruciforme.10
Dependendo do tipo, a infecção cutânea pelo HPV relaciona-se com o aumento da incidência de carcinomas, em particular o carcinoma espinocelular. Muitas vezes, em RTRs, a proliferação de lesões queratósicas nas áreas expostas provoca confusão diagnóstica entre VVs, queratoses actínicas e queratoses seborreicas, além do próprio carcinoma espinocelular. Na população deste estudo, também foi possível observar a existência de lesões cutâneas múltiplas, polimórficas e atípicas, principalmente nas áreas expostas, sujeitas a microtraumatismos e exposição solar, como os membros superiores e inferiores.
A baixa detecção de HPV nas lesões deste estudo poderia ser explicada pela presença de tipos incomuns de HPV, não habitualmente detectados em lesões de VV. Nesse caso, a repetição da PCR utilizando outros primers poderia aumentar a chance de detecção do HPV.
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Endereço para correspondência: Adriana Maria Porro Alameda Jauaperi, 975, ap. 31, Moema 04523 014 São Paulo - SP - Brasil Tel.: +55 11 5576 4804 E-mail: [email protected]
Recebido em 28.04.2009. Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 19.03.10. Conflito de interesse: Nenhum / Conflict of interest: None Suporte financeiro / Financial funding: CNPq, com bolsa Pibic para o aluno da graduação, e Capes, com verba do programa de pós-graduação em dermatologia clínica e cirúrgica (Unifesp).
* Trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM) - São Paulo (SP), Brasil.
Infecção pelo papilomavírus humano: etiopatogenia, biologia molecular e manifestações clínicas*
Maria das Graças Pereira LetoI; Gildo Francisco dos Santos JúniorII; Adriana Maria PorroIII; Jane TomimoriIV
IMestre pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp); dermatologista - São Paulo (SP), Brasil IIDoutor em Ciências pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp); biomédico da AFIP Medicina Laboratorial - São Paulo (SP), Brasil IIIDoutor em Medicina pela Universidade Federal de São Paulo (Unifesp); professora adjunta do Departamento de Dermatologia da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - Escola Paulista de Medicina - São Paulo (SP), Brasil IVPós-doutorado pela Universitat Munster (Westfalische-Wilhelms); professora-associada do Departamento de Dermatologia da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - Escola Paulista de Medicina - São Paulo (SP), Brasil
Endereço para correspondência
RESUMO
O papilomavírus humano (HPV) é um vírus DNA que apresenta tropismo por células epiteliais, causando infecções na pele e nas mucosas. A replicação do HPV ocorre no núcleo das células escamosas e o seu ciclo de vida é diretamente relacionado ao programa de diferenciação da célula hospedeira. Até o momento, foram completamente caracterizados cerca de 100 tipos diferentes de HPVs e há um grande número adicional de tipos ainda não sequenciados. Além de ser o responsável por lesões benignas de pele e mucosas, o HPV também está envolvido no desenvolvimento de diversos tumores cutaneomucosos: doença de Bowen, cânceres de pele não melanoma e carcinomas genitais. Esta revisão aborda as características do HPV, quadros cutâneos e mucosos benignos e malignos causados por ele e os principais métodos empregados em sua detecção e tipagem.
Palavras-chave: Infecções por papilomavírus; Verrugas; Vírus DNA
INTRODUÇÃO
Lesões verrucosas e papilomatosas que comprometem a pele são descritas desde a Grécia antiga. No começo do século XX, iniciaram-se as pesquisas sobre o
papilomavírus (PV). Em 1933, o PV foi isolado como o possível agente etiológico de verrugas em coelhos. Desde então, essa classe viral tem sido considerada como agentes infecciosos naturais, responsáveis pelo desenvolvimento de verrugas em diferentes grupos de mamíferos, inclusive no homem.
Em 1935, Rous descreveu que as verrugas em coelhos apresentavam potencial para transformação maligna. Strauss et al., por meio da microscopia eletrônica, relataram, em 1949, a primeira observação de partículas de PV em verrugas humanas. Em 1950, foi descoberto o potencial carcinogênico dos papilomavírus humanos (HPV) em pacientes com epidermodisplasia verruciforme. A estrutura do genoma viral só foi desvendada em 1963 por Crawford & Crawford.1 Porém, nos anos subsequentes, pesquisas sobre HPV foram desestimuladas pela impossibilidade de um sistema de cultura de tecidos e pela aparente natureza benigna das verrugas humanas.
Na década de 1970, começou a surgir um gradual interesse pelo vírus. Nessa época, pesquisadores descreveram a diversidade dessa classe viral e Zur Hausen propôs a hipótese de que os HPVs participavam da etiologia dos cânceres de colo uterino.2
No início dos anos 1980, houve um rápido crescimento das pesquisas, os HPVs 16 e 18 foram identificados e sua relação com o câncer cervical foi estabelecida. Em 1987, o primeiro estudo epidemiológico sobre HPV e câncer cervical foi publicado.3 A partir de então, vários estudos moleculares e epidemiológicos confirmam que a infecção cervical por certos tipos de HPVs é um evento precursor na gênese da neoplasia de colo uterino.
CARACTERÍSTICAS DO VÍRUS
Os PVs são pequenos vírus DNA (50-55nm) pertencentes à família Papoviridae - gênero Papillomavirus. Trata-se de vírus não envelopado, com simetria icosaédrica. Apresenta um genoma de aproximadamente 8.000 pares de base (8Kb) de DNA dupla fita e circular. Apesar do tamanho pequeno, sua biologia molecular é bastante complexa. O DNA viral encontra-se associado a proteínas semelhantes a histonas, envoltas por 72 capsômeros constituídos por duas proteínas estruturais, L1 e L2. Esses vírus são capazes de infectar seres humanos e grande número de espécies animais (gatos, coelhos e primatas não humanos), sendo o homem o hospedeiro mais extensivamente estudado.4
Os PVs são altamente específicos por espécie e não há relato de exemplos de PV de uma espécie causando infecção produtiva em outra espécie. São vírus que apresentam tropismo por células epiteliais, causando infecções na pele e nas mucosas (genital, oral, laringe, esôfago), e a sua replicação ocorre no núcleo das células escamosas epiteliais.5
O genoma viral está dividido em três regiões, de acordo com a sua localização e propriedades funcionais: as regiões E (early) e L (late), denominadas ORFs (open read frames ou unidades de tradução), e uma terceira região, LCR (long control region) ou NCR (non-coding region) ou URR (upstream regulatory region).
Na região E encontram-se até oito genes (E1 a E8), que são responsáveis pela replicação do HPV (E1 e E2), transcrição do DNA (E2), maturação e liberação das partículas virais (E4), transformação celular (E5, E6, E7) e imortalização (E6 e E7). Estes dois últimos genes também codificam proteínas associadas à malignização de lesões.6 Tais proteínas estimulam a proliferação celular por interagir com as proteínas celulares p53 e pRb envolvidas no controle da proliferação celular e
suprimir suas funções. Apenas as proteínas E6/E7 de HPVs de alto risco oncogênico são capazes de imortalizar queratinócitos humanos primários, mas não as proteínas análogas de HPVs de baixo risco oncogênico.
Os genes da região L (L1 e L2) codificam, respectivamente, as proteínas principal e secundária do capsídeo.7 A região tardia L1 ORF é a mais conservada entre os HPVs. O seu produto, proteína L1, representa 80% das proteínas do capsídeo viral, constituindo a proteína mais abundante e de alta imunogenicidade. A proteína L2, com a L1, contribui para a incorporação do DNA viral dentro do vírion.
A região LCR encontra-se entre L1 e E6 e possui entre 500 e 1.000 pares de bases. Em geral, não é bem conservada entre os HPVs e está envolvida com a expressão gênica e com a replicação viral que ocorre no núcleo da célula do hospedeiro.
Evidências consistentes sugerem que o genoma dos PVs é estático e mudanças na sua sequência por mutação ou recombinação são eventos muito raros. Alterações mutacionais parecem acontecer em uma frequência semelhante à que ocorre no genoma do hospedeiro infectado.4
O ciclo de vida do PV é diretamente relacionado ao programa de diferenciação celular da célula hospedeira. O vírus infecta as células basais do epitélio que apresentam potencial de diferenciação. As funções vegetativas virais, síntese do DNA e proteínas do capsídeo, bem como a montagem dos novos vírus, ocorrem exclusivamente nos queratinócitos diferenciados.8
Os PVs parecem permanecer no seu hospedeiro por longos períodos de vida. Uma grande variedade de tipos diferentes de PVs pode ser detectada em sítios aleatórios de pele normal em humanos e animais, o que reforça que o ciclo de vida latente é uma característica frequentemente presente nesses vírus.9
FILOGENÉTICA
Diferentemente de outros grupos virais, os PVs não são referidos por sorotipos. Sua classificação em tipos distintos se baseia na espécie de origem e no grau de relação dos genomas virais,8 mediante a comparação da sequência de nucleotídeos do seu genoma viral.
Os PVs são agrupados em diferentes gêneros que, por sua vez, são divididos em diferentes espécies contendo um ou mais genótipos. Cada genótipo é agrupado em subtipos e variantes de acordo com a similaridade da sequência na região L1.4
Até o momento, foram completamente caracterizados cerca de 100 tipos diversos de HPVs.4 Somados a esses totalmente sequenciados há um grande número de tipos cuja sequência genética ainda não foi obtida pelos métodos convencionais.8
Gêneros diferentes de HPVs compartilham menos de 60% de similaridade na sequência de nucleotídeos do capsídeo principal da proteína L1 ORF. Diferentes espécies virais dentro de um mesmo gênero dividem de 60% a 70% de similaridade. Considera-se um novo tipo de HPV quando o seu genoma apresenta variações maiores que 10% nos genes L1, E6 e E7 e quando se comparam com qualquer tipo de HPV previamente conhecido. Dessemelhanças entre 2% e 10% representam novos subtipos e variações menores que 2% constituem variantes de tipos.4
Os HPVs são agrupados nos seguintes gêneros: alfapapilomavírus, betapapilomavírus, gamapapilomavírus, mupapilomavírus e nupapilomavírus. Os demais gêneros agrupam PVs isolados em mamíferos e pássaros. O agrupamento filogenético, algumas vezes, reflete similaridades biológicas e patológicas, mas ocorrem frequentes divergências. Por exemplo, espécies e tipos diversos de um mesmo gênero podem exibir características completamente diferentes e ainda assim pertencer ao mesmo gênero.4,8
Alfapapilomavírus (supergrupo A)
Neste grupo estão os HPVs com tropismo para epitélio genital, mas alguns tipos pertencentes a este gênero causam verrugas vulgares. Encontram-se os tipos de HPVs de alto risco para câncer de colo de útero, como os HPVs 16 e 18, alocados, respectivamente, nas espécies 9 e 7 deste gênero, e tipos de baixo risco, como os HPVs 6 e 11, ambos na espécie 10. Paralelamente, neste mesmo gênero, encontram-se tipos de HPV não mucosos. Destacam-se o HPV 7, associado a verrugas cutâneas em açougueiros e manipuladores de carne, aves e peixes, os HPVs contidos na espécie 4 (HPVs 2, 27 e 57) e os da espécie 2 (HPVs 3 e 10), causadores de verrugas vulgares na pele. 4,8,10
Betapapilomavírus (supergrupo B - subgrupo B1)
Este grupo engloba cinco diferentes espécies. Os HPVs 5 e 8, pertencentes à espécie 1 deste gênero, são os tipos mais comumente identificados na pele de indivíduos com epidermodisplasia verruciforme (EV). Neste gênero também se encontram HPVs cutâneos detectados na pele da população geral sem lesões, demonstrando a ubiquidade e a alta ocorrência de infecções não sintomáticas.4,5,8,10
Gamapapilomavírus (supergrupo B - subgrupo B2)
O supergrupo B abrange cinco espécies diversas com sete tipos diferentes que causam lesões cutâneas: HPVs 4, 48, 50, 60, 88, 65, 95.4,5,8
Mupapilomavírus (supergrupo E)
Este grupo contém os HPVs 1 e 63. O HPV1 é o mais estudado e causa verrugas vulgares e palmares.4,5,8
Nupapilomavírus (supergrupo E)
Neste grupo se classifica apenas uma espécie, o HPV 41.4,5,8
CLASSIFICAÇÃO
Historicamente, os HPVs são agrupados de acordo com o seu tropismo tecidual por determinados tipos de epitélio e com a localização onde foram inicialmente isolados. Com base nessas características, destacam-se três grupos de HPV: cutâneos, mucosos e associados a EV (tabela 1). Os HPVs mucosos são subdivididos em: de baixo e de alto risco, dependendo de seu potencial oncogênico.
Todos os tipos de HPV possuem tropismo por células do epitélio escamoso estratificado, mas há variações de afinidade com diferentes sítios anatômicos. Por exemplo, o HPV-1 é um tipo cutâneo com elevada taxa de replicação em epitélio queratinizado da região palmoplantar. O HPV 16 é um tipo mucoso, com preferência
por áreas genitais, e o HPV 11, também mucoso, se replica no epitélio genital e laríngeo.11
Essa classificação não é totalmente correta, pois tipos genitais de HPV podem ser detectados na pele e o contrário também é possível.
TÉCNICAS DE DETECÇÃO DO HPV
O HPV não cresce em meio de cultura convencional e os métodos diagnósticos sorológicos apresentam precisão limitada. Faz-se o diagnóstico da infecção do HPV por meio da histopatologia das lesões11 ou da detecção do DNA viral nas células infectadas.12
As técnicas de hibridização e a reação de polimerização em cadeia (PCR - polimerase chain reaction) são métodos utilizados para a detecção do HPV.
Dentre as técnicas de hibridização utilizadas destacam-se:
1) Southern blot, que tem alta especificidade e sensibilidade. Possibilita estimar a quantidade de DNA na lesão. Apresenta limitações em relação à grande diversidade de tipos de HPV, pois não é capaz de detectar o DNA de sequências virais desconhecidas;13
2) Dot blot e reverse blot são técnicas trabalhosas, que apresentam sensibilidade similar e boa acurácia;12,13
3) Hibridização in situ: utiliza sondas radiomarcadas e permite a localização topográfica do DNA viral nas células e tecidos. Embora a sensibilidade desta técnica seja limitada, é o melhor método para avaliar a distribuição do HPV nas lesões e possibilita a localização viral com outros marcadores;13
4) Captura híbrida não radioativa: é uma técnica segura, de fácil realização e reprodutibilidade, bem como precisa para lesões mucosas.13
A reação de polimerização em cadeia (PCR - polimerase chain reaction) é o método mais sensível e mais largamente utilizado para detecção viral e encontra sua principal aplicação em situações em que a quantidade de DNA disponível é reduzida. Primeiramente, deve-se proceder à extração do material genético a ser utilizado. Depois de extraído o DNA, adiciona-se a ele uma mistura (pré-mix) que contém os desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dATP, dCPT, dGTP, dTTP), os primers (iniciadores ou oligonucleotídeos), a enzima DNA polimerase e uma solução tampão. Toda essa mistura é encaminhada ao termociclador, que faz ciclos de temperatura preestabelecidos com tempos exatos específicos para cada etapa da reação (desnaturação, anelamento, extensão). O resultado da PCR é visibilizado como uma banda de peso molecular específico para o fragmento de DNA amplificado através da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, mediante coloração com brometo de etídio.
Após a amplificação do DNA viral pela PCR, o material precisa ser submetido a uma técnica que permita a identificação do tipo de HPV. As técnicas mais frequentemente utilizadas para isso são: Southern blot, dot blot; hibridização reversa; restrição enzimática e sequenciamento.12
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA INFECÇÃO PELO HPV
I. LESÕES CUTÂNEAS BENIGNAS VERRUGAS CUTÂNEAS
As verrugas são as manifestações clínicas mais comuns e características da infecção pelo HPV. São tumores induzidos por vírus pleomórficos, que acometem diversas localizações, principalmente a pele de extremidades, mucosa, pele genital e mucosas oral e laríngea.11
Epidemiologia, transmissão e patogênese
O HPV é um vírus com distribuição universal. As verrugas cutâneas são afecções virais muito frequentes, com uma incidência estimada de 7% a 10% na população europeia e de 1% na população americana.14 Nos imunodeprimidos, por exemplo, nos receptores de transplante renal, esses números aumentam 50 a 100 vezes, chegando a mais de 90% após 15 anos de transplante.15 Verrugas ocorrem em qualquer idade e a incidência cresce durante a idade escolar, com pico na adolescência e nos adultos jovens.16
O HPV é transmitido pelo contato direto ou indireto com o indivíduo que tem a lesão. Disfunções na barreira epitelial por traumatismos, pequenas agressões ou macerações provocam perda de solução de continuidade na pele, possibilitando a infecção viral. Após a inoculação, o período de incubação varia de três semanas a oito meses.39 Observa-se regressão espontânea na maioria dos casos.17
A imunidade mediada por células (IMC) parece ter um papel importante na resposta do hospedeiro ao HPV. Em pacientes com depressão da IMC, como os receptores de transplante renal, os indivíduos com infecção pelo HIV (vírus da imunodeficiência humana) e pacientes com EV, observa-se maior prevalência de verrugas e quadros mais extensos e persistentes.5,11,17
O ciclo de vida do HPV está diretamente ligado ao programa de diferenciação celular da célula hospedeira. A infecção inicia-se quando o HPV alcança as células da camada basal, sendo que, nessa localização, não há replicação viral, o vírus apenas mantém seu genoma mediante a amplificação de baixo número de cópias. A fase replicativa e a síntese protéica ocorrem nos queratinócitos diferenciados das camadas suprabasais.5,18 O tempo de evolução e o tipo de lesão se correlacionam com a quantidade de partículas virais detectadas. Verrugas mais recentes apresentam maior quantidade viral quando comparadas a verrugas antigas. Verrugas plantares possuem maior carga viral do que verrugas vulgares. O centro da lesão parece ser o local de maior concentração viral.18
Nas lesões benignas, a replicação do genoma viral é extracromossômica. Nas lesões malignas, o DNA viral encontra-se integrado aos cromossomos da célula hospedeira e não acontece replicação viral. Há inativação da expressão da proteína E2, que funciona como regulador negativo da expressão dos oncogenes E6 e E7. Estes últimos promovem a imortalização celular ao inibirem as proteínas celulares reguladoras do ciclo celular (p53 e pRB), que são fundamentais para supressão tumoral.5,18
Características histopatológicas das verrugas cutâneas
As características histopatológicas presentes nas verrugas virais são papilomatose, hiperceratose proeminente com paraceratose, hipergranulose e acantose.19
Nas verrugas vulgares, as cristas epidérmicas são alongadas e, na periferia da lesão, apontam radialmente para o centro (arborização). As características mais
importantes para distinguir a verruga vulgar dos demais papilomas são: a) coilócitos (células pequenas vacuolizadas com núcleo pequeno redondo fortemente basófilo, rodeados por um halo claro e citoplasma que se cora palidamente, localizadas na camada granulosa e espinhosa alta); representam o efeito citopático viral; b) fileiras verticais de paraceratose; c) focos de grânulos de querato-hialina. Essas três alterações são muito evidentes nas verrugas vulgares jovens ou ativas.19
Alguns autores sugerem que determinadas características histológicas são específicas para cada tipo de HPV. Dessa forma, o exame histopatológico auxiliaria na identificação dos diferentes tipos virais. Outros pesquisadores discordam quanto a diferentes HPVs determinarem padrões histológicos distintos e característicos para cada tipo viral, portanto, não haveria correlação da histologia com o tipo de HPV.17
As verrugas planas apresentam hiperceratose e acantose. A papilomatose e áreas de paraceratose não menos proeminentes, observando-se apenas discreto alongamento das cristas epidérmicas. Nas camadas espinhosa e granulosa há vacuolização difusa e aumento de tamanho das células, com centralização dos núcleos, que se tornam picnóticos e fortemente basofílicos. As verrugas palmoplantares superficiais (em mosaico) apresentam aspectos histopatológicos semelhantes aos das verrugas vulgares. As verrugas palmoplantares profundas (mirmécia), por sua vez, são caracterizadas por apresentarem na camada granulosa e espinhosa grânulos de querato-hialina abundantes e eosinófilos, formando corpos de inclusão irregulares nos citoplasmas dos ceratinócitos.17,19
I.1. VERRUGA VULGAR (VV)
A verruga vulgar (VV) consiste em pápulas ou nódulos individualizados, com superfície áspera. As lesões podem ser únicas ou múltiplas, de tamanhos variados, e habitualmente são assintomáticas (Figura 1). A confluência das lesões pode formar grandes massas. Ocorrem em qualquer parte do tegumento, porém são mais comuns no dorso das mãos e dos dedos.17 Em crianças, uma localização frequente é o joelho.11
Verrugas isoladas podem permanecer inalteradas por meses ou anos ou, então, um grande número de novas lesões pode se desenvolver rapidamente em curto intervalo de tempo. A evolução das verrugas não é previsível. Aproximadamente 65% das verrugas desaparecem espontaneamente dentro de dois anos. A idade do paciente e o número de lesões não parecem influenciar o prognóstico.20
Os tipos de HPV mais envolvidos nas lesões de VV são: HPV 2,5,21 HPV 27, HPV 5721,22 (tipos de HPV intimamente relacionados ao HPV 2), HPV 45,23 e HPV 1.24,25 O HPV 7 é o tipo mais encontrado nas verrugas de açougueiros e também é descrito em manipuladores de peixe e aves domésticas.26
I.2. VERRUGA PLANTAR
A verruga plantar é a verruga viral que ocorre na região plantar. Pode ser profunda e, nessa forma de apresentação, é conhecida como mirmécia. É comumente dolorosa e causada pelo HPV 1. Quando se desenvolve mais superficialmente, formando placas hiperceratóticas, denomina-se verruga em mosaico, que é menos dolorosa e habitualmente causada pelo HPV 2. O HPV 4 também é detectado em lesões de verrugas plantares.27
I.3. VERRUGA PLANA
As verrugas planas são levemente elevadas, da cor da pele ou pigmentadas (acastanhadas, levemente amareladas), com superfície plana, lisa ou ligeiramente áspera. São arredondadas ou poligonais e o seu tamanho varia de 1mm a 5mm de diâmetro ou mais (Figura 2). A face e o dorso das mãos são as localizações mais comuns. A quantidade de verrugas pode ser numerosa. Observa-se com frequência distribuição linear das lesões, correspondendo a lesão escoriada ou outro trauma (fenômeno de Koebner). A regressão espontânea é comum, geralmente precedida de inflamação das lesões. Os tipos de HPV mais detectados nas lesões de verrugas planas são o HPV 3 e o HPV 10.11,17
I.4. VERRUGA FILIFORME
A verruga filiforme consiste em lesões pedunculadas, espiculadas, de crescimento perpendicular ou oblíquo à superfície da pele (Figura 3). Apresenta-se como lesões isoladas ou múltiplas, acometendo, principalmente, a face e o pescoço. É uma variante morfológica distinta da verruga vulgar e os tipos de HPV encontrados parecem ser os mesmos detectados nas lesões de verruga vulgar, em especial, o HPV 2.11
I.5. VERRUGA PIGMENTADA
Clinicamente, as verrugas pigmentadas apresentam coloração que varia de cinza a castanho-enegrecida e, histopatologicamente, apresentam corpos de inclusão citoplasmáticos homogêneos específicos (Figura 4). Os tipos de HPV detectados nessas lesões são HPV 4, 60 e 65.28
II. EPIDERMODISPLASIA VERRUCIFORME (EV)
A epidermodisplasia verruciforme (EV) é uma doença genética rara, usualmente autossômica recessiva, em que há distúrbio da imunidade celular e alta suscetibilidade a câncer de pele induzido pelo HPV. A associação entre HPVs e câncer foi primeiramente reconhecida na década de 50 em pacientes com EV. Estes possuem alta predisposição a infecções por um grupo específico de HPVs e alto risco de tumores cutâneos malignos, resultantes dos efeitos oncogênicos do vírus.29
As lesões de pele surgem precocemente na infância e são polimórficas. Na face e no pescoço, são indistinguíveis das verrugas planas; no tronco e nos membros, são máculas eritematosas hipopigmentadas ou hiperpigmentadas, descamativas, semelhantes a pitiríase versicolor. Placas mais espessas, róseas ou violáceas, semelhantes à ceratose seborreica, também são encontradas. Transformações malignas se iniciam, em geral, na quarta e quinta décadas de vida e predominam nas áreas fotoexpostas, sugerindo papel importante da radiação ultravioleta. Observam-se lesões pré-malignas, como ceratoses actínicas, e lesões malignas, como doença de Bowen e carcinoma espinocelular invasivo. O carcinoma basocelular é raro nesses pacientes.30
Os tipos de HPV encontrados nas lesões dos pacientes com EV são referidos como HPVs associados a epidermodisplasia verruciforme (HPV-EV). Os tipos de HPV-EV mais encontrados nas lesões de pacientes com EV são: 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 28, 29, 36-38, 47, 49 e 50. Nas verrugas planas dos pacientes são detectados HPV 3 e 10, analogamente ao que acontece na população em geral. O HPV 5 e o HPV 8 são os mais encontrados nas lesões malignas. Detectam-se com menos frequência os HPVs 14, 17, 20 e 47.13,30,31
Com o avanço das técnicas de identificação e tipagem do HPV, os HPVs-EVs começaram a ser observados não apenas em pacientes com o diagnóstico de EV, mas também nas lesões e na pele normal de pacientes imunossuprimidos (Figura 5) e imunocompetentes; nestes últimos não sendo comumente patogênicos. Os HPVs-EVs também foram detectados nos pacientes com psoríase, nos indivíduos com distúrbio da proliferação de queratinócitos, doenças bolhosas autoimunes e queimaduras.4,9,32,33
III. LESÕES CUTÂNEAS MALIGNAS III.1. DOENÇA DE BOWEN (DB)
A doença de Bowen (DB) é um carcinoma espinocelular in situ que evolui, ocasionalmente, para carcinoma invasivo.
O encontro do HPV, particularmente dos tipos mucosos de alto risco, nas lesões de doença de Bowen extragenital (DBEG) localizadas, sobretudo, na região periungueal, nas mãos e, mais raramente, nos pés é frequente, de acordo com a literatura. A detecção do vírus nessas localizações sugere a autoinoculação a partir de lesões genitais.34 O papel do HPV está bem estabelecido na DB genital, mas não está totalmente esclarecido nas formas extragenitais.35
Na DBEG, a detecção do HPV não se restringe apenas às extremidades (pés, mãos, região periungueal). O encontro de HPVs de alto risco em lesões de DBEG também ocorre na ausência de lesões genitais.35
Outros tipos de HPV têm sido detectados na DBEG, como o HPV 2, HPVs mucosos de baixo risco 6 e 11, HPVs 54, 58, 61, 62, 73, HPV 58, detectado na DBEG localizada nos cotovelos e nos dedos das mãos e dos pés, associado a carcinoma cervical e vulvar, HPVs cutâneos 27 e 76 e HPV-EV 20 e HPV-EV 23.
Em 2005, Zheng et al.35 avaliaram amostras de 41 pacientes com DBEG e detectaram em 7% das lesões HPVs mucosos de alto risco (HPVs 16 e 33) e em 5%, HPVs cutâneos (HPVs 27 e 76). Nas lesões com HPVs de alto risco, a carga viral foi alta e a demonstração do DNA viral no núcleo das células da camada espinhosa e parte da basal no tecido acometido pela DBEG foi facilmente detectável pela técnica de hibridização in situ. Esses achados não foram observados nas lesões com tipos de HPVs cutâneos nem nas amostras de controle de pele normal. Com base nesses resultados, os autores concluíram que os HPVs mucosos de alto grau podem desempenhar um papel importante na patogênese da DBEG.
III.2.CARCINOMAS ESPINOCELULAR E BASOCELULAR
O papel exato do HPV no desenvolvimento do câncer de pele não melanoma (CPNM) - carcinoma espinocelular (CEC) e carcinoma basocelular (CBC) - ainda não está totalmente definido.36 Evidências crescentes sugerem que o HPV tem importante potencial no processo de carcinogênese cutânea.36-38
A associação do HPV com o CPNM é observada tanto em pacientes imunocompetentes como em indivíduos imunossuprimidos. Nestes últimos, a positividade de detecção do DNA viral nas lesões é maior e a ocorrência de tipos variados de HPV numa mesma lesão é mais frequente.13,37,39 Acima de 90% dos receptores de transplante renal, em quinze anos de transplante, desenvolverão verrugas virais, e 40% desenvolverão CPNM, ou seja, um risco de 50 a 100 vezes maior do que na população geral. Nesse grupo de pacientes, diferentemente do que se observa na população como um todo, o tipo de CPNM mais prevalente é o CEC, numa razão aproximada de 3:1, e as lesões tendem a ser múltiplas e mais agressivas.15 Nas lesões de CEC dos receptores de transplante renal, os HPVs-EVs são os tipos mais encontrados. A positividade de detecção do HPV nessas lesões é alta, alcançando até 80-88%.32,37 É comum a detecção de novos tipos de HPV-EV e a coinfecção de uma mesma lesão com mais de um tipo de HPV. Nas lesões de CBC, a detecção do HPV é mais baixa.32,37,39
Nos imunocompetentes, ainda são poucos os trabalhos sobre HPV e lesões de CPNM. Nesses indivíduos, a prevalência do HPV é mais baixa, variando de 35% a 55% nas lesões de CEC e chegando a 43,5% nas de CBC.37,39 Os HPVs-EVs também são os tipos predominantes. Além deles, tipos cutâneos e mucosos têm sido detectados, porém, nos estudos que os apontam como os mais comuns, observa-se que os métodos para a detecção dos tipos EV são limitados e insatisfatórios.37,39
Em 2000, Harwood et al.39 encontraram HPV em 84,1% nas lesões de CEC e 75% nas de CBC de pacientes imunossuprimidos submetidos a transplante renal, em comparação com 27,2% nas lesões de CEC e 36,7% nas de CBC do grupo imunocompetente. O tipo de HPV prevalente em ambos os grupos foi o HPV-EV. Tipos cutâneos de HPV e infecções por múltiplos tipos de HPV foram observados apenas no grupo dos imunossuprimidos. Não se verificaram diferenças estatisticamente significantes entre o CBC e o CEC no que diz respeito aos tipos de HPV presentes nas lesões.
Em 2003, Iftner et al.24 realizaram um estudo caso-controle para investigar a associação do CPNM com o HPV. Nas 72 amostras de CEC analisadas, observaram HPV em 59,7%; nas 18 lesões de CBC, detectaram HPV em 27,8%. O HPV 4 e o HPV 33 foram os mais prevalentes nessas lesões de CPNM. Os autores também descobriram que os HPVs mucosos de alto risco podem representar fator de risco para lesões de CPNM em pacientes imunocompetentes.
Forslund et al., em 2007,38 estudaram 349 pacientes imunocompetentes com lesões cutâneas: 82 lesões de CEC, 126 lesões de CBC, 49 lesões de ceratose actínica e 92 lesões benignas (apenas um caso de verruga vulgar). Realizaram biópsias pareadas de pele normal do mesmo paciente, as quais também foram submetidas à PCR para detecção do HPV DNA. Identificaram 42 tipos diferentes de HPV e forte associação entre a prevalência do HPV e a exposição solar. Os HPVs do grupo betapapilomavírus espécie 1 foram mais encontradiços nas lesões benignas, enquanto os tipos de HPV do gênero betapapilomavírus espécie 2 predominaram nas lesões de CEC. Os autores concluíram que os tipos de HPV do gênero betapapilomavírus espécie 2 estão implicados na etiologia do CEC cutâneo.
Em 2008, Asgari et al.36 realizaram um estudo caso-controle em indivíduos caucasianos imunocompetentes com o objetivo de analisar o papel do HPV nas lesões cutâneas de CPNM. Analisaram 132 pacientes com CEC e 95 indivíduos sem lesões de CPNM. Nos pacientes com lesões de CPNM, obtiveram material da lesão e
da área perilesional. No grupo-controle, colheram o material em área exposta e em área não exposta ao Sol. A prevalência do HPV foi similar nos dois grupos do estudo, sugerindo que o HPV é amplamente distribuído na população como um todo. Nas lesões de CPNM, os tipos de HPV do gênero betapapilomavírus (HPV-EV) espécie 2 foram mais prevalentes quando comparados aos do grupo-controle, o que indica que certos tipos de HPV podem estar envolvidos na progressão do CPNM, porém seriam necessários fatores adicionais para o desenvolvimento do câncer.
A detecção e tipagem do HPV nas lesões de CPNM são dificultadas pela grande variedade genômica desses vírus. Além disso, as técnicas utilizadas até o início dos anos 1990 eram menos capazes de atender a essa complexidade viral. Apesar do avanço considerável nos métodos de detecção e tipagem, da introdução de novosprimers e da utilização dos primers degenerados, ainda se observam discrepâncias na prevalência e no espectro dos tipos virais encontrados nessas lesões nos diferentes estudos.37,39 Nas lesões de CEC da região periungueal, a detecção dos HPVs mucosos é frequente e o tipo mais identificado é o HPV 16.40 A possibilidade da associação de carcinomas genitais e CECs ungueais foi documentada em vários estudos, sugerindo autoinoculação a partir das lesões genitais.38 Também são encontrados mais raramente nas lesões de CEC ungueal outros tipos de HPV, como: HPVs 2, 31, 34, 35, 58, 61 e 73.38,40
IV. LESÕES MUCOSAS BENIGNAS IV.1. HIPERPLASIA EPITELIAL FOCAL (HEF)
A hiperplasia epitelial focal (HEF) ou doença de Heck é uma doença rara da mucosa oral, de curso benigno, e está associada aos HPVs 13 e 32.41 É mais frequente em crianças e mulheres e apresenta clara predominância racial, sendo mais comum em índios americanos, esquimós e algumas comunidades africanas. Clinicamente, caracteriza-se por múltiplas pequenas pápulas, de coloração rósea, individualizadas ou formando placas (Figura 6). As lesões são assintomáticas e com tendência a regressão espontânea. A localização mais comum é o lábio inferior. A HEF acomete com menos frequência o lábio superior, a língua, a mucosa jugal, a orofaringe, o palato e o assoalho da boca.
IV.2. CONDILOMA ACUMINADO
A manifestação mais comum do HPV na genitália são as verrugas anogenitais ou condilomas acuminados.13 Essas lesões apresentam-se como pápulas, nódulos ou vegetações macias, filiformes, róseas, sésseis ou pedunculadas. Podem apresentar crescimento exofítico semelhante à couve-flor e são, geralmente, assintomáticas. Os HPVs de baixo risco, HPV 6 e HPV 11, são os mais detectados nas lesões de condiloma acuminado. HPVs de alto risco, como os HPVs 16 e 18 e outros tipos de HPV, podem ser encontrados isolados ou, mais comumente, coinfectando com os HPVs 6 e 11.42
O tumor de Buschke-Löwenstein (condiloma acuminado gigante ou carcinoma verrucoso da região anogenital) é um tumor clinicamente agressivo, com lesões tipo "couve-flor", ulceradas, muitas vezes associadas a fístulas e abscessos. Apresentam crescimento endofítico e exofítico, invasão local e altas taxas de recidiva. Metástases são muito raras e, histologicamente, têm comportamento benigno. Essa lesão está associada aos HPVs 6 e 11.43
IV.3. PAPULOSE BOWENOIDE
O termo papulose bowenoide (PB) refere-se a lesões papulosas multifocais na genitália com características histológicas semelhantes às do CEC in situ ou DB. O quadro clínico se caracteriza por múltiplas pápulas de coloração acastanhada ou eritematosa localizadas na região anogenital, que atingem, principalmente, adultos jovens com vida sexual ativa. Clinicamente, a PB deve ser diferenciada de ceratose seborreica, nevo melanocítico e verruga comum. A PB está fortemente relacionada com o HPV 16.13
Apesar da atipia histológica e da associação com HPV de alto risco, o curso da PB no sexo masculino e em indivíduos jovens é usualmente benigno, ocorrendo regressão espontânea em muitos casos. No sexo feminino, a associação com neoplasia do colo uterino sugere um curso menos benigno, tanto para as mulheres que apresentam lesões como também para as parceiras de indivíduos com PB. Em pacientes idosos e imunossuprimidos, a evolução também tende a ser mais agressiva.13 Outros tipos de HPV, como os HPVs 18, 31-35, 39-42, 48 e 51-54, têm sido detectados em lesões de PB.44
V. LESÕES MUCOSAS MALIGNAS V.1. DOENÇA DE BOWEN DA GENITÁLIA
O carcinoma in situ ou DB da genitália associase com HPVs de alto risco, especialmente, o HPV 16.45Clinicamente, apresenta-se como uma placa, em geral única, sem tendência a regressão espontânea e com potencial de evolução para CEC. Alguns autores consideram que a DB na mucosa corresponde à eritroplasia de Queyrat (EQ). Porém, outros pesquisadores acreditam que sejam entidades com padrões histológicos distintos. As lesões características da EQ são placas eritematosas, aveludadas, brilhantes com ou sem infiltração e podem acometer glande, prepúcio, uretra, vulva, mucosa oral, língua e conjuntiva. A progressão da EQ para CEC ocorre em mais de 30% dos casos e é maior do que a observada em relação à DB. Estudos sobre a detecção do tipo de HPV nas lesões de EQ são escassos. O HPV 16 é o mais encontrado e o HPV-EV 8 também tem sido observado.46
V.2. CÂNCER VULVAR
O câncer invasivo da vulva é geralmente precedido por neoplasia intraepitelial vulvar (NIV) ou carcinoma cervical e, muitas vezes, desenvolve-se a partir de verrugas genitais de longa evolução. A detecção do HPV nas lesões de CECs vulvares varia de 30% a 70%.47 A positividade de detecção do HPV no câncer vulvar é muito inferior à do carcinoma cervical, o que pode decorrer da sensibilidade dos métodos de detecção empregados ou da presença de novos tipos de HPV ainda não identificados que podem estar presentes nessas lesões.13 O HPV 16 é o tipo mais observado nos carcinomas vulvares, mas os HPVs 18, 21, 31, 33 e 34 também têm sido encontrados nessas lesões.
V.3. CÂNCER PENIANO
Clinicamente, o câncer peniano se distingue por lesões enduradas, nodulares, ulceradas ou erosivas e podem apresentar superfície verrucosa. A detecção de HPV nas lesões de câncer peniano alcança 40-70% de positividade e o tipo mais encontrado é o HPV 16.48
V.4. CÂNCER ANAL
O HPV é detectado em cerca de 80% a 96% das lesões de câncer anal. O tipo mais encontrado é o HPV 16, mas outros, como os HPVs 18 e 33, também são detectados.47
V.5. CÂNCER CERVICAL
Um grande número de lesões da região cervical está associado à presença do HPV, desde anormalidades citológicas incipientes, displasias de diferentes graus, até o câncer cervical. Observa-se relação causal de HPV e câncer de colo do útero em cerca de 90% a 100% dos casos.49 A infecção cervical por alguns tipos de HPV é um fator precursor na gênese da neoplasia cervical, embora outros cofatores atuem para que ocorra o desenvolvimento da neoplasia.
Os HPVs 16 e 18 são os dois tipos carcinogênicos mais importantes e responsáveis por cerca de 70% dos carcinomas cervicais e 50% das neoplasias intraepiteliais de grau III. Os HPVs 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 e 58 também têm sido detectados nas lesões de câncer cervical.50
Na tabela 2 encontra-se um resumo das manifestações clínicas mais frequentemente associadas a cada tipo de HPV.
CONCLUSÕES
O grupo dos HPVs cutâneos apresenta um número significativo de tipos diferentes, com grande ubiquidade e muitas diferenças regionais e raciais. O estudo e o melhor entendimento dos HPVs são necessários porque, além de serem vírus envolvidos na etiologia de diversos cânceres, também estão implicados em doenças cutâneas muito comuns na prática de dermatologistas.
AGRADECIMENTOS
À equipe médica do Parque Indígena do Xingu (Departamento de Medicina Preventiva) e ao Grupo de Imunocomprometidos (Departamento de Dermatologia), ambos da Unifesp, pelas fotos clínicas cedidas.
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Endereço para correspondência: Maria das Graças Pereira Leto Rua Padre Manoel Barbosa, 527 - Ap. 1.004 - Itaigara 41815-050 Salvador - Bahia Telefax: (71) 3351-1433 / 8738-7778 E-mail: [email protected]
Aprovado pelo Conselho Editorial e aceito para publicação em 01.7.2010. Conflito de interesse: Nenhum Suporte financeiro: Nenhum
* Trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) - Escola Paulista de Medicina - São Paulo (SP), Brasil.
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Medicina (B. Aires) v.67 n.4 Buenos Aires julho / ago. 2007
Papilomavírus humano em lesões orais
Joaquín V. González 1 , Rafael A. Gutiérrez 2 , Alicia Keszler 3 , Maria Del Carmen Colacino 2 , Lidia V. Alonio 1 , Angélica R. Teyssie1 ; Maria Alejandra Picconi 1
1 Servicio Oncogénicos vírus, Laboratório Nacional de Referencia de papilomavírus, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Buenos Aires, 2 Cátedra de Patologia Clínica y bucodental II 3 Cátedra de Anatomía Patológica, Faculdade de Odontologia, Universidade de Buenos Aires, Argentina
Endereço postal : Dra. María Alejandra Picconi. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán , Av.Vélez Sársfield 563, 1282 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4302-5064 e-mail: [email protected]
Resumoevidência crescente sugere um papel para o papilomavírus humano (HPV) e câncer oral, mas seu envolvimento é ainda controversa.Este estudo avalia a freqüência do DNA do HPV em uma variedade de lesões bucais em pacientes da Argentina. Um total de 77 amostras de tecidos orais de 66 pacientes foram selecionadas (casos), os diagnósticos clínico-histopatológicos correspondeu a: HPV-11 associados lesões benignas, oito não-HPV associados lesões benignas, 33 lesões pré-malignas e 25 tipos de câncer.Sessenta amostras de células descamadas da mucosa oral normal foram utilizados como controle. Detecção e tipificação do HPV foi realizada por reacção de polimerase em cadeia (PCR) utilizando iniciadores MY09, 11, combinado com o RFLP ou, alternativamente, por PCR utilizando os iniciadores GP5 +, 6 + combinado com hibridização. HPV foi detectado em 91,0% das lesões associadas ao HPV benignos, 14,3% dos não-HPV associados lesões benignas, 51,5% dos preneoplasias e 60,0% dos casos de câncer. Nenhuma amostra de controlo positivo de HPV testados. Em benignas associadas ao HPV lesões, 30,0% de amostras positivas de HPV abrigava tipos de alto risco, enquanto que em lesões pré-neoplásicas o valor aumentou para 59,9%. Em lesões de câncer, detecção de HPV em carcinoma verrucoso foi de 88,9% e no carcinoma epidermóide de 43,8%, com taxas de alto risco do tipo de 75,5% e 85,6%, respectivamente. A frequência de HPV de alto detectado nas lesões pré-neoplásicas e neoplásicas apoia um papel etiológico do HPV, pelo menos, um subconjunto dos cancros orais.
Resumen vírus papiloma Humano en lesiones orales . Crecientes Evidências sugieren Que el vírus Papiloma Humano (HPV) tiene un rol en el câncer bucal; pecado embargo su participación es todavía controvertida. Este estudio avalia la frecuencia de ADN de HPV en una variedad de lesiones orales de PACIENTES de Argentina. Se seleccionaron 77 Muestras De Tejido orais de 66 patients (CASOS); el Diagnóstico histo-patológico correspondió a: 11 lesiones benignas Asociadas um HPV, 8 benignas lesiones não Asociadas um HPV, 33 lesiones premalignas y 25 cánceres. Como Controles se usaron 60 Muestras de Células exfoliadas de mucosa oral normal. La detección y tipificación de HPV se realizó POR PCR empleando los primers MY09, 11, seguida de RFLP, o PCR usando los primers GP5 +, 6 + seguida de hibridación en dot blot. HPV fue en detectado 91% de las lesiones benignas Asociadas um HPV, 14,3% de las lesiones benignas não Asociadas, 51,5% de preneoplasias y 60% de cánceres. Ninguna muestra controle resultó HPV Positiva. En las lesiones benignas, 30% de las Muestras HPV Positivas correspondieron um Tipos de alto riesgo, Mientras Que en las lesiones preneoplásicas la positividad ascendió de 59,9%. En cánceres, la detección de HPV en carcinomas verrugosos fue 88,9% carcinomas escamosos y en 43,8%, con 75,5% y 85,6% de Tipos virales de alto riesgo, respectively. La alta frecuencia de HPV detectada en lesiones preneoplásicas y cánceres apoya un rol etiológico del HPV en, al Menos, un Subgrupo de cánceres orales.
Palabras clave: Vírus Papiloma Humano, câncer oral; mucosa oral; leucoplasia oral; liquen Plano oral; Tipificación de HPV
O papel causal de "alto risco" papilomavírus humano (HPV) em câncer do colo do útero foi estabelecida através da acumulação de dados epidemiológicos e estudos moleculares 1-3 . Até esta data, 15 HPVs diferentes foram incluídos no grupo de "alto risco" (HPV tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82), sendo considerados cancerígenos humanos pela Agência Internacional para Pesquisa do Câncer (IARC), 4, 5 . infecção pelo HPV também tem sido apontada como um fator de risco para o desenvolvimento de câncer oral, o que é sugerido por semelhanças histológicas entre lesões da mucosa oral mucosa genital e 6-9 , e apoiado por estudos in vitro que mostram que o HPV pode imortalizar queratinócitos orais. No entanto, compreender o papel do HPV na carcinogênese oral tem
sido dificultada por causa da variação de taxas de prevalência do HPV "grande entre os estudos-10-80% - em orais lesões pré-neoplásicas e neoplásicas, mesmo quando a reação em cadeia da polimerase (PCR) são usados 10 - 13 . As razões para essas discrepâncias são ainda pouco claras, apesar de diferenças de métodos de amostragem, perfis de pacientes e sistemas de detecção pode levar a conclusões imprecisas. Além disso, a presença do HPV também foi mostrado em lesões orais benignas e mucosa normal de doentes sem verrugas ou tumores 13, 14 . cancro oral é a malignidade sexto mais comum em países desenvolvidos, o que representa cerca de 3% dos tumores malignos 15, 16 . Na Índia e outras regiões do Sudeste da Ásia, é o tumor maligno predominante, representando até 50% de todos os cânceres 16 . Na Argentina, a taxa de mortalidade média de câncer oral entre 1997 e 2000 foi de 1,15 por 100.000 habitantes 17 . A incidência estimada, a partir de dados de mortalidade que aplicam o sistema desenvolvido pela IARC 18 faixas de 2,67-2,95 novos casos por 100 000 habitantes, por ano. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência de infecção pelo HPV em uma variedade de benigna, pré-neoplásicas neoplásicas e lesões bucais em pacientes da Argentina.
Materiais e Métodos
As amostras foram obtidas a partir de pacientes atendidos no Departamento de Estomatologia da Faculdade de Odontologia da Universidade de Buenos Aires. Um total de 66 pacientes (25 homens e 32 mulheres) foram incluídos. Um total de 77 amostras de tecido (casos) foram selecionados, os diagnósticos clínico-histopatológicos correspondeu a: HPV-11 associados lesões benignas (3 hiperplasia focal epitelial, 6 condiloma acuminado, verrugas vulgares 2), 8 não HPVassociated lesões benignas (2 erosiva benigno lesões ulcerativas, 5 hiperplasia reacional e 1 branco esponja nevo); 33 lesões pré-malignas (11 e 22 de leucoplasia líquen plano), e cancros orais (16 carcinoma de células escamosas e carcinoma verrucoso 9). Em 11 pacientes que apresentaram lesões associadas ao HPV em diferentes sítios orais, mais do que uma amostra foi analisada. Amostras foram arquivísticas biópsias formaldeído-fixo e paraffinembedded; uM 8 secções foram cortadas com um micrótomo, usando uma lâmina nova para cada amostra para minimizar bloco para bloquear a contaminação. Sessenta amostras de células esfoliadas de pacientes (28 homens e 32 mulheres) sem qualquer sinal de lesões da mucosa oral foram incluídos (controles). Células esfoliadas foram coletadas com cytobrush em PBS estéril (pH 7,4) a partir de mais do que um local na cavidade oral (mucosa bucal, borda da língua e soalho da boca) e transportadas para o laboratório em gelo durante virologia processamento dentro de 48 horas. formulários de consentimento informado para usar os espécimes em ensaio viral foram obtidas de ambas, casos e controlos. células frescas foram processadas por digestão com proteinase K e fenol-clorophorm protocolos de purificação padrão 19 . O mesmo protocolo foi utilizado para processar fixos e embebidos em parafina de lesões de tecidos, após deparaffinizing amostras com n-octano e a lavagem com etanol a 20 . DNAs foram testados por PCR para o gene da b-globina para confirmar a presença do modelo adequado nas amostras 21 . HPV detecção e tipagem de ADN foi realizada por PCR utilizando iniciadores MY09, 11, combinada com a digestão com enzimas de restrição dos produtos de PCR (RFLP) de acordo com Bernard et al. 22 , estes primers degenerados alvo de consenso de uma região de aproximadamente 450 pb do gene L1 viral . Resumidamente, as alíquotas dos produtos de PCR foram misturados com 10 U de 7 diferentes enzimas de restrição (Bam HI, Hae III, Hinf I Dde I, Pst I, Rsa I e Sau3AI) em reacções separadas. Produtos de digestão foram separados por electroforese em gel de agarose a 2,5% e o padrão obtido foi comparado com os dados publicados22 . CaSki e DNAs de células HeLa (que sequências de porto de HPV 16 e 18,
respectivamente) foram utilizados como controlos positivos, e água como controlo negativo (sem matriz de ADN). Nos MY09, 11 amostras de PCR negativos, uma PCR utilizando iniciadores GP5 +, 6 + genérico HPV primers foi realizada 23 .Estes iniciadores como alvo uma região de aproximadamente 140 pb da região L1 mesmo viral. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1,5%, visualizado com brometo de etídio de coloração sob a luz UV e fotografados. GP-PCR de amostras positivas foram digitados por dot-blot hibridação usando tipo específico oligoprobes biotinilados correspondentes ao HPV tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 45 24 . As reacções positivas foram revelados por chemiluminiscence, utilizando o kit ECL, de acordo com as recomendações do fabricante (Amersham).
Resultados
Todas as amostras de DNA amplificado do gene da b-globina, e foram, portanto, consideradas apropriadas para o estudo da PCR. Viral detecção e tipagem resultados estão resumidos na Tabela 1 . HPV foi detectado em 55,8% (43/77) dos casos: 91,0% (10/11) corresponderam a benignas associadas ao HPV lesões, 12,5% (1/8) para benignas não-HPV lesões associadas, 51,5% (17 / 33) para preneoplasias e 60,0% (15/25) para cancros. Todas as amostras de controlo negativo HPV testados.
TABELA 1 -. HPV detecção e tipificação em amostras orais de pacientes argentinos
Em benignas associadas ao HPV lesões de 30% (3/10) de amostras de HPV positivos abrigava tipos de alto risco, enquanto que em lesões pré-neoplásicas o valor subiu para 58,8% (10/17). Em lesões de câncer, o HPV foi detectado
em 60% (15/25), sendo 88,9% (8/9) para o carcinoma verrucoso e 43,7% (7/16) para o carcinoma de células escamosas, com taxas de alto risco do tipo de 75,5% ( 6/8) e 85,7% (6/7), respectivamente. HPV 6 e 11 foram os tipos mais freqüentes em lesões benignas, enquanto o HPV 16 foi o tipo mais comum detectado em lesões pré-neoplásicas e neoplásicas. Infecções mistas foram comprovados em 27,9% . (12/43) das amostras positivas do tipo HPV permaneceu indeterminado em 6,9% (3/43) dos casos positivos, o tamanho limitado de amostras impedida posterior caracterização das amostras. Em 11 doentes com múltiplas lesões orais, as amostras dos 2 diferentes os locais foram analisadas ( Tabela 2 ). Dois pacientes eram HPV negativo em ambos os sites e 8 pacientes que testaram positivo para HPV tinham pelo menos um genótipo comum em ambos, em apenas um paciente os resultados de HPV de diferentes locais não corresponde (HPV 11 e HPV negativo).
TABELA 2 -. detecção de HPV em lesões múltiplas de diferentes locais orais
Discussão
Tipos de HPV de alto risco são amplamente envolvidos na patogênese do câncer anogenital 1-4 , em contraste com seu papel mais especulativa no câncer oral 6-8 . O fumo de tabaco ou de mascar, e consumo de álcool são
considerados fatores de risco para o câncer bucal. No entanto, esses fatores de risco estão ausentes em muitos casos, indicando outros caminhos etiológicos possíveis, que podem incluir o HPV ou outros agentes infecciosos 25 . Este estudo investigou a presença de DNA do HPV em benigna (HPV associados ou não associados), pré-neoplásicas e neoplásicas lesões orais ( casos), e as amostras normais (controlos), em pacientes da Argentina. HPV foi detectado em quase 50% das lesões orais incluídos neste estudo. HPV 6 e 11 foram os mais prevalentes em lesões associadas ao HPV benignos, enquanto que em lesões pré-neoplásicas e cânceres HPV 16 foi o tipo mais freqüente viral, semelhante aos achados descritos para lesões cervicais em Buenos Aires população 26, 27 . Em leucoplasia e líquen plano, HPV16/18 foram detectados na maioria das amostras, de acordo com outros relatórios 12 . Outros autores têm mostrado a predominância de HPV18 eo HPV16 relativa ausência de lesões orais em em pacientes de algumas regiões europeias 28, 29 . Considerando a influência geográfica sobre o HPV tipo de distribuição, a Organização Mundial de Saúde recomenda mais estudos para investigar e adquirir mais conhecimento sobre a prevalência de diferentes tipos de HPV ", não só no trato anogenital, mas também na pele e no trato aerodigestivo. Esta informação epidemiológica podem ser considerados para estratégias de prevenção do HPV aplicando vacinas profiláticas que estão sendo licenciados 30 . HPV não foi detectado nesta série de amostras de controle, o que é consistente com outros estudos que revelaram uma baixa positividade do HPV no grupo controle 12, 31 , 32 . No entanto, alguns grupos encontraram uma taxa de infecção de HPV surpreendentemente alta em mucosa normal 14, 33 . Alguns relatórios considerar que o uso de células descamadas poderia subestimar a detecção viral 34, 35 , enquanto outros obtiveram dados semelhantes à biópsia análises 20 . Deve-se ter em mente que a biópsia é um procedimento invasivo e amostras de mucosa normal pode ser eticamente difícil de obter, por esta razão usamos células descamadas como controles. No entanto, o DNA do HPV tem sido demonstrada em amostras de indivíduos saudáveis "bucais em um certo número de estudos, tornando-se claro que a mucosa oral pode actuar como um reservatório para novas infecções por HPV e / ou uma fonte de lesões recorrentes de HPV 12, 13, 36 . Este estudo incluiu alguns dos mais comuns benignos epiteliais lesões orais; mucosas tipos de baixo risco foram predominantes, como já descrito 8 . Os nossos dados mostraram que os tipos virais identificadas em locais orais eram semelhantes aos observados na mucosa genital e laringe, com a excepção de HPV13, que foi encontrado apenas na mucosa oral. Apesar de verruga vulgar tem sido associada a tipos de pele, especialmente HPV2 37 , um caso de verruga vulgar era HPV negativo, talvez devido às nossas abordagens técnicas dirigidas aos tipos mucosotropic que pode ter faltado casos cutâneos. HPV16 DNA foi demonstrado em um nevo esponja branca, uma constatação apenas anteriormente descrito por Cox et al 38 . Esta lesão benigna foi caracterizado muitos anos atrás como uma hiperplasia hereditária disceratóticas das membranas mucosas 39 . Provavelmente estado das células nevo 'diferenciada é compatível com a amplificação de ADN de HPV, que é pensado para residir em estado latente nas células basais epiteliais, por isso a presença de HPV16 nestas lesões parece ser aleatória.
HPV envolvimento na etiologia da potencialmente malignas, lesões orais (por exemplo, leucoplasia e líquen plano) tem sido largamente suspeita ainda que não claramente demonstrado 6-8, 11-13, 32 . HPV A freqüência aqui obtidos para essas lesões (51,5%) é consistente com alguns dados anteriores 32, 40 , em que o HPV positivo foi de pelo menos 50%, mas mais elevada do que a média obtida analisando outros relatórios (31%)12, 41 . Independentemente do tipo de HPV, neste estudo, como em muitos outros, detecção de HPV em lesões orais potencialmente malignas é, sem dúvida, maior do que em controles normais. carcinoma verrucoso é uma variante localmente invasivo e não-metastático oral de carcinoma de células escamosas da cavidade 42 . Em ambos genital e oral carcinoma verrucoso, os tipos de HPV de baixo risco 6 e 11 têm sido relatados como os mais prevalentes. Na nossa série de tamanho limitado, observou-se uma predominância de HPV16, o nível de detecção do HPV ser marcadamente mais elevada no carcinoma verrucoso (88,9%) do que no carcinoma de células escamosas (43,8%), que se encontra dentro do intervalo descrito na maior parte baseados em PCR publicações (25 - 75%) 7, 40, 43 . Neste trabalho, um carcinoma de células escamosas abrigava apenas HPV11. Embora a evidência indica a ausência de carcinogenicidade de tipos de HPV 6 e 11 de 3, 5 , esses tipos de baixo risco foram previamente relatada em câncer bucal 41 e carcinomas penianos 44-46 apoiando o seu potencial oncogênico. Em 11 pacientes portadores de lesões múltiplas, amostras de locais diferentes foram obtidos. A maioria deles era de pares de amostras de uma lesão pré-neoplásica e um carcinoma, mostrando resultados coincidentes. Embora essas lesões estavam localizadas perto, mas não no mesmo local, a sua origem poderia ter sido idênticos, e lesões pré-neoplásicas poderia ter agido como precursores. Quase metade dos carcinomas de células escamosas analisados eram HPV negativo. A "bater e correr" teoria tem sido propostas para explicar o envolvimento do HPV nos tumores vírus-negativos que podem se desenvolver a partir de HPV contendo precursores, não exigindo que o HPV para manter o estado maligno 8, 13 . O método utilizado não se pode descartar que essas lesões abrigar um número de cópias virais indetectáveis. Carcinomas orais, assim como outras relacionadas com o HPV em neoplasias do trato aerodigestivo superior, parecem ter copiar números baixos de HPV, geralmente produzindo produtos mais fracos PCR de HPV-positivos amostras cervicais 8, 12,
13, 25 . Há consenso sobre a necessidade de desenvolver um sensível, teste de laboratório validado para detectar o HPV em células esfoliadas orais, que poderia refletir o alto risco do HPV em tumores de cabeça e pescoço 47-49 . Alguns autores descobriram que em um subconjunto de cabeça e tumores do pescoço albergando HPV, a presença viral poderia ser um marcador de resultados favoráveis 48, 49 . Uma retrospectiva oral, displasia epitelial estudo caso-controle sugerem que a prevalência de HPV 16 é maior em displasias progredindo para oral SCC do que aqueles que não o fazem, embora a associação foi baseada em uma amostra pequena e não significativa 50 . A investigação será necessária para determinar o uso de testes de HPV em relação à prevenção, tratamento, resultados e vigilância de recorrência de lesões orais. Este estudo contribui os primeiros dados sobre a diversidade HPV em uma variedade de lesões orais de pacientes argentinos. Eles contribuem mais
evidências de que a infecção oral por HPV, particularmente os tipos cancerígenos, é um fator de risco para, pelo menos, um subconjunto de pré-neoplásicas e neoplásicas orais. Por outro lado, tem-se apontado que, para além do papel viral, outros factores devem ser tidos em conta para a progressão de lesões induzidas por HPV, como compromisso imunitário, antecedentes genéticos e exposição a agentes químicos ou físicos cancerígenos. A longo prazo, acompanhamento de lesões potencialmente malignas podem ajudar a definir o papel efetivo do HPV em sua etiologia.
Agradecimentos: Os autores agradecem a Sra. Silvia A. Núñez e Jorge A. Basiletti (Malbrán Institute) para a sua assistência técnica qualificada. JA Basiletti recebeu durante este trabalho uma bolsa da Fundação Bunge e Born (Buenos Aires, Argentina). Os autores agradecem aos Drs.. María A. Campomanes, Clarisa Valenzuela e Marcelo Almeida (Faculdade de Odontologia da Universidade de Buenos Aires) para a sua generosa ajuda durante a amostragem. Este projecto foi apoiado em parte por doações da UBA (para AK) e Fundação Mosoteguy (Buenos Aires, Argentina).
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Brazilian Journal of MicrobiologyVersão impressa ISSN 1517-8382
Braz. J. Microbiol. vol.43 no.2 São Paulo Apr. / jun 2012
http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822012000200039
GENÉTICA E microbiologia molecular
Correlação entre EBV co-infecção e HPV16 integridade do genoma de pacientes com câncer do colo do útero da Tunísia
Saloua Kahla I ; Sarra Oueslati I ; Mongia Achour I ; Lotfi Kochbati II ; Mohamed Badis Chanoufi III ; Mongi Maalej II ; Ridha Oueslati I, *
I Unidade de Imunologia Microbiologia Ambiental e Carcinogênese (IMEC), da Faculdade de Ciências de Bizerte, Universidade de Cartago, 7021 Jarzouna, Bizerte, Tunísia II Radio-Oncologia, Salah Azaiz Instituto, Tunis, Tunísia III Centro Departamento de Ginecologia Obstetrícia A, da Maternidade e Neonatologia, Hospital La Rabta, Tunis, Tunísia
RESUMO
A infecção pelo papilomavírus de alto risco Humanos (HR-HPV) é necessária, mas não suficiente para causar câncer cervical. Este estudo investigou se múltiplo HR-HPV ou co-infecção com vírus de Epstein-Barr (EBV) influenciam o estado de integração do genoma de HPV16. A presença e tipagem de HPV de uma série de 125 amostras cervicais foram avaliados por meio da reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os iniciadores específicos para a região L1 do HPV. Como para a infecção por EBV, o gene EBNA1 viral foi utilizado para a detecção através de amplificação por PCR. A ruptura do gene E2 do HPV foi
avaliada através da amplificação do gene E2 inteiro com um único conjunto de iniciadores, ao passo que as transcrições de E2 foram avaliadas por um método de transcrição reversa PCR (RT-PCR). A prevalência global de HPVDNA foi de 81,8% em cânceres cervicais contra 26,9% em lesões benignas. Em casos de HPV positivos, HPV16 e HPV18 foram os tipos mais prevalentes, seguidas por HPV dos tipos 33, 31. EBV prevalência EBNA1 foi estatisticamente mais freqüente nos carcinomas do colo do útero do que em lesões benignas (29,5%, contra 9,6%; P = 0,01). Não foi detectada a infecção viral, em mulheres saudáveis de controle. O gene E2 ininterrupta foi correlacionado com a presença de transcritos de E2 originários a partir das formas de HPV epissomais. Observou-se que a integração é mais comum em HPV18 e co-infecção com EBV. A presença de EBV causou uma de cinco vezes [OR = 5; CI = 1,15-21,8; P = 0,04] aumento do risco de HPV16 integração do genoma no genoma do hospedeiro. Este estudo indica que a infecção EBV está agindo como um co-fator para a indução do câncer de colo uterino, favorecendo a integração HPVDNA.
Palavras-chave: câncer de colo do útero, o vírus Epstein-Barr, E2 gene, mRNA E2, papilomavírus humano de alto risco.
INTRODUÇÃO
Papilomavírus humano (HPV) é um pré-requisito para o desenvolvimento do cancro do colo do útero (6). Esta associação é forte, consistente, e específica para um número limitado de tipos virais (9, 26), em que HPV16 e HPV18 são os mais prevalentes (23, 14, 48). Diferenças geográficas nas frequências de outros tipos de HPV de alto risco, incluindo os HPV 31, 33, e 45, têm sido relatados para existir (10, 26). Quase todas as mulheres serão infectados com o HPV durante a sua vida, mas apenas uma minoria dessas infecções irá progredir a cânceres invasivos. Por conseguinte, existe uma necessidade contínua para a identificação de factores virais e do hospedeiro que modulam o risco de progressão da doença (11). Possíveis agentes incluídos Herpes vírus entre as quais, mais recentemente, o vírus Epstein-Barr (EBV), têm sido suspeitos de participar na carcinogênese cervical (15, 33, 31, 13). Por exemplo, a infecção latente por EBV tem sido mostrada a agir como um cofactor carcinogénico em várias doenças malignas de células epiteliais (38). O regulador viral EBNA1 de EBV transcrição e replicação é tipicamente expressa em muitas formas de neoplasias EBV-positivos (24). Por outro lado, a integração do ADN do HPV no genoma humano é considerado um passo essencial na progressão da infecção associada a HPV cervical de carcinoma cervical invasivo (18, 41). Mediante a integração do gene E2 virai, que codifica um repressor da transcrição, é muitas vezes perturbada com a perda da sua função de repressor conduzindo assim a regulação para cima da transcrição dos oncogenes E6 e E7 (30, 12). Elevada expressão dos oncogenes virais leva a perturbação dos controlos do ciclo celular e da instabilidade genómica que aumentam o risco de transformação maligna (25, 29). O principal objetivo do nosso estudo foi o de explorar a distribuição de freqüência de genótipos de HPV de AR e infecção EBV em câncer de colo do útero e lesões pré-malignas, a fim de correlacioná-los com o HPV 16 de estado físico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Coleta de Amostra e População do Estudo
Este estudo envolveu 44 pacientes com carcinoma cervical recrutados do departamento de rádio-oncologia de Salah Azaiez Institute (Tunis, Tunísia). A idade média dos pacientes era de 57,2 anos (intervalo: 38-76 anos).Amostras tumorais foram coletados por biópsia, que consistia de 39 carcinomas de células escamosas e 5 adenocarcinomas. Estágios da doença foram codificados de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO). Nenhum malignos biópsias cervicais foram obtidas de 52 mulheres que frequentam as Obstetrícia e Ginecologia do Departamento de La Rabta Hospital (Tunis, Tunísia) por outros motivos que não o câncer cervical. Também 29 mulheres controles saudáveis, aconselhamento para a saúde reprodutiva de rotina, foram utilizadas como referência. O intervalo de idades variou de 27 a 56 anos, com uma média de 41 anos.Controles não tinha história passada ou atual de anomalias cervicais. Espécimes de biópsia foram transferidos para criotubos, suspensas em 1 ml de PBS (solução de tampão fosfato pH, solução salina 7,4) e armazenadas congeladas a -20 ° C até à análise.
DNA e RNA isolamento
Extracção de ADN foi realizada utilizando o sistema QIAamp, QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com procedimentos padrão, tal como descrito no kit, com tampão de lise de detergente e a digestão com proteinase K. O DNA total foi eluído em 100 ul de tampão de eluição e armazenado congelado a -20 ° C. RNA a partir de tecidos congelados foi isolado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), como recomendado pelo fornecedor, e dissolvido em 30 uL de água livre de RNase.
A qualidade e quantidade dos ácidos nucleicos alvo foram analisados por eletroforese em gel de agarose e medição da densidade óptica (absorvância a 260 nm).
HR-HPV digitação e EBV detecção
DNA genómico purificado foi amplificado utilizando a técnica de PCR para o HPVL1 HR e EBNA1 de EBV (genes sintetizados por GeneCust Europa, Dudelange, Luxemburgo) utilizando iniciadores específicos, bem como para a referência interna gene β-globina, para determinar se o DNA isolado foi adequada para a amplificação. Ciclos térmicos foram realizados em um termociclador programável PCR (Applied Biosystem, Foster City, EUA), como descrito anteriormente (46, 21). Cada experiência foi realizada com PCR positivos (plasmídeos de HPV, carcinoma cervical anteriormente provou conter EBV) e negativo (branco água) controles. As amostras positivas para theβ-globina controle de ADN, o que confirma que nenhuma das amostras era inibitório para PCR ou não tinham DNA. As sequências de iniciadores, tamanhos amplicon e programas de ciclismo são ilustrados na Tabela 1 .
Avaliação de HPV16 E2 DNA e RNA integridade
Adaptar uma abordagem anteriormente descrito (4), a integridade do gene E2 foi avaliada por meio de um único conjunto de iniciadores específicos de sequência, que foram desenhados para amplificar o enquadramento de leitura aberto (ORF) os fragmentos abrangendo todo o comprimento do gene E2 de HPV16 ( Tabela 1 ).
Todas as amostras positivas para HPV 16 L1 expressão foram sujeitos a amplificação por PCR da região ORF E2. A presença de E2 amplicon em gel de agarose confirmou um gene E2 intacta, enquanto a falta de banda específico indicado ruptura. HPV16 amostras positivas foram ainda submetidas a amplificação
dos transcritos de E2 (28).Para controlar a integridade de ARN, a RT-PCR utilizando reacções β -actina iniciadores específicos foram realizados (34). Um micrograma de ARN total foi reversamente transcrito usando a um passo de RT PCR Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Os produtos amplificados foram submetidos a electroforese sobre um gel de agarose a 1,5%, caracterizado por uma escada de DNA de 100 pb (gene Régua TM , Fermentas, Foster City, EUA), corado com brometo de ethiduim, e visualizados sob luz UV. As imagens foram gravadas usando o sistema de documentação Foto (Doc-impressão II, Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, França).
Várias precauções foram tomadas medidas para evitar resultados falso positivos. Passos diferentes, tais como a preparação da amostra, a extracção de ácidos nucleicos, a amplificação por PCR e pós, foram realizadas em salas estritamente separadas.
Estatística
Os dados foram analisados usando SPSS, versão 18,0 para Windows Vista. As associações entre as variáveis foram avaliadas por meio do teste exato de Fisher. Odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram estimados por modelos de regressão logística. A análise de regressão logística foi utilizada para avaliar o efeito simultâneo de mais de uma variável e identificar os possíveis fatores de confusão. Em todas as análises, os valores de probabilidade inferior a 0,05 foram considerados significativos.
RESULTADOS
Freqüências de HR-HPV e EBV DNA em amostras cervicais
Utilizando os iniciadores dirigidos contra o gene L1 altamente conservada, foram detectados quatro tipos diferentes de HPV na nossa colecção de amostras. A 36 total de 44 amostras de câncer de colo do útero (81,8%) eram HPV positivos. HPV tipo 16, o mais frequente tipo de HPV oncogênico, foi encontrado em 24 casos (54,5%), enquanto HPV18 ficou em segundo lugar com uma taxa de 15,9% (7/44). Tipos menos frequentes incluem HPV 33 e HPV31 foram também encontrados em 6,8%, 4,5% das amostras, respectivamente, enquanto não se detectou HPV45. Dupla infecção foi encontrada em cinco casos de HPV 16 e 18 em três casos e HPV 16 e 33 em dois casos.
A partir das lesões benignas do colo do útero, 21,1% eram positivos para HPV16 (11/52), enquanto que 5,7% foram positivos para HPV18 (3/52). Uma amostra contendo o tipo de HPV 16 e 18 foi encontrado. Entre o grupo de controle, não há infecção viral foi detectado. Os resultados da tipagem do HPV estão resumidos na Tabela 2 .
Os nossos resultados indicam um aumento significativo na detecção de HR-HPV nos cancros em comparação com amostras não malignos ( P <0,01).
A taxa de detecção de EBV EBNA1 em amostras de tecido de pacientes com câncer do colo do útero foi mais freqüente do que em amostras não malignos (29,5% vs 9,6%, P = 0,01). Além disso, o EBV EBNA1 não foi encontrada em nenhuma das amostras de controlo. De acordo com a Proporção de Odd (OR) [3,9 (1,28-12,16)], as mulheres infectadas com EBV tem uma probabilidade de três vezes de desenvolver carcinoma cervical.
A acção sinérgica de HPV16 e EBV também pode ocorrer em alguns carcinomas cervicais (22,7%), contendo tanto o EBV e HPV16 DNA versus apenas 7,6% nas amostras benignas.
Correlação entre HPV16 estado E2 física e epissomais transcrições derivados
Formas integradas de HPV16 DNA foram predominantes nos cânceres cervicais, constituindo 62,5% (15/24), enquanto formas epissomais foram detectados em nove casos (37,5%). Dentre as lesões benignas, 2 dos 11 HPV 16 casos positivos (18,1%) mostraram interrupção E2, enquanto as formas epissomais foram observadas em nove casos (81,8%). Assim, a ruptura E2 foi significativamente maior entre cancros como esperado [ P = 0,02, OR (IC 95%) = 7,5 (1,32-42,77)] Tabela 3 . Optou-se então para verificar a expressão transcricional de HPV16 E2 em lesões associadas, utilizando RT-PCR.
Todas as amostras foram positivas para a β -actina RNA de controlo, o qual foi incluído para evitar resultados falso-negativos, devido à degradação do ARN (não mostrados). HPV16 E2 mRNAs foram expressos na presença do vírus intacto, com formas epissomais e transcrições E2 origem apenas a partir do DNA de HPV16 epissomal. NaFigura 1A e Figura 1B , 6 dos 18 casos positivos HPV16E2 cervicais (pistas 1-6) são apresentados como exemplos.
Presença do DNA intacto E2 de HPV16, flanqueando os segmentos 1026-pb do fragmento ORF, foi finalmente confirmada por HPV16 E2 RNA utilizando iniciadores que dão um produto amplificado de 149 pb. Em geral, a amplificação de E2 com RT-PCR apareceu mais sensível do que a amplificação de ADN pelo método de PCR para a detecção de intacta do gene E2 do HPV, porque os sinais de ADN de E2 a partir de RT-PCR são geralmente mais fortes do que os de DNA-PCR ( Figura 1 A , Figura 1B ).
A interrupção do gene E2 juntamente com vários HR HPV ou co-infecções por EBV prever progressão cancerígena
Para analisar se os factores virais podem ter uma influência sobre o estado de integração, correlacionamos ruptura do genoma de HPV16, com múltiplas HR HPV e co-infecções por EBV.
Tal análise revelou que a co-infecção com HPV 18 foi encontrado mais frequentemente associado com HPV16 integração, enquanto que em contraste, a co-infecção com HPV33 foi associada apenas com HPV16 formas epissomais ( Figura 2 ). Também correlacionaram a presença de EBV com o estado do genoma de HPV16 em lesões co-infectados. Curiosamente, o EBV foi mais frequentemente presentes nas amostras com formas integradas de HPV16 do que nas formas epissomais. Com base nestes dados, a infecção por EBV foi significativamente
associado com a interrupção do genoma de HPV16 como revelado por OR (IC 95%) e P valores [OR = 5; CI = 1,15-21,8; P = 0,04] Tabela 4 . EBV poderia, portanto, ser considerado como um cofactor de risco de doença, tal como determinado pelo ou com base em modelos de regressão logística. A presença de EBV pode também aumenta a probabilidade de integrada do genoma de HPV16.
Na conclusão da nossa análise, EBV pode desempenhar um papel na cooperativa HPV16 progressão cancerígena, favorecendo HPV16 integração do DNA no genoma celular.
DISCUSSÃO
A infecção com o HPV de AR é uma causa necessária mas não suficiente do carcinoma cervical, com adicionais virais e do hospedeiro eventos genéticas necessárias para dirigir as células para o fenótipo maligno (47). Neste relatório, confirmou que HPV16 e 18 são os dois tipos mais freqüentes detectadas entre carcinoma cervical na Tunísia, e que são responsáveis por 70,4%, o que é muito semelhante à proporção estimada em outras regiões do mundo pela publicados recentemente meta-análises de grandes dimensões ( 23, 14). Em menor grau, HPV31 e HPV33 foram detectados em 11,3% dos casos, enquanto que não foi encontrado HPV45. Dados semelhantes foram descritos para HPV31, 33, 35, 45, 52 e 58, que podem ser agrupadas em vários ramos diferentes na distribuição geográfica e na prevalência relativa dentro de diferentes grupos étnicos (7,
8). HPV18 é o tipo de HPV primário associado com adenocarcinoma do colo do útero e seu tipo de relacionados HPV45 (alfa 7 espécies) mostra uma taxa semelhante de associação (42). Curiosamente, os nossos dados patológicos demonstram maior prevalência de carcinoma de células escamosas sobre adenocarcinomas em nossas amostras, além disso, a presença de HPV em lesões benignas do colo do útero tem sido amplamente documentada. No nosso estudo, a prevalência de HPV tipo específico foi semelhante ao encontrado na análise de agregação, onde HPV 16/18 são os tipos mais frequentes observados (39, 40).
Embora o papel de alto risco de infecção por HPV em cancro cervical está bem documentado, o papel da infecção múltipla tem sido pouco estudado. Infecção por HPV múltipla foi encontrado para ser associado com a persistência da infecção por HPV, que é um pré-requisito para a transformação neoplásica (2, 17). Esse relatório detectou infecção de HPV múltipla em 11,3% dos pacientes com câncer cervical. Em outros estudos, a taxa de infecção por HPV em vários cancros cervicais invasivos variou entre 0% e 36% (32). Assim, múltiplas infecções de HPV de RH deve ser mais relevante para HPV18. Mulheres co-infectados com HPV16 e HPV18 estão em risco significativamente maior de desenvolver CIN3 e câncer quando comparada a mulheres infectadas com outros tipos de alto risco (22).
É interessante notar que a infecção com HPV 33 foi detectada quase exclusivamente como parte de infecção pelo HPV múltipla. Apenas um paciente teve HPV tipo 33, como uma única infecção entre os três casos detectados.Uma explicação para o HPV tipo 33 foi um elemento comum de infecções múltiplas pode ser que o HPV 33 ocorre geralmente em combinação com tipos filogeneticamente relacionados (HPV16, 31, 35 e 58). Por outro lado, HPV31 foi consideravelmente menos comum em carcinoma cervical, como observado em estudos anteriores (20), sugerindo que, em populações tunisinas, que tem apenas um potencial relativamente fraco carcinogénico em comparação com outros tipos. Apenas uma lesão maligna não foi mostrado para abrigar HPV16/18 co-infecção. É provável que esta lesão específica benigna está em risco de progressão cancerígena.
Caso contrário, a prevalência dos tipos de HPV de AR sozinho não dá uma imagem precisa do estado cancerígeno da lesão. A este respeito, os estudos sobre o estado físico do genoma de HPV pode ajudar a avaliar o risco de carcinogénese do colo do útero. Nossos achados confirmam relatos anteriores sobre a associação de ruptura do gene E2 com câncer de colo uterino, carcinoma de células escamosas em que abrigou a interrupção de 62,5%, em contraste com 18,1% em lesões benignas. Estes dados estão de acordo com o relatório por Nagao et al., (27), que mostrou um aumento de formas integradas de HPV 16 em paralelo com a progressão da doença. A proteína E2 do HPV desempenha um papel essencial no ciclo de vida viral, como uma transcrição e um factor de replicação.E2 mostrou também ser capaz de transporte do núcleo, para o citoplasma, onde ativa caspase 8, induzindo assim a apoptose (5, 36, 37). A proteína E2 de HPV16 foi também mostrado para ser expressa a níveis relativamente elevados em comparação com lesões benignas cancros (45). Por conseguinte, a detecção de transcritos HR-HPV E2 pode servir como um biomarcador adicional de doenças do colo do útero. Os resultados do presente estudo também indicam que a actividade de transcrição de HPV16 E2 é um indicador mais sensível da perturbação genómico de análises do ADN genómico. Quando carcinomas do colo uterino co-infectados pelo HPV16 e HPV18 foram investigados pudéssemos mostrar que HPV18 co-infecção foi mais provável ligado ao HPV16 formas integradas. Foi previamente estabelecido que HPV16 está presente exclusivamente em formas epissomais em 30-70% dos cancros cervicais (3, 43), ao passo que HPV18 foi relatado para ser principalmente integrado (3), o que indica que estes tipos de HPV pode ter diferentes características biológicas . Ao mesmo tempo, alguns dados indicam que os doentes infectados com HPV 18 mostrou uma rápida progressão por etapas pré-cancerosas (44).Em contraste, o HPV33 foi encontrado substancialmente mais freqüentemente associada com HPV 16 formas epissomais, em comparação com HPV18. Ela está em
boa concordância com a observação de que os cancros associados com HPV16 e HPV18 tendem a ser mais agressivos, e que a detecção de outros tipos de HPV 16 e 18 que é um preditor independente da melhor sobrevivência em pacientes com carcinoma cervical (19). Retratando a presença de genes intactos E2 em quase 37,5% de HPV 16 casos positivos de câncer do colo do útero, que posteriormente abriu o caminho para novos paradigmas de carcinogênese cervical.
Um suposto papel de fatores de cooperação, tais como a interação com os colegas vírus infectante, possivelmente em diferentes estágios da carcinogênese cervical é demonstrado aqui. Anteriormente, EBV, o vírus herpes oncogénico, tem sido sugerido como um co-factor possível viral (35). O facto de o receptor EBV/C3d foi mostrado para ser expresso em amostras cervicais epiteliais, bem como a ligação de EBV claro com tumores originados do epitélio, fez esta hipótese plausível (15). No entanto, outros autores não chegar à mesma conclusão, confirmando que o EBV estava agindo na patogênese do tumor do colo do útero (33). A ausência de infecção por EBV em controlos e do declínio do EBV pico em lesões benignas da cervical sugerem que a infecção por EBV ocorre no final da oncogénese cervical. Pode ser que o vírus EBV está a actuar como um cofactor do HPV, na indução da cérvix uterina patologia, a sugestão foi confirmada por estudos de Szkaradkiewicz et al, (35), que relatam uma via possível para a transmissão sexual de EBV.. No entanto, não existem evidências convincentes para suportar a hipótese de que a infecção por VEB tem um papel directo na patogênese da neoplasia cervical. Embora, EBV infectados linfócitos infiltrantes de tumor pode contribuir indirectamente, a carcinogénese do colo do útero através de produção de IL-10 virai expressa a partir do BamHI-C para a direita leitura fragmento do gene da armação 1 (BCRF-1), o que provoca uma redução da imunidade local que conduz à supressão da resposta a células transformadas por HPV-(1). Isto, juntamente com o facto de que a infecção por VEB pode contribuir para a integração do genoma de HPV16 ocorrência, sugere que, embora não possam estar envolvidos nos processos oncogênicos directamente, eles podem desempenhar um papel como co-factor. Assim, o vírus EBV EBNA1 proteína tem mostrado ser capaz de diminuir a apoptose e a reparação do ADN em lesões associadas a EBV, assim, potencialmente contribuir para a transformação maligna de co-transfectadas com EBV / HPV lesões (16).
Em resumo, o conhecimento adicional dos marcadores de HPV integração genômica tem o potencial para melhorar a gestão objectivo de neoplasia cervical. Os dados aqui apresentados podem também ser benéfico para a nossa compreensão da biologia dos tumores humanos associados a integração do vírus tumorais de DNA de outros.
Lista de abreviaturas: EBV: Epstein-Barr; RT-PCR: reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase; PBS: salino tamponado com fosfato; HPV: papilomavírus humano.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos especiais ao Pr Françoise THIERRY, investigador principal, Instituto de Medicina Biologia, Biomédicas Grove, Singapura, para discussões construtivas e comentários sobre o manuscrito. Os autores agradecem a equipe médica que contribuíram para a coleta e avaliação dos espécimes. Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido pela concessão do Ministério do Ensino Superior e Investigação Científica, na Tunísia.
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Submissão: 22 de julho de 2011 devolvidos aos autores para as correções: 22 setembro de 2011 Aprovado: 07 de junho de 2012
* Autor Correspondente. Endereço para correspondência: Unidade de Imunologia e Microbiologia Ambiental e Carcinogênese (IMEC), da Faculdade de Ciências de Bizerte, Universidade de Cartago, 7021 Jarzouna, Bizerte, Tunísia; E-mail:. [email protected]
SBM
USP - ICB III - Dep. de Microbiologia Sociedade Brasileira de Microbiologia
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Revista do Instituto de Medicina Tropical de São PauloVersão impressa ISSN 0036-4665
Rev. Inst. Med. trop. Vol.54 no.1 São Paulo São Paulo janeiro / fevereiro 2012
http://dx.doi.org/10.1590/S0036-46652012000100003
VIROLOGIA
Circulação de Papilomavírus Humano (HPV) em mulheres de genótipos de Córdoba, Argentina, com lesões intra-epiteliais
Circulación de genotipos de papiloma vírus Humano (VPH) en con mujeres lesiones intrepiteliales escamosas de Córdoba, Argentina
Raul Fernando Venezuela I ; Ana Ximena Kiguen Eu , Maria Celia Frutos I ; Cecilia Gabriela Cuffini I
Eu Instituto de Virologia "Dr.JM Vanella" UNC
Correspondência para
RESUMO
Papilomavírus humano (HPV) pode induzir uma grande variedade de lesões intraepiteliais escamosas (SIL) de gravidade variável. O objetivo do presente estudo foi estabelecer a frequência de infecção pelo HPV e identificar os genótipos circulantes em mulheres de Córdoba, Argentina, em relação à idade e citologia. Um total de 186 mulheres, entre 18 e 65 anos de idade, com antecedentes de SIL, passou por um exame pélvico e tinha células cervicais coletadas para citologia e detecção de DNA do HPV. Noventa e seis amostras (51,6%) foram positivas para a detecção de HPV, e 63 (65,6%) dos pacientes mostrou a presença de pelo menos um HR-HPV. SIL de baixa e de alta qualidade mostraram associação significativa em pacientes com menos de 35 anos de idade.Encontramos 18 genótipos diferentes,
com uma maior presença de HR-HPV. Genótipos 16 e 6 foram os mais frequentes. Sete (7,3%) infecções múltiplas, 85,7% dos que tinham pelo menos um HR-HPV, foram detectados. A detecção de um grande número de genótipos diferentes do HPV é um sinal de aviso. É, portanto, necessário reforçar o monitoramento da circulação de genótipos de alto risco, atualmente menos prevalente em lesões intra-epiteliais, como uma medida de controle para o possível impacto da implementação de vacinas contra os genótipos 16 e 18.
Palavras-chave: HPV; lesões intra-epiteliais do colo uterino;; genótipos, Argentina.
RESUMEN
El papilomavírus Humano (papiloma humano, o HPV) induzir un amplio ESPECTRO de lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) de variada severidad. Objetivo: conocer la frecuencia de infección POR HPV y los determinar genotipos circulantes en mujeres de la ciudad de Córdoba, Argentina, en relación con la edad y la citología. Se realizó citología y detección de ADN-HPV en Células cervicales de 186 mujeres de 18 a 65 años con Antecedentes de SIL. Noventa y SEIS (51,6%) fueron Positivas para la detección del HPV, de las cuales, en 63 (65,6%) se Detecto la presencia de al Menos, un HPV de Alto Riesgo (HR-HPV). Las SIL de alto grado (HSIL) y bajo de Grado (LSIL) SE asociaron de Pacientes Menores de 35 años. Se hallaron 18 genotipos Diferentes, con presencia prefeito de HR-HPV. HPV 16 y 6 y más fueron frecuentes se detectaron sete (7,3%) Múltiplos infecciones, 85,7% de Estás presentaron al Menos un HR-HPV. La detección de un alto numero de Diferentes genotipos es una señal de Alerta. Por Tanto, es necesario fortalecer la vigilancia de los HR-HPV, actualmente Menos frecuentes en las SIL, Como Medida de controle del Impacto Que Tendra la implementación de las vacunas contra HPV 16 y 18.
INTRODUÇÃO
Papilomavírus humano (HPV) pode induzir um largo espectro de lesões intraepiteliais escamosas de gravidade variável. A prevalência da infecção genital por HPV, que é o mais comum em todo o mundo de infecções sexualmente transmissíveis, depende da idade da mulher e o método de detecção 5 . Numerosos estudos têm relatado que certos tipos de HPV são a causa principal do cancro cervical. Mais de 40 genótipos foram identificados no tracto anogenital. Dependendo da sua associação com baixo / alto grau lesões intraepiteliais escamosas ou carcinomas invasivos, que podem ser agrupados em baixo risco (LR-HPV), tais como HPV 6 e 11, e HPV de alto risco (HPV), tais como HPV 16, 18, 31, 33 e 18,23 .
A patogénese do cancro do colo do útero começa como um processo lento que perturba a diferenciação do epitélio escamoso cervical, provocando alterações na sua estrutura e fisiologia 35 .
Displasia cervical de células, o que é evidenciado por alterações na forma, tamanho e organização do epitélio, é causada como resultado de uma infecção com HPV 20,35 .
Por meio do Sistema de Bethesda 31 , essas lesões podem ser classificadas como: células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), baixo grau de lesões intra-epiteliais (LSIL), alto grau de lesões intra-epiteliais (HSIL) ou carcinoma de células escamosas (SCC ).
O conhecimento dos genótipos do HPV na nossa população feminina é importante para o estabelecimento de estratégias para prevenir e controlar a SCC lesões intraepiteliais escamosas, incluindo o diagnóstico molecular do vírus e vacinação. Assim, considerando a recente inclusão de vacinas anti-HPV no calendário nacional de vacinação, o acompanhamento dos genótipos circulantes deve ser sustentado ao longo do tempo, uma vez que a possível existência de mecanismos de pressão imune resultaria em uma diminuição da circulação dos genótipos listados nas vacinas e o consequente aumento da frequência de detecção de não aqueles incluídos na formulação.
O objetivo do presente estudo foi estabelecer a frequência de infecção pelo HPV e identificar os genótipos circulantes em mulheres na cidade de Córdoba, Argentina, em relação à idade e citologia.
MATERIAIS E MÉTODOS
Um total de 186 mulheres com antecedentes de lesões intra-epiteliais que participaram de clínicas privadas e centros de saúde públicos em Córdoba, Argentina, entre maio de 2008 e maio de 2010 foram convidados a participar de um estudo transversal sobre a infecção pelo HPV cervical. No início do estudo, os participantes responderam a um questionário e assinaram um termo de consentimento, por escrito, de acordo com o Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Córdoba. Os participantes foram então submetidos a um exame pélvico para a recolha de células cervicais para a citologia e HPV-DNA de detecção.
As amostras foram recolhidas em 500 mL de tampão fosfato salino (PBS). O DNA foi extraído usando o comercial AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Inc., CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.
Um segmento de 450 pb, correspondendo à região L1 do genoma viral, foi amplificado por PCR, utilizando os iniciadores degenerados MY09 e MY11 (Integrated DNA Tecnologia - EUA) 3 . O produto foi detectada por electroforese em gel de agarose a 1,5% utilizando um transiluminador de UV. O gene da b-globina foi usada como um marcador de ADN de conservação 12 . As amostras negativas foram considerados inadequados.
HPV-DNA amostras positivas foram tipificados por Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) de acordo com Bernard et al., 1994. Resumidamente, as alíquotas dos produtos de PCR obtidos utilizando os iniciadores degenerados de consenso MY09-MY11, tendo como alvo uma região de aproximadamente 450 pb de comprimento do ORF L1 do genoma viral, foram misturados com sete diferentes enzimas de restrição ( Bam HI, Hae III, Dde I,Pst I, Hinf I, Sau III e Rsa I) em reacções separadas. Os produtos de digestão foram separados por electroforese em gel de agarose a 3% e o padrão obtido em comparação com os dados publicados 3 .
A análise estatística foi realizada com InfoStat versão 2011, com um nível de significância de 5% [95% IC] 17 .
A fim de estimar as probabilidades de ocorrência, foram calculadas as freqüências para os genótipos diferentes, idades e características citológicas.
Qui-quadrado (χ 2 ) testes de independência foram conduzidos para determinar a associação entre diferentes grupos de idade, características citológicas, genótipo de HPV e risco. Ao mesmo tempo, de regressão logística foi realizada para determinar a associação entre a idade, tipo de lesão (LSIL / HSIL) e genótipo. Para este último, nós trabalhamos com os genótipos 6, 11, 16 e 18.
RESULTADOS
A idade dos pacientes variou entre 18 e 65 anos (média de idade de 31,13 anos) ea distribuição por idade foi a seguinte: <25 anos ( 22,1 DP 1,79) = 35 (18,8%), 25-34 anos ( 29,5 SD 2,76 =) 96 (51,6), 35-44 anos ( 38,9 DP 2,89) = 28 (15,1%) e ≥ 45 anos ( 48,7 DP 5,71) = 11 (5,9%). Idade informação não estava disponível para 16 das amostras (8,6%). Estas amostras foram excluídas da análise da idade.
Os esfregaços de Papanicolaou foram corados e interpretadas localmente por uma equipe de citopatologistas e os resultados foram classificados de acordo com o Sistema Bethesda. LSIL foi diagnosticado em 120 mulheres (64,5%), HSIL em 42 (22,6%), ASCUS em 16 (8,6%), e SCC em um (0,5%). Sete amostras (3,8%) foram normais.
Todas as amostras mostraram a amplificação do gene da beta-globina.
Noventa e seis amostras (51,6%) foram positivas para a detecção de HPV, e 63 (65,6%) dos pacientes (isto é, 33,9% de todas as amostras) mostrou a presença de pelo menos um HR-HPV.
A Tabela 1 mostra a detecção de HPV (HPV e LR-HPV) em função da idade, em comparação com a classificação citológica.
Embora a análise global não mostraram predominância de nenhuma das classificações citológicas por faixa etária (χ 2 = 17,9, p = 0,3276), na análise de independência entre o grupo de idade e do tipo de lesão (HSIL e LSIL), encontramos uma associação significativa com as mulheres com menos de 35 anos (χ 2 = 4,9, p = 0,026 OR = 0,30, 0,10 a 0,87).
O tipo de lesão HSIL teve a maior detecção de HPV (71,4%) e freqüência de HR-HPV (86,7%). No entanto, a distribuição de HR-HPV não mostraram uma associação estatisticamente significativa com o tipo de lesão (χ 2 = 2,7, p = 0,0995 OR = 0,43, 0,16, 1,16). Apesar disto, excepto para o grupo <25 anos de idade, a taxa de detecção de HPV em HR-HSIL foi superior a 90%.
Além disso, a detecção do HPV superior a 50% em todas as faixas etárias, exceto para o grupo de 35-44 anos de idade, no grupo <25 anos de idade foi verificada a maior porcentagem de HR-HPV (76,2%), a maioria dos quais (78,6% ) foram detectados em LSIL.
A Tabela 2 mostra a distribuição de genótipos de acordo com a classificação citológica. Os genótipos mais prevalentes foram 16 e 6. Juntos, estes dois genótipos atingiu 50% do total (52/104, incluindo infecções múltiplas). Ambos foram identificadas em todas as classificações citológicas, excepto para o genótipo 6 em SCC e 16 em condições normais.
Genótipo 16 foi o mais prevalente em SCC e HSIL, enquanto que genótipo 6 foi o mais prevalente em amostras normais, bem como em ASCUS e LSIL.
O segundo mais prevalente LR-HPV foi genótipo 11 (8,3%), que foi detectada apenas em ASCUS e LSIL, enquanto o segundo mais prevalente HR-HPV foram genótipos 18, 52 e 58 (6,2% cada), que foram encontrados em LSIL e HSIL, com uma percentagem mais elevada no segundo.
Os quatro genótipos mais freqüentes em HSIL foram 16, 52, 18 e 58 anos, enquanto o mais freqüente em LSIL foram 6, 16, 11 e 31.
Na análise de regressão logística para lesão idade, tipo e genótipo, HPV 16, 11 e 18 estavam presentes em todas as faixas etárias e tipos de lesão, sem associação estatística. Em contraste, o genótipo 6 mostrou associação com LSIL (b = -1,65, p = 0,0417 valor, OR = 0,19, 0,04-0,94), mas tal associação não foi observada com as diferentes idades ( Tabela 3 ).
RFLP detectou a presença de sete (7,3%) infecções múltiplas, 85,7% dos que tinham pelo menos um HR-HPV, sendo o genótipo 16 a mais freqüente. A distribuição destas infecções de acordo com a lesão era: LSIL 57,1%, 28,6% e HSIL ASCUS 14,3%, mas as freqüências de infecções múltiplas versus lesões não apresentaram diferenças significativas (χ 2 = 3,75, p = 0,4409 valor).
Seis destas infecções múltiplas (85,7%) foram observadas em mulheres com menos de 35 anos de idade, com mais frequência no grupo 25-34 anos de idade (57,1%) (dados não mostrados).
A Figura 1 mostra uma comparação entre a detecção de genótipos incluídos na vacina anti-HPV e de os não incluídos na formulação. O teste de bondade de ajuste mostra diferenças estatisticamente significativas entre os pares de colunas: HR-HPV 16 e 18 vs HR-HPV outros genótipos de 16 e 18 (χ 2 = 6,00; p valor = 0,0143), a LR-HPV 6 e 11 vs LR-HPV genótipos diferentes de 6 e 11 (χ 2 = 15,04; p <0,001) e 6, 11, 16 e 18 contra HPV restante (χ 2 = 12,04; p <0,001).
DISCUSSÃO
No presente estudo, a percentagem de detecção de HPV (51,6%) foi semelhante à descrita na região (entre 41% e 64%). De modo semelhante, a detecção de HPV-HR (65%) estava dentro do intervalo anteriormente descrito (30-73%) para a mesma população utilizando o mesmo método de detecção 13,29 .
Notavelmente, como também observado em estudos realizados em Concórdia, Argentina, a freqüência de HR-HPV diminui à medida que aumenta a idade, possivelmente associado com o desenvolvimento de imunidade contra esses genótipos 22 .
O nosso trabalho evidencia a importância de rastreio de HPV na avaliação do prognóstico, o controlo da lesão e a aplicação do tratamento 11 , uma vez que uma
percentagem elevada (57,9%) de HR-HPV foi detectado em LSIL, 13,3% de HSIL foi positivo para LR -HPV e 28,6% de HSIL foi negativo para HPV.
Embora a elevada percentagem de HR-HPV em LSIL coincide com os resultados de uma meta-análise realizada em diferentes regiões do mundo 8 , não há nenhuma evidência de uma diferença estatisticamente significativa, o que sugere que ambos LR-HPV e HR-HPV pode ser encontrada na lesão.
A falta de acordo na detecção de HPV em amostras com classificação normal pode ser porque em nosso trabalho o número de pacientes que tinham manchas normais era muito baixo.
Embora detectados 18 genótipos diferentes, a maioria dos quais eram HR-HPV, a distribuição de genótipos em nosso estudo foi polarizada entre o HPV 6 e 16, desde que a freqüência dos genótipos foram, respectivamente, duas e três vezes maior do que os restantes ( Tabela 2 ).
A maior frequência de detecção do genótipo 16 está de acordo com a encontrada em relatórios anteriores realizadas na região e outros realizados na Península Ibérica, com algumas variações na taxa de detecção dos genótipos restantes 2,4,6,9,
22 .
Nós não encontramos nenhuma associação estatística entre o HPV 16 e do tipo de lesão (por análise de regressão logística, β: 0,28, p : 0,5820). Conclui-se que, de acordo com o que foi relatado anteriormente 15,33 , HPV 16 pode ser encontrado em HSIL e LSIL. No entanto, em nossa população, genótipo 16 foi encontrada principalmente em HSIL.
De acordo com os achados de outros autores 21 , HR-HPV 16, 18, 52 e 58 foram os mais frequentemente detectado em HSIL. Nós também descobrimos que os únicos LR-HPV genótipos encontrados em HSIL foram de 6 e 54, o último dos quais foi encontrada em múltiplas infecções por HPV 6.
Entre os genótipos que não estão presentes no desenvolvimento de vacinas, as mais frequentemente detectadas foram HPV 52 e HPV 58 ( Tabela 2 ). Estes foram mais comuns em HSIL e observadas no grupo etário dos 25-34 anos (dados não mostrados). .
Alguns estudos indicaram que a prevalência do DNA de HPV 52 e está presente em cerca de 2% de todos os casos de lesões intraepiteliais escamosas cervicais 28,29 e que a presença de HPV 58 para essas lesões varia entre 6% e 20%, o que é a gama em que esses genótipos foram detectados em nosso trabalho 13,24,25,26 .
A detecção de infecções múltiplas foi menor do que em outras regiões, e pelo menos um HR-HPV foi detectada em várias infecções mais 22,29 . Alguns estudos relataram uma estreita associação entre infecções múltiplas e do aumento da gravidade da lesão 10,19 . No entanto, de acordo com outros estudos, a maioria das infecções múltiplas em nosso trabalho foram detectados em LSIL (57,1%). Isto pode ser devido ao facto de que, em lesões de alto grau, o DNA viral é integrado no genoma do hospedeiro, o que conduz à perda parcial da região do gene L1, em que a amplificação por o conjunto de primers MY09/11 é dirigido 14,32 .
Outro aspecto interessante da presença destas infecções é a geração de um ambiente que favorece a recombinação potencial, o que pode ter um impacto importante sobre a farmacogenómica ea prevenção primária com a implementação das vacinas existentes 1 .
É digno de nota que a variedade de HR-HPV é cerca do dobro de LR-HPV (11 vs 7) e, como se mostra na fig. 1 , embora a imunização com vacinas existentes que cobrem mais de 50% das infecções, uma percentagem elevada (45,3%) de HR-HPV infecções não seria impedido por estas vacinas. Embora os dados de protecção cruzada são encorajadores 16,30 , os títulos de anticorpos neutralizantes para os genótipos não incluídos na formulação são cerca de dez vezes menor do que aqueles para os genótipos que estão incluídos. Isto gera incerteza sobre se eles vão desaparecer mais depressa do que os anticorpos específicos. Também tem sido relatado que a protecção contra HPV 52 e HPV 58 (dois dos quatro mais frequente HR-HPV no nosso estudo) não é significativo. Estes dados levaram alguns autores a inferir que a proteção cruzada parece ser limitada 27,30 .
A distribuição do HPV entre diferentes populações não é homogênea, ea interação das relações humanas leva a dinâmica viral que poderiam alterar o risco relativo de cada lesão na população, especialmente quando a prevalência de HR-HPV é alta 34 .
A informação fornecida no presente estudo, o qual é o primeiro a ser realizado em Córdoba, Argentina, é importante para a prevenção do HPV, e realça a importância de rotina controlos ginecológicas em mulheres com menos de 35 anos de idade, uma vez que este grupo etário foi encontrado para ser associado com LSIL e HSIL.Outro dado importante é que HR-HPV pode ser detectado em todos os tipos de lesão e grupos etários, com a agravante de que o genótipo 16 foi encontrado em uma alta porcentagem de LSIL, demonstrando assim a importância do diagnóstico virológico e vacinação preventiva contra este genótipo particular.
RECONHECIMENTO
Este trabalho foi suportado por concessões do Ministério de Ciencia y Tecnología (MINCYT) PIO 170/2011.
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Endereço para correspondência: Raul Fernando Venezuela Instituto de Virologia "Dr.JM Vanella" UNC . Calle enfermera Gordillo Gómez s / n (entre avenidas Enrique Barros y Valparaíso) Ciudad Universitaria, Córdoba Capital, Argentina. CP 5016. Tel:.. 054-0351-4334022 E-mail: [email protected]
Recebido: 05 de agosto de 2011 Aceito: 10 nov 2011
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Jornal Brasileiro de Doenças InfecciosasVersão impressa ISSN 1413-8670
Braz J Infect Dis vol.11 no.2 Salvador abr 2007
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-86702007000200003
Artigos originais
Os co-fatores ambientais na carcinogênese de alto risco do HPV / HIV-positivas
Michele Paulo; Alex Bittencourt Borges; Geraldo Duarte; Silvana Maria Quintana; Marlise Bonetti Agostinho Montes, Maria Regina Torqueti Toloi
Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo; São Paulo, SP, Brasil
O objectivo do presente estudo foi o de avaliar a presença de vírus do papiloma humano (HPV) em mulheres infectadas por HIV, com a comparação entre a técnica de Papanicolaou citológico e a técnica de PCR molecular, bem como para determinar o tipo de HPV, para medir celular imunocompetência e para identificar a presença de factores de risco para a aquisição de infecção pelo HPV. Trinta mulheres infectadas pelo HIV foram selecionados.Amostras vaginais e endocervical foram coletados de 27 deles. Os esfregaços foram examinadas por três observadores experientes para diagnosticar a presença do HPV pela técnica de Papanicolaou e os resultados foram comparados com a detecção e tipagem do HPV por PCR. Infectadas com HPV pacientes foram entrevistados de modo a identificar a presença de factores de risco para a aquisição do vírus. Oito dos 27 doentes analisados (29%) apresentaram infecção por HPV em amostras endocervicais submetidos a PCR, 6 deles (75%) apresentaram HPV que envolvem um elevado risco de desenvolvimento de cancro cervical. Para 5 destes pacientes, o diagnóstico citológico não foi confirmada por PCR. Quando imunocompetência celular estava relacionado com a infecção pelo HPV, PCR revelou um diagnóstico de HPV em 37,50% dos pacientes com risco intermediário para a infecção por HPV e em 83,33% dos pacientes com alto risco de infecção por HPV. Estes imunologicamente comprometidos pacientes infectadas pelo HPV estão em maior risco de desenvolver neoplasia cervical. Nós mostramos aqui que a PCR é adequado para a detecção do HPV e que, se apenas o método de Papanicolaou é utilizado para o acompanhamento desses pacientes, que não irá fornecer boa prevenção do câncer de colo do útero.
Os papilomavírus humanos (HPV) são epiteliotrópicos e possuem uma elevada afinidade para o tracto genital. A infecção com alguns genótipos de HPV é considerado de elevado risco para o desenvolvimento de cancro cervical.A infecção persistente com HPV oncogênico é uma condição necessária, mas não suficiente, para o desenvolvimento do câncer cervical. A ação conjunta de outros co-fatores ambientais com HPV é necessário para influenciar a transição da infecção cervical pelo HPV ao câncer cervical. Entre cofatores tais HIV, tabagismo e atividade sexual [1].
Carcinoma cervical invasivo em adolescentes e adultos, quando associada com o HIV-positivo sorologia, define o diagnóstico da Aids, indicando imunidade celular prejudicada [2,3]. Quando associada à infecção pelo HIV, carcinomas do colo uterino têm se mostrado mais agressiva e refratária ao tratamento tradicional, com altas taxas de recorrência (39% em pacientes soropositivos contra 9% em pacientes com sorologia negativa) e com a gravidade diretamente relacionada com o grau de imunossupressão. Eles também apresentam um padrão incomum de metástase e estão relacionadas a um pior prognóstico do que aqueles que não estão associados ao HIV [4,5].
O estudo da infecção por HPV entre mulheres infectadas pelo HIV tem atraído a atenção de pesquisadores devido à prevalência de cerca de 5 vezes maior desta infecção entre eles em relação ao não-mulheres infectadas pelo HIV, com um comportamento de alto risco. Esse interesse está focado no alto potencial de infecção pelo HPV se associar com neoplasias cervicais e lesões precursoras entre suas mulheres infectadas pelo HIV, em diferentes freqüências [5,6]. A infecção pelo HIV, provavelmente, atua como um desses fatores, ativando a transformação celular por mecanismos ainda pouco conhecidos ou por imunidade local deprimente no trato genital [1].
Do sangue periférico de CD 4 + contagem de linfócitos ter implicações prognósticas na evolução da infecção pelo HIV, uma vez que representam uma medida de imunocompetência celular. Nos Estados Unidos, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças enfatiza a importância do CD 4 + contagem de linfócitos na caracterização das condições clínicas relacionadas com o VIH, com contagens de menos de 200 células / ml de sangue ou uma percentagem inferior a 14% dos linfócitos totais sendo considerado crítico. No Brasil, o Ministério da Saúde estabeleceu que a contagem de linfócitos de 50 a 200 células / mm 3 caracterizar um palco com uma alta probabilidade de aparecimento de doenças oportunistas [3].
Considerado como um todo, os dados relatados por Palefski et al. [6] sugerem que as medições de imunidade (CD4 + contagens de linfócitos e carga viral do HIV), juntamente com tipagem de HPV, particularmente quando é detectado HPV persistente, pode ser valiosa para a identificação de mulheres infectadas pelo HIV com alto risco de desenvolvimento de neoplasia cervical. Eles devem ser acompanhados por freqüentes exames citológicos e submetidos a métodos mais sensíveis para a detecção de infecção pelo HPV.
Os agentes terapêuticos para o tratamento da infecção pelo HIV estão actualmente disponíveis no mercado. O uso desses medicamentos tornou-se conhecido como terapia antiretroviral altamente ativa (HAART). Um dos principais objectivos da HAART é reduzir a carga viral para níveis indetectáveis (inferior 50-80 cópias / mL) dentro de um período de 6 meses, retardando a progressão da imunidade da imunodeficiência e / ou restaurar, tanto quanto possível, aumentando o tempo e qualidade de vida do indivíduo infectado. A eficiência da HAART pode ser avaliada com base na sua capacidade para reduzir a carga viral a níveis satisfatórios, ou seja, abaixo do limite de detecção, a fim de 6 meses. Uma redução de 99% da carga viral inicial após 12 e 16 semanas é considerado como um resultado positivo de HAART [3].
Os pacientes estudados no presente estudo estão em alto risco de desenvolver câncer de colo do útero por causa de seu importante fator de risco representado pela AIDS. O objectivo do presente estudo foi o de determinar a presença do HPV nestas mulheres, com uma comparação de uma técnica citológica (Papanicolaou) e uma técnica molecular (PCR), assim como para determinar o tipo de HPV e para medir a imunocompetência celular e outros fatores de risco associados, como tabagismo, atividade sexual, tipo de parto e uso de métodos anticoncepcionais.
Materiais e Métodos
Trinta mulheres infectadas pelo HIV atendidos no Serviço de Doenças Infecto-Contagiosas em Ginecologia e Obstetrícia (SEMIGO) e na Unidade Especial de Doenças Infecciosas (UETDI), ambos pertencentes ao Hospital Universitário da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HC-FMRUSP ), foram selecionados. Os pacientes foram submetidos a exame ginecológico, incluindo a recolha de amostras
vaginais e endocervicais (Papanicolaou) e um esfregaço endocervical para a análise do DNA do HPV [9].
Para o diagnóstico com base no método de Papanicolaou, 3 citologistas examinou as manchas e os resultados obtidos foram comparados com a detecção e tipagem do HPV por PCR, de acordo com o protocolo de Gravitt et al. [9].
Como um controlo interno de PCR, um fragmento de 268 pb do gene da b-globina foi amplificado utilizando os iniciadores GH20/PC04, a fim de garantir a integridade do ADN. Como controlo negativo, as amostras foram substituídos com água [10,11]. Uma das amostras iniciais, denominados 6T0, foi testado no Laboratório de Virologia do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. O controlo positivo foi utilizado o ADN de uma linha celular humana (HeLa) com o genoma do HPV integrado serótipo 18. Esta amostra foi usada como o controlo de amplificação tanto do fragmento em relação ao HPV e o fragmento em relação ao gene da b-globina. As amostras foram submetidas a electroforese em gel de agarose a 2% durante 50 minutos, com a constante de 100 mA amperagem, seguido de coloração com brometo de etídio a 1%. As amostras foram comparadas com o controlo positivo, citado acima e aqueles que mostra a amplificação do segmento de 450 pb do HPV e do segmento de 268 pb de b-globina foram considerados positivos. As amostras para a PCR foram tipificados por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), produzida por as enzimas de restrição Bam HI, Hae III, Hin f I, Pst I, RSA I ( Amersham Pharmacia Biotech , Little Chalfont - Burckinghamshire, UK) e Dde (Roche , F.Hoffmann - La Roche LTD Corporate Communications Grenzacherstrasse - Suiça), de acordo com o método de Bernard et al.[12]. Os produtos da digestão enzimática foram separados por electroforese em gel de acrilamida a 10% durante 90 minutos a amperagem constante mA 100. Após coloração com brometo de etídio e visualização sob luz UV, os padrões foram comparados com o padrão de peso molecular do DNA RF FX174 Fragmentos de DNA / Hae III (Invitrogenä Life Technologies, Carlsbad, California). Os tipos virais foram comparados com o padrão descrito por Bernard et al. [12].
Os dados epidemiológicos e socioeconômicos foram obtidos através de uma entrevista padrão, utilizando um questionário estruturado. Os pacientes foram questionados sobre seu comportamento sexual (número de parceiros ao longo da vida, e número de parceiros durante o ano passado e durante os últimos 6 meses), o tipo de método contraceptivo utilizado, o tipo de parto, o hábito de fumar e consumo de bebidas alcoólicas. Pacientes menores de 18 anos e pacientes virgens foram excluídos do estudo, que foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Todos os sujeitos foram voluntários e assinaram termo de consentimento informado.
Resultados
PCR e Tipagem Viral
Trinta pacientes infectados pelo HIV foram selecionados para o presente estudo. Três deles não compareceram às consultas médicas e foram excluídos do estudo. Vinte e sete mulheres foram submetidas a exame ginecológico e coleta de esfregaço endocervical. O material foi submetido a exames citológicos (citologia triplo ou exame de Papanicolaou) e de PCR para o diagnóstico do HPV.
Entre as amostras analisadas por PCR, oito foram positivas para o DNA do HPV (pacientes 1, 2, 3, 6, 9, 10, 15 e 16). A amplificação de fragmentos de
aproximadamente 450 pb, característica de HPV, ocorreu em 29,6% dos casos (8/27), como se mostra na Figura 1 .
Para exame citológico, cada amostra foi testada por três diferentes citologistas que desconheciam o estado sorológico dos pacientes em relação ao HIV. O examinador detectado pela primeira vez uma imagem sugestiva de HPV em 8 pacientes (números 2, 10, 11, 13, 15, 18, 23 e 24), o segundo detectado em 4 pacientes (números 2, 11, 13 e 23) ea terceiro detectado em apenas um paciente (número 13). Estes resultados são apresentados naTabela 1 .
Dos 8 pacientes que se verificou ser positivo para o ADN de HPV por PCR ( Figura 1 ), apenas o número do paciente 10 receberam um diagnóstico de classe III, sugerindo displasia moderada. 13 Número paciente apresentou displasia moderada de acordo com a classificação de Papanicolaou, mas não mostram a presença de HPV por PCR ( Tabela 1 ).
De acordo com a técnica de RFLP, os tipos virais detectados nas 8 amostras positivas para HPV DNA ( Figura 1 ) foram de 16, 26, 56, 59 e 69. HPV tipo 69 foi detectado em pacientes 1 e 9, HPV tipo 56 foi detectado em pacientes 2 e 16, HPV tipo 16 foi detectado em o paciente 10, e HPV tipo 59 foi detectada no paciente 6. Todos estes tipos são considerados como sendo de alto risco para o desenvolvimento de carcinoma cervical. [13] Estes resultados são apresentados na Tabela 2 . HPV tipo 26 foi detectado em pacientes 3 e 15, este tipo é considerado como sendo de baixo risco para o desenvolvimento de carcinoma cervical, sendo mais associada a lesões benignas, tais como verrugas genitais comuns [14].
Características epidemiológicas
Os dados epidemiológicos dos pacientes são apresentados na Tabela 3 . A idade do paciente variou de 18 a 52 anos, média de idade foi de 33 anos ea faixa etária mais freqüente foi de 18 a 39 anos (66% -18/27). Casado e mulheres que vivem juntos correspondiam a 51,8% (14/27) dos participantes do estudo.
A média de idade na primeira relação sexual, com penetração vaginal, foi de 17 anos (intervalo: 12-33). Uma parte considerável dessas mulheres (88%, 24/27) teve sua primeira experiência sexual entre 12 e 22 anos. Seis participantes (22,2%,
6/27), que tinham sido ou ainda eram profissionais do sexo, não foram capazes de estabelecer o número de parceiros sexuais com quem haviam tido contato. Para 17 participantes, o número médio de parceiros sexuais ao longo da vida foi de 3. O número médio de parceiros durante os últimos 6 meses do ano passado foi de menos de um (0,9), uma vez que quatro participantes não ter relações sexuais durante o período de estudo e um deles informou que ela ainda era uma profissional do sexo.
Treze participantes (13/27-48%) foram tomar ou estava tomando contraceptivos orais (CO) por um tempo médio de 48 meses (intervalo: 7 meses a 10 anos). O uso regular de um conservante de seus parceiros foi relatada por 10 pacientes (48% -13/27), e a utilização concomitante de um conservante e um OC foi relatada por 3 deles.Dois participantes tinham submetidos à ligação do tubo como um método contraceptivo.
Oito mulheres (29,6% -8/27) relataram ter tido uma doença sexualmente transmissível (DST) e 8 (29,6% -8/27) informou que seu parceiro havia sofrido uma DST.
Dezesseis pacientes (59,2% -16/27) declararam que eram ou tinham sido fumantes, a maioria deles (51,8% -14/27) consumindo 10-30 cigarros por dia. Fumar começou, em média, aos 15 anos de idade e foi mantida por um tempo médio de 16 anos (intervalo: 5 a 31 anos).
A média do número de gestações e de filhos nascidos vivos foi de 3. Quatro pacientes tiveram pelo menos um aborto. O parto vaginal foi o tipo predominante, com 59,2% (16/27) dos participantes tendo entregue pelo menos uma criança por esta via. Quatro pacientes eram nulíparas.
Terapia antiretroviral altamente ativa (HAART)
Dezesseis pacientes (números 1, 3, 8, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26) não receber HAART, mas foram acompanhados por um período de tempo variando 98-309 dias. Onze pacientes receberam HAART, durante um período de seguimento variando 125-351 dias. Normalmente, os pacientes que haviam iniciado tratamento com intervalos entre 7 e 351 dias após a visita inicial (números 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 14, 16, 18, e 27) Cinco desses pacientes (números 2, 6, 9, 10 e 16) foram encontrados para ter DNA de HPV pela técnica de PCR.
Como mostrado na Tabela 4 , todos os pacientes que receberam HAART apresentavam aumento CD 4 + contagens e diminuiu as cargas virais de HIV. O Ministério da Saúde recomenda que todos os pacientes na fase inicial do tratamento, como foi o caso para os pacientes presentes, receber potentes ou triplo esquemas anti-retrovirais [3]. Como mostrado na Tabela 4 , a HAART inicial seleccionada para os pacientes apresentam a combinação de dois inibidores nucleósidos da transcriptase reversa análogos (NRTI), lamivudina (3TC) mais estavudina (d4T), ou a zidovudina (AZT), e uma reversa não-nucleósido análogo inibidor de transcriptase (NNRTI), nevirapina ou efavirenz. Dois doentes (números 6 e 14) recebeu uma combinação de AZT e 3TC (NRTI) com nelfinavir.
Discussão
Detecção de vírus e Digitação
HPV foi detectada por PCR em amostras endocervicais de 8 dos 27 pacientes estudados, com 6 deles (75%) apresentando os serótipos 16, 56, 59 e 69, de alto risco para o desenvolvimento de cancro cervical. O HPV 16 genótipo foi detectado em apenas um paciente (número 10), o HPV 56 genótipo foi diagnosticada em dois pacientes (números 2 e 16), o HPV 59 foi detectado apenas em paciente não. 6, HPV 56 foi diagnosticada em dois pacientes (números 2 e 16), e 69 do HPV nos números de pacientes. 1 e 9. Dois outros pacientes (números 13 e 15) apresentaram infecção por HPV tipo 26, de baixo risco para o desenvolvimento de câncer de colo do útero, o que corresponde a uma percentagem de 25%.
Entre as 27 amostras analisadas pelos citologistas 3 examinando, não examinador. 1 detectou alterações citológicas sugestivas de HPV em pacientes 2, 10, 11, 13, 15, 18, 23 e 24. Em 5 destes pacientes (números 11, 13, 18, 23 e 24) o diagnóstico citológico não foi confirmada por PCR. Não citologista. 2 detectou alterações citológicas sugestivas de HPV em 4 pacientes (números 2, 11, 13 e 23). Apenas um destes resultados, para o paciente número 2, foi confirmada por PCR. Número citologista 3 detectou alterações citológicas sugestivas de HPV somente em paciente de 13 e este resultado não foi confirmada por PCR. Isto deveu-se ao facto de o exame citopatológico, que tem sido largamente utilizado e aceite como um método de triagem para a prevenção do cancro do colo do útero, tem uma baixa sensibilidade de cerca de 70%, devido à variabilidade intra-e inter-observador envolvido no exame , o que leva a um grande número de resultados falso-negativos [18-20]. No presente estudo, apesar de a amostra do paciente era pequena, da citopatologia apresentou sensibilidade de apenas 38% em relação ao PCR.
Em 4 casos (pacientes 1, 6, 9 e 16), alto risco de infecção por HPV foi detectada por PCR, enquanto que nenhum dos citologistas examinando detectaram alterações citológicas sugestivos de infecção pelo HPV ( Tabelas 1 e 2 ).
Cofatores de risco para a progressão da infecção pelo HPV ao câncer cervical
Doenças Sexualmente Transmissíveis
STDs são considerados importantes para a co-factores a progressão da infecção por HPV em lesões mais graves [15]. Todas as mulheres estudadas aqui, por estarem infectados com o HIV, já estavam sob a influência deste cofactor. Oito pacientes (8/27-29.6%) relataram ter sido infectado com alguma DST que a infecção pelo HIV e 8 (29,6%) relataram que os seus parceiros tinham sido infectados com um STD diferente de infecção por HIV (Tabela 3 ). No entanto, esta informação é de valor relativo, uma vez que foi obtido por meio de entrevistas com os pacientes. Este tipo de informação é influenciada por vários fatores, tais como a incapacidade de compreender os termos técnicos utilizados em diagnósticos anteriores, constrangimento durante a entrevista, esquecimento, confusão e dificuldade no diálogo e na relação do paciente com seus parceiros, entre muitos outros.
Partos vaginais
O risco de infecção por HPV progressão para o câncer do colo do útero entre as mulheres mais jovens do que 45 anos é diretamente proporcional ao número de gestações resolvidas por parto normal, provavelmente devido a eventos hormonais relacionadas com os segundo e terceiro trimestres de gravidez, tais como ectopia e metaplasia na zona de transformação [16].
Devido ao número e tipo de partos e com a idade, 3 pacientes (números 14, 15 e 22) foram expostas a este cofactor risco de progressão neoplásica.
Fumador
Estudos publicados pela IARC têm mostrado que o risco de desenvolver câncer do colo do útero para as mulheres infectadas com HPV é cerca de duas vezes maior entre as mulheres com histórico de fumo 20 cigarros por dia durante pelo menos 6 anos [14]. Quatro participantes do estudo (números 6, 15, 22 e 25) cumpriu esses critérios, com infecção por HPV oncogênico eo tabagismo variando de 7 a 21 anos. Assim, estas mulheres foram expostas a um co-factor altamente relevante, capaz de influenciar de forma significativa a progressão de infecções cervicais para lesões de alto grau e cancro cervical invasivo.
T-CD 4 + Conde Linfócitos e Quantificação de Carga Viral
A elevada prevalência de HPV de alto risco entre mulheres infectadas pelo HIV se acredita estar mais relacionada com a imunossupressão, o que leva à persistência e reativação de infecções latentes que culminam com a recente aquisição de novos tipos de HPV. A determinação imunidade e tipagem do HPV são parâmetros importantes para a identificação de mulheres infectadas pelo HIV com alto risco de desenvolver neoplasia cervical [5].
Tabela 5
A combinação de CD 4 + carga contagem de linfócitos e viral do HIV tem um excelente valor preditivo do risco de infecção por HPV entre mulheres infectadas pelo HIV. De acordo com Palefski et al. [5], nos seus valores mais baixos (CD 4 + contagem inferior a 200 células / mm 3 e uma carga viral superior a 20.000 cópias / mL), os dois parâmetros são importantes para a activação e a replicação do HPV, bem como para a sua detecção. Mulheres infectadas pelo HIV são de baixo risco quando seu CD 4 + contagens são maiores do que 200 células / mm 3 e suas cargas virais menor do que 20.000 cópias / ml. Mulheres cujos CD 4 + contagens são maiores do que 200 células / mm 3 e cuja carga viral são maiores do que 20.000 cópias / mL estão em risco intermediário, e as mulheres com CD 4 + inferior a 200 células / mm 3 , independentemente da carga viral estão em maior risco.
Medição da Imunidade
De acordo com a Tabela 4 , que se refere a contagem de células, carga viral do HIV e de risco para a infecção por HPV, nenhum dos 9 pacientes considerados de baixo risco para a infecção por HPV, apresentaram um resultado positivo para o diagnóstico do HPV por PCR. Dos 8 pacientes considerados de risco intermediário para a infecção por HPV, 3 (número de 3, 6 e 15) mostraram-se positivas por PCR de HPV, que corresponde a 37,50% (3/8). Das 6 pacientes considerados de alto risco para a infecção por HPV, 5 (83,33%) (os números 1, 2, 9 e 16) mostraram-se positivas por PCR de HPV.
Citologia
Walboomers et al. (1992) concluíram que o exame citopatológico é de baixa sensibilidade (cerca de 70%), possivelmente levando a resultados falso-negativos. No presente estudo, observou-se um menor percentual de concordância (38%) quando comparados os dois técnicas, no entanto, devemos salientar a importância do tamanho da amostra quando os estudos diferentes são comparados. O critério morfológico para o diagnóstico de infecção por HPV apresenta baixa sensibilidade e especificidade, uma vez que é baseada em critérios morfológicos, tais como a presença de hipertrofia, bi-ou multi-nucleadas, hipercromáticas, coilocitóticas, displásico ou anfofílicas células cervicais, cuja
detecção depende largamente a boa preparação e coloração das lâminas e na experiência do examinador [17]. Assim, pacientes infectados com VIH requer uma técnica mais específico para a detecção de infecção por HPV, em vez de simplesmente um diagnóstico citológico.
Os presentes resultados mostram que a PCR detectou 8 dos 27 pacientes com a presença de ADN de HPV, com 6 deles estarem infectados com os tipos de HPV que envolvem um elevado risco de desenvolvimento de cancro cervical. A técnica citológica indicou alterações sugestivas de HPV em apenas quatro destes oito mulheres, mostrando baixa sensibilidade.
Os pacientes que participaram do estudo, por estarem infectados com HIV e imunocomprometidos e pela exposição a fatores como tabagismo, atividade sexual e outras DST, estão em maior risco de desenvolver neoplasia cervical e, portanto, exigem técnicas mais sensíveis para o diagnóstico de HPV. No presente estudo, mostrou-se que a PCR é uma técnica adequada para este fim e também determinado que a utilização de apenas o Papanicolaou teste para monitorizar esses pacientes não fornecerão boa prevenção do cancro do colo do útero.
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Endereço para correspondência: Dr. Maria Regina Torqueti Toloi Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Brasil, Departamento de Clínica, Toxicológicas e Bromatológicas Análise Avenida do Café S / N, Bloco: M, Sala: 327, Bairro: Monte Alegre CEP: 14040-903 E-mail: [email protected] .
Recebido em 17 de setembro de 2006; revista 12 fevereiro de 2007.
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O Jornal Brasileiro de Doenças Infecciosas e publicação Contexto
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Braz. J. Microbiol. vol.41 no.3 São Paulo out 2010
http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822010000300027
GENÉTICA E microbiologia molecular
Infecção pelo papilomavírus humano em mulheres de Tlaxcala, México
Noé Velázquez-Márquez I, III ; Lucio Jaime Jiménez-Aranda II ; Patricia Alonso Sánchez- III ; Gerardo Santos-López I ; Julio Reyes-Leyva I ; Verónica Vallejo-Ruiz I, *
I Laboratório de Biologia Molecular y Virologia, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Metepec, Puebla, México II Clínica de Displasias, Hospital Geral de Zona No. 1, Instituto Mexicano del Seguro Social, Tlaxcala, Tlaxcala, México III Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidade Autônoma de Puebla, Pue., México
RESUMO
O câncer cervical é um importante problema de saúde em mulheres que vivem em países em desenvolvimento. A infecção com alguns genótipos do vírus do papiloma humano (HPV) é o fator de risco mais importante associado com o câncer cervical. Há pouca informação sobre HPV distribuição de genótipos em regiões rurais e suburbanas do México. Assim, determinou-se a prevalência de genótipos de HPV em mulheres de Tlaxcala, um dos estados mais pobres do México central, e avaliou a prevalência da infecção idade e fatores de risco associados com neoplasia cervical. Um estudo transversal foi realizado em 236 mulheres que procuram atendimento ginecológico do Instituto Mexicano de Segurança Social em Tlaxcala, México. Raspas cervicais foram diagnosticados como normais, de baixo grau e alto grau de lesões intra-epiteliais (LIE-BG, LIE-AG). Amostras paralelas foram usados para detectar genotipos de HPV por PCR usando primers específicos para cada tipo de HPV 6, 11, 16, 18, e 31.Um questionário epidemiológico foi aplicado. Prevalência de infecção por HPV foi de 31,3%. A partir das amostras infectadas, a prevalência de HPV 16 foi de 45,9%; HPV 18, 31,1%; HPV 31, 16,2%; HPV 6, 10,8%; HPV 11, 6,7%.No que diz respeito à idade, a prevalência mais elevada de HPV (43,5%) foi encontrada no 18 - a 24-year-old grupo e a mais baixa (19%) do 45 - a 54-year-old grupo. Nenhum dos fatores de risco mostrou associação com neoplasia cervical. HPV 16 foi o mais comum em lesões cervicais. HPV estava presente em 22% das amostras normais e, destes, 82,6%, representado HPVs de alto
risco. Tlaxcala mostrou a prevalência de HPV comparável ao das maiores cidades do México, com maior prevalência de HPV 31.
Câncer cervical (CC) permanece como um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento.Mortalidade estimada para CC no México em 2000 foi de 17.1/100, 000 (1, 19). O papilomavírus humano (HPV) é o principal fator causal do CC, mas existem outros fatores de risco que contribuem para o desenvolvimento de CC, como o tabagismo, gravidez múltipla, uso de anticoncepcional oral, história familiar de CC, carga viral elevada e baixo nível socioeconômico ( 2, 9).
A prevalência global da infecção pelo HPV em mulheres com citologia normal, todo o mundo é estimada em 10,5% (6), no entanto, a prevalência de HPV variou quase 20 vezes entre diferentes populações, de 1,4% em Espanha e 25,6% na Nigéria (5).
Mais de 40 tipos de HPV infectam o tracto anogenital humano (7). Os tipos de HPV são classificados em baixo ou alto risco, com base em sua associação com lesões pré-malignas e malignas (23). A este respeito, o HPV de tipo 16 é envolvida em ~ 54% de todos os casos em todo o mundo de CC invasivos, enquanto que o tipo de HPV 18 causas de cerca de 11% de todos os casos (15). Outros genótipos de HPV são menos freqüentemente associada com câncer. HPV tipos 16, 18, 31, 45, 53 e 58 têm sido encontrados em amostras cervicais de mulheres mexicanas (14, 16, 17, 22). Pouco se sabe sobre a prevalência do HPV em mulheres com e sem CC em diferentes populações mexicanas. A prevalência obtido variou dependendo do estudo. Em amostras de cancro, o HPV foi detectada em 87-92% das amostras. Elevado grau de lesões intraepiteliais escamosas (LIEAG) foram detectados em 29,4-88% das amostras, e escamosas de baixo grau de lesões intraepiteliais (LIE-BG) foram detectadas em 24-57% das amostras e em esfregaços normais em 12-17% das amostras ( 3, 16, 22). A prevalência geral de HPV em mulheres da cidade de Durango (localizado no norte do México) foi estimada em 4,8% (17), mas a maior prevalência (20,4%) foi relatado para o HPV, no estado de Morelos (14). Lazcano-Ponce et al. (14) encontraram uma prevalência de 16,7% em mulheres mexicanas <25 anos de idade, que diminuiu para 3,7% em mulheres 25-44 anos de idade e aumentou para 23% em mulheres> 65 anos de idade. Há pouca informação sobre HPV em regiões rurais e suburbanas do país, e pouco se sabe sobre a epidemiologia molecular do HPV no estado de Tlaxcala, no México. No presente estudo, determinou-se a prevalência de genótipos de HPV 6, 11, 16, 18 e 31 em mulheres atendidas em um Hospital Geral em Tlaxcala, que também está situado na região central do México e é um dos estados mais pobres do México.
MATERIAIS E MÉTODOS
População de estudo
Foram estudadas as mulheres que solicitaram um exame de Papanicolaou cervical no Hospital Geral Zona No. 1 do Instituto Mexicano de Seguro Social (IMSS), em Tlaxcala, México. Todos os participantes foram incluídos consecutivamente a partir de novembro de 2006 a maio de 2008.
Um total de 236 amostras foram analisadas. Os dados do paciente, como idade, residência, idade da primeira relação sexual, número de parceiros sexuais e número de gestações também foram coletados a partir de um questionário. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional. O propósito e os procedimentos do estudo foram explicados aos pacientes e ao consentimento informado foi obtido de todos os participantes.
Coleta de amostras
Duas amostras cervicais foram obtidos a partir de cada paciente, utilizando um cytobrush. A primeira amostra foi utilizado para diagnóstico citológico. Esfregaços de Papanicolaou foram avaliados por um patologista de acordo com os critérios de diagnóstico de Bethesda (18). A segunda amostra foi utilizada para a detecção de HPV por PCR. Além de Papanicolau, cada mulher tinha colposcopia e, quando necessário, uma biópsia foi obtida para o diagnóstico patológico. Não biópsia foi obtida para fins de pesquisa.
Extracção de ADN
Os esfregaços cervicais foram colocadas em tubos contendo 5 ml de salina tamponada com fosfato (PBS), agitada vigorosamente, e centrifugado durante 10 min a 4000 'g. As peletes foram ressuspensas em 1 ml de PBS, e uma alíquota de 0,5 ml foi usada para a extracção de ADN utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA purificado foi suspenso em 100 μ l de água e armazenado a -20 º C até à sua utilização. Todas as amostras foram testadas quanto à integridade de DNA por electroforese em gel de agarose a 1%.
PCR
Detecção de genótipos de HPV 6, 11, 16, 18, e 31, foi realizada utilizando o iniciador específico do PCR (21). As reacções de amplificação contendo um volume final de 25 μ l foi realizada com PCR Taq Mix Master Kit (Promega, Madison, WI), 0,2 μ M de concentração de cada iniciador e 10,5 μ l de amostra de DNA. Quarenta ciclos de amplificação foram realizadas com um termociclador (PTC 200, MJ Research, Watertown, MA). Cada ciclo consistiu de um passo de desnaturação a 95 ° C durante 1 min, seguido por um passo de hibridação do iniciador durante 1 minuto a 55 ° C para os tipos de HPV 16 e 31 ou a 60 ° C para os tipos de HPV 6, 11 e 18, e uma cadeia passo de alongamento a 72 ° C durante 1 min. Finalmente, 15 μ l do produto de amplificação foi analisada por electroforese em gel de agarose a 1,5%. Um fragmento do gene foi amplificada ciclofilina como controlo interno (24). Os géis foram corados com brometo de etídio (1 μ g / ml), observado com um transiluminador de luz ultravioleta, e fotografadas utilizando uma câmara digital (DC290, Kodak, Rochester, NY).
A análise estatística
Freqüências de dados clínicos foram calculados. Diferenças entre os grupos foram calculadas por χ 2 de teste; p<0,05 foi considerado significativo. Os dados foram analisados usando SPSS para Windows, v.12 (Chicago, IL).
RESULTADOS
População de estudo
Um total de 236 amostras cervicais foram analisados para detecção e diagnóstico citológico de HPV. LIE-BG foi diagnosticada em 97 (41,1%) casos, LIEAG em 39 (16,5%) casos e normais manchas cervicais em 100 casos (42,4%).
Prevalência de tipos de HPV
Prevalência de HPV na população estudada foi de 31,3%. HPV foi detectada em 22/100 (22%) das amostras com citologia normal, 36/39 (37%) amostras com LIE-BG e amostras de 16/39 (41%) com LIEAG ( Tabela 1 ).
HPV 16 e 18 foram encontrados em 34/74 (45,9%) e 23/74 (31,1%) das amostras infectadas, respectivamente (incluindo co-infecções). A prevalência de HPV dos tipos 31, 6 e 11 foram de 16,2%, 10,8% e 6,7%, respectivamente.
Infecções com misturas de dois genótipos foram detectados em 8/74 (10,8%) amostras positivas para HPV-; 6/8 coinfections envolvido HPV tipo 16, e 5/8 envolvido HPV tipo 18 ( Tabela 2 ). Misturas de genótipos do HPV de baixo risco não foram observadas. Múltiplas infecções por diferentes genotipos virais foram detectados nos três grupos (normal, LIE-BG e LIE-AG).
HPV 16 foi encontrado em 9/100 (9%) amostras normais e 17/97 (17,5%) amostras com LIE-BG e amostras 8/39 (20,5%) com LIEAG ( Tabela 3 ). HPV 18 foi encontrado em 9/100 amostras normais, 12/97 (12,4%) amostras com LIE-BG e 2/39 (5,1%) amostras com LIEAG.
Idade específica prevalência de HPV
A média de idade das mulheres participaram do estudo foi de 37,8 anos (intervalo: 18-74 anos). A média de idade das mulheres com LIEAG foi de 41,7 anos, 36,5 anos, LIE-BG e citologia normal de 37,7 anos. Não houve diferença estatística significativa entre idade e grau da lesão.
Os pacientes foram estratificados em grupos de idade como a seguir: 18-24 anos (23 amostras), 25-34 anos (82 amostras), 35-44 anos (67 amostras), 45-54 anos (42 amostras) e> 55 anos (19 amostras). Prevalência geral do HPV para cada faixa etária foi de 43,5%, 31,7%, 35,8%, 19% e 26,3%, respectivamente ( Fig.. 1a ).
Distribuição de HPV tipo 16, de acordo com a idade dos pacientes era de 5/23 (21,7%) no 18 - para o grupo de 24 anos de idade, 13/82 (15,8%) no 25 - a 34-year-old grupo , 12/67 (17,9%) no 35 - a 44-year-old grupo, 1/42 (2,4%) no 45 - para o grupo de 54 anos de idade e 4/19 (21%) no grupo> 55 anos de idade ( Fig.
1b ). Este tipo de distribuição predominância de idade, com dois picos foi observado para HPV 16, mas não para o HPV 31, HPV 6 e HPV11 (dados não mostrados).
Mulheres infectadas com os tipos de HPV de alto risco apresentou uma idade média mais elevada (41,4 anos) do que as mulheres com os tipos de HPV de baixo risco (33,4 anos), mas a análise estatística não foi significativa.
Lesões cervicais e variáveis clínicas
A média de idade da primeira relação de todas as mulheres que participaram do estudo foi de 19,3 anos (intervalo: 12-32 anos). A média de idade da primeira relação no grupo LIEAG (18,5 anos) foi semelhante ao do grupo normal (19,4 anos). Não encontramos diferenças estatísticas entre a idade da primeira relação sexual e grau de neoplasia cervical.
As mulheres no estudo tinham uma média de 2,7 gestações. Nós não encontrou uma associação entre história positiva de gestações múltiplas e grau de neoplasia ( Tabela 4 ).
DISCUSSÃO
O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência de genótipos de HPV em mulheres mexicanas atendidos no Hospital Geral de Tlaxcala, no México, um município densamente povoada e caracteristicamente rural.
A prevalência do HPV em mulheres com citologia normal foi estimada em 10,4% em todo o mundo, enquanto a estimativa correspondente na América Central e no México foi de 20,4% (6). Alguns relatos mostraram variações significativas entre as diferentes regiões do México, encontrar a menor prevalência (4,8%), na cidade de Durango localizado no norte do México com uma baixa densidade populacional (PD) 49 p / km 2 ea maior prevalência (17%) em da área metropolitana da Cidade do México (PD 7815 p / km 2 ), (13, 17). Encontramos uma prevalência de HPV global de 31,3% em mulheres tratadas no Hospital Geral, Tlaxcala, com 22% em mulheres com citologia cervical normal. Isso representa uma maior prevalência de infecção por HPV em relação a outros estudos semelhantes (16, 17). Em um estudo semelhante realizado com mulheres que vivem em uma zona rural em Puebla, que está localizado ~ 100 km de Tlaxcala, encontramos uma menor prevalência do HPV em geral (20%), com 14,7% em mulheres com citologia normal (22). Esperávamos obter valores de prevalência comparáveis nestes estudos, porque as duas mulheres envolvidas residente em zonas rurais e mulheres que foram tratados em um hospital geral. No entanto, a maior prevalência de HPV em Tlaxcala pode refletir uma limitada infra-estrutura de serviços de saúde, combinada com uma maior densidade de população humana; município Tlaxcala tem 1.597 p / km 2 vs Atlixco município, que tem 532 p / km 2 (10, 11).
Comportamento sexual em homens no desenvolvimento do câncer de colo do útero foi identificado como tendo um papel como um fator de risco potencial. Especialmente entre populações de alto risco, a prevalência do DNA do HPV no pênis dos maridos de mulheres com CC é muito alto. O status socioeconômico das famílias em Tlaxcala aumenta a migração de homens para os EUA, a fim de procurar trabalho e obter uma renda. Isso pode ter uma repercussão na aquisição de doenças sexualmente transmissíveis por mulheres, incluindo HPV, quando seus sócios retornar.
Os tipos de HPV 16, 18, 31, 58 e 52 representam> 50% de todas as infecções de HPV em todo o mundo (6). Em nosso estudo, buscamos a presença de tipos de alto risco 16, 18 e 31 e os tipos de baixo risco 6 e 11, devido à sua importância e frequência.
O HPV 16 é o tipo mais prevalente em todo o mundo com exceção da África Oriental, Japão e Taiwan, onde o tipo mais comum é o HPV 52 (6). A prevalência de HPV 16 foi encontrado neste estudo (45,9%), é elevada, mas consistente com a de outros estudos que a prevalência de 34,7-59,6% para este tipo de vírus (2). Como esperado, o HPV 18, foi determinado como sendo o genótipo mais prevalente segundo (31,1%).
Vale ressaltar que mulheres com citologia normal teve uma maior taxa de infecção pelo HPV 18 do que em outros estados do México (15, 17). Estes resultados devem ser interpretados com cautela, pois foram analisadas uma população tendenciosa. Na verdade, as mulheres em nosso estudo foram tratados em uma clínica de displasia, portanto, a prevalência de lesões intra-epiteliais e HPV é maior do que em uma população aberta. Infecção simultânea com mais do que um genótipo de HPV foi encontrada em 10,8% da população em estudo. Este valor está no intervalo observado para as infecções múltiplas entre os diferentes estudos (4, 8, 12, 20, 22). Infecções simultâneas têm sido freqüentemente observada entre as
mulheres mais jovens (4). No entanto, neste e em nosso estudo anterior (22), a idade média das mulheres com infecções múltiplas foi de ~ 45 anos (intervalo: 26-63 anos).
Idade específica prevalência de HPV foi estimada em diferentes estudos em todo o mundo. A infecção pelo HPV caracteristicamente picos logo após o início da atividade sexual, geralmente entre as mulheres em seus vinte e poucos anos. Após a idade de 25 anos, a prevalência do HPV é maior em países menos desenvolvidos do que nos países desenvolvidos, mas ambos mostraram um declínio contínuo com o aumento da idade até 45-54 anos de idade, quando as estimativas aumentaram em ambas as regiões (6, 12). Nós encontramos um pico no 18 - para o grupo de 24 anos de idade, e uma diminuição na prevalência até a 55 - para o grupo de 64 anos de idade, onde encontramos um pequeno pico de prevalência segundo.
Lazcano-Ponce et al. (14) avaliaram a correlação entre a idade dos pacientes e prevalência de HPV em mulheres mexicanas. Um pico de 16,7% foi encontrada no grupo de <25 anos de idade, as mulheres. Valores diminuíram para 3,7% no 25 - para o grupo de 44 anos de idade, e aumentou para 23% no grupo> 65 anos de idade. No nosso estudo a maior prevalência de HPV foi encontrado em 18 - para o grupo de 24 anos de idade (10/23, 43,5%), e a prevalência mais baixa (8/42, 19%) foi encontrada no 45 - a 54 - anos do grupo.
Quando analisamos idade específica prevalência de HPV de cada tipo de HPV, descobrimos que o HPV 16 foi predominante entre todos os grupos etários, com valores de 15-21%, com exceção do 45 - para o grupo de 54 anos de idade, que mostrou uma prevalência muito baixa ( 2,4%). Tipos de HPV de baixo risco e HPV 31 não mostrar este segundo pico. HPV 16 pode demonstrar um comportamento diferente do HPV de baixo risco e HPV 31. O segundo pico foi reportado em outros estudos e pode ser atribuída a um efeito de corte ou a uma reactivação do vírus latentes (14, 22). Mulheres mexicanas parecem ter a mesma curva de prevalência idade, independentemente da região estudada. O segundo pico de prevalência foi observada em todo o mundo, com exceção da Ásia, onde as taxas continuam a diminuir (6). É importante para determinar se a idade, a prevalência de HPV específico depende do tipo de HPV, a fim de começar a compreender os factores envolvidos neste padrão de distribuição. Tem sido relatado que as mulheres com pelo menos sete gestação a termo tem um 3 - a 5 vezes maior risco para o desenvolvimento de CC em comparação com mulheres nulíparas. No entanto, nessa população o número de gravidezes não mostrou associação com lesão cervical. Fatores de risco associados com CC em determinadas populações não pode ser importante em outras populações.
Nossos dados contribuem para o conhecimento da epidemiologia do HPV e apoiar a proposta de incluir o diagnóstico do HPV nos programas de rastreio para prevenir CC. Isso adquire importância por causa da recente introdução da vacina contra o HPV no nosso país. A informação pode ajudar no futuro para monitorar o impacto dos programas de vacinação sobre a prevalência de HPV e CC em uma população específica.
RECONHECIMENTO
Este trabalho foi financiado por doações do CONACYT (SALUD-2003-C01-067, SALUD-2005-13918, e SALUD-2003-C01-085) México. NVM é o destinatário de uma bolsa de estudos do projeto CONACYT SALUD-2005-13918 e do Instituto Mexicano de Seguro Social.
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Enviado: 07 de Setembro de 2009; devolvidos aos autores para as correções: 20 de outubro de 2009 aprovado: 16 de Março de 2010.
* Autor Correspondente. Endereço para correspondência: Laboratório de Biologia Molecular y Virologia, Centro de Investigación Biomédica de Oriente, Instituto Mexicano del Seguro Social, Metepec, Puebla, México; Tel. / Fax:. 52 24 44 44 01 22, E-mail:. veronica_vallejo @ yahoo . com / veronica.vallejor @ imss.gob.mx
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Revista da Associação Médica BrasileiraVersão impressa ISSN 0104-4230
Rev. Assoc. Med. Bras. vol.57 no.4 São Paulo July / Aug. 2011
http://dx.doi.org/10.1590/S0104-42302011000400017
ARTIGO ORIGINAL
Prevalência e multiplicidade de HPV em mulheres HIV em Minas Gerais, Brasil
Prevalência e multiplicidade do HPV los Mulheres infectadas pelo HIV Pelo los Minas Gerais
Christine Miranda Corrêa I ; Nara Chartuni Pereira Teixeira II ; Angela Cristina Labanca de Araújo III ; Nara de Oliveira Carvalho IV ; Dora Mendez del Castillo V ; Rachel Rezende Campos VI ; Isaura Oliveira Vargas VII ; Antonio Rafael Alves VIII , Ana Flávia de Moura França IX ; Victor Hugo Melo X
Eu M.Sc. em Saúde da Mulher; Coordenador do Programa de Atenção Integral à Saúde da Mulher de Três Rios, Três Rios, RJ, Brasil II M.Sc. em Saúde da Mulher; Médico da Prefeitura de Belo Horizonte, Belo Horizonte, MG, Brasil III Ph.D. em Medicina; Médico da Prefeitura de Belo Horizonte, Belo Horizonte, MG, Brasil IV M.Sc. em Patologia; biólogo da Genética e Biologia Molecular Laboratório NUPAD da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasil V Especialização em Genética; Coordenador da Genética e Biologia Molecular Laboratório NUPAD da Faculdade de Medicina da UFMG , Belo Horizonte, MG, Brasil VIM.Sc. em Saúde da Mulher; Médico em Betim Prefeitura, Betim, MG, Brasil VII Especialização em Gynecolgy e Obstetrícia; Médica Barbacena City Hall, Barbacena, MG, Brasil VIII Especialização em Gynecolgy e Obstetrícia; Médica Conselheiro Lafaiete Câmara Municipal, Conselheiro Lafaiete, MG, Brasil IX Especialização em Gynecolgy e Obstetrícia; Médico da Câmara Municipal de Divinópolis, Divinópolis, MG, Brasil X Ph.D. em Medicina, Professor Associado da
Faculdade de Medicina, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil
Correspondência para
RESUMO
: Objetivo Para detectar a frequência e subtipos de HPV no colo do útero de mulheres infectadas pelo HIV.MÉTODOS: A amostra foi composta de 288 mulheres infectadas pelo HIV, recrutados a partir do sistema público de saúde de cinco cidades de Minas Gerais, Brasil. As mulheres eram vistas a partir de agosto de 2003 a agosto de 2008. Amostras cervicais foram coletadas para análise citológica e para HPV, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA do HPV foi classificado de acordo com seu potencial oncogênico em baixo risco (tipos 6, 11) e alto risco (tipos 16, 18, 31, 33, 35). A colposcopia foi realizada, seguida pela biopsia cervical quando necessário. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste do qui-quadrado, com um nível de significância ao nível de 5%. RESULTADOS: a prevalência de HPV foi de 78,8%. Genótipos mais freqüentes foram HPV-6 (63,9%) e HPV-16 (48,5%). HPV de alto risco foram observados em 70,5% das mulheres; baixo risco em 71,4%; tanto HPV de alto e baixo risco foram detectados em 55,1% dos pacientes. Múltiplos genótipos de HPV foi detectado em 64,8% dos pacientes, dois genótipos em 23,8%, e três em 18,9%. CONCLUSÃO: a prevalência de HPV foi alta entre mulheres infectadas pelo HIV. Múltiplos genótipos de HPV eram comuns em amostras do colo do útero de mulheres infectadas pelo HIV.
Palavras-chave: sondas de DNA, HPV, HIV, reação em cadeia da polimerase; colo do útero; infecções por papilomavírus, prevalência.
RESUMO
OBJETIVO: Detectar uma frequencia subtipos de HPV E OS fazer nd cérvice uterina de Mulheres infectadas pelo HIV Pelô. Métodos: Uma Amostra era Composta POR 288 Mulheres infectadas Pelo HIV, recrutadas fazer Sistema Público de Saúde de Cinco Cidades de Minas Gerais, Brasil. Como Mulheres FORAM avaliadas de agosto de 2003, um de agosto de 2008. Amostras coletadas cervicais FORAM parágrafo Análise citológica e parágrafo detecção fazer DNA do HPV, usando uma Reação los Cadeia de polimerase (PCR). O DNA do HPV FOI classificado de a Acordo com Seu potencial oncogênico los Baixo Risco (Tipos 6,11) e Alto Risco (Tipos 16, 18, 31, 33, 35). FOI realizada colposcopia, seguida de biópsia do colo do útero, QUANDO indicada. Variáveis categóricas FORAM comparadas usando o teste quiquadrado fazer, COM NIVEL DE significância estabelecido de 5%. RESULTADOS: A Prevalência fazer HPV 78,8% de Liberdade de Informação. Os genótipos Mais
Frequentes FORAM HPV-6 (63,9%) e HPV-16 (48,5%). Genótipos de HPV de alto Risco FORAM observados Em 70,5% das Mulheres; de Baixo Risco los 71,4%; HPV de alto e Baixo Risco FORAM detectados Em 55,1% das PACIENTES. Múltiplos genótipos de HPV detectados FORAM EM 64,8% das PACIENTES; Dois genótipos Em 23,8%, Três de e EM 18,9%. Conclusão: A Prevalência fazer HPV FOI alta Entre Mulheres infectadas Pelo HIV. Múltiplos genótipos de HPV FORAM comuns in samples d bis cérvice uterina Mulheres destas.
Unitermos: Sondas de DNA de HPV, HIV; Reação los Cadeia polimerase da; colo fazer útero; Infecções POR papilomavírus; Prevalência.
Introdução
A associação entre o cancro cervical e o vírus da imunodeficiência humana (HIV) está bem estabelecida a 1,2 .Vários estudos têm demonstrado que a infecção pelo HPV é muito mais comum entre as mulheres HIV positivas em comparação com mulheres HIV negativas 3-10 .
A associação entre o câncer cervical e papilomavírus humano (HPV) também foi demonstrada, mas o papel potencialmente modificação do HIV sobre a associação neoplasia HPV / cervical intra-epitelial ainda está sob investigação 11 . Os dados atuais sugerem que a infecção pelo HIV aumenta a persistência do HPV, com aumento do risco de lesões cervicais intra-epiteliais 2,4 .
Os dados publicados sugerem que mulheres infectadas pelo HIV são mais propensos a ter DNA do HPV, bem como vários tipos virais e uma maior freqüência dos tipos oncogênicos 6-8 . Resultados similares foram relatados em diferentes regiões do Brasil 9,12-14 e HPV 16 foi o tipo mais freqüente oncogênico 7-9 .
Reação de polimerase em cadeia (PCR) tem a maior sensibilidade para a detecção de genótipos de DNA do HPV e discrimina múltiplas infecções melhores do que os métodos biomoleculares outros. Ele também tem boa especificidade e os resultados são rapidamente disponíveis 2 .
O objetivo deste estudo foi estimar a prevalência da infecção pelo HPV DNA em mulheres infectadas pelo HIV de diferentes cidades. Também foi investigar a prevalência de genótipos do HPV, assim como a frequência de múltiplos tipos de HPV.
Métodos
Pacientes
Mulheres atendidas em um Centro de Referência e Treinamento em Doenças Infecciosas e Parasitárias, em Belo Horizonte ( Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG ) e unidades de saúde públicas de atendimento ginecológico geral de quatro outras cidades do Estado de Minas Gerais (Betim,
Barbacena, Conselheiro Lafaiete e Divinópolis) foram aleatoriamente escolhidos para serem incluídos no estudo. Este estudo foi realizado a partir de agosto de 2003 a agosto de 2008.
Um questionário padronizado foi utilizado para a recolha de dados demográficos, sociais e comportamentais da amostra, bem como para a obtenção do historial médico. Exame ginecológico foi realizada e amostras cervicais foram colhidas para exame de Papanicolau, bem como para HPV-DNA, por médicos do grupo de estudo para garantir a recolha normalizada. Amostras de sangue foram coletadas para obter células T CD4 + e contagem de carga viral do HIV. Colposcopia, biópsia e tratamento adequado de lesões cervicais foram realizados como parte do tratamento de rotina médica.
Os critérios de inclusão foram: infecção pelo HIV diagnosticada por ELISA e confirmados por imunofluorescência ou Western blot indireta, com ou sem AIDS; idade ≥ 18 anos; consentimento para participar (assinatura do termo de consentimento informado aprovado). Os critérios de exclusão foram: dificuldades na obtenção de informações (barreira da linguagem, desorientação), não-analisável amostras, gravidez, história de histerectomia.
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da UFMG.
Procedimentos
Amostras cervicais de DNA-HPV exames foram obtidos usando uma espátula de Ayre, e transferida para um tubo estéril que continha 2 mL de solução salina (0,09%). O tubo foi acondicionado em uma caixa especial com gel frio.As amostras foram enviadas para um laboratório de referência ( Núcleo de Ações e Pesquisas los Apoio Diagnóstico da Faculdade de Medicina da UFMG ), no prazo de 24 horas após o procedimento.
O DNA foi extraído usando resina quelante Chelex 100 (BioRad), de acordo com o protocolo do fabricante 15 .Primers específicos para os tipos de HPV DNA 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35 foram testados.
Reação em cadeia da polimerase e análise de critérios
A fim de controlar para a qualidade do ADN, o gene da globina foi amplificado em todas as amostras 16 . -Globina negativos amostras foram excluídos do estudo. Detecção de HPV por PCR foi realizada em um sistema de nested-PCR, utilizando MY09/11 17 e GP5 + / 6 + 18 primers. As amostras positivas foram testadas com primers específicos para os tipos de DNA de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35, através de reações independentes 15 . Todos os produtos foram submetidos a electroforese em gel de agarose% 2, tratado com brometo de etídio e analisados sob a luz UV. O DNA foi classificada de acordo com o seu potencial oncogénico em baixo risco (6, 11) e de alto risco (16, 18, 31, 33 e 35).
A análise estatística
Os dados foram transferidos para uma base de dados especialmente concebido usando Excel 2003. Variáveis demográficas e sociais incluídas foram: idade (em anos) no momento da inscrição, idade da primeira relação sexual, número de parceiros sexuais vida; estado civil; status de trabalho, tabagismo, uso de preservativos; via de transmissão e dependência de drogas. Variáveis clínicas e laboratoriais foram: classificação CDC (1993) 19 ; uso regime anti-retroviral; colposcopia; contagem de células CD4 + linfócitos T, carga viral do HIV-1. Frequência e tipo de genótipos do HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33 e 35) foram também analisados.
A versão do software Epi-Info 3.3.2 foi utilizado para a análise estatística. As proporções foram comparadas com o teste do qui-quadrado. A significância estatística foi estabelecida em 5% os níveis. O tamanho da amostra foi determinado com base nos resultados publicados (prevalência de HPV em mulheres infectadas pelo HIV variou entre 52 a 87%) 9,14 . A prevalência de 50% foi utilizado para a obtenção de uma amostra mínima que pode garantir mais precisos testes estatísticos. Para alcançar 80% de energia, estimou-se a amostra em 278 participantes.
Resultados
A amostra foi composta por 288 mulheres de cinco cidades diferentes: A (n = 152; 52,8%), B (n = 36, 12,5%), C (n = 20; 6,9%); D (n = 44; 15,3%) , e E (n = 36, 12,5%). Como pode ser visto na Figura 1 , a prevalência da infecção por HPV em geral foi elevada (78,8%) entre estes pacientes infectados com HIV. Não houve diferença significativa entre HPV prevalência das mulheres destas cidades diferentes (p = 0,19).
Média de idade no momento da inscrição era de 35 anos, idade média da primeira relação sexual foi de 17 anos, o número médio de parceiros sexuais ao longo da vida era de três. Quanto às características clínicas e comportamentais, a maioria dos participantes estavam em uma união estável (44,1%), trabalhava em casa (51,7%) e foram infectados por via sexual (92,0%). Poucas mulheres fumavam (31,3%), usado preservativo (42,7%) e eram viciados em drogas (0,7%). Metade deles tinha SIDA 19 e 67,7% faziam uso de drogas anti-retrovirais. Colposcopia normal foi encontrada em 63,2% deles. Tabela 1 resume algumas das características clínicas e comportamentais dessas mulheres.
Detectou-se que 151 pacientes apresentavam uma carga viral mais elevado do que o estabelecido valor de corte de 400 cópias / mL (limite mínimo de detecção do RNA do HIV no momento do estudo). Entre eles, em 123 (81,5%) foi detectado o ADN de HPV. Por outro lado, 119 doentes tinham carga viral não detectada ( < 400 cópias /
mL) e 90 (75,6%) apresentaram a ADN de HPV. As diferenças não foram significativas (p = 0,2441).
Além disso, uma redução dos linfócitos T CD4 + contagem de células em 200 células / mm 3 foi feito com base na classificação CDC de SIDA e não-SIDA 19 . Entre 45 pacientes que apresentavam linfócitos T CD4 + contagem de células <200 células / mm 3 , 37 (82,2%) tiveram o DNA do HPV. Por outro lado, 226 pacientes tinham contagem de linfócitos T CD4 + de células ≥ 200 células / mm 3 e 177 (78,3%) apresentaram a ADN de HPV. As diferenças não foram significativas tanto (p = 0,5574).
HPV de alto risco (paciente apresentando pelo menos um tipo de alto risco de HPV) foi observada em 70,5% (160/288) dos pacientes, o HPV de baixo risco (paciente apresentando pelo menos um tipo de baixo risco de HPV) foi encontrada em 71,4% (162/288) das mulheres, e tanto alto e baixo risco de HPV foram detectados em 55,1% (125/288) dos mesmos. A prevalência de HPV foi maior (61,7%) em pacientes que tiveram três ou mais parceiros sexuais. No entanto, este resultado não foi significativo (p = 0,8431).
A Tabela 2 mostra a prevalência de cada genótipo, bem como a proporção de mulheres com vários genótipos de HPV. A maioria dos genótipos prevalentes foram HPV-6 (63,9%) e HPV-16 (48,5%). Surgiram diferenças entre as cidades. HPV-31 e HPV-33 genótipos foram os mais prevalentes na cidade C (60% e 53,3%) e E Cidade (24% para ambos). Múltiplos genótipos estavam presentes em 64,8% das mulheres: dois (23,8%) e três (18,9%) genótipos diferentes eram comuns. Esta tabela também mostra que a percentagem de pacientes com HPV, que não podia ser digitado variou de 0% a 11,1%. Uma das cidades (Cidade E) apresentou o maior percentual de não-identificado HPV (48%).
Discussão
Prevalência de infecção pelo HPV foi alta (78,8%) entre nossa amostra de pacientes infectados pelo HIV recrutados em cinco cidades diferentes. Estes resultados são consistiu com outros estudos 6,14,20 .
A idade mediana (35 anos) foi semelhante para a idade de uma amostra diferente no Brasil 14,21 . Isso sugere que o HPV / HIV é comum entre mulheres em idade reprodutiva.
Embora a idade média para a primeira relação sexual foi de 17, a dispersão foi alta e algumas mulheres tiveram a primeira relação sexual mais cedo, com a idade de 10, como descrito anteriormente 8 .
A transmissão sexual foi a via predominante de aquisição do HIV (92%), em taxas mais elevadas do que anteriormente relatadas 22 . O uso do preservativo não era uma prática comum, de forma consistente utilizado por apenas 42,7% dos parceiros. Percentagem semelhante foi previamente relatada em uma amostra de 75 doentes infectados com VIH 22 .
Os dados obtidos a partir de uma meta-análise de diferentes países da América do Norte, África, Ásia, Europa e Sul / América Central avaliou a prevalência de HPV e genótipos entre 5,578 pacientes infectados pelo HIV. Do Sul e América do Norte (Brasil e México) contribuiu 7,8% da amostra. Prevalência de HPV foi maior entre as mulheres do Brasil e do México (57,3%), em comparação com resultados globais (36,5%). De acordo com esta meta-análise, a prevalência de HPV foi associada com
lesão cervical avançado. Múltiplas infecções eram freqüentes, e pacientes HIV-positivos com HPV-16 eram mais propensos a ter lesões cervicais avançadas 7 .
Além disso, estudos realizados no Brasil 9 e Índia 8 descobriu que o HPV-16 foi o genótipo mais comum (30,9% e 33%, respectivamente) entre mulheres infectadas pelo HIV. Nós descobrimos que o HPV-6 foi o genótipo mais prevalente (63,9%), seguido por HPV-16 (48,5%). Outros estudos encontraram porcentagens que variam de 52%6 a 87% 9 .
A proporção de pacientes com HPV não-identificado foi de 13,2%, com a maior frequência de City E (48%). O pequeno número de tipos investigados para além da grande variedade de tipos presentes nestes pacientes pode explicar as diferenças entre as prevalências relatadas 23,24 . Nós não testamos todos os genótipos de HPV, que é uma das limitações do nosso estudo. Além disso, a comparação entre as cidades era meramente descritivo, como a amostra não foi calculado para este fim e que o objetivo era apenas para detectar a frequência e subtipos de HPV no colo do útero de mulheres infectadas pelo HIV de diferentes cidades de Minas Gerais.
Número de parceiros sexuais e consumo de álcool foram os fatores de risco mais significativos para a infecção por HPV, seguido pela idade jovem e de baixa renda, em uma amostra de 225 mulheres gregas que frequentam um ambulatório ginecológico 25 . Pelo contrário, não encontramos nenhuma associação entre o HPV prevalência e fatores de risco, como relação sexual desprotegida, número de parceiros sexuais, CD4 e carga viral do HIV T + contagem de células, provavelmente devido as limitações de potência. Além disso, nós não temos acesso aos dados longitudinais para estado imunológico e carga viral do HIV.
De acordo com nossos resultados, o maior a carga viral do HIV foi o mais prevalente (81,5%) do HPV. No entanto, estes resultados não foram estatisticamente significativos (p ≥ 0,05). Havia uma tendência entre os pacientes com linfócitos T CD4 + contagem de células <200 células / mm 3 , para apresentar uma maior taxa de infecção por HPV (82,2%). Mais uma vez o resultado não foi significativa (p ≥ 0,05). O mais provável é o de acompanhamento de mulheres infectadas pelo HIV - incluindo PCR para detectar o HPV no colo do útero associado a linfócitos T CD4 + contagem de células e quantificação da carga viral - pode permitir a melhor avaliação entre infecção por HPV cervical e baixa imunidade desses pacientes 11 .
Um achado importante foi a alta prevalência de múltiplos tipos de HPV 7,9 , que foi encontrado em 64,8% das mulheres. Diferentes percentagens de múltiplos genótipos de HPV foram encontrados por outros autores - 36% 26, 45% de 9 e 52% 6 - provavelmente explicada por diferentes métodos de genotipagem de HPV, bem como os iniciadores utilizados para a detecção de diferentes.
Os resultados diferem dos achados de Cuschieri et al. 26 Esses autores realizaram PCR em 3444 pacientes, a infecção por HPV e foi encontrado em apenas 20% dos participantes. Infecções múltiplas com, pelo menos, um genótipo de alto risco de HPV foram encontrados em 23,3% (164/705) dos casos, o HPV de baixo risco em 0,8% (6/705) e HPV de risco alto e baixo em 19,3% (136/705), taxas muito mais baixas do que a nossa. No entanto, a falta de estratificação por status de HIV pode explicar esta discrepância.
A presença de múltiplos genótipos de HPV pode ser explicado pela reativação de tipos de HPV com latentes sobreposta nova infecção, impulsionados por relações sexuais desprotegidas e também, talvez pelo longo período de coleta de dados de nosso estudo. Podem também reflectir falha da resposta imunológica. Foram avaliados os linfócitos T CD4 + contagem de células, mas não medir a resposta imune local. No entanto, o mecanismo do HIV / associação HPV pode ser apenas especular neste momento.
Conclusão
Embora nosso estudo avaliou mulheres de um único estado, os dados podem reflectir a situação das mulheres infectadas pelo HIV no Brasil em geral. Foi confirmada a alta prevalência de HPV e de múltiplas infecções de HPV em amostras do colo do útero de mulheres infectadas pelo HIV. Nossos dados também demonstraram a importância de estudar subpopulações para planejar programas adequados de prevenção.
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Endereço para correspondência: Victor Hugo Melo Av. Alfredo Balena, 190, 2 º andar Belo Horizonte, MG, Brasil, CEP: 30130-100 [email protected]
Enviado em: 2010/12/18 Aprovado em: 2011/05/19 Apoio Financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) Conflito de interesse: Nenhum.
Trabalho realizado na Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil
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Revista Brasileira de OtorrinolaringologiaPrint version ISSN 0034-7299
Rev. Bras. Otorrinolaringol. vol.75 no.2 São Paulo Mar./Apr. 2009
http://dx.doi.org/10.1590/S0034-72992009000200002
ARTIGO ORIGINAL
Detecção de HPV na mucosa oral e genital pela técnica PCR em mulheres com diagnóstico histopatológico positivo para HPV genital
Therezita M. Peixoto Patury Galvão CastroI; Ivo Bussoloti FilhoII; Velber Xavier NascimentoIII; Sandra Doria XavierIV
IMestra em Medicina pela Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, Pós-graduanda Doutorado pela Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo IIDoutor em Medicina pela UNIFESP, Prof. Dr. da Disciplina de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, FCMSCSP IIIPós-graduando doutorado em biologia molecular IVMestra em Otorrinolaringologia pela Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
A infecção do papilomavírus humano (HPV) é uma das mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis em todo o mundo. A relação entre o HPV genital e oral permanece incerta, assim como o seu papel na carcinogênese oral. O objetivo deste estudo foi verificar a presença do DNA do HPV na mucosa oral e genital de mulheres com infecção genital por HPV, pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). FORMA DE ESTUDO: Coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Trata-se de um estudo piloto, prospectivo, com 30 mulheres, idade de 14 a 51 anos, portadoras de infecção genital por HPV confirmada pelo exame de histopatológico. Todas as pacientes foram submetidas a exame e coleta por raspagem da cavidade oral e genital para pesquisa do DNA do HPV pela técnica PCR. RESULTADOS: Nenhuma das amostras da cavidade oral foi positiva para HPV, enquanto no genital, o HPV foi detectado em 17 (57%) das 30 pacientes, principalmente o HPV 6b e 16. CONCLUSÃO: Os resultados mostraram maior porcentagem do HPV genital em relação à cavidade oral, e sugerem que o HPV genital não parece ser fator predisponente para a infecção oral no mesmo paciente.
O papilomavírus humano (HPV) pertence a um grupo heterogêneo1 de DNA vírus, que infecta a pele e mucosas de vários locais do corpo humano2.
Não se conhece claramente, ainda, o processo de transmissão deste vírus para a mucosa oral. Admite-se que possa ocorrer durante o parto vaginal, ou através da auto-inoculação e da prática de sexo oral3-5.
Há possibilidade de a saliva ter um papel protetor contra a infecção pelo HPV devido à presença de agentes antimicrobianos como as lisozimas, lactoferrina, IgA e citocinas6,7.
Os locais mais freqüentemente acometidos na cavidade oral são: lábios, palato, língua, gengiva, úvula, tonsilas e assoalho da boca. O assoalho da boca é um local com muita saliva, onde agentes cancerígenos, como o fumo e o álcool aí dissolvidos, permitem maior oportunidade para a ação deletéria viral8,9.
Classicamente, a infecção pelo HPV pode ser dividida em três formas distintas: clínica, subclínica e latente. A infecção clínica é facilmente detectada à vista desarmada, como uma verruga. A forma subclínica é a mais freqüente no colo do útero, correspondendo a 80% dos casos, é diagnosticada com o uso do colposcópio, após o uso de ácido acético a 5%. A forma latente é identificada apenas através dos exames de biologia molecular10,11.
No diagnóstico do HPV, a biópsia permite o estudo anatomopatológico de amostra representativa da lesão, para confirmar e graduar a mesma, não sendo capaz de identificar o HPV e nem o tipo do HPV, o que se obtém apenas pelas técnicas de biologia molecular12.
Atualmente, são os testes de hibridização os métodos de escolha para detecção do DNA do HPV em esfregaços e amostras de tecido. O DNA do HPV pode ser detectado por diferentes técnicas de hibridização incluindo o dot blot, Southern blot e a hibridização in situ, assim como a reação em cadeia de polimerase (PCR), sendo esta última a mais sensível13,14.
A PCR caracteriza-se pela amplificação de quantidades diminutas de seqüência de DNA-alvo em diversos milhões de vezes. São necessários os sistemas iniciadores (primers), sendo os mais utilizados os iniciadores consensus MY09-MY11 e GP5-GP615-17.
Os tipos de HPVs variam em seu tropismo tecidual, em suas associações a diferentes lesões e em seu potencial oncogênico. São caracterizados em HPVs de baixo risco (6,11,41,43,44) para desenvolver neoplasias, enquanto outros têm alto risco (16,18,31,33,35,39,45,46,51,52). Os tipos 6 e 11 são os principais tipos envolvidos na maioria dos condilomas do trato genital, enquanto os tipos 16 e 18 são encontrados principalmente no câncer do colo do útero12,16,17.
Foram identificados até o presente mais de 100 tipos de HPV18-20. Desses, 25 tipos (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 31, 32, 33, 35, 40, 45, 52, 55, 57,58, 59, 69, 72 e 73), foram associados com as lesões orais benignas (papilomas de células escamosas (PCE), condiloma acuminado, verruga vulgar e hiperplasia epitelial focal (HEF) e as lesões orais malignas, principalmente o carcinoma de células escamosas21.
Vários autores pesquisaram o HPV na mucosa oral e genital, com intuito de esclarecer se a infecção genital por este vírus poderia ser um fator predisponente para a infecção em outros locais, como a cavidade oral22-26.
Van Doornum et al.22 pesquisaram, pela técnica PCR, o HPV genital e oral em 65 homens e 111 mulheres. O exame da cavidade oral foi à vista desarmada com coleta por raspado. Encontrou-se o HPV genital em 21 (32%) dos 65 homens e 25 (23%) das 111 mulheres, porém, em nenhum dos pacientes foi encontrado HPV oral. Não há relato da prática de sexo oral.
Badarrocco et al.23, pela técnica PCR, encontraram HPV oral em cinco de dez mulheres com diagnóstico de HPV genital. Todas as pacientes foram submetidas ao exame da cavidade oral à vista desarmada e com colposcópio, sendo a coleta do material por raspado citológico da mucosa oral. Não há relato da prática de sexo oral.
Camadas et al.24 pesquisaram, pela técnica PCR, o HPV na região genital e oral de 188 mulheres. O exame da cavidade oral foi à vista desarmada com coleta por raspado. Houve positividade na mucosa oral em 15 (7.9%). Não há relato da taxa de prática de sexo oral.
Giraldo et al.25 encontraram positividade para HPV oral pela técnica PCR em 29 (20.7%) das 140 mulheres com ou sem lesão genital. A coleta foi por raspado da mucosa oral à vista desarmada. Detectaram também a positividade para HPV genital, pela técnica PCR, em 26 (89%) das 29 mulheres com HPV oral. A prática de sexo oral ocorreu em 16 (55.2%) das 29 mulheres com positividade para HPV oral, e em 59 (23.2%) das 111 mulheres negativas para HPV oral.
Xavier et al.26 pesquisaram, pela técnica PCR, a presença de HPV oral em 10 homens com HPV genital confirmado pela PCR. O exame da cavidade oral foi à vista desarmada e com coleta por raspado. Nenhum dos pacientes apresentou HPV na mucosa oral e não há relato da taxa de prática de sexo oral.
Tendo em vista a variabilidade dos resultados nos trabalhos encontrados na literatura sobre a presença do HPV na mucosa oral e sua relação com o HPV genital, torna-se necessária uma maior investigação científica sobre este assunto.
O objetivo deste estudo é verificar a presença do DNA do HPV na mucosa oral e genital de pacientes com infecção genital por HPV, pela técnica PCR.
MATERIAL E MÉTODO
Estudo prospectivo, realizado no período de maio de 2005 a novembro de 2006, aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UFAL, sob o protocolo nº 005564/02-50. Todas as pacientes foram previamente informadas do objetivo do trabalho, bem como dos procedimentos envolvidos. Após a leitura e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, todos aceitaram participar da pesquisa.
Os critérios de inclusão admitiam pessoas do sexo feminino, idade de 14 a 51 anos, com vida sexual ativa e com presença de lesão genital clínica ou subclínica por HPV, enquanto os critérios de exclusão compreendiam as pacientes portadoras de doenças imunológicas, como o HIV, imunodeprimidas e com uso de drogas imunossupressoras.
Foram recrutadas 30 pacientes com lesão genital (clínica e/ou subclínica) sugestiva para HPV, através do exame ginecológico e colposcópico com o uso de ácido acético a 5%, e se fez a biópsia das lesões para confirmação. Durante o exame de colposcopia colheram-se amostras de raspados citológicos utilizando escovas esterilizadas (Kit para coleta de copocitologia oncótica da Libbs) no local da lesão genital (genital externo, vagina e colo do útero).
No mesmo dia, fez-se também o exame da cavidade oral à vista desarmada, com o auxílio de luz artificial proveniente de fotóforo para identificação de alguma lesão clínica sugestiva de HPV. Foram coletadas amostras por raspado da mucosa oral, usando escovas esterilizadas nas regiões de possível implantação do vírus, palato mole, úvula, tonsilas, dorso da língua, região sublingual e mucosa jugal. Durante o exame da cavidade oral, não foi utilizado colposcópio e nem aplicação de ácido acético.
Estes raspados foram colocados em tubos separados e identificados como genital e oral, contendo uma solução tampão (tris-HCL 10mM, pH 8, EDTA 1mM ), encaminhados para o Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e mantidas sob temperatura de -20ºC, para execução da técnica PCR.
A extração do DNA genômico foi realizada conforme a metodologia do kit GFX (Asmersham Bioscience), enquanto que a concentração do DNA de cada amostra foi estimada através de um espectrofotômetro (Genova). A amplificação do DNA viral foi através dos primers consensus MY09/MY11, com posterior identificação dos tipos virais pela visualização dos padrões obtidos de eletroforese.
As 30 pacientes também responderam a um questionário padronizado onde foram abordados fatores epidemiológicos, como: início da atividade sexual, número de parceiros, sexo oral, sexo anal, etilismo e tabagismo.
RESULTADOS
A investigação epidemiológica mostrou que 22 das 30 pacientes (73%) praticavam sexo oral e 16 (53%) praticavam sexo anal, enquanto nove delas eram fumantes (30%) e nenhuma era etilista, conforme apresentado na Tabela 1.
Os resultados dos exames colposcópicos mostraram lesões subclínicas em 19 (63%) das 30 pacientes, lesões subclínicas e clínicas em oito pacientes (27%) e apenas lesões clínicas em três pacientes (10%), sendo a região do colo do útero a mais acometida. Com relação às biópsias das lesões genitais, todas as 30 amostras evidenciaram diagnóstico histológico de HPV, observado na Tabela 1.
Os resultados da PCR das amostras genitais apresentaram positividade em 17 amostras (57%) das 30 pacientes, ficando 13 amostras negativas. Foram identificados com maior freqüência o HPV 6b em sete (41%) das 17 amostras positivas, seguido pelo HPV 16 em quatro amostras (23%), os outros, o HPV66, HPV52 e HPV31 em uma amostra (6%) para cada um deles, entretanto, três amostras (18%) foram indeterminadas, conforme Tabela 1.
Os exames da cavidade oral à vista desarmada das 30 pacientes não mostraram a presença de lesão clínica sugestiva de HPV.
Os resultados da PCR das 30 amostras de raspados citológicos orais foram negativas para HPV.
DISCUSSÃO
Neste estudo, 19 (63%) das 30 pacientes tinham apenas infecções subclínicas no genital, principalmente no colo do útero, confirmadas pela colposcopia, o que é condizente com a literatura, que relata ser a forma mais freqüente de infecção pelo HPV10,11.
O exame histológico é um método importante no diagnóstico do HPV, pois todas as amostras genitais apresentaram alterações histológicas sugestivas de HPV, podendo ser considerado um exame de rotina inicial para o diagnóstico do HPV. Por não ser, todavia, capaz de identificar o HPV, torna-se necessária a confirmação da infecção viral pelas técnicas de biologia molecular12, principalmente a PCR, que é a mais sensível ao HPV13,14.
A técnica PCR foi o método usado para a pesquisa do HPV oral e genital neste estudo, utilizando os iniciadores consensus MY09-MY1116-18, uma vez que é o método mais sensível13,14 e mais preferido para a detecção do DNA do HPV em esfregaços e amostras de tecido14.
Os tipos de HPV mais encontrados na região genital das 17 pacientes positivas pela PCR foram o HPV tipo 6b (41%) e 16 (23%), sendo o primeiro de baixo risco e freqüente em condilomas genitais, e o segundo encontrado principalmente no câncer do colo do útero17.
Com relação aos hábitos de fumar e ser etilista, a taxa de fumantes foi de nove (30%) das 30 pacientes e nenhuma era estilista, o que não influiu nos resultados, apesar de serem fatores que favorecem a infecção do vírus HPV na mucosa oral8,9.
As amostras orais foram negativas nas 30 pacientes deste estudo pela técnica PCR. Em comparação com outros estudos22-26, utilizando a mesma técnica, houve positividade de 0 a 50%. Deste modo, deduzimos que a presença da infecção genital por HPV não parece ser fator predisponente para a infecção oral por HPV. Esta constatação é importante para aqueles pacientes que tem HPV genital e ficam preocupados com a possível transmissão ao(s) seu(s) parceiro(s) e também para outros locais de seu corpo.
Provavelmente a baixa da defesa imunológica seja o fator mais importante no aparecimento da infecção por HPV em outros locais do nosso corpo. Na cavidade oral, além da IgA, temos a presença de enzimas proteolíticas que agem como protetoras contra a infecção pelo HPV6,7.
A transmissão do HPV para a mucosa oral ainda não está bem esclarecida3-5. Neste estudo ocorreu elevada taxa da prática de sexo oral; em 73% dos casos, no entanto, os resultados para HPV oral foram negativos. Comparando com outros estudos22-26, observamos a falta de esclarecimento quanto a esta via de transmissão para a mucosa oral, impossibilitando afirmar se os pacientes com lesão genital e que praticam sexo oral estão mais predispostos a ter a infecção viral na cavidade oral.
Portanto, são necessários mais estudos sobre a relação entre o HPV oral e genital, para que possamos explicar a sua atuação na mucosa oral.
CONCLUSÃO
Neste estudo, a porcentagem de HPV foi maior na região genital, de 57% em relação à mucosa oral, de 0%, e sugere que o HPV genital não parece ser fator predisponente para a infecção oral no mesmo paciente.
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Endereço para correspondência: Therezita P. Galvão Fax: (0xx82)3327-5353 E-mail: [email protected]
Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 30 de agosto de 20075. cod.4755 Artigo aceito em 1 de fevereiro de 2008.
Apresentado no 5ª Congresso Triológico de Otorrinolaringologia, realizado em Brasília, no período de 6 a 9 de junho de 2007.
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São Paulo Medical JournalVersão impressa ISSN 1516-3180
São Paulo Med. J. vol.127 no.3 São Paulo 2009
http://dx.doi.org/10.1590/S1516-31802009000300003
ARTIGO ORIGINAL
Filogenética classificação de genótipos de HPV de alto grau de neoplasia intra-epitelial cervical em mulheres
de uma área densamente povoada região urbana brasileira
Classificação filogenética dos genótipos de papilomavírus Humano neoplasia intraepitelial cervical los de alto grau los Mulheres de UMA Região urbana densamente povoada brasileira
Denise Rocha Pitta I ; Luis Otávio Sarian II ; Elisabete Aparecida Campos I ; Sílvia Helena Rabelo-SantosIII ; Kari Syrjänen IV ; Sophie Françoise Derchain V
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, São Paulo, Brasil I MSc. Biólogo, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, São Paulo, Brasil II MD, PhD. Professor assistente do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, São Paulo, Brasil III doutorado.Farmacêutico e professor assistente da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, Goiás, Brasil IV MD, PhD, FIAC. Professor Associado do Departamento de Oncologia e Radioterapia, Turku University Hospital, Turku, Finlândia V MD, PhD. Professor Associado do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, São Paulo, Brasil
Endereço para correspondência
RESUMO
CONTEXTO E OBJETIVO: As diferenças de papilomavírus humano (HPV) podem ser correlacionados com o potencial biológico e risco de invasão de alto grau de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC 2 e NIC 3). O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre diferentes combinações de tipos de HPV e gravidade da NIC.DESENHO E LOCAL: . Estudo transversal, da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) MÉTODOS: amostras cervicais de 106 mulheres com NIC 2 (18) ou NIC 3 (88) foram avaliados os genótipos específicos de HPV utilizando Roche Linear Array ® (LA-HPV). As proporções de NIC 2 e NIC 3 em grupos de mulheres infectadas com o HPV filogenética grupos A7 e A9 foram comparados. Foram formados três grupos: mulheres com infecções simples, infecções múltiplas, e todo amostras. RESULTADOS: infecções múltiplas foram detectadas em 68 amostras (64,7%). Os mais freqüentes de alto risco genótipos detectados (simples / múltipla)
foram HPV 16 (57,1%), HPV 58 (24,7%), HPV 33 (15,2%), HPV 52 (13,3%), HPV 31 (10,4%), o HPV 51 (7,6%) e HPV 18 (6,6%).Mulheres sem infecção por HPV espécies Alpha 9 eram menos propensos a ter NIC 3 do que foram os seus Alpha 9 infectadas com HPV homólogos. HPV 16 e / ou HPV 18, com ou sem associação com outros tipos virais foram mais freqüentes em mulheres com NIC 3 do que naqueles com NIC 2. CONCLUSÕES: A gravidade da NIC de alto grau pode ser agravada pela presença de HPV tipos incluídos na classificação filogenética Alfa 9 e por infecções que incluem HPV 16 e 18, isoladamente ou em combinação com outros genótipos de HPV.
CONTEXTO E OBJETIVO: Diferentes Tipos de Papilomavírus Humano ( papilomavírus humano , HPV) PODEM Ser correlacionados com uma capacidade Biológica e Risco de Invasão das neoplasias intra-epiteliais de alto grau cervical (NIC 2 e NIC 3). O Objetivo deste Estudo FOI determinar a Relação de Diferentes Tipos de HPV com um Gravidade d bis NIC. TIPO DE ESTUDO E LOCAL: . Estudo transversal nd Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) MÉTODOS: FORAM OS avaliados genótipos específicos de HPV da Amostra cervical de 106 Mulheres com NIC 2 (18) OU NIC 3 (88), utilizando Roche Linear Array ® (LA) HPV genotipagem . FORAM comparadas como proporções de NIC 2 e NIC 3 em Grupos de Mulheres infectadas com Tipos de HPV dos Grupos filogenéticos A7 e A9. Três Grupos formados FORAM: Simples MULHERES COM Infecção; Infecção Múltipla; Simples e de e Infecção Multipla. RESULTADOS: Infecções MULTIPLAS FORAM detectadas in 68 (64,7%) samples DAS. De Os genótipos de Alto Risco Mais frequentemente detectados Simples in Infecção OU FORAM Múltipla HPV 16 (57,1%), HPV 58 (24,7%), HPV 33 (15,2%), HPV 52 (13,3%), HPV 31 (10,4%), HPV 51 (7,6%) e HPV 18 (6,6%). A Probabilidade de Mulheres com NIC 3 Serém infectadas com HPV Que Nao da especie Alfa Menor era 9 Que fazer com OS Tipos de HPV da especie Alfa 9. HPV 16 e 18 OU, OU NAO Associado com other Tipos Virais ERAM Mais frequentemente encontrados NAS Mulheres com NIC 3 Que fazer naquelas com NIC 2. CONCLUSÃO: A Gravidade da NIC de alto grau PODE Ser aumentada Pela Presença de Tipos de HPV incluidos nd classificação filogenética Alfa 9 e Infecções POR Que incluem HPV 16 e 18 Combinados OU NAO COM other genótipos de HPV.
Infecção persistente com tipos de alto risco de vírus do papiloma humano (HPV) é conhecida por ser um factor de risco para o desenvolvimento de unificação de neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) e carcinoma invasivo. 1-4CIN é classificada em três classes, com base na divulgação da progressiva células atípicas das camadas proliferativas para toda a espessura do epitélio. 5 Embora CIN CIN 2 e 3 representam lesões de alto grau do colo do útero, que são heterogéneas no seu potencial de progressão para cancro invasivo. 6
Evidência corrente indica que as diferenças nos tipos de HPV podem ser correlacionados com a capacidade biológica e risco de invasão de lesões CIN. 2,7,8 Dados recentes mostram que os tipos de HPV na CIN 2 são diferentes das observadas nos CIN 3 e CIN 2 frequentemente contém os tipos de HPV que não são comumente encontrados como tipos de solteiro em cânceres invasivos. 9 Isto poderia sugerir que o câncer invasivo é improvável que seja o ponto final para tais CIN 2 lesões. 9,10
Tipos de HPV genital são classificados como géneros Alpha papilomavírus. As espécies dentro destes gêneros estão intimamente relacionados, em termos de filogênese. Apesar de ter sequências genómicas distintas, eles mostram idênticos ou muito semelhantes propriedades biológicas ou patológicas. Junto com a espécie tipo HPV 16, espécie 9 também inclui os tipos de HPV 31, 33, 35, 52, 58 e 67. Junto com a espécie tipo do HPV 18, espécie 7 também inclui os tipos de HPV 39, 45, 59, 68, 70 e 85. 11
Existem controvérsias sobre uma possível concorrência ou sinergia de tipos individuais em infecções múltiplas.Alguns estudos de história natural têm sugerido que as mulheres que estão já infectadas apresentam maior risco de adquirir novos tipos de HPV do que aqueles que são HPV-negativo. 12,13 Uma interpretação alternativa destes resultados pode ser que mais do que um tipo de HPV é transmitida simultaneamente, e sua detecção sequencial pode ser uma consequência do ciclo de vida, que são replicados assíncrona e apenas ocasionalmente se sobrepõem. 14 Estes ciclos de vida podem ser interdependentes. 15 Múltiplos tipos de HPV podem estar associados a um risco de progressão que excede o risco devido a um único tipo de infecções . Num estudo recente, verificou-se evidência de que este risco aumenta com o número cumulativo de tipos de HPV, na maioria das combinações, e essas associações pareceu particularmente forte no curto prazo. 16
OBJETIVO
Neste relatório, o nosso foco principal era abordar a questão da heterogeneidade de tipos de HPV como uma possível fonte de variação biológica em NIC 2 e NIC 3. Para adicionar novas informações ao crescente corpo de literatura em mulheres com estas lesões, que teve como objetivo avaliar a distribuição de infecções simples e múltiplas de diferentes tipos de HPV em mulheres com alto grau de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC 2 e NIC 3), e para comparar a prevalência de diferentes tipos de HPV em NIC 2 e NIC 3, tendo em conta a classificação filogenética do vírus.
MÉTODOS
Tipo de estudo e definição
A amostra de pacientes para este estudo transversal composto por 106 mulheres não-consecutivos submetidos excisão ampla da zona de transformação (LLETZ) para tratar NIC 2 ou 3, entre Fevereiro de 2001 e Abril de 2004.
O estudo foi realizado nas clínicas colposcopia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), no Brasil, uma instituição de saúde pública dedicada à assistência integral para as mulheres.
Amostra
O tamanho da amostra para este estudo foi estimado de acordo com a relação de n = (p * q) / E 2 , onde n é o tamanho da amostra, p é a prevalência estimada da condição em mulheres afectadas (no caso presente, a prevalência de HPV em CIN de alto grau é tão elevada como 95% 16 ), e q é a prevalência da doença em indivíduos não afectados. A prevalência geral de tipos altamente oncogênicos do HPV em uma população urbana do sexo feminino (média de idade: 33 anos), sem NIC de alto grau foi estimada em 6,2%. 16 E é o erro padrão, previsto para 2,5% para os cálculos atuais. Assim, estimou-se um tamanho de amostra de cerca de 94 mulheres.
As mulheres deste estudo foram selecionados após o encaminhamento para a Unicamp para tratamento especializado de alta qualidade lesões intra-epiteliais (HSIL). Eles foram convidados a participar do estudo no momento da sua visita de pré-tratamento (ou seja, sua primeira visita depois de ser aceito para tratamento). Um dos pesquisadores estava sempre presente nessas visitas e, depois de explicar o protocolo de estudo e preocupações éticas, fez o convite. Todos os pacientes que concordaram em ser incluídos no estudo deram o seu consentimento por escrito assinado.
Na visita pré-tratamento, todas as mulheres foram entrevistadas para a obtenção de dados clínicos, sociais e demográficas. Um exame ginecológico completo foi realizado, com a coleta de amostras endocervicais para o teste de HPV, seguido por exame colposcópico do colo do útero. A decisão de executar conização diatérmico foi baseada na citologia de referência e a configuração clínica / colposcópico do colo do útero. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local (Protocolo n º CEP 309/2004).
Procedimentos
Histologia
As amostras histológicas consistiram de 106 espécimes conização diatérmico. Este material foi fixado em fosfato de formol tamponado 10% e depois foi incluído em parafina e corados com hematoxilina e eosina. As amostras foram analisadas de acordo com critérios da Organização Mundial de Saúde. 17 Nesta série, apenas os casos diagnosticados como NIC 2 (n = 18) ou NIC 3 (n = 88) foram incluídos. Idade média dos pacientes foi de 34,08 anos (90% faixa central: 17,5-73,6 anos). As idades das mulheres com NIC 2 (idade média: 32,01 anos, 90% faixa central: 17,4-59,5 anos) e NIC 3 (média de idade de 34,05 anos; 90% faixa central: 17,3 a 73,6 anos) foram semelhantes (P = 0,32).
Principais medidas
Detecção de HPV
Extracção de ADN
Para tipagem do HPV, as células cervicais foram coletadas utilizando um Digene TM escova cervical e em seguida agitado em meio coleção universal (UCM). Uma alíquota de 200 μ l de UCM foi amostrada (Digene Corporation, EUA) e centrifugada a 13.000 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido eo sedimento celular foi armazenada a -20 º C até à sua utilização. As células no sedimento foram re-suspensas em 200 μ l de solução de digestão (Tris 1 mM, 200 μ g / ml de proteinase K e 0,5% de sulfato de sódio dodecilo, SDS). Esta suspensão foi abalada e incubados a 55 º C por duas horas e de 95 º C por cinco minutos. Em seguida, 200 μ l de solução de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25:24:1) foi adicionado e agitado vigorosamente antes da centrifugação a 5000 g durante 10 minutos. A fase aquosa foi removida e transferida para um tubo limpo, e 1/10 (10%) de NaAc (acetato de sódio) a 3M pH 5,2 e misturou-se. Em seguida, os volumes de 2,5 a 70% de etanol arrefecido em gelo foi adicionado e agitado. A solução foi centrifugada a 15.000 g durante 15 minutos eo sobrenadante foi removido.Após o sedimento de ácido desoxirribonucleico (DNA) tinha secado, dissolveu-se em 100 μ l de tampão Tris-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA-TE) solução (Tris 1 mM, EDTA 100 μ M, pH 8,2). Os ácidos nucleicos foram armazenadas a -20 º C até à sua utilização.
Roche Linear Array ®
A Roche Linear Array ® (LA) genotipagem de HPV ensaio (Roche Molecular Systems, Alameda, Califórnia, EUA) é baseada na reacção em cadeia da polimerase (PCR) amplificação do DNA alvo utilizando iniciadores de HPV (PYGM09/11), hibridação do amplificado produto utilizando sondas de oligonucleótidos e, em seguida, a sua detecção, utilizando uma reacção colorimétrica. A mistura mestra contém iniciadores para a amplificação de um 450 base-par fragmento (pb) da região L1 de mais de 37 genótipos de HPV 18 e um fragmento 268-bp do humanoβ gene da p-globina, como um controlo interno.
Detecção e determinação do genótipo foram realizadas utilizando o DNA amplificado desnaturado e uma matriz de sondas de oligonucleótidos localizada na região polimórfica de L1. Esta identificação habilitado independente de 37 genótipos de HPV individuais ( Figura 1 ), como se segue: 16 tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73 e 82), 11 tipos de baixo risco do HPV (6,11, 40, 42, 54, 61, 70, 72, 81, CP6108 e 67), dois tipos de risco intermediário de HPV (26 e 53) e oito tipos de HPV de risco indeterminado (55, 62, 64, 69, 71, 83, 84 e IS 39).
Métodos estatísticos
Os dados foram tabulados no OpenOffice e analisados no ambiente R para análises estatísticas. As proporções de NIC 2 e NIC 3 em grupos de mulheres infectadas com o A7 e vários grupos A9 filogenéticas HPV foram comparadas pelo teste exato de Fisher. Três situações foram consideradas: as mulheres com infecções simples, infecções múltiplas, e toda a amostra. Um modelo de regressão linear foi então equipado para avaliar as proporções de NIC 2 e NIC 3 em grupos de mulheres com diferentes combinações únicas ou múltiplas de infectar tipos de HPV.
RESULTADOS
A distribuição dos tipos de HPV como infecções únicas e múltiplas é mostrada na Tabela 1 . Dos 37 tipos de HPV incluídos em LA-HPV, 32 foram detectados nas amostras analisadas. HPV 16 foi o genótipo mais prevalente (presente em 57,1% das amostras), quer como uma única infecção ou co-infecção do colo do útero, juntamente com outros tipos de HPV. Foi o único tipo infectante em 15,2% das amostras. Outros genótipos freqüentes, tanto em infecções múltiplas ou única, foram HPV 58 (26/105; 24,7%), HPV 33 (16/105; 15,2%), HPV 52 (14/105; 13,3%),
HPV 31 (11 / 105; 10,4%) e HPV 51 (8/105; 7,6%), os quais são todos os tipos de HPV de alto risco.HPV 18 apareceu em apenas 6,6% das lesões, e não era um agente único de qualquer um deles. Apenas 3/105 (2,87%) das mulheres tinham infecções compostas exclusivamente de tipos de baixo e intermediário risco HPV (como tipos simples ou múltiplo). A composição exacta dos vários múltiplas infecções de HPV é mostrado naFigura 1 .
Infecções múltiplas foram detectadas em 68/105 (64,7%) das mulheres. A maioria destas infecções múltiplas do tipo incluídos dois tipos de HPV (39/68; 57,3%). Consideravelmente menos freqüentemente, havia três tipos (17/68; 25%),
quatro tipos (8/68; 11,7%), cinco tipos (2/68; 2,9%) e até seis tipos (2/68; 2,9%) (dados não apresentados). Entre as infecções múltiplas do tipo, 42/68 (61,7%) era composta exclusivamente de tipos de HPV de alto risco. Os vários tipos predominantes associações ( Figura 2 ) foram HPV 16/58 com ou sem outros tipos (n = 14), seguido de HPV 16/52 com ou sem outros tipos (n = 8), HPV 16/18 com ou sem outros tipos (n = 5), HPV 16/33, com ou sem outros tipos (n = 4) e HPV 33/58 e HPV 35/52 com ou sem outros tipos (n = 2, cada um).
A distribuição dos tipos de HPV de acordo com as suas espécies filogenéticas (Alpha género, espécie 7: HPV 18, 39, 45, 59, 68, 70 e 85, e Alpha género, espécie 9: HPV 16, 31, 33, 35, 52 , 58, e 67), em 2 e 3 CIN CIN lesões é mostrado na Tabela 2 . A maioria das mulheres tinha um tipo de HPV de espécies Alpha 9 e outros, enquanto muito poucos tinham Alpha 7 e outros (5/105). Havia 22 mulheres (22/105), com ambas as espécies (Alpha 9 e Alpha 7). Proporcionalmente, as mulheres não infectadas com HPV espécies Alpha 9 eram menos propensos a ter CIN 3, em comparação com os seus Alpha 9 infectadas com HPV homólogos (P = 0,01). Esta tendência também foi encontrada quando se analisa o subgrupo de mulheres com infecções múltiplas apenas (P = 0,001). Em mulheres infectadas com um único tipo de HPV, a proporção de CIN 3/CIN 2 foi o mesmo, independentemente da espécie de HPV presentes no seu útero (P = 0,20).
A detecção geral de HPV por LA foi 105/106 mulheres (99%), por NIC 2 foi de 100% e para NIC 3 foi de 99%. O HPV 16 e 18 individuais, de infecções de HPV 16/18 co-infecções e infecções por HPV simples ou múltiplas sem HPV 16 e 18 estão resumidas na Tabela 3 . Infecções, incluindo o HPV 16 e 18, isoladamente ou em associação com outros genótipos de HPV foram significativamente mais comum em NIC 3 do que em NIC 2 (P = 0,01).
DISCUSSÃO
Neste estudo, utilizando a Roche LA-HPV genotipagem, o HPV foi detectado em 99% dos NIC 2 e 3 CIN amostras.Resultados semelhantes foram relatados por Castle et al. 19 e Gargiulo et al. 20 LA-HPV é um teste de HPV comercial, fabricado seguindo boas práticas de fabrico com reagentes padronizados. 19 Neste ensaio, o mesmo fragmento amplificado pode ser directamente utilizado para a detecção de β globina e de 37 genótipos diferentes de HPV numa reacção única. Na presente série, este método foi fácil de usar e altamente preciso para detectar a maioria dos genótipos do HPV clinicamente significativas.
Ao contrário de seqüenciamento de DNA, LA-HPV é capaz de identificar infecções múltiplas. 21,22 Na presente série, 64,7% das amostras apresentaram múltiplos genótipos de HPV. Esta prevalência elevada de infecções múltiplas é evidente na maioria dos estudos que usam LA-HPV, que varia de 49,7% para 79,0%. 20-
22 Detecção e genotipagem de HPV torna-se mais complexo em amostras contendo vários genótipos, devido à competição para os reagentes durante a amplificação e discriminação dos tipos amplificados por PCR. A correlação entre o número de tipos adicionais detectados com LA-HPV sugere que menos competição durante a amplificação foi encontrado com LA-HPV. 23
Uma vantagem clara de total genotipagem de HPV é a capacidade de aumentar o desempenho dos programas de rastreio usando HPV, identificando as mulheres HPV-positivos que têm persistente HPV oncogênico. Há algumas evidências recentes de que o risco de desenvolvimento da lesão com o aumento do número cumulativo de tipos de HPV, e essas associações pareceu particularmente forte durante o primeiro ano de acompanhamento. 16Assim, a detecção de curto prazo persistência HPV podem aumentar a especificidade da triagem baseada em HPV.Se genotipagem completa é introduzido no rastreio, a questão de como frequentemente as mulheres que repetidamente teste positivo para HPV oncogênicos (com ou sem o HPV 16 e HPV 18) presente persistente infecção por HPV oncogénico podem ser resolvidos. 24 No entanto, deve salientar-se que a corrente orientações sobre rastreio cervical sugerem que o teste de HPV deve ser usado em intervalos não inferiores a três anos, o que compensa a aplicabilidade da genotipagem de HPV, na forma descrita acima.
Nesta série de mulheres brasileiras, a prevalência geral do HPV 16 foi de 57,1%, embora o HPV 16 como um único tipo só estava presente em 15,2% dos casos. As associações mais freqüentes foram de HPV 16, juntamente com o HPV 58, 52, 18 e 33. Em um estudo muito semelhante à atual, em termos de design, Prétet et al. 25 examinou uma amostra de CIN 2 e 3 e descobriu que o HPV 16 foi o tipo mais freqüente. No entanto, em contraste com as presentes descobertas, que tipo era o único agente em 40,4% das amostras. Em uma recente meta-análise, Smith et al. 8 constatou que a prevalência de HPV 16 (single e co-infecções) em lesões de alto grau coletadas em todo o mundo foi de 45,3%.
Em nosso estudo, o HPV 18 genótipo aparece na sétima posição em termos de prevalência, ocorrendo em 6,6% das amostras. Invariavelmente, o HPV 18 foi associado com outros genótipos de HPV. Isto é muito semelhante ao relatório da Prétet et al., 25 , com a prevalência do HPV 18 de 4,3% (6,6% de 121 CIN 2 lesões e 3,5% dos 372 CIN 3 lesões) e apenas três NIC 3 apresentavam lesões HPV 18 como a única tipo de infecção. No relatório por Smith et al., 8 HPV 18 aparece na quinta posição, com uma prevalência geral de 6,9%. Há algumas pequenas diferenças entre esta meta-análise 8 e nossos resultados, quanto à ordem de prevalência dos genótipos mais comuns de HPV: 16, 31, 33, 58, 18, 52, 35 e 51 na meta-análise, e 16 , 58, 33, 52, 31, 51, 18 e 68 na presente série. No entanto, estes autores afirmam que houve uma falta de dados importante da América do Sul em sua meta-análise, e nosso estudo acrescenta novas informações sobre a distribuição do tipo de HPV em lesões de alto grau entre as mulheres brasileiras.
Comparando NIC 2 e NIC 3, o HPV 16 e 18 foram significativamente mais prevalente em CIN 3 lesões. Isto é consistente com os dados de Prétet et al., 25 , que analisou 121 NIC 2 e NIC 3 372 lesões na França, e também encontraram maior prevalência de HPV 16 em NIC 3 (64,2%) do que no CIN 2 lesões (56,2%) . Essa diferença foi ainda mais acentuada em um estudo de Zuna et al., 9 que relataram infecção por HPV 16 em 65,6% das NIC 3 e apenas 19,0% em NIC 2 lesões. Apesar do facto de que em todas as séries relatadas, CIN 2 lesões representados numa minoria de casos, estes dados sugerem que o CIN 2 e 3 pode ser diferente no seu potencial biológico, e que os genótipos de HPV pode interferir com o risco de progressão nestas duas categorias de CIN lesões.
De acordo com os resultados do presente estudo, as mulheres infectadas com o Alpha 9 espécies eram mais propensos a ter NIC 3 do que as mulheres infectadas com Alpha 7 espécies e outros. Esses dados são compatíveis com as informações sobre o potencial carcinogênico de tipos específicos de HPV. De fato, estudos têm demonstrado que o HPV 16, 18 e 45 são mais prevalentes em carcinoma de células escamosas do que em HSIL (NIC 2 e NIC 3), enquanto que o inverso é verdadeiro para outros tipos oncogênicos, incluindo o HPV 31, 33, 52 e 58 . A infecção com o HPV 16 impõe o maior risco de tanto NIC 3 e carcinoma cervical, embora o HPV 33, que também pertence ao Alpha 9 espécies, possivelmente tem um maior potencial oncogênico de HPV 18 e 45. 7Em outro estudo epidemiológico, Wheeler et al . 26 observou-se maior risco de NIC 3 entre as mulheres com HPV 31 (Alpha 9) e relativamente de baixo potencial oncogênico de HPV 56 e 59 (Alpha 7).
O presente estudo fornece novas informações sobre a distribuição de genótipos individuais de HPV e infecções múltiplas, obtidas no ensaio LA Roche-HPV. Estes dados sugerem que uma vacina profilática contra HPV 16/18 tem o potencial para prevenir a aproximadamente metade das lesões de alto grau. Para uma das duas vacinas candidatas, Harper et al. 27 indicou que esta proporção pode ainda ser aumentada, se uma protecção cruzada contra foram alcançados alguns outros tipos de HPV de alto risco, a protecção total de, por exemplo contra o HPV 45, uma protecção parcial contra HPV 31 e nenhuma proteção contra o HPV 33, 52 e 58. No entanto, as implicações desta observação são difíceis de definir, porque o HPV 45 foi sub-representadas em nossa casuística, da mesma forma como no recente meta-análise. 8 Estes dados sobre distribuição de genótipos de HPV entre diferentes populações são de importância crucial para a concepção de segunda geração de vacinas profiláticas contra o HPV no futuro próximo. Também de relevância, futuras vacinas terapêuticas contra o HPV teriam maior benefício potencial se o seu projeto para o tratamento de infecções por HPV não se restringiram ao HPV 16 e 18.O melhor cenário hipotético é aquele em que os componentes da vacina são escolhidos levando-se em consideração a distribuição epidemiológica de tipos de HPV nas regiões geográficas específicas em que eles estão a ser utilizados.
CONCLUSÕES
A presente série firmemente corrobora a hipótese de que, na maioria das NIC 2 e NIC 3 casos, vários tipos de alto-oncogênicos do HPV pode ser encontrado. Na nossa série, a prevalência de HPV 58 e HPV 33 foi inesperadamente alta. CIN 3 foi tipicamente associados com HPV género Alpha, espécies 9, na maioria das vezes que consiste dos tipos 16 e 58, por si só ou em combinação com outros tipos de HPV.
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Agradecimentos: Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Fapesp) para Grant 04/09309-5. SD é um pesquisador credenciado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq)
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Jornal Brasileiro de Doenças InfecciosasVersão impressa ISSN 1413-8670
Braz J Infect Dis vol.14 no.1 Salvador janeiro / fevereiro 2010
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-86702010000100018
RELATO DO CASO
Infecção oral por HPV em um paciente de transplante de medula óssea: relato de caso com apresentação clínica atípica e resultado inesperado
Claudio Maranhão Pereira, DDS I ; PhD Laura Guimarães Melo II ; Maysa Milazzo Correa II ; Carmino Antônio de Souza, MD, PhD III , Maria Elvira P. Corrêa, DDS, PhD IV
I Professor Assistente em Patologia Oral da Faculdade de Odontologia, Universidade Paulista, Goiânia / GO-Brasil e Professor Assistente de Patologia, Universidade Estácio de Sá, Goiânia / GO-Brasil II estudante de Odontologia, Faculdade de Odontologia, Universidade Paulista, Goiânia/GO- Brasil IIIProfessor Assistente em Hematologia Ambulatório, Centro de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil IV Professor Assistente em Odontologia Ambulatório, Centro de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil
Correspondência para
RESUMO
HPV (Vírus de Papiloma Humano) é uma das infecções mais prevalentes mundialmente. Infecção por HPV oral pode estar associada com doenças diferentes de cavitie oral. Embora a infecção oral por HPV ocorre com freqüência, raramente provoca lesões. Um aumento da taxa de orais lesões induzidas por HPV é observado em pessoas com um sistema imunológico comprometido. As condições mais comuns induzidas pela infecção oral por HPV são a hiperplasia epitelial focal,
condilomas orais e papilomas orais. Nós relatamos um caso de lesão HPV oral em um paciente transplante de medula óssea com apresentação clínica atípica e resultado inesperado.
Palavras-chave: HPV, o transplante de medula óssea, a leucemia.
INTRODUÇÃO
Os vírus de papiloma humano (HPVs) são uma grande família de vírus de DNA, capazes de infectar uma grande variedade de superfícies epiteliais, incluindo o epitélio da mucosa e da pele tanto. O HPV é uma das infecções mais prevalentes em todo o mundo, com vários milhões de novos casos diagnosticados anualmente. Existem mais de 120 tipos de HPV, e, pelo menos, 30 destes foram detectados na cavidade oral. 1-3
Na maioria das vezes lesões por HPV aparecem nos lábios, mas eles também têm sido relatados em mucosa oral, língua, gengiva e palato. Ao mesmo tempo, deve notar-se que as infecções orais por HPV são na sua maioria assintomáticos. Embora orais HPV-relacionados lesões são raros, eles são na sua maioria associados com tipos de HPV genital. 3,4
Um aumento da taxa de orais lesões induzidas por HPV é observada em pessoas com o sistema imunológico comprometido, especialmente em indivíduos HIV-positivos. As condições mais comuns induzidas pela infecção oral por HPV são a hiperplasia epitelial focal, condilomas orais e papilomas orais. Infecção oral por HPV foi encontrado para ser associado com alguns casos de cancro da orofaringe, mas não é o principal factor de risco para este tipo de cancro. 3,5
Verrugas orais e papilomas em transplante de medula óssea (TMO) tem sido relatado 1-3 anos após o transplante.4
Nós relatamos um caso de lesão HPV oral em um paciente TMO com apresentação clínica atípica e resultado inesperado.
RELATO DO CASO
Um homem de 41 anos de idade, com história de 5 anos de idade de transplante de medula óssea, foi encaminhado para o Serviço de Hematologia Dental Center / UNICAMP, em outubro de 2001 para um check-up rotineiro.
A história clínica revelou que o paciente recebeu o transplante de medula óssea alogénica (Junho de 1996) a partir de um antigénio de leucócitos humanos (HLA)-idênticos irmão, depois de um regime de condicionamento com ciclofosfamida (CPH) e irradiação total do corpo (TBI). GVHD profilaxia foi realizada com ciclosporina A (CsA).Em 200 dias após o transplante, após a retirada da ciclosporina, apresentou extensa crônica do enxerto versus hospedeiro (GVHD) sobre os olhos, pele, pulmões e fígado. Exame físico completo, testes de função pulmonar, hemograma, testes de função hepática, exame oftalmológico com teste
de Schirmer e biópsias da face e no tronco apoiado o diagnóstico de DECH crônica. O tratamento com prednisona oral 30 mg / dia de CsA e 250 mg / dia foi iniciado, com a melhoria das lesões e a função pulmonar e hepática após um mês. CsA foi reduzida gradualmente, até a suspensão em 279 dias após o transplante. Exame oral foi realizada antes do TMO, e ele tem sido seguido pelo Serviço de Hematologia Dental Center / UNICAMP desde então. O paciente não apresentou queixas orais e só tinha sido submetidos a tratamento periodontal.
No entanto, em outubro de 2001, o exame clínico oral mostrou uma placa branca no palato mole esquerda, com cerca de 3,0 x 3,0 cm de extensão, firmes, não removível e assintomática ( Figura 1 ). Nessa altura, o paciente não receber tratamento GVHD porque a doença estava sob controll, e não havia nem alterações quantitativas, nem qualitativas em seu sistema imunológico.
Uma biópsia da lesão foi realizada e o exame microscópico revelou hiperqueratose, acantose, células do epitélio com citoplasma picnóticos e hialinos, a presença de células vacuolizadas com inclusões eosinofílicas intercelulares e brutas grânulos basofílicos de keratohyaline, sugerindo infecção por HPV ( Figura 2 ). Dados obtidos em testes imuno-histoquímica confirmou o diagnóstico da infecção por HPV ( Figura 3 ).
O paciente foi encaminhado para o Serviço de Dermatologia do Hospital Clinic / UNICAMP em janeiro de 2002 e foi submetido a laser Nd: YAG para a excisão da lesão devido ao baixo risco de sangramento comparado a outras técnicas cirúrgicas. No entanto, os resultados finais não foram como esperado. O paciente retornou em abril de 2002 com uma lesão recorrente e exacerbada. Exame clínico revelou a placa no palato duro e mole esquerda cobrindo também os rebordos alveolares e papila gengival, espalhados por uma área de aproximadamente de 6,0 x 5,0 cm ( Figura 4 ).
Em junho de 2002, a paciente retornou para uma visita de acompanhamento e da lesão mostrou uma regressão espontânea parcial ( Figura 5 ). No entanto, a lesão não foi completamente curada até agora. A aparência da placa branca em Outubro de 2001 e no início de regressão espontânea do que em Junho de 2002 foi independente com o tratamento médico ou quantitativos e qualitativos alterações imunológicas.
Porque a lesão não apresentar assintomáticos e relevantes aspectos clínicos, a medicação não foi colocado. O paciente foi seguido e lesão permaneceu
inalterado. O paciente está sendo acompanhado no Hemocentro / UNICAMP, e não tem nenhuma mudança médica até agora
DISCUSSÃO
Infecção por HPV oral pode estar associada com diferentes doenças da cavidade oral, mas, embora esta infecção ocorre frequentemente, raramente provoca lesões. A aparência macroscópica das verrugas orais varia muito e, frequentemente, reflete o genótipo HPV específico causador da lesão. Muitas vezes, a aparência clínica das lesões é o reflexo do genótipo HPV específico causador da lesão. Por exemplo, os genótipos de HPV 6 e 11, as causas mais comuns de verrugas genitais, tendem a causar acuminado condiloma na cavidade oral. Genótipos de HPV 1, 2, e 7, os quais estão associados com verrugas cutâneas, causar firmes, sésseis, orais verrugas comuns.Genótipos de HPV 13 e 32, que têm sido descritos apenas na cavidade oral, são a causa de hiperplasia epitelial focal bucal. 6
Pós-transplante pacientes estão em maior risco de infecções orais papilomavírus humano, especialmente em pacientes imunodeprimidos, normalmente aqueles em terapia de alta dose para GVHD. Parece que a maioria dos casos representam a reativação do vírus latente com pacientes que relatam mão ou lesões genitais, às vezes antes do transplante. 7,8
TMO complicações após 12 meses transplantes ofallogeneic são associados com complicações crônicas de regimes de condicionamento, GVHD, e infecções tardias. Infecções são raras, mas um aumento da incidência de infecções orais HPV tem sido observada em alguns centros. A apresentação destas lesões orais podem variar de exofíticas orais verrucosas vulgaris massas semelhantes a mais condiloma plano aparência acuminata-like. 4,9,10Este caso descrito uma placa-como leucoplasia branco no palato mole esquerda. Sua aparência clínica é muito raro e não descrever na literatura médica.
O tratamento deve ser determinada em uma base caso-a-caso. Muitas vezes, a recuperação adicional da função imune levará a redução e eliminação de lesões orais de HPV. Por outro lado, torna-se necessário considerar a terapia, cirurgia a laser ou crioterapia para a remoção de lesões orais de HPV, as injecções intralesionais de IFN-α pode revelar-se eficaz para as lesões recorrentes. 4,9,10 Nisto caso relatado foi recebido Nd: YAG para a excisão da lesão, mas os resultados finais não foram como esperado. Depois de três meses, o paciente retornou com uma lesão recorrente e exacerbada no palato duro e mole esquerda cobrindo também os rebordos alveolares e papila gengival, espalhados para uma área em torno de 6,0 x 5,0 cm.
No entanto, a lesão começou a diminuir de forma espontânea ao fim de dois meses. Desde o aparecimento da placa branca e início da regressão espontânea após nove meses, não foram observadas alterações no tratamento médico do paciente, bem como a ausência de alterações qualitativas e quantitativas em seu sistema imunológico.Além disso, a lesão não chegou a uma regressão completa até o presente momento. Nenhum factor pode ser encontrada, ou não inerentes ao TMO, que pode contribuir significativamente para a regressão espontânea da lesão no paciente e, portanto, é necessário mais estudos.
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Endereço para correspondência: Cláudio Maranhão Pereira Faculdade de Odontologia da Universidade Paulista, campus Flamboyant Patologia Oral-Diagnóstico Oral BR-153, KM 503, Fazenda Botafogo CEP: 74845090 - Goiânia / GO - Brasil + 55 62 32394000 E-mail: claudiomaranhao @ hotmail. com ; claudio.maranhao @ go.estacio.br
Enviado em: 09/18/2009 Aprovado em: 11/19/2009 Declaramos a inexistência de conflito de interesses.
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Jornal Brasileiro de Doenças InfecciosasVersão impressa ISSN 1413-8670
Braz J Infect Dis vol.14 no.1 Salvador janeiro / fevereiro 2010
Prevalência de papilomavirus humano (HPV) e HPV-16 genotipagem por PCR em tempo real em pacientes com diversas patologias cervicais
Bedia Dinc I ; Seyyal Rota I ; Anil Onã II ; Gulendam Bozdayi I ; Cagatay Taskiran II ; Aydan Biri II ; Haldun Güner II
I Departamento de Microbiologia Médica II do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Universidade de Gazi, Faculdade de Medicina, 06500, Ancara, Turquia
Correspondência para
RESUMO
OBJETIVO: este estudo foi planejado para avaliar a prevalência de HPV (exceto tipo 16) e HPV 16 por PCR em tempo real em pacientes Colposcopia e de interpretar os resultados com idade, idade da primeira relação sexual (FSI), paridade e resultados citológicas . MÉTODOS: 102 pacientes colposcopia (50 e 52 dos pacientes foram classificados como colposcopia positiva e negativa, respectivamente) que se aplicam a clínica de ginecologia foram incluídos. HPV (exceptuando o tipo 16) e HPV 16 foi determinada por PCR em tempo real usando a região L1. Em tempo real amplificações aninhados de MY09/11 produtos foi feita por GP5 + / GP6 + primers e cianina-5 HPV rotulados e HPV 16 sonda de DNA específica, após a extração do DNA do HPV por fenol clorofórmio isoamílico.RESULTADOS: HPV (exceto tipo 16) e HPV 16 foram positivo em 12% e 18% dos pacientes colposcopia positivos, respectivamente. HPV (exceto tipo 16) e HPV 16 foram positivas em 5,7% e 3,8% dos pacientes colposcopia negativas, respectivamente. CONCLUSÃO: houve uma diferença estatisticamente significativa entre pacientes positivos colposcopia e colposcopia negativa comparando HPV 16 com a positividade do HPV total (p = 0,021 para o tipo 16 e p = 0,010 para o HPV total), mas não houve diferença estatisticamente significativa entre pacientes positivos colposcopia e colposcopia negativa quando comparado HPV positividade (exceto tipo 16) (p = 0,314).Em conclusão, a detecção de HPV e de digitação pode ser útil para o rastreio do cancro do colo do útero e de prevenção.
Palavras-chave: HPV tipo 16, PCR em tempo real, a colposcopia.
INTRODUÇÃO
O câncer cervical é globalmente o segundo câncer mais comum em mulheres, com aproximadamente 493 mil novos casos anualmente. 1 câncer de colo do útero também é um importante problema de saúde pública nos países em desenvolvimento. Há uma relação estatisticamente significativa entre o câncer cervical e do número de parceiros sexuais de uma mulher. Estes dados nos levam a agentes sexualmente transmissíveis, principalmente os vírus. 2,3Como resultado dos estudos epidemiológicos sobre o câncer de colo do útero, não há dúvida sobre a importância do papilomavírus humano (HPV), especialmente o tipo 16 e 18, como agente etiológico . 2-5 Em consequência, a detecção e tratamento da infecção pelo HPV pode ser uma etapa importante no diagnóstico e tratamento do cancro do colo do útero. O exame de Papanicolaou, como o teste mais utilizado de despistagem do cancro no mundo, é rentável e rastreio organizado desde um declínio na mortalidade por câncer de colo do útero. No entanto, nos países em desenvolvimento, onde os programas de rastreio são incomuns, o câncer de colo do útero ainda permanece como uma das mais importantes causas de morte entre as mulheres. HPV só pode ser confiavelmente detectado por testes de DNA baseadas desde as alterações morfológicas do citologia como coilocitose não são específicos para os HPVs oncogênicos. Estas observações reforçam a necessidade de desenvolver mais eficazes métodos de diagnóstico. 6,7 métodos baseados em PCR amplificar ácidos nucleicos de HPV são comumente usados por causa da sensibilidade limitada de papanicolau levando a preparação de amostras e problemas de interpretação, a insuficiência de testes sorológicos e na impossibilidade de culturas in vitro.Detecção de ADN de HPV, especialmente em infecções latentes, podem ser úteis na detecção de cancro e lesões precursoras. 8 O presente estudo foi desenhado para avaliar o efeito de HPV, especialmente do tipo 16, em pacientes colposcopia, ambos com e sem patologias cervicais e associá-la a os achados clínicos em nosso hospital.
MATERIAL E MÉTODOS
Pacientes: de dezembro de 2003 a outubro de 2004, os pacientes direcionados para colposcopia foram incluídos no estudo. Após a observação de ácido acético aplicação de epitélio cervical acetobranca, pontuação vascularização, atípica ou mosaico no exame colposcópico foram classificados como portadores de colposcopia positivos, e os pacientes com achados colposcópicos normais foram classificados como colposcopia negativa.Todos os pacientes foram examinados por colposcopia exame de Papanicolaou e respondeu a um questionário com perguntas como idade, idade da FSI, e paridade.
Amostras: amostras de esfregaço do colo do útero foram coletadas em tubos contendo 3-5 ml de fosfato estéril salina tamponada (PBS) na Clínica de Ginecologia do Gazi Faculdade de Medicina da Universidade de pacientes colposcopia antes da aplicação de ácido acético. Depois do transporte para o laboratório de diagnóstico molecular, todas as amostras foram agitadas em vortex e aliquotado em tubos de 1,5 ml e congeladas a eppendorf -86 º C até extracção do DNA.
Extracção de DNA: as amostras cervicais foram digeridos em um tampão contendo 20 mg / mL de proteinase K (20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 75 mM Tris HCl [pH 8,8] de 0,1% de Tween 20), a 55 º C por 3 horas, seguido por 10 minutos a 95 º C. Isolamento de ADN foi realizada por meio de fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. O DNA foi então suspensa em água destilada estéril e armazenado a -86 º C até a amplificação.
A amplificação do DNA: aninhado em tempo real, PCR foi utilizado para a análise de ADN de HPV e a positividade do HPV 16. MY09/11 conjunto de iniciadores (5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3 '), (5'-CMCAGGGWCATAAYAATGG-3 ', Tib Molbiol, Alemanha) foi utilizado para amplificação de PCR após a extracção do DNA. Em tempo real amplificações aninhados de MY09/11 produtos foi feita por GP5 + / GP6 + primers e Cyanine-5 marcado sonda de DNA do HPV 16 específico [Primer F 5 'TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC 3', Primer R 5 'GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 3', Cy5.0 sinal da sonda 5 'Cy5-GTTTCTGAAGTAGATATGGCAGCACA-biotina 3' (Tib Molbiol, Alemanha)]. Análise em tempo real do produto de PCR foi realizada por meio de análise de fusão em LightCycler curva versão Software 3.5.3 (LC 2,0 Roche Diagnostics, Alemanha). Picos de fusão de 78-82 º C mostrou a detecção de ADN de HPV na amostra. Sonda picos de fusão de amostras positivas foram analisadas em uma mesma corrida e HPV 16 amostras positivas rendeu picos em torno de 68 º C.
Revisão ética da proposta e do consentimento
A proposta de pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Gazi. O consentimento informado foi obtido de todas as mulheres antes da coleta da amostra.
RESULTADOS
Um total de 50 mulheres colposcopia positivas (18-63 anos de idade, a idade média ± DP: 39 ± 7) e 52 mulheres colposcopia negativos (17-65 anos de idade, a idade média ± DP: 40 ± 9) foram incluídos no estudo. Houve uma diferença estatisticamente significativa entre pacientes positivos colposcopia e colposcopia negativa quando comparou o HPV 16 e HPV positividade total por Pearson teste do qui-quadrado (p = 0,021 para o tipo 16 e p = 0,010 para o HPV total), mas não houve uma diferença estatisticamente significativa diferença entre os pacientes positivos colposcopia e colposcopia negativa quando comparado HPV positividade (exceto tipo 16), pelo teste exato de Fisher (p = 0,314) ( Tabela 1 ).
De acordo com a idade das mulheres incluídas no estudo não houve diferença estatisticamente significativa entre pacientes com idade < 34 e > 35 quando comparado a positividade do HPV 16 e HPV (exceto tipo 16), pelo teste exato de Fisher (p = 0,154) para o tipo 16 e p = 0,240 para o HPV (exceto tipo 16), mas houve uma diferença estatisticamente significativa entre pacientes com idade < 34 e > 35 quando comparado a positividade do HPV total por Pearson teste do qui-quadrado (p = 0,036) ( Tabela 2 ).
Não houve diferença estatisticamente significativa entre FSI em pacientes < 19 anos de idade e FSI em pacientes> 20 anos de idade, quando comparamos o HPV 16, o HPV (exceto tipo 16) e positividade do HPV total pelo teste exato de Fisher (p = 0,505 para o tipo de 16, p = 0,159 para o HPV (exceptuando o tipo 16) e p = 0,650 para o HPV total) ( Tabela 2 ).
Paridade parece estatisticamente significativa entre pacientes paridade e 0-2 > 3 pacientes de paridade quando comparamos o HPV 16, o HPV (exceto tipo 16) e positividade do HPV total por teste exato de Fisher (p = 0,037 para o tipo 16 e p <0,001 para hpv (excetuando Tipo 16) e p <0,001 para HPV total) ( Tabela 2 ).
De acordo com a análise dos resultados citológicas, não houve diferença estatisticamente significativa entre os pacientes com exame de Papanicolau normal e exame de Papanicolau patológico quando comparamos a positividade do HPV 16 e HPV (exceto tipo 16), pelo teste exato de Fisher (p = 0,169 para o tipo 16 e p = 0,254 para o HPV (exceto tipo 16), mas o valor de p foi 0,050 por Pearson qui-
quadrado que é um valor limite quando comparamos a positividade do HPV total ( Tabela 2 ).
DISCUSSÃO
Porque HPV, especialmente o tipo 16, é relatado como um fator de risco importante para o desenvolvimento de displasia cervical e câncer, e 99,7% dos cancros do colo do útero pode ser provado relacionado ao HPV, um dos principais objetivos de prevenção do câncer do colo do útero é o exame de HPV. 9
Tuncer et al . 10 detectada no seu estudo de 12,5%, 19,4%, 46,3% e 83,3% de positividade de HPV tipo 16 em CIN I, II CIN, CIN III e as amostras de carcinoma invasivo, respectivamente, por PCR em pacientes turcos.Também Onan et al . 11 da Turquia encontrado 4,2%, 14,8%, 45% de positividade de HPV em CIN I, II CIN e III CIN amostras, respectivamente, e a positividade do HPV em doentes com CIN III foi significativamente mais elevada do que em doentes com CIN I e NIC II.
Em 102 pacientes colposcopia (tanto colposcopia positivo e negativo), um 19,6% de positividade em favor de HPV total foi detectado em nosso estudo, a positividade de 9,5% e 30,0% de positividade em grupos colposcopia negativas e positivas, respectivamente. Este resultado indica que há uma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos (p = 0,010).
Na avaliação conjunta de HPV (exceto tipo 16) e HPV 16, encontramos uma 55% de positividade em pacientes com menos de 34 e 45% de positividade em pacientes com mais de 35. Nossos resultados se correlacionam com os estudos que indicam uma diminuição da infecção por HPV como o aumento da idade, 12-15 embora Ko et al . 16em seu estudo descobriu que as mulheres entre as idades 30-69 tiveram menor taxa de positividade do HPV (variando 14-34%) comparadas às mulheres com menos de 30 anos e maiores de 70 (variando 47-52%).
Considerando HPV total, encontramos 70% de casos positivos no grupo que experimentou o seu FSI, com a idade de 19 ou antes, e 30% de casos positivos no grupo que experimentou o seu FSI, com a idade de 20 ou depois.Embora não haja uma diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos e os resultados de HPV, nossos achados confirmam os resultados de estudos anteriores 12,17,18 que a infecção pelo HPV é mais comum entre as mulheres que experimentaram o seu FSI nas idades precoces. Consequentemente, Flores et al . 19 indicam em seu estudo que a idade avançada em FSI está significativamente associado com uma diminuição do risco de alto grau CIN ou câncer em HPV (+) mulheres.
Existem resultados contraditórios nos estudos que avaliam o HPV-câncer cervical e de relacionamento paridade, alguns dos quais sugerem que não há associação com paridade e câncer HPVcervical. 20,21 Considerando todos os tipos de HPV, 40% dos casos positivos no grupo que deram dois ou nascimentos menos e 60% de casos positivos no grupo que lhe deu três ou mais partos foram encontrados em nosso estudo e HPV parece estatisticamente significativa entre pacientes paridade e 0-2 > 3 pacientes de paridade quando comparamos o HPV 16, o HPV (exceto tipo 16) e positividade HPV total. Shields et al . 22 e Castellsague et al . 23 sugerem que as mulheres HPV expostos com alta paridade estão em maior risco para o câncer cervical. Nosso estudo sugere que a paridade parece um fator de risco para o HPV e, conseqüentemente, para o câncer cervical. Pelo contrário, Sellors et al . 17 no Canadá detectou uma positividade de 17,1% em mulheres que nunca deram à luz, de 12,7% em mulheres que deram um nascimento, 8,7% em mulheres que deram dois nascimentos e 6,5% em mulheres que deram três ou mais nascimentos.
Nós primeira realizada colposcopia e citologia e que detectou o DNA do HPV por PCR em tempo real. Sugere-se que, em comparação com o teste Pap, o teste de HPV tem uma maior sensibilidade para a detecção de CIN, 24 e a adição de um teste de HPV a um teste Pap para rastrear as mulheres na sua meados dos anos 30 para o cancro cervical reduz a incidência de grau 2 ou 3 NIC ou câncer. 25 Cuzick 26 salienta, em um comentário que a detecção do DNA do HPV por testes moleculares é mais sensível, mas menos específico e, portanto, o uso destes métodos em conjunto, devem ser o padrão ouro em programas de rastreio do colo do útero.
Grce et al . 27 detectado DNA do HPV em pacientes colposcopia positivos em Zagreb. Os resultados foram de 64,4% positiva. Como eles detectaram os esfregaços citológicos, eles chegaram à conclusão de que, como o grau de SIL aumentou houve um aumento no prevalance de HPV de alto risco (HPV tipo 16 prevalance DNA foi de 8,5% e 17,1% em LSIL e HSIL casos, respectivamente) . Os resultados foram considerados estatisticamente significativos. Fife et al . 28 encontraram 35% de positividade do HPV 16 em mulheres com resultados de Papanicolau patológicas mancha em seu estudo por PCR. Todos ASCUS, LSIL, HSIL, CIN I, NIC II, NIC III casos em nosso estudo foram considerados como baciloscopia patológicas de Papanicolau. Encontramos 45,5% de positividade HPV 16 em mulheres com baciloscopia patológicas de Papanicolau. Enquanto positividade de 45% (HPV total) foi encontrada no grupo com resultados patológicos esfregaço de Papanicolau, a proporção de positividade de HPV (HPV total) foi de 55% no grupo com resultados de esfregaço Pap normais. Nossos resultados não estão correlacionados com os resultados da literatura. A razão para isto pode ser devido declinação para a preparação da amostra ou a interpretação dos resultados de esfregaço.
DNA de HPV, especialmente do tipo 16, seguido do tipo 18, 45, 31 e 33 é diagnosticada em mais de 99% das biópsias de cancro cervical. Embora as proporções variam de acordo com o método de diagnóstico, HPV tipo 16 é detectada em 33-50% dos tecidos de cancro do colo do útero e isto é a razão principal para se concentrar em tipo 16. 29 Antonishyn et al . 30 encontrado no seu estudo que o mais comumente genótipo identificado em pacientes com neoplasia intraepitelial cervical grau 2 ou pior era HPV-16 (46,7%), seguido por HPV-31 (14,7%) e HPV-18 (3,9%) em tempo real, por reacção em cadeia da polimerase. Eles descobriram que o HPV-31 está a contribuir de forma significativa para a percentagem de mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical na população do estudo e mostra uma maior prevalência de HPV-18 em lesões de alto grau.
Foram estudadas amostras de esfregaço e encontrou uma positividade de 19,6% em todos os pacientes colposcopia. Este resultado mostra a elevada sensibilidade do PCR em tempo real. PCR em tempo real, o mais avançado e sensível dos métodos moleculares, foi utilizado em nosso estudo. Desde o experimento ocorreu em um ambiente fechado, não havia contaminação mínima em comparação com os métodos convencionais ea sensibilidade é maior devido a mais um passo na amplificação. 31,32
Detectamos o HPV eo HPV 16 positividade por PCR em tempo real. A fim de detectar outros tipos de 16, a sequenciação pode ser realizada.
Em conclusão, o objetivo foi detectar a prevalência de HPV, especialmente o tipo 16 em pacientes colposcopia como um grupo específico com queixas cervicais e este é o primeiro estudo que reflecte os resultados de HPV de pacientes colposcopia em nosso país. Como o câncer cervical é um importante problema de saúde pública entre as mulheres e HPV, especialmente o tipo 16 é significativamente relacionada com o cancro do colo do útero, a detecção do HPV serão úteis para a concepção de programas eficazes de prevenção do câncer cervical.Pensamos que novos estudos,
incluindo um grande número de pacientes colposcopia devem ser realizados para avaliar o prevalance de HPV neste grupo de doentes.
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Endereço para correspondência: Bedia Dinc, MD Gazi University, Faculdade de Medicina, Departamento de Microbiologia Médica Dekanlik Binasi, 2. Kat, Besevler Ancara, Turquia, 06500 Tel: +90 312 202 46 28 Fax: +90 312 212 46 47 E-mail: [email protected]
Enviado em: 2009/07/20 Aprovado em: 11/05/2009 Declaramos a inexistência de conflito de interesses.
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O Jornal Brasileiro de Doenças Infecciosas e publicação Contexto
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Autora: Juliana Barroso Zimmermmann Orientador: Prof. Dr. Victor Hugo de Melo Co-orientadora: Profa. Dra. Helenice Gobbi
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ginecologia e Obstetrícia (Saúde da Mulher) da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), para obtenção do título de Doutor, em 28 de março de 2008
OBJETIVO: avaliar a resposta imunológica local por meio da contagem de células de Langerhans na mucosa cervical de pacientes soropositivas e soronegativas para o HIV. MÉTODOS: estudo realizado com 77 pacientes portadoras de HPV, sendo 40 soropositivas e 37 soronegativas para o HIV, submetidas à colposcopia e à biópsia de colo uterino. O material obtido para biópsia de colo uterino foi encaminhado para estudo histopatológico e imunoistoquímico, utilizando-se os anticorpos CD1a (1:200), S100 (1:1200) e E-caderina (1:400), todos da marca Dako. O sistema de detecção utilizado foi o Novolink (Novocastra). RESULTADOS: nas pacientes soropositivas para o HIV, a média de células/campo foi de 0,8+0,7 células e pelo anticorpo S100 a média de células/campo foi de 1,3+1,0 células. Nas pacientes soronegativas para o HIV, a média de células marcadas pelo anticorpo CD1a por campo foi de 2,6+1,6 células e pelo marcador S100 verificou-se contagem de 3,6+1,7 células, sendo a diferença significante para o CD1a (p<0,0001) e para S100 (p<0,0001). Entretanto, esta contagem não se associou à carga viral, à contagem de linfócitos TCD4+ e nem ao genótipo do papilomavírus humano (p>0,05). A análise multivariada identificou como responsável pela redução do número de células de Langerhans apenas a infecção pelo HIV. CONCLUSÕES: conclui-se que as pacientes soropositivas apresentam menor quantidade de células de Langerhans na mucosa cervical, quando comparadas com as soronegativas, mas este efeito não está associado à contagem de linfócitos TCD4+ e à carga viral do HIV.
