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Hygienemonitoring mit dem BAX®-Kit Listeria spp.
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Gliederung
Einleitung• Das BAX®-PCR System• Das PCR-Protokoll
Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA
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Die BAX®- PCR
BAX®-Kits
+
BAX® -System
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BAX®-PCR- Testkits
Verfügbare Tests:
SalmonellaListeria monocytogenesListeria monocytogenes 24 hGenus ListeriaGenus Listeria 24 hCronobacter (Enterobacter) sakazakiiE. coli O157:H7 Hefen und SchimmelpilzeStaphylococcus aureus Real-Time
Campylobacter jejuni/coli/lari Real-Time
Genus Listeria Hygienemonitoring Reverse Transkriptase
Jedes Kit enthält 96 Tests:• PCR Reaktionsgefäße mit
alle PCR-Reagenzien• Protease und Lysis-Puffer
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Vorteile der BAX®-PCR
Einfache, unkomplizierte Durchführung
Wenige manuelle Arbeitsschritte (< 1 min/Probe)
Automatische Auswertung
Kürzere Analysezeiten
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Probenmaterial
Lebensmittel
Fleisch/Fisch
Schokolade
Aromen
Milch und Milchprodukte
Gewürze
Feinkost
Getreide
u. a. Lebensmittel
Sonstige Proben
Umgebungsproben
Futtermittel
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Gliederung
Einleitung• Das BAX®-PCR System• Das PCR-Protokoll
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BAX®- Protokoll (Kultur + PCR)
Probe PCRDetektion +
AnalyseZelllyseAnreicherung
2 Pipettierschritte
1. 2.
Lyophisierte Reagenzien
Keine DNA-Aufreinigung nötig
DNA-PolymerasePrimerNukleotideSupplementeFluoreszenzfarbstoff / SondeInterne PositivkontrolleKein Mastermix erforderlich sehr geringes Kontaminationsrisiko
• Komplett automatische Detektion und Analyse• Ja/Nein-Antwort zur Anwesenheit des Keims• Paralellanalyse Salmonella, E. coli, E. sakazakii, L. monocytogenes
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Anr
eich
erun
gA
usst
reic
hen
Bes
tätig
enProbe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser)
Bebrütung:18±2 h bei 37°C
0,1 ml Kultur in 10 ml RVS-Bouillon
24±3 h bei 41,5 °C
1 ml Kultur in 10 ml Mkttn-Bouillon
24±3 h bei 37°C
XLD-Medium +
festes Medium nach Wahl
24±3 h bei 37 °C
charakteristische Kolonien von jeder Platte auf Nähragar
24±3 h bei 37 °C
Bioch. Bestätigung 4– 24h Serologische Bestätigung
Interpretation der Ergebnisse
nach 3 bis 5 Tagen
Nachweis von Salmonellen DIN EN ISO 6579:2003 Horizontales Verfahren
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Anr
eich
erun
gB
AX®
-PC
R
Ergebnisse
nach ~ 23 Stunden
Nachweis von Salmonellen aus Fleischproben mit der BAX® PCR:
Einfache Probenbearbeitung da keine DNA-Extraktion erforderlich ist
Probe homogenisieren (1:10 in gep. Peptonwasser)
Bebrütung: 18±2 h bei 37°C
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Anr
eich
erun
gA
usst
reic
hen
Bes
tätig
enProbe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser)
Bebrütung: 24±3 h bei 30°C
Ausstreichen auf Listerien-Agar nach Ottaviani und Agosti (Oxoid CM 1084)
und ein zweites festes Medium nach Wahl
Bebrütung 24 -48 h bei 37 °C
Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSYEA
18 - 24 h bei 37 °C
Nachweis von L. monocytogenes DIN EN ISO 11290-1:2005
0,1 ml der Kultur in 10 ml Fraser-Bouillon; Bebrütung: 24 - 48 h bei 35°C – 37°C
Bestätigungsreaktionen:Gramfärbung
KatalaseHämolyse
CAMP-TestRhamnose / Xylose
Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6
Tagen
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Anr
eich
erun
gB
AX®
-PC
R
Ergebnisse
nach ~ 29 bis 41 Stunden
Nachweis von L. monocytogenes mit der BAX®-PCR:
Probe homogenisieren (1:10 in ½ Fraser)
Bebrütung: 24±3 h bei 30°C
100 µl in 9,9 ml MOPS-BLEB; Bebrütung: 18 - 24 bei35°C – 37°C
Einstufige Anreicherung
Probe homogenisieren
(1:10 in LEB-Bouillon)Bebrütung: > 24 h bei 30°C
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BAX®-PCR Kits zum Nachweis von L. (monocytogenes)
½ Fraser
MOPS-Bleb
22h, 35 ºC
2,5 d
23 h, 30 ºC
2- stufige AnreicherungQB0610C (QB0609C)
LEB
24h, 37 ºC
1 - stufige AnreicherungQB8135C (QB8125C)
1,5 d
keine AnreicherungQB2912C
Probennahme
4 h, 30 ºC
8 h#QUA 18/05- 07/08
NEU
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Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Taxonomie
Umbenennung von Enterobacter sakazakii in eine neue GattungCronobacter spp. nov.
Die Gattung Cronobacter umfasst die fünf Arten:C. sakazakiiC. muytjensiiC. dublinensisC. turicensisCronobacter genomspecies 1
Von allen Arten geht eine Infektionsgefahr aus.
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Anr
eich
erun
gA
usst
reic
hen
Bes
tätig
enProbe homogenisieren (1:10 in Peptonwasser)
Bebrütung:18±2 h bei 37°C
Ausstreichen auf selektivem chromogenen Agar ESIA
(Alternative: DFI)
Bebrütung 24 ± 2 h bei 44°C
Reinkultur verdächtiger Kolonien (5) auf TSA
48 ± 4 h bei 25 °C
Nachweis von Enterobacter sakazakii DIN ISO TS 22964:2006
0,1 ml der Kultur in 10 ml mLST / Vancomycin;
Bebrütung: 24 ±2 h bei 44°C
Bestätigungsreaktionen:gelbes Pigment
biochemische Charakterisierung(Microbact, RapID, API)
Interpretation der Ergebnisse nach 3 bis 6
Tagen
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Anr
eich
erun
gB
AX®
-PC
R
Ergebnisse
nach ~ 28 Stunden
Nachweis von Enterobacter sakazakii mit der BAX® PCR
Probe homogenisieren (1:10 in mLST / Vancomycin)
Bebrütung: 20 – 22 bei 44°C
10 µl in 500 µl in BHI;
Bebrütung: 3 h bei 37°C
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ISO 6888:1 versus Bax-PCR Staphyloccous aureus
Feste Probe 1:10 verd.
2 Baird-Parker-Platten
24 +/- 2 h bei 35-37 ºC
2 x 0,1 ml
5 verdächtige Kolonien in BHI
Koloniezahl notieren
24 +/- 2 h bei 35-37 ºC
24 +/- 2 h bei 35-37 ºC
Koagulasetest: 0,1 ml + 0,3 ml Kaninchenplasma 4-6h, 35-37 ºC , wenn neg. weitere 24 h Inkubation
Ergebnis: bis zu 4 d
10 g Probe in 90 ml Giolitti-Cantoni
22-24 h, 37 ºC
< 24 h neg. und pos. Ergebnis
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Hefen und Schimmelpilze (ISO DIS 21527-1) versusBAX®-PCR
Probe 1:10 Peptonwasser
DRBC> 500 KbE/g
5 d bei 25ºC
Kolonienzählung
44 h, 25 ºC
5 h – 2,5 d pos. und neg. Ergebnis
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Internationale Zertifikate
AOAC International Official MethodSalmonella #2003.09; L. monocytogenes #2003.12
AOAC-RI Performance Tested MethodSalmonella #100201; L. monocytogenes #070202; L. spp #030502, 8 h Listeria030801; E. coli O157:H7 #10401, E. coli O157:H7 MP #050-501 Campylobacter lari/coli/jejuni # 40702; S. aureus # 120701
USDA-FSIS AdoptionSalmonella #MLG 4C.00; L. monocytogenes #MLG 8A.00, E. coli O157:H7 #MLG 5A.00
Health Canada CertificationSalmonella #MFLP-29; L. monocytogenes #MFLP-28, L. spp. #MFLP-15eE. coli O157:H7 #MFLP-30; Enterobacter sakazakii #MFLP-27
AFNOR CertificationSalmonella #QUA 18/3-11/02
NordVal CertificationSalmonella #2006-30-5408
Brazil MAPA Official Reference MethodSalmonella #MLG4C-01, L. monocytogenes #MLG 8A-01
Japanese Ministry of Health, Labour and WelfareListeria sp.; L. monocytogenes
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Gliederung
Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.
• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA
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Mögliche Kontaminationsquellen von Lebensmitteln
1. Kontaminierte Rohstoffe
2. Kontamination während der Verarbeitung
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Hygienemonitoring
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Die Gattung Listeria als Hygieneindikator
Ubiquitäre Verbreitung
L. seeligeri*L. welshimeri*L. monocytogenes*
L. grayiL. innocuaL. ivanovii*
* Bei Infektionen beim Menschen nachgewiesen
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Gliederung
Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.
• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität
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Reverse Transkriptase-PCR
RNA
DNA
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70 S Ribosomen der Bakterien
30 S Untereinheit21 Proteine +16S rRNA (~1540 bp)
50 S Untereinheit34 Proteine +5 S rRNA (120 bp)23 S rRNA (~2900 bp)
= Proteine (35%)= rRNA (65%)
rRNA bis zu 15% der Zelltrockenmasse
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Listeria sp.-Kit Hygienemonitoring
Normale PCR
Etliche tausend Ribosomen/Zelle
RT- PCR mit rRNA als Target
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Gliederung
Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.
• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität
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Schematische Darstellung des Protokolls
DuPont Qualicon Wipesterile
DuPont Q
ualicon Wipe
sterile
Vortexer
Agenz 1Agenz 2
Vortexen und 35 min bei 37°C inkubieren. Danachmit Verdünnunspuffer verdünnen, 30 µl Lysat zu
PCR-Gefäß geben und RT-PCR starten
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BAX®- Protokoll Hygienemonitoring Listeria sp.
Reverse Trans-kriptase-PCR
Detektion +AnalyseZelllyse“Stoffwechsel”Zelllyse
4 h, 30°C DNA-PolymerasePrimerNukleotideSupplementeFluoreszenzfarbstoff Kontroll-DNA+PrimerReverse Transkriptase
Ergebnis liegt nach 8 h vor
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Ergebnisdarstellung nach < 3 h
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Gliederung
Hygienemonitoring mit dem neuen BAX®-Kit Listeria spp.
• Reverse Transkriptase-PCR zum Nachweis von rRNA• Protokoll• Inklusivität/Exklusivität • Sensitivität
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Inklusivität / Exklusivität
Inklusivität (58 Isolate der Gattung Listeria) = 100%
Exklusivität (52 Nicht-Listeria-Isolate) = 100%
L. seeligeriL. welshimeriL. monocytogenes
L. grayiL. innocuaL. ivanovii
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Sensitivität
0/44/44/40/44/44/4L. grayi subsp. grayi
KbE/ ml Puffer
4/44/44/44/44/44/4L. welshimeri
4/44/44/44/44/44/4L. seeligeri
4/44/44/44/44/44/4L. monocytogenes
4/44/44/44/44/44/4L. ivanovii
3/44/44/43/44/44/4L. innocua
0/44/44/40/44/44/4L. grayi subsp. murayi
100101102100101102Spezies
BAX® System ClassicBAX® System Q7
Nachweisgrenze = < 101 KbE / mL (~20 - 200 Zellen)
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USDA-FSIS- Methode zum Nachweis von Listeria spp. auf Oberflächen
~100 cm2
2 min
22 h, 30°C
100 µl zu 10 ml Fraser
48 h, 37°C
MOX (100µl)
48 h, 37°C
MicroID
225 ml UVM
Ergebnisse liegen erst nachbis zu 6 d vor
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Kulturmethode versus BAX®-RT-PCR (Edelstahl)
USDA/FSIS
BAX®-System Classic
BAX®-System Q7
Negativkontrolle
L. monocytogenes2 * 104 / 100 cm2
Negativkontrolle
L. ivanovii5,6*104 / 100 cm2
000005
142020202020
000005
52020202020
Ref. PosBest. PosBax Pos
Best.PosBAX pos.n
100 µl BHI-Suspension auf 100 cm2, 18-20 h bei RT getrocknet
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Zusammenfassung BAX®-RT-PCR-Kit Listeria spp. zum Hygienemonitoring
Das bewährt einfache Protokoll der BAX®-PCR ist nur geringfügig modifiziert
Detektion über Schmelzkurvenanalyse
Kein Anreicherungsschritt erforderlich
Inklusivität/Exklusivität = 100 %
Nachweisgrenze = 10 KbE/ ml
Ergebnisse liegen bereits nach 8 h vor
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit