Date post: | 07-Oct-2015 |
Category: |
Documents |
Upload: | endah-permata-sari |
View: | 12 times |
Download: | 0 times |
Improving the production of transgenic fish germlines: In vivo evaluation of
mosaicism in zebrafish (Danio rerio) using a green fluorescent protein (GFP)
and growth hormone cDNA transgene co-injection strategy.
Amanda Swari Prasepti1, Claudya Larisha
1, Endah Permata Sari
1, Shafa Imanda
1
1Jurusan Biologi (Bioteknologi), Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Al Azhar Indonesia
Jl. Sisingamangaraja, Kebayoran Baru, Jakarta Selatan 12110
ABSTRAK
Metode mikroinjeksi pada ikan biasanya digunakan untuk mentransfer
gen. Tetapi hasil terekspresinya gen akan beragam karena integrasi transgen
yang terlambat. Jika tidak terintegrasi ke dalam sel bakteri maka gen tidak dapat
terekspresi dengan baik pada keturunannya. Maka dari itu tujuan dilakukannya
penelitian ini adalah untuk mengevaluasi in vivo mosaikisme sampai pada tahap
tertentu dalam mengekspresikan gen. Ketika ikan tersebut diberi reporter gen
berupa GFP dan growth hormone cDNA, maka akan terlihat mosaikisme dari
germline dan ukuran tubuh pada hewan model. Pada penelitian ini menghasilkan
keturunan dari ikan transgenik dengan gen yang terekspresi secara stabil.
Kata kunci : Transgenesis, ikan transgenik, mikroinjeksi, growth hormone cDNA.
PENDAHULUAN
Transgenesis merupakan proses
mengintroduksi satu atau lebih gen ke
dalam embrio suatu organisme yang
selanjutnya gen tersebut dapat
ditransmisikan pada generasi berikutnya.
Gen asing yang diintroduksikan tersebut
biasanya berkaitan dengan karakter
fenotipe penting dalam suatu budidaya,
sehingga dapat menghasilkan organisme
yang lebih unggul dari pada oraganisme
aslinya. Dan dengan adanya metode ini
kita dapat mengaplikasikannya ke
organisme vertebrata rendah dengan
menyajikan reproduksi dan karakteristik
biologis yang memungkinkan mudah
untuk di manipulasi proses genetik
maupun fisiologis pada tahap awal
ontogenesis dan salah satu contoh hewan
yang akan ditransgenik adalah ikan jenis
Danio rerio atau yang lebih dikenal zebra
fish.
Transfer gen pada ikan ini
bertujuan sebagai model eksperimetal
dalam hal penelitan dibidang medis
khususnya dalam penelitian yang
melibatkan embriogenesis dan
organogenesis, serta dalam mempelajari
penyakit penyakit yang menyerang
manusia, serta dalam memproduksi protein
rekombinan. Salah satu cara untuk transfer
gen ini adalah dengan mikroinjeksi.
Penggunaan mikroinjeksi dalam transgenik
ikan didukung oleh hal-hal seperti jumlah
telur yang relatif banyak dan fertilisasinya
terjadi secara eksternal yangmemudahkan
introduksi gen asing pengkode target.
Dengan mikroinjeksi pada ikan
zebra ini yang dapat memungkinkan
mengevaluasi motif dan potensi induk
dalam menghasilkan organisme yang
diingkinkan. Penggunaan gen reporter
yang memungkinkan evaluasi derajat di
mosaicism vivo pada ikan transgenik dapat
memfasilitasi identifikasi pendiri. Gen
yang digunakan untuk motif pada ikan
zebra menggunakan gen coding untuk
green fluorescent protein (GFP) dari ubur-
ubur ubur yang telah banyak digunakan
sebagai gen pelapor.
Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui hasil dari proses transgenesis
pada zebra fish dengan menonjolkan
ekspresi sifat pertumbuhannya (msGH)
dan mozaikisme (GFP).
METODOLOGI
Untuk memproduksi ikan
transgenic maka diperlukan ikan dewasa
dari spesies zebra fish (Danio rerio) wild
type. Lalu ikan dipelihara dalam sistem
perairan tertutup bersuhu 28 C dengan
penyinaran dibawah 14 h light/10 h. Lalu
telur yang terbuahi dari ikan tadi diambil
dan akan di mikroinjeksi dengan dua
transgen. Transgen yang satu diambil dari
ikan mas (Cyprinus carpio) - aktin
promotor mendorong ekspresi baik A.
Victoria GFP gen (pcA / GFP plasmid)
atau ikan silverside laut (Odonthestes
argentinensis) untuk diambil hormon
pertumbuhannya yaitu (msGH) cDNA
(pcA / msGH plasmid). Yang kedua
disediakan oleh Dr. Suzanne Brooks
(Universitas Southampton, Inggris) yaitu
plasmid pcA / GFP untuk menghasilkan
pcA /msGH plasmid dan menggantinya
dengan gen GFP dengan msGH cDNA
(Marins et al., 2002). Kedua gen ini
dilinierisasi dengan Spe I enzim yang
terekstriksi dan disuntikkan pada
perbandingan 1 : 1 ke dalam embrio ikan
tersebut dengan konsentrasi DNA total 35
ng uL-1. Setelah itu proses mikroinjeksi
menggunakan protocol yang sama dari
Vielkind (1992) menggunakan IM-30
bermotor picoinjector (Narishige, Jepang).
Sebanyak 1872 embrio disuntikkan
dan diinkubasi dengan suhu 28 C sampai
telur-telur menetas. Satu minggu setelah
pembuahan, ikan dianalisa kembali dengan
mikroskop epifluorescence (eksitasi = 485
nm; emisi = 520 nm). Lalu diklasifikasikan
menurut terekspresinya GFP embrio yang
tertetasi dengan pola ekspresi
mosaikismenya(Gibbs dan Schmale, 2000;
Thermes et. al, 2002). Jika lemah maka
hanya ada beberapa sel yang terkspresi.
Jika moderat maka kurang dari 50%
terekspresi dan yang terkuat akan lebih
dari 50% terekspresi GFP-nya. Lalu gen
akan dievaluasi keberadaannya dengan
(RT-PCR). Ikan transgenic ini diberikan
nama G0 yang membawa gen GFP.
Lalu ikan G0 dan ikan non-
transgenik sama-sama dibesarkan untuk
dilihat skala pertumbuhannya. Mereka
diberi makan sehari dua kali dengan kadar
protein 47.5 %. Dan data ukuran serta
berat tubuh dianalisa menggunakan t-test
variasi heterogenus statistic program v.06
(statsoft, USA). Delapan G0 yang terpilih
dengan ekspresi GFP yang terkuat
dipisahkan di akuarium yan g berbeda dari
teman-temannya dan dipasangkan dengan
ikan non-transgenik. Hanya enam yang
memilki hasrat untuk kawin dengan ikan
non-transgenik (wild type) dan membuahi
G1 dengan GFP yang terekspresi. Dari
semua ketrurunan G0, G1, dan seterusnya
diekstrak DNA-nya dengan PCR untuk
dilihat apakah GFP dapat terekspresi
dengan baik di setiap keturunannya.
HASIL
Transgenik yang dilakukan pada
ikan zebra menghasilkan 1872 embrio
pada satu sel.dengan penggunaan cA /
GFP dan cA / msGH dengan rasio
equimolar (1:1). Dan setelah seminggu
pengamatan didapatkan embrio yang atau
telur yang masih bertahan sebanyak 1414
yang diamati dibawah mikroskop
epifluorescence, satu minggu setelah
pembuahan, tingkat kelangsungan hidup
untuk ikan yang tidak diobati embrio
adalah 1414 dari 1872 (75,5%), sedangkan
kelangsungan hidup tingkat embrio
microinjected adalah 877 dari 1872
(46,8%), dimana 275 dari 877 (31,4%)
digolongkan sebagai GFP negatif (tidak
ada ekspresi), 315 dari 877 (35,9%)
sebagai lemah GFP positif, 198 dari 877
(22,6%) sebagai moderat GFP positif dan
89 dari 877 (10,1%) sekuat GFP positif.
Jumlah dari tiga kelas ekspresi GFP adalah
602 dari 877 ikan (68,6%).
Dan setelah 12 bulan didapatkan
hasil ikan positif untuk ekspresi msGH
oleh RT-PCR msGH transgen. Dan analisa
untuk berat rata rata menunjukan
peningkatan yang signifikan (p
transgenik tidak menunjukan perilaku
reproduksi yang dikembangkan namun
terdapat dua jantan (M0104 dan M0204)
dan empat betina (F0104, F0204, F0304
dan F0404) yang direproduksi, empat di
antaranya (M0104, F0104, F0204 dan
F0304) ditransmisikan gen GFP ke G1
dalam persentase yang bervariasi dari
2,2% menjadi 42%. Ekspresi GFP diamati
dalam keturunan G1 menunjukkan ikan
mengekspresikan gen ditransfer di semua
sel tubuh.
Namun, gen msGH hanya dapat
dideteksi dalam keturunan G1 yang
diperoleh dari induk ikan M0104 dan
F0104 . Hanya setengah keturunan GFP-
positif dari orangtua M0104 yang dapat
membawa gen msGH tetapi untuk induk
F0104 semuanya membawa gen tersebut.
Keturunan GFP-positif juga positif untuk
eksogen-nous GH gen (Tabel 1). Tidak ada
ekspresi gen GFP dideteksi dalam
keturunan dari orang tua M0204 dan
F0404.
Keturunan G1 dari M0104 dan
F0104 G0 mosaik orang tua yang positif
untuk kedua transgen yang dipelihara
sampai pematangan seksual dan enam G1
ikan dari masing-masing induk
dikawinkan dengan jenis ikan liar untuk
menghasilkan keturunan G2. Sebanyak
466 anak G2 dihasilkan dari perkawinan
M0104 sementara 588 anak G2 diperoleh
dari perkawinan F0104.
Gambar 1. Ikan Zebra (Danio rerio) a.Ikan
non-transgenik berumur 1 tahun (bobot =
0.68g 0.13 g) b. Ikan transgenik G0
berumur 1 tahun (bobot = 1.79 g 0.37 g)
PEMBAHASAN
Proses yang paling sulit pada
transgenic adalah saat menghasilkan
germline yang dapat membawa transgen
dalam keadaan stabil. Hal ini bertujuan
untuk menghasilkan ikan transgenik yang
membawan transgen aktif (cA/msGH)
namun juga transgen reporter (cA/GFP)
yang mampu mengevaluasi mozaik yang
terdapat disemua generasi G0 ikan
transgenik.
Seminggu setelah 68,6% embrio
ikan diinjeksi, maka menghasilkan ikan
transgenik. Bila dibandingan dengan ikan
zebra transgenik 1,95% yang diperoleh
Morales et al. (2011) dan 10% ikan
transgenik yang diperoleh Rahman dkk.
(1997) yang menggunakan transgen
reporter yang sama dengan startegi co-
injeksi.
Mereka menemukan bahwa 10%
dari ikan yang dianalisis olehnya
menghasilkan ekspresi gen reporter GFP
yang kuat, lebih dari 5% ekspresi GFP
lebih kuat dripada yang diperoleh oleh
Gibbs dan Schmale (2000) untuk ikan
zebra transgenik G0 dan 3% lebih kuat
yang diperoleh Thermes et al. (2002)
untuk G0 ikan transgenik. Kondisi yang
digunakan oleh para peneliti sebelumnya
mirip dan mereka juga menggunakan
transgen linierisasi di mana gen GFP
dikendalikan oleh promotor ( dan -
aktin).
Analisis RT-PCR menunjukkan
bahwa 100% dari G0 ikan transgenik GFP
positif mengekspresikan gen msGH namun
tidak semua ikan tersebut membawa
transgen msGH dalam sel dan bisa saja
menurunkan transgen msGH ke generasi
berikutnya, ini akan terlihat jelas ketika G0
dan ikan wildtype disilangkan. Data
percobaan pertumbuhan didukung hasil
RT-PCR dan menunjukkan bahwa
kelompok transgenik meningkat berat 2,6
kali lebih banyak dari kelompok
nontransgenic. Hasil ini menunjukkan
bahwa cA / msGH transgen
menghasilkan hormon aktif. Semakin berat
ikan transgenik itu memungkin terkaitnya
dengan peningkatan msGH yang beredar
dan tidak dapat dikontrol oleh mekanisme
umpan balik negatif yang mengatur
ekspresi gen GH endogen (Peter dan
Marchant, 1995).
Konsekuensi negatif dari produksi
mozaik germline ikan transgenik
kenyataan adalah bahwa sel ikan G0 hanya
dapat menerima sedikit atau tidak ada
sama sekali salinan transgen yang
membuat transmisi transgen ke generasi
berikutnya namun hal ini dapat
diminimalkan dengan mengevaluasi
mozaik dengan penggunaan strategi co
injeksi reporter. Hal ini dapat didukung
dengan adanya penelitian yang
menunjukan adanya iakn yang positif GFP
ke generasi G1.
Presentasi dari GFP menujukan
bahwa ikan G1 memiliki tingkat mozaik
yangs ama pada germ line ikan G0. Namun
pada penelitian ini menunjukan terdapat
dua ikan yang tidak menghasilkan
keturunan transgen, sementara empat ikan
yang ditransmisikan dengan cA / GFP
dari 2,2% menjadi 42% yang positif
menunjukan adanya GFP. Pada penelitian
ini dalam mengidentifikasi ikan G1
sangatlah berhubungan dengan adanya gen
reporter GFP dan penggunaan mikroskop
epifluorescence. Ikan G1 ini berasal dari
betina F0104 dan jantan M0104yang
disilangkan dengan jenis ikan wild yang
memverifikasi bagaimana transgen
tersebut di integrasi pada genom ikan G2.
Dalam G2 diproduksi dari keturunan
M0104 sejumlah ikan GFP-positif tidak
membawa eksogen GH transgen sementara
beberapa ikan GFP-negatif membawanya.
Hal ini menunjukkan bahwa cA / GFP
dan cA / msGH transgen terpisah di G2,
sejak diamati rasio genotipe (Tabel 1)
sesuai dengangen terletak pada kromosom
yang berbeda. Namun, untuk F0104
keturunan G2 keturunan semua individu
GFP-positif yang membawa cA / msGH
transgen serta cA / GFP transgenik,
menunjukkan bahwa kedua transgen
memiliki telah terintegrasi pada kromosom
yang sama.
Dengan adanya metode ini dapat
memungkinkan mengidentifikasi ikan G0
dan dapat pula mengidentifikasi ikan
transgen pada generasi berikutnya. Selain
itu, metode ini juga dapat digunakan untuk
mengetahui proses integrasi transgen
genomik serta mengidentifikasi keturunan
yang ditransmisikan transgen pada
kromosom yang sama.
KESIMPULAN
Transgenik merupakan teknik
memindahkan gen dari satu makhluk hidup
ke makhluk hidup lainnya, baik dari satu
hewan ke hewan lainnya ataupun dari satu
tanaman ke tanaman lainnya. Salah contoh
dari teknologi transgenetik ini yaitu ikan
transgenik yang mampu menghasilkan
benih ikan unggul, melalui perbaikan
mutu genetik ikan yang dibudidayakan.
DNA rekombinan ikan yang telah
dikendalikan dimasukkan ke dalam
genom, sehingga DNA ikan yang
dimasukkan dapat mengembangkan salah
satu aspek dari produktivitas, juga efeknya
dapat diturunkan kepada keturunannya. Ini
bermanfaat untuk meningkatkan produksi
dan produktivitas ikan. Keunggulan dari
rekayasa ini yaitu pertumbuhan cepat,
tahan terhadap serangan penyakit, dan
tahan terhadap lingkungan yang cukup
ekstrem. Dalam transgenik ikan
menggunaan mikroinjeksi yang didukung
oleh hal-hal seperti jumlah telur yang
relatif banyak dan fertilisasinya terjadi
secara eksternal yang memudahkan
introduksi gen asing pengkode target, yang
dapat memungkinkan mengevaluasi motif
dan potensi induk dalam menghasilkan
organisme yang diingkinkan.
DAFTAR PUSTAKA
Figueiredo, Mrcio de Azevedo., Lanes,
Carlos Frederico Ceccon., Almeida,
Daniela Volcan., and Marins, Luis
Fernando. 2007. Improving the production
of transgenic fish germlines: In vivo
evaluation of mosaicism in zebrafish
(Danio rerio) using a green fluorescent
protein (GFP) and growth hormone cDNA
transgene co-injection strategy. Genetics
and Molecular Biology. Vol 30 (1):31-36.