IMMUNOHISTOCHEMISTRY immunohistochemistry im·mu·no·his·to·chem·is·try =Micro scopic localization of specific antigens i n tissues by staining with antibodies labeled with fluorescent or pigmented material. =the demonstration of specific antigens in tissues by the use of markers that are either fluorescent dyes or enzymes, especially horseradish peroxidase = Immunohistochemistry is the localization of antigens in tissue sections by the use of labeled antibody as specific reagents through antigen-antibody interactions that are visualized by a marker such as fluorescent dye, enzyme, radioactive element or colloidal gold. =prose s lokalisasi protein pada sel di tissue section dengan menggunakan prinsip bahwa antibodi mengikat antigen pada jaringan biologis secara spesifik. o Immunohistoche mical staining banyak digunakan pada diagnosis sel-sel abnormal seperti yang ditemuka n pada cancerous tumor s. IHC juga banyak digunakan pada pen elitian dasar untuk menjelaskan tentang persebaran dan lokalisasi dari biomarkers dan differe ntially expressed protein pada bagian yang berbeda di jaringan biologis. o Memvisualisasikan interaksi antibodi-antigen dapat dilakukan dengan banyak cara. Yang paling sering adalah immunoperoz idase staining (antibodi dikonjugasik an dengan enzim, seperi peroxidase, yang dapat mengkatalisasi reaksi yang menghasilkan warna) atau immufluorescece (antibodi dapat dilabeli fluorophore, seperti fluorescein, rhodamine, DyLight Fluor atau Alexa Fluor) o IHC mempunyai keuntungan , bahwa dia mampu untuk mengidentifikasi tipe sel yang mengekspr esikan protein dan specific cellular location dari protein. How Immunohistochemistry Is Done • Langkah pertama dilakukan oleh surgeon atau pathologist, yang memutuskan bahwa immunostain penting dilakukan berdasarkan rencana treatment dan tampak mikroskopis tumor. • Lalu, antigen yang akan dicari harus ditentukan. Cth: breast cancer stained for estrogen receptor. • Pengambilan sampel . Biasanya sampel diperoleh standard biopsy atau open procedures. • Sample processing. Memproses jaringan biasanya meliputi formalin fixation, paraffin embedding, dan sectioning Pada beberapa kasus, interaksi memerlukan special sample handling seperti frozen sectioning (untuk melindungi, atau mengawetkan antigen) atau heating (untuk meningkatkan esposure atau “retrieve” the antigen) • Immunostaining. Memerlukan exposure sample terhadap specific (primary) antibody dalam kondisi yang memungkinkan terjadinya antigen-entibosy binding. Pada beberapa kasus, primary antibody dikonjugasikan dengan enzim seperti horseradish peroxidase (HRP). Format ini cepat, tapi direct-conjugate-labeled method mempunyai sensitivitas yang rendah dan memerlukan konsen trasi antibodi yang tinggi. **Prosedur lain meliputi different (secondary) antibody yang berikatan ke constant (Fc) region dari primary antibody dan terhubung dengan HRP atau enzim lainnya. Karena benyak secondary antibody dapt menempel pada single primary antibosy, sensitivitas meningkat. − Antigen retrieval. antigen retrieval reagent → menghancurkan protein cross-link yang terbentuk oleh formalin fixation sehingga memunculakn antigenic sites yang tersembunyi. Tekniknya bisa dengan cara pemanasan atau “Heat Induced Epitope Retrieval” (HIER), enzyme digestion atau “Proteolytic Induced Epitope Retrieval” (PIER). Combination of Heat Mediated and Proteolytic Enzyme Method juga dapat digunakan. − Improving antibod y penetration . Dapat digunakan T riton X-100, yang mengurangi tegangan permukaan, memungkinkan penggunaan reagent yang lebih sedikit dan pencakupan yang lebih luas pada sample. Teknik lainnya adalah reeze and thaw method yang mere duksi glutaraldehyde linkages pada ant igen yang tertutupi
immunohistochemistry im·mu·no·his·to·chem·is·try=Microscopic localization of specific antigens in tissues by staining with antibodies labeledwith fluorescent or pigmented material.=the demonstration of specific antigens in tissues by the use of markers that are eitherfluorescent dyes or enzymes, especially horseradish peroxidase= Immunohistochemistry is the localization of antigens in tissue sections by the use of labeledantibody as specific reagents through antigen-antibody interactions that are visualized by amarker such as fluorescent dye, enzyme, radioactive element or colloidal gold.=proses lokalisasi protein pada sel di tissue section dengan menggunakan prinsip bahwaantibodi mengikat antigen pada jaringan biologis secara spesifik.
o Immunohistochemical staining banyak digunakan pada diagnosis sel-sel abnormal sepertiyang ditemukan pada cancerous tumors. IHC juga banyak digunakan pada penelitiandasar untuk menjelaskan tentang persebaran dan lokalisasi dari biomarkers dandifferentially expressed protein pada bagian yang berbeda di jaringan biologis.
o Memvisualisasikan interaksi antibodi-antigen dapat dilakukan dengan banyak cara. Yangpaling sering adalah immunoperozidase staining (antibodi dikonjugasikan dengan enzim,seperi peroxidase, yang dapat mengkatalisasi reaksi yang menghasilkan warna) atauimmufluorescece (antibodi dapat dilabeli fluorophore, seperti fluorescein, rhodamine,DyLight Fluor atau Alexa Fluor)
o IHC mempunyai keuntungan, bahwa dia mampu untuk mengidentifikasi tipe sel yangmengekspresikan protein dan specific cellular location dari protein.
How Immunohistochemistry Is Done• Langkah pertama dilakukan oleh surgeon atau pathologist, yang memutuskan bahwa
immunostain penting dilakukan berdasarkan rencana treatment dan tampak mikroskopis
tumor.• Lalu, antigen yang akan dicari harus ditentukan. Cth: breast cancer stained for estrogen
receptor.• Pengambilan sampel. Biasanya sampel diperoleh standard biopsy atau open procedures.
• Sample processing. Memproses jaringan biasanya meliputi formalin fixation, paraffinembedding, dan sectioningPada beberapa kasus, interaksi memerlukan special sample handling seperti frozensectioning (untuk melindungi, atau mengawetkan antigen) atau heating (untukmeningkatkan esposure atau “retrieve” the antigen)
• Immunostaining. Memerlukan exposure sample terhadap specific (primary) antibodydalam kondisi yang memungkinkan terjadinya antigen-entibosy binding. Pada beberapa
kasus, primary antibody dikonjugasikan dengan enzim seperti horseradish peroxidase(HRP). Format ini cepat, tapi direct-conjugate-labeled method mempunyai sensitivitas yangrendah dan memerlukan konsentrasi antibodi yang tinggi.**Prosedur lain meliputi different (secondary) antibody yang berikatan ke constant (Fc)region dari primary antibody dan terhubung dengan HRP atau enzim lainnya. Karenabenyak secondary antibody dapt menempel pada single primary antibosy, sensitivitasmeningkat.− Antigen retrieval. antigen retrieval reagent → menghancurkan protein cross-link yang
terbentuk oleh formalin fixation sehingga memunculakn antigenic sites yangtersembunyi. Tekniknya bisa dengan cara pemanasan atau “Heat Induced EpitopeRetrieval” (HIER), enzyme digestion atau “Proteolytic Induced Epitope Retrieval” (PIER).Combination of Heat Mediated and Proteolytic Enzyme Method juga dapat digunakan.
− Improving antibody penetration . Dapat digunakan Triton X-100, yang mengurangitegangan permukaan, memungkinkan penggunaan reagent yang lebih sedikit danpencakupan yang lebih luas pada sample. Teknik lainnya adalah reeze and thawmethod yang mereduksi glutaraldehyde linkages pada antigen yang tertutupi
• Langkah terakhir adalah interpretasi hasil. Biasanya dilakukan secara manual, yangberarti bergantung pada pengalaman dan kemampuan dari interpreter. Juga bisaComputerized image analysis, antibody-conjugated fluorophores, flurescent microscopysystems, dsb.
IMMUNOHISTOCHEMISTRY DALAM BREAST
CANCER The IHC test results are most reliable for fresh or frozen tissue samples. IHC tends to be anunreliable way to test tissue that's preserved in wax or other chemicals.
Estrogen and ProgesteroneReceptors
Various methods have been and are used for scoring ER and PgR:• H Score. Persentase dari sel yang di-stain → negative, weak, moderate, or strong → overal
maximum score = 300H score between 0 and 300 was obtained where 300 was equal to 100% of tumour cellsstained strongly (3+)
• Quick score berdasarkan rentang persentase cell staining dari 1-4 dan overall intensitysebagai 1-3, lalu ditambahkan sehingga nilai maximum = 7.
• Allred score rentang dari 1-5 dan maximumnya 8. ER positive → score >2
Yang dapat diperoleh pada hasil tes:• Persentase : 0% (no receptor) – 100% (all have receptors)
Critical factor pada assessment yang berhubungan dengan interpretasi:• Setiap assay harus meliputi control
• ER dan PgR: apabila no staining berarti ada masalah pada assay; tapi umur pasien harusdipertimbangkan karena level pada wanita premenopausal dapat sangat rendah.
• Frekuensi hasil positif sangat tinggi pada grade I invasive cancer dan screen dtectedcancers, jadi apabila tidak ada atau low level dari staining, assay harusnya diulang.
• Cytosol staining mungkin disebabkan antigen retrieval yang berlebihan, jadi yang
diperhatikan hanya nuclear staining saja.
o It is well known that ER expression is inversely correlated with tumour grade.o ER expression berbanding terbalik dengan tumour grade. BRCA-associated tumours, yang
lebih sering terjadi dalam higher grade daripada sporadic breast cancer, lebih sering ERnegative.
Figure 1. Immunohistochemical staining of BRCA1 tumour for (a) oestrogen receptor and (b)progesterone receptor.
HER2= human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) (also known as HER-2/neu/c-erbB2).• HER2 memproduksi human epidermal growth factor receptor = HER2 protein.
• HER2 gene amplification or protein expression → poor prognosis
• Selain dengan immunohistochemistry, bisa dengan cara FISH (Fluorescent In-SituHybridisation)
o Gene amplification. Keberadaan lebih dari 2 copies of gene.o Gene expression. Pembentukan protein berdasarkan informasi genetik.o Overexpression. Sel mensintesis unusually large amount of proteins. Biasanya karena
geen amplification. Biasa ditemukan 25-30% pada wanita dengan breast cancer, tapi jugadapat ditemukan pada tumour of the lung, intestine, prostate, fallopian tubes, dsb
HER2 protein yang berlebihan menyebabkan state of sustained activation dimana growth-transmitting signals ditransmisikan ke sel nukleus ditransmisikan ke sel nukleus dan selmerespon dengan pertumbuhan tidak terkontrol dan peningkatan kecepatan pembelahan.
2+ cases should be assessed by FISH, as should other cases where there is heterogeneity,problems with immunohistochemistry interpretation and problems relating to fixation.
Scheme depicting signalling transduction in breast HER2-gene amplification by
cancer involving HER2, Src, focal adhesion kinase Fluorescence in situ hybridization (FISH)(FAK), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)
Scoreto
report
HER2protein
assessment
Staining pattern
0 Negative No staining is seen or membrane staining is <10% of invasive
tumour cells1+ Negative Faint/barely perceptive membrane staining detected in >10% of
invasive tumour cells2+ Equivocal Weak to moderate complete membrane staining in >10% of invasive
tumour cells or <30% with strong complete membrane staining3+ Positive Strong complete membrane staining in >30% of invasive tumour
HER2-protein overexpression by Immunohistochemistry
Other Markers
Epidermal growth factor receptor• Epidermal growth factor receptor (EGFR, also HER1) is a type 1 tyrosine kinase receptor
that is expressed in normal breast.• The presence of EGFR in breast cancers → berhubungan dengan lack of ER and poor
prognostic features.• Assessment of EGFR dapat menguntungkan → Tyrosine kinase inhibitors of EGFR (cth:
gefitinib), sekarang tersedia dan sedang dalam percobaan dalam advenced dan earlybreast cancer.
TP53•
p53 → penjaga stabilitas dan integritas genome → mencegah proliferasi sel setelah DNAdamage dan mengaktivasi apoptosis dimana terjadi unrepairable damage.• p53 → potential predictor untuk respon breast cancer terhadap chemotherapy
• Mutasi di gen TP53 → perubahan genetik yang paling sering pada human cancers → 20-40% sporadc breast cancers.
• Frekuensi dari mutasi ini sebanding dengan tumour grade.
p27• Another cyclin-dependent kinase complex inhibitor
• Over express p27 → significantly higher survival rates
cyclin D1• regulator of progression from G1 to S phase in cell cycle.
• Menunjukkan bagian penting dari hormonal regulation of mammary epitheliumgrowth:− cyclin D1 → upregulated by estrogen and progestins → downregulated by anti-
oestrogens− The transcription of ER-regulated genes is also modulated by cyclin D1.
• Overexpression of cyclin D1 → common event in breast cancer → especially frequent inearly onset breast cancer → probably because of high levels of oestrogens in this agegroup.
• BRCA1/BRCA2-associated tumours → very low expression of cyclin D1 in both the invasiveand in situ components
• Pada BRCA1/BRCA2 cancers → absecnce of ER dan PgR + absence of cyclin D1 →→
hormone independence of BRCA-associated familial breast cancer.
